KR102337049B1

KR102337049B1 - 폴리펩티드 생성 방법

Info

Publication number: KR102337049B1
Application number: KR1020167035518A
Authority: KR
Inventors: 울리히 괴퍼트; 벤야민 모리츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2021-12-08
Also published as: RU2016149411A3; JP6661549B2; BR112016024103B1; EP3146057A1; CN106255757A; ES2821940T3; JP2017515492A; US20170067087A1; MX2016014473A; RU2016149411A; RU2699715C2; KR20170003699A; SG11201609639VA; EP3146057B1; CA2943719A1; PL3146057T3; WO2015177084A1; BR112016024103A2; US10329595B2; SI3146057T1

Abstract

본 발명은 전사 시작 부위에 대한 위치 -41 및/또는 -179 에서 C - G 점 돌연변이를 갖는 인간 CMV 주요 즉시-초기 (hCMV-MIE) 프로모터/인핸서인, SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 03 의 핵산 서열을 갖는 프로모터에 관한 것이다. 이러한 신규한 프로모터는 감소된 프로모터 침묵화 및 개선된 폴리펩티드 생성에서 나타나는 바와 같이, 대규모로의 폴리펩티드 생성에 특히 유용하다.

Description

폴리펩티드 생성 방법 {METHOD FOR PRODUCTION OF POLYPEPTIDES}

본 발명은 단백질 발현 분야의 것이다. 본원에서 보고되는 것은, 하나 이상의 점 돌연변이를 갖는 프로모터, 및 폴리펩티드를 생성하기 위해 이러한 프로모터를 사용하는 방법이다.

단백질의 발현은 살아있는 세포에서 기본적인 과정이다. 단백질 발현에 필요한 모든 정보는 단일 핵산에 의해 제공된다. 이러한 핵산은 단백질의 아미노산 서열 정보를 함유할 뿐 아니라, 또한 프로모터 /프로모터 서열을 포함하는 필요한 조절 정보 (예를 들어, 리보솜 결합 부위, 전사에 대한 시작 및 종료-신호, 스플라이스 신호, 인핸서 요소 등) 를 제공한다.

프로모터는 핵산, 예를 들어 그에 작동가능하게 연결되는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 예비 (pre)-mRNA 로의 전사량을 조절하는 핵산이다. 이는 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 5'-말단에서 RNA 중합효소 개시 부위 근처에 위치하는 전사 제어 요소이다. SV40 초기 프로모터의 분석으로부터, 전사 활성제에 대한 인지/결합 부위가 7-20 개 염기쌍으로 이루어지는 부분에서의 프로모터에 포함된다는 것이 공지되어 있다. 한 부분은 RNA 합성을 위한 시작 부위이다 (예를 들어, 널리 공지되어 있는 TATA-박스). RNA 합성에 대한 시작 부위에 대해 5', 즉 업스트림에 위치한 대략 30-110 개 염기쌍인 다른 부분은 전사 개시의 빈도를 정의한다. 프로모터는 적어도, 특정 부위에서 및 규정된 방향으로, 즉 5' 에서 3' 방향으로 RNA 합성을 개시하는 하나의 부분을 필요로 한다.

장기간 배양에서의 생산성의 점진적 감소는 생산 세포주의 개발에 대한 흔한 논점이다 (Barnes, L.M., et al. Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 631-639). 재조합체 단백질 발현의 감소는 이식유전자 카피의 감소 및/또는 이식유전자 프로모터의 침묵화 (silencing) 으로 인한 것일 수 있다 (예를 들어 Escher, G., et al. J. Lipid Res. 46 (2005) 356-365; Krishnan, M., et al., FASEB J. 20 (2006) 106-108; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185 참조). 프로모터의 침묵화는 크로마틴의 후생적 변형 예컨대 히스톤의 번역후 변형 뿐 아니라 CpG 부위에서의 프로모터 DNA 의 직접 메틸화에 의해 초래된다 (예를 들어 Cedar, H. and Bergman, Y., Nat. Rev. Genet. 10 (2009) 295-304; De Carvalho, D.D. et al., Trends Cell Biol 20 (2010): 609-617; Klose; R.J. and Bird, A.P., Trends Biochem Sci 31 (2006): 89-97 참조). 메틸화된 프로모터는 일반적으로 불활성이다.

인간 거대세포바이러스의 주요 즉시-초기 유전자 (hCMV-MIE) 의 매우 강력한 프로모터 및 인핸서는 포유류 세포에서의 폴리펩티드의 재조합체 발현에 사용된다. 프로모터가 일시적 뿐 아니라 안정적으로 트랜스펙션된 포유류 세포에서의 메틸화에 의해 침묵화되기 쉬운 것이 나타난 바 있다 (예를 들어 Escher, G., et al. J. Lipid Res. 46 (2005) 356-365; Krishnan, M., et al., FASEB J. 20 (2006) 106-108; Proesch, S. et al., Biol Chem Heppe Seyler 377 (1996): 195-201; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185 참조).

hCMV-MIE 프로모터의 직접 메틸화가 재조합체 CHO 세포주의 불안정성을 예측하기 위한 초기 마커로서 사용될 수 있다는 것이 WO 2011/128377 에서 이전에 입증된 바 있다.

Osterlehner, A., et al. 은 프로모터 메틸화 및 이식유전자 카피수가 재조합체 중국 햄스터 난소 세포주에서의 불안정한 단백질 생성을 예측한다는 것을 보고하고 있으며, 상이한 CpG 부위가 상이한 빈도로 메틸화된다는 것을 기재하고 있다 (Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681).

발명의 개요

특정 부위에서의 hCMV-MIE 프로모터에서 C - G 점 돌연변이 (C to G point mutation), 즉 단일한 C - G 돌연변이가 감소된 프로모터 침묵화 및 마찬가지로 개선된 생성 안정성을 초래한다는 것이 발견된 바 있다. 또한, 더 높은 역가의 생성 폴리펩티드가 달성될 수 있다는 것이 발견된 바 있다. 전사 시작 부위에 대한 위치 -41 및/또는 위치 -179 에서의 C - G 돌연변이가 특히 효과적인 것으로 나타난다.

본원에 보고한 바와 같은 한 양태는 전사 시작 부위에 대한 뉴클레오티드 위치 -41 (및/) 또는 -179 에서 뉴클레오티드 G 를 갖는 인간 CMV 프로모터이다 (SEQ ID NO: 01 의 프로모터 기반).

이러한 양태의 한 구현예에서 인간 CMV 프로모터는 개선된 생성 안정성 및/또는 개선된 생성물 역가를 갖는다 (전사 시작 부위에 대한 위치 -41 및/또는 -179 에서 C - G 점 돌연변이를 갖지 않는 인간 CMV 프로모터와 비교시).

이러한 양태의 한 구현예에서 인간 CMV 프로모터는 SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 03 의 아미노산 서열을 갖는다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 SEQ ID NO: 02 의 핵산 서열을 갖는 프로모터이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는, SEQ ID NO: 02 의 핵산으로 이루어지며, 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 을 인코딩하는 SEQ ID NO: 04 의 핵산에 작동가능하게 연결되는 경우 SEQ ID NO: 01 의 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터의 80% 이상의 프로모터 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계:

a) 폴리펩티드를 인코딩하는 제 2 핵산에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO: 02 의 제 1 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산으로 진핵세포를 트랜스펙션시키는 단계,

b) 단계 a) 에서 트랜스펙션된 세포를 선별하는 단계,

c) 단계 b) 의 선별된 세포를 배양하는 단계 (폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하),

d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계

를 포함하며 그로써 폴리펩티드를 생성하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드의 생성 방법이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 생성은 대규모로의 생성이다. 한 구현예에서 생성은 500 l 이상, 한 구현예에서는 500 l 내지 10,000 l 의 최종 배양 부피에서의 것이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 상기 폴리펩티드는 면역글로불린, 또는 면역글로불린-단편, 또는 면역글로불린-접합체이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 변이체 또는 이의 단편 또는 이의 융합물이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가의 발현 카세트를 포함한다. 이러한 양태의 한 구현예에서 핵산은 면역글로불린 경쇄 또는 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 추가의 발현 카세트를 포함한다.

이러한 양태의 한 구현예에서 상기 진핵세포는 포유류 세포이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 상기 포유류 세포는 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, Sp2/0 세포 또는 Per.C6® 세포이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 상기 포유류 세포는 CHO 세포 또는 HEK 세포이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 상기 선별 마커는 디히드로폴레이트 리덕타아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 또는 히그로마이신-포스포트랜스퍼라아제이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 폴리펩티드의 생성을 위한 SEQ ID NO: 02 의 프로모터의 용도이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 본원에 보고한 바와 같은 프로모터 또는 본원에 보고한 바와 같은 핵산을 포함하는 세포이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 SEQ ID NO: 03 의 핵산 서열을 갖는 프로모터이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는, SEQ ID NO: 03 의 핵산으로 이루어지며, 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 을 인코딩하는 SEQ ID NO: 04 의 핵산에 작동가능하게 연결되는 경우 SEQ ID NO: 01 의 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터의 80% 이상의 프로모터 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계:

a) 폴리펩티드를 인코딩하는 제 2 핵산에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO: 03 의 제 1 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산으로 진핵세포를 트랜스펙션하는 단계,

b) 단계 a) 에서 트랜스펙션된 세포를 선별하는 단계,

d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 폴리펩티드의 생성을 위한 SEQ ID NO: 03 의 프로모터의 용도이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 전사 시작 부위에 대한 뉴클레오티드 위치 -41 에서 뉴클레오티드 G 를 갖는 인간 CMV 프로모터이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 인간 CMV 프로모터는 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 전사 시작 부위에 대한 뉴클레오티드 위치 -179 에서 뉴클레오티드 G 를 갖는 인간 CMV 프로모터이다.

발명의 상세한 설명

분비된 단백질, 세포간 리포터단백질 또는 세포 표면 마커와 같은, 재조합체 폴리펩티드의 생성/발현을 위한 안정적으로 트랜스팩션된 진핵세포주를 사용하는 경우, 장기간 배양에서의 생산성의 점진적 감소는 생산 세포주의 개발에 대한 흔한 논점이다 (Barnes, L.M., et al. Biotechnol. Bioeng. 81 (2003) 631-639). 세포주/세포 클론, 즉 예를 들어 항체와 같은 폴리펩티드의 대규모 재조합체 생성에 사용할 세포 클론/세포주에 대해, 세포 클론/세포주의 생성 안정성, 즉 세대별 생산성 감소가 중요하다. 따라서, 재조합체 단백질 생성을 위한 포유류 세포주는 확장된 배양 시간에 걸쳐 생산성을 유지할 필요가 있다. 일반적으로 세포 클론/세포주의 생성 안정성은 장기간에 걸쳐 세포 클론/세포주를 배양함으로써 결정된다. 일정 간격으로 배지를 새 배지로 희석하고 세포당 특이적 생산성을 생성물 역가 및 생존가능 세포 밀도를 기준으로 측정한다. 특이적 생산성의 변화 (보통 감소) 는 세포 클론/세포주의 장기간 생성 안정성을 나타내는 것이다.

재조합체 단백질 발현의 감소는 이식유전자 카피의 손실 및/또는 이식유전자 프로모터의 침묵화로 인한 것일 수 있다 (예를 들어 Escher, G., et al. J. Lipid Res. 46 (2005) 356-365; Krishnan, M., et al., FASEB J. 20 (2006) 106-108; Yang, Y., et al., J. Biotechnol. 147 (2010) 180-185 참조). 프로모터의 침묵화는 CpG 부위에서의 프로모터 DNA 의 직접 메틸화 뿐 아니라 히스톤의 번역후 변형과 같은 크로마틴의 후생적 변형에 의해 초래된다 (예를 들어 Cedar, H. and Bergman, Y., Nat. Rev. Genet. 10 (2009) 295-304; De Carvalho, D.D. et al., Trends Cell Biol 20 (2010): 609-617; Klose; R.J. and Bird, A.P., Trends Biochem Sci 31 (2006): 89-97 참조). 메틸화된 프로모터는 일반적으로 불활성이다.

프로모터 메틸화 및 이식유전자 카피 수가 재조합체 중국 햄스터 난소 세포주에서의 불안정한 단백질 생성을 예측한다는 것이 Osterlehner, A., et al. 에 의해 앞서 나타난 바 있으며 상이한 CpG 부위가 상이한 빈도로 메틸화된다는 것이 기재되어 있다 (Biotechnol. Bioeng. 108 (2011) 2670-2681).

본원에서, 상이한 CpG 부위를 단독으로 또는 조합으로 조사하였다. 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 내에 CpG 점 돌연변이를 포함하는 다양한 세포주를 생성시키고 장기간 생산성에 대해 시험하였다.

프로모터에서의 돌연변이가 유전자 발현의 그의 효능에 유의하게 영향을 주지 않는 것, 즉 프로모터 강도가 영향을 받아서는 안되는 것이 중요하다.

프로모터 강도가 본원에서 보고한 바와 같이 수행된 점 돌연변이를 갖는 hCMV-MIE 프로모터에서 영향받지 않는다는 것이 본 발명에서 발견되었다. 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편에서의 점 돌연변이를 갖는 플라스미드와 미돌연변이화된 대조군 플라스미드 사이에는 유의차가 검출되지 않았다.

본 발명은, 프로모터의 침묵화가 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서의 특정 CpG 부위에서의 C - G 점 돌연변이에 의해 감소될 수 있다는 발견을 적어도 일부 기반으로 한다. 그에 따라서 세포주의 장기간 생성 안정성은 개선될 수 있으며 재조합체 폴리펩티드는 높은/더 높은 수율에서 장기간에 걸쳐 생성될 수 있다.

예시적 CHO 세포를 플라스미드 16107 (C-179 - G 점 돌연변이를 가짐) 또는 플라스미드 16109 (C-41 - G 점 돌연변이를 가짐) 로 안정적으로 트랜스펙션하고 배양하였다. 플라스미드 당 8-10 개의 독립적인 안정적으로 트랜스펙션된 세포 풀 (pool) 의 eGFP 세기를 확장된 배양 시간에 걸쳐 측정하였다.

트랜스펙션된 세포의 장기간 생산성에 있어서의 통계학적 유의차가 플라스미드 16109 또는 대조군 플라스미드 16111 로 트랜스펙션된 세포 사이에서 검출되었다 (p-값 < 0.05; 하기 표 참조).

전사 시작 부위에 대한 위치 -41 에서 C - G 점 돌연변이가 도입되는 경우 (즉, 메틸화 부위가 제거됨), 리포터 유전자 발현의 안정성에 대한 긍정적 효과가 달성될 수 있다는 것이 발견된다.

표: 최소 유의차 (LSD) 에 대한 플라스미드 16107, 16109 또는 16111 로 트랜스펙션된 CHO 세포 풀의 형광 기하 평균의 p-값

따라서, 본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 SEQ ID NO: 02 의 핵산 서열을 갖는 프로모터, 즉 C-41 - G 점 돌연변이를 갖는 hCMV-MIE 프로모터이다. 한 구현예에서 프로모터는 하나 이상의 C - G 점 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 프로모터는 2 개의 C - G 점 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 프로모터는 3 개의 C - G 점 돌연변이를 갖는다. 한 바람직한 구현예에서 프로모터는 단일한 C - G 점 돌연변이를 갖는다. 한 바람직한 구현예에서 프로모터는 전사 시작 부위에 대한 위치 -41 에서 단일한 C - G 점 돌연변이를 갖는다. 한 바람직한 구현예에서 프로모터는 전사 시작 부위에 대한 위치 -179 에서 단일한 C - G 점 돌연변이를 갖는다.

본원에 보고한 바와 같은 또 다른 양태는, SEQ ID NO: 02 의 핵산으로 이루어지며, 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 을 인코딩하는 SEQ ID NO: 04 의 핵산에 작동가능하게 연결되는 경우 SEQ ID NO: 01 의 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터의 80% 이상의 프로모터 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 하기 단계:

a) 폴리펩티드를 인코딩하는 제 2 핵산에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO: 02 의 제 1 핵산 (즉, C-41 - G 점 돌연변이를 갖는 hCMV-MIE 프로모터) 을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산으로 진핵세포를 트랜스펙션하는 단계,

b) 단계 a) 에서 트랜스펙션된 세포를 선별하는 단계,

d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계

이러한 양태의 한 구현예에서 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 변이체 또는 이의 단편 또는 이의 융합물이다. 완전한 면역글로불린 분자가 생성될 것이라면, 각각의 다른 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 핵산을 갖는 추가의 발현 카세트를 포함하는 것이 필요함이 이해된다. 예를 들어, 폴리펩티드가 면역글로불린 경쇄인 경우, 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 핵산을 갖는 추가의 발현 카세트가 도입된다. 이러한 양태의 한 구현예에서 핵산은 면역글로불린 경쇄 또는 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 추가의 발현 카세트를 포함한다.

이러한 양태의 한 구현예에서 핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가의 발현 카세트를 포함한다. 이러한 양태의 한 구현예에서 상기 선별 마커는 디히드로폴레이트 리덕타아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 또는 히그로마이신-포스포트랜스퍼라아제이다. 본원에 보고한 바와 같은 또 다른 양태는 폴리펩티드의 생성을 위한 SEQ ID NO: 02 의 프로모터의 용도이다.

이러한 양태의 한 구현예에서 상기 진핵세포는 포유류 세포이다. 이러한 양태의 한 구현예에서 상기 포유류 세포는 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, Sp2/0 세포 또는 Per.C6® 세포이다. 이러한 양태의 한 구현예에서 상기 포유류 세포는 CHO 세포 또는 HEK 세포이다.

추가적으로, 세포주 16107 및 16111 을 직접적으로 비교하였다. 대조군 세포주 16111 에 비하여, 더 높은 eGFP 발현에 대한 세포주 16107 의 경향은 전사 시작 부위에 대한 위치 C-179 에서 C - G 점 돌연변이의, eGFP 발현 유전자의 안정성에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다.

전사 시작 부위에 대한 위치 -41 은 SEQ ID NO: 01 의 위치 561 에 상응한다. 전사 시작 부위에 대한 위치 -179 는 SEQ ID NO: 01 의 위치 423 에 상응한다.

따라서, 본원에서 보고한 바와 같은 한 양태는 SEQ ID NO: 03 의 핵산 서열을 갖는 프로모터, 즉 C-179 - G 점 돌연변이를 갖는 hCMV-MIE 프로모터이다.

본원에서 보고한 바와 같은 또 다른 양태는, SEQ ID NO: 03 의 핵산으로 이루어지며, 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 을 인코딩하는 SEQ ID NO: 04 의 핵산에 작동가능하게 연결되는 경우 SEQ ID NO: 01 의 인간 CMV-주요 즉시-초기 프로모터의 80% 이상의 프로모터 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

본원에서 보고한 바와 같은 또 다른 양태는 하기 단계:

b) 단계 a) 에서 트랜스펙션된 세포를 선별하는 단계,

d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계

이러한 양태의 한 구현예에서 핵산은 선별 마커를 인코딩하는 추가의 발현 카세트를 포함한다.

본원에서 보고한 바와 같은 또 다른 양태는 폴리펩티드의 생성을 위한 SEQ ID NO: 03 의 프로모터의 용도이다.

정의

"프로모터" 는 핵산, 즉 그에 작동가능하게 연결되는 핵산의 전사를 제어하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 프로모터는 RNA 중합효소 결합 및 전사 개시에 대한 신호를 포함할 수 있다. 사용한 프로모터(들) 는 작동가능하게 연결된 핵산의 발현이 고려되는 숙주 세포의 세포 유형에서 기능할 수 있을 것이다. 다양한 상이한 공급원으로부터의 구성적, 유도성 및 억제성 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터는 당업계에 널리 공지되어 있다 (그리고 GenBank 와 같은 데이터베이스에서 확인된다). 이들은 클로닝된 폴리뉴클레오티드로서 또는 그 내에서 이용가능하다 (예를 들어 저장소 예컨대 ATCC 뿐 아니라 기타 상업적 또는 개인적 공급원으로부터). "프로모터" 는 예를 들어 작동가능하게 연결된 구조 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 통상, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 부위에 근접하여, 유전자의 5'-비코딩 또는 5'-비번역 부위 (5' UTR) 에 위치한다. 전사 개시에서 기능하는 프로모터 내의 서열 요소는 종종 컨센서스 (consensus) 뉴클레오티드 서열에 의해 특징지어진다. 이러한 서열 요소는 RNA 중합효소 결합 부위, TATA 서열, CAAT 서열, 분화-특이적 요소 (DSE; McGehee, R.E., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551), 시클릭 AMP 반응 요소 (CRE), 혈청 반응 요소 (SRE; Treisman, R., Seminars in Cancer Biol. 1 (1990) 47), 글루코코르티코이드 반응 요소 (GRE), 및 CRE/ATF 와 같은 기타 전사 인자에 대한 결합 부위 (O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938), AP2 (Ye, J., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728), SP1, cAMP 반응요소 결합 단백질 (CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-264) 및 옥타머 인자 (일반적으로, Watson et al., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987, 및 Lemaigre, F.P. and Rousseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14 참조) 를 포함한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다. 반대로, 프로모터가 구성적 프로모터인 경우 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다. 억제성 프로모터가 또한 공지되어있다. 예를 들어, c-fos 프로모터는 성장 호르몬이 세포 표면 상의 그의 수용체에 결합시 특히 활성화된다. 테트라사이클린 (tet) 조절된 발현은 예를 들어 CMV 프로모터, 그 이후 2 개의 Tet-오퍼레이터 부위로 이루어지는 인공적 하이브리드 프로모터에 의해 달성될 수 있다. Tet-리프레서는 2 개의 Tet-오퍼레이터 부위에 결합하며 전사를 차단한다. 유도제 테트라사이클린의 첨가시, Tet-리프레서는 Tet-오퍼레이터 부위로부터 배출되고 전사가 진행된다 (Gossen, M. and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5547-5551). 메탈로티오네인 및 열 충격 프로모터를 포함하는 기타 유도성 프로모터에 대해서는, 예를 들어 [Sambrook, et al. (상기)] 및 [Gossen, M., et al., Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520] 을 참조한다. 고수준 발현을 위한 강력한 프로모터로서 확인된 진핵생물 프로모터 중에서는, SV40 초기 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복물, 중국 햄스터 연장 인자 1 알파 (CHEF-1, 예를 들어 US 5,888,809 참조), 인간 EF-1 알파, 유비퀴틴 및 인간 거대세포바이러스 주요 즉시-초기 프로모터 (CMV-MIE) 가 있다. "인핸서" (즉, 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 시스-작용 DNA 요소) 는 프로모터 단독으로 수득한 발현 수준을 증가시키기 위해 프로모터와 함께 기능하는 것이 필요할 수 있으며, 전사 조절 요소로서 포함될 수 있다. 종종, 프로모터를 함유하는 폴리뉴클레오티드 부분은 인핸서 서열 또한 포함할 것이다 (예를 들어, CMV 또는 SV40).

용어 "CpG-부위" 는 세포의 메틸화 효소에 의해 인지될 수 있는 핵산 내의 디뉴클레오티드 CG 를 나타내며, 여기서 시토신은 5-메틸 시토신으로 변환될 수 있다. 한 구현예에서 CpG-부위는 프로모터 핵산 내에 있다.

본원에서 사용한 바와 같은 용어 "핵산" 은 개별 뉴클레오티드로 이루어지는 중합체, 즉 폴리뉴클레오티드이다. 이는 자연 발생적, 또는 부분 또는 전체 비-자연 발생적 핵산 (예를 들어 재조합적으로 생성될 수 있는 폴리펩티드를 인코딩함) 을 나타낸다. 핵산은 화학적 수단에 의해 단리되거나 합성되는 DNA-단편의 증강물 (build up) 일 수 있다. 핵산은 예를 들어 숙주 세포의 게놈/염색체 또는 발현 플라스미드에서 또 다른 핵산에 통합될 수 있다. 플라스미드는 셔틀 (shuttle) 및 발현 벡터를 포함한다. 통상, 플라스미드는 또한 박테리아 내에서 벡터의, 각각 복제 및 선별을 위한 복제 기원 (예를 들어 복제의 ColE1 기원) 및 선별 마커 (예를 들어 암피실린 또는 테트라사이클린 저항성 유전자) 를 포함하는 원핵생물 증식 단위를 포함할 것이다.

본 발명 내에서 사용하는 바와 같은 용어 "프로모터 강도" 및 이의 문법적 동의어는 작동가능하게 연결된 핵산의 전사에서의 프로모터의 효과를 나타낸다. 프로모터의 프로모터 강도는 SEQ ID NO: 01 의 야생형 hCMV-MIE 프로모터의 프로모터 강도와 비교하는 경우, 높은, 즉 75% 내지 100% 초과의 것일 수 있거나, 중간, 즉 40% 내지 75% 미만의 것일 수 있거나, 낮은, 즉 40% 미만까지의 것일 수 있다. 이러한 값은 동일한 세포 유형에서 야생형 SV40 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 폴리펩티드의 발현량에 대하여, 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 폴리펩티드의 발현량을 비교함으로써 측정될 수 있다. 이는 예를 들어 ELISA-검정에 의해, 이종 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 논의의 프로모터로 이루어지는 발현 카세트로 트랜스펙션된 CHO- 또는 HEK-세포에서의 이종 폴리펩티드의 발현량을 측정함으로써 수행될 수 있다. 이러한 양을 동일한 ELISA-검정으로 측정된 이종 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 야생형 SV40 프로모터로 이루어지는 발현 카세트로 트랜스펙션된 동일한 세포주에서의 동일한 이종 폴리펩티드의 발현량과 비교함으로써, 즉 프로모터만이 바뀌는 동일한 발현 플라스미드를 갖는 동일한 세포에서의 이종 폴리펩티드의 양을 비교함으로써, 상대적 프로모터 강도를 측정할 수 있다.

"작동가능하게 연결된" 은 이와 같이 기재된 성분이 그의 의도된 방식으로 기능하게끔 하는 관계에 있는, 둘 이상의 성분의 병렬 배치를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서는, 이것이 연결된 코딩 서열의 전사를 제어하거나 조절하도록 시스 (cis) 로 작용하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적이지만 반드시 그런 것은 아니게, "작동가능하게 연결된" DNA 서열은 인접하며, 분비 리더/신호 서열 및 폴리펩티드와 같은 2 개의 단백질 인코딩 부위에 연결될 필요가 있는 경우, 인접하고 판독 프레임 내에 있다. 그러나, 작동가능하게 연결된 프로모터가 일반적으로 코딩 서열의 업스트림에 위치하지만, 이에 반드시 인접할 필요는 없다. 인핸서는 인접할 필요가 없다. 인핸서가 코딩 서열의 전사를 증가시키는 경우, 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 인핸서는 코딩 서열의 업스트림, 코딩 서열 내에, 또는 코딩 서열의 다운스트림에, 프로모터로부터 상당한 거리로 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 부위는, 전사가 코딩 서열을 통해 폴리아데닐화 서열로 진행되는 방식으로 코딩 서열의 다운스트림 말단에 위치하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 연결은 당업계에 공지된 재조합 방법, 예를 들어 PCR 방법론을 사용하고/하거나 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 이루어진다. 편리한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 종래의 실행에 따라 사용한다.

본 발명의 범주 내에서, 트랜스펙션된 세포는 당업계에 공지된 임의 종류의 트랜스펙션 방법으로 실질적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 전기천공 또는 미세주입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 리포펙틴 시약 예컨대 FuGENE 6 (Roche Diagnostics GmbH, Germany), X-tremeGENE (Roche Diagnostics GmbH, Germany) 및 LipofectAmine (Invitrogen Corp., USA) 을 사용할 수 있다. 또한 대안적으로, 핵산은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 기반의 적절한 바이러스 벡터 시스템에 의해 세포 내로 도입될 수 있다 (Singer, O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 5313-5314).

용어 "세포" 또는 "숙주 세포" 는 이에 예를 들어 이종 폴리펩티드를 인코딩하거나 shRNA 를 구성하는 핵산이 도입 / 트랜스펙션될 수 있거나 도입 / 트랜스펙션되는 세포를 나타낸다. 숙주 세포는 벡터/플라스미드의 증식에 사용되는 원핵세포, 및 핵산의 발현에 사용되는 진핵세포 모두를 포함한다. 한 구현예에서 진핵세포는 포유류 세포이다. 또 다른 구현예에서 포유류 숙주 세포는 CHO 세포 (예를 들어 CHO K1 또는 CHO DG44), BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK 293 세포, HEK 293 EBNA 세포, PER.C6 세포 및 COS 세포를 포함하는 포유류 세포에서 선택된다. 추가 구현예에서 포유류 세포는 하이브리도마, 골수종 및 설치류 세포를 포함하는 군에서 선택된다. 골수종 세포는 랫트 골수종 세포 (예를 들어 YB2) 및 마우스 골수종 세포 (예를 들어 NS0, SP2/0) 를 포함한다. 한 구현예에서, 약학적 적용물에 사용하기 위한 폴리펩티드는 CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, Per.C6® 세포 등과 같은 포유류 세포에서 생성된다. 숙주 세포의 발효 및 그에 따른 관심 폴리펩티드의 발현을 위해 배양 배지를 사용한다. 오늘날 CHO 세포는 실험실에서의 소규모로, 또는 생산 공정에서의 대규모로, 약학적 폴리펩티드의 발현에 광범위하게 사용되고 있다. 그의 광범위한 분포 및 사용으로 인해, CHO 세포의 특이적 특성 및 유전적 배경은 널리 공지되어 있다. 따라서, CHO 세포는 인간에 대한 적용을 위한 치료 단백질의 생성에 대해 규제 기관에 의해 승인받았다. 한 구현예에서 포유류 세포는 CHO 세포이다.

"발현 카세트" 는 숙주 세포에서 적어도 함유된 구조 유전자의 발현 및 분비에 필요한 요소를 함유하는 핵산을 나타낸다. 마찬가지로, 핵산은 개별 뉴클레오티드로 이루어지는 이의 서열 또는 핵산 분자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 특징으로 한다.

"유전자" 는 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 발현에 영향을 줄 수 있는 플라스미드 또는 염색체 상의 부분인 핵산을 나타낸다. 코딩 부위, 즉 구조 유전자 외에, 유전자는 다른 기능적 요소, 예를 들어 신호 서열, 프로모터(들), 인트론 및/또는 터미네이터를 포함한다.

"구조 유전자" 는 신호 서열이 없는 부위, 즉 코딩 부위를 나타낸다.

본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "발현" 은 세포 내에서 발생하는 전사 및/또는 번역을 지칭한다. 숙주 세포에서 원하는 생성물의 전사 수준은 세포에 존재하는 상응하는 mRNA 의 양을 기초로 하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 분비된 핵산으로부터 전사된 mRNA 는 PCR 또는 노던 (Northern) 하이브리드화에 의해 정량될 수 있다 (Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 참조). 선별된 핵산에 의해 인코딩된 단백질은 다양한 방법, 예를 들어 ELISA, 단백질의 생물학적 활성에 대한 검정, 또는 이러한 활성에 독립적인 검정 이용 (예컨대 웨스턴 (Western) 블롯팅 또는 방사면역측정법), 단백질을 인지하고 결합하는 항체 사용에 의해 정량될 수 있다 (상기 Sambrook, et al., 1989 참조).

"폴리펩티드" 는 자연적으로 또는 합성적으로 생성되었는지 여부에 따라, 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 중합체이다. 약 20 개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩티드는 "펩티드" 로 지칭될 수 있다. 2 개 이상의 아미노산 사슬을 포함하거나 100 개 이상의 아미노산 길이의 아미노산 사슬을 포함하는 폴리펩티드는 "단백질" 로 지칭될 수 있다. 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 비-펩티드성 성분, 예컨대 탄수화물 기 또는 금속 이온을 포함할 수 있다. 단백질이 생성되는 세포에 의해, 탄수화물 및 기타 비-펩티드성 치환기가 단백질에 첨가될 수 있으며, 세포 유형에 따라 가변적일 수 있다. 단백질 및 폴리펩티드가 그의 아미노산 백본 구조 면에서 본원에서 정의되고; 탄수화물 기와 같은 부가는 일반적으로 명시되지 않지만, 존재할 수 있다. 한 구현예에서 폴리펩티드는 면역글로불린, 또는 면역글로불린-단편, 또는 면역글로불린-접합체이다. 한 구현예에서 폴리펩티드는 면역글로불린 중쇄 또는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편, 융합물 또는 접합체이다.

용어 "선별 마커" 는 상응하는 "선별제" 의 존재 하에 특이적으로 그에 대해 또는 그에 대항하여 선택되는 핵산을 세포가 운반하게끔 하는 핵산을 나타낸다. 유용한 양성 선별 마커는 예를 들어 항생체 저항성 유전자이다. 선별 마커는 그로 형질전환되는 세포가 상응하는 선택제의 존재 하에 그에 대해 선택되게끔 하고; 비-형질전환된 세포는 선별적 배양 조건 하, 즉 선별제의 존재 하에 성장하거나 생존할 수 없다. 선별 마커는 양성, 음성 또는 이작용성일 수 있다. 양성 선별 마커는 마커를 운반하는 세포를 선별하는 한편, 음성 선별 마커는 마커를 운반하는 세포가 선별적으로 제거되게 한다. 통상, 선별 마커는 약물에 대한 저항성을 부여하거나 세포에서의 대사 또는 이화 결함을 보충할 것이다. 진핵세포에 유용한 선별 마커는 예를 들어, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 (APH), 예컨대 히그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (HYG), 네오마이신 및 G418 APH, 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR), 티미딘 키나아제 (TK), 글루타민 신테타아제 (GS), 아스파라긴 신테타아제, 트립토판 신테타아제 (선별제 인돌), 히스티디놀 데히드로게나아제 (선별제 히스티디놀 D) 에 대한 유전자, 및 푸로마이신, 블레오마이신, 플레오마이신, 클로람페니콜, 제오신 및 미코페놀산에 대한 저항성을 제공하는 유전자를 포함한다. 추가의 선별 마커가 WO 92/08796 및 WO 94/28143 에서 보고되어 있다.

용어 "상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하" 는 이종 폴리펩티드를 발현하는 포유류 세포의 배양에 사용되며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 조건을 나타낸다. 이러한 조건이 배양한 포유류 세포의 유형 및 발현된 단백질의 유형에 따라 가변적일 수 있다는 것이 당업자에게 또한 알려져 있다. 일반적으로 포유류 세포는 예를 들어 20℃ 내지 40℃ 의 온도에서, 효과적으로 단백질이 생성되게 하기에 충분한 시간, 예를 들어 4 내지 28 일 동안, 0.1 리터 내지 10⁷ 리터의 부피로 배양된다.

본 출원 내에서 사용하는 바와 같은 용어 "폴리펩티드의 회수" 는 침전, 염석, 한외여과, 정용여과, 동결건조, 농축 용액을 수득하기 위한 용매 부피 감소, 또는 크로마토그래피를 나타낸다. 일반적으로 크로마토그래피 공정을 폴리펩티드의 분리 및 정제에 사용한다. 상이한 방법이 잘 확립되어 있으며 단백질 회수 및 정제에 광범위하게 사용된다 {예컨대 미생물 단백질로의 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환), 황친화성 흡착 (예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 (arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동)} (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).

용어 "면역글로불린" 은 2 개 이상의 소위 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함하는 분자를 나타낸다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 항원과 상호작용할 수 있는 결합부를 포함하는 가변 도메인 (가변부) (일반적으로 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 또한 불변부 (일반적으로 카르복시-말단 부분) 를 포함한다. 중쇄의 불변부는 면역글로불린의, i) Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 갖는 세포, 예컨대 식세포, 또는 ii) 브람벨 (Brambell) 수용체로도 알려져 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 갖는 세포에 대한 결합을 매개한다. 이는 또한 고전적 보체 시스템의 인자 예컨대 성분 (C1q) 를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다.

본원의 용어 "면역글로불린" 은 폭넓은 의미로 사용되며 단일클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 면역글로불린 단편을, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 것인 한 비제한적으로 포함하는, 다양한 면역글로불린 구조를 포함한다.

중쇄의 불변부의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 다음과 같은 상이한 클래스로 나뉜다: IgA 클래스, IgD 클래스, IgE 클래스, IgG 클래스 및 IgM 클래스. 이러한 클래스 중 일부는 서브클래스 (동종), 즉 IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 로, 또는 IgA 는 IgA1 및 IgA2 로 더 나뉜다. 면역글로불린이 속하는 클래스에 따라, 중쇄 불변부는 각각 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 및 μ(IgM) 로 지칭된다. 한 구현예에서 면역글로불린은 IgG 클래스의 면역글로불린이다. 또 다른 구현예에서 면역글로불린은 인간 불변부 또는 인간 기원에서 유래한 불변부를 갖는다. 추가 구현예에서 면역글로불린은 Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRIIIa) 결합 및/또는 C1q 결합이 검출될 수 없는 방식으로 변형되는 IgG4 서브클래스 또는 IgG1, IgG2 또는 IgG3 서브클래스의 것이다. 한 구현예에서 면역글로불린은 인간 IgG4 서브클래스 또는 돌연변이화된 인간 IgG1 서브클래스의 것이다. 한 구현예에서 면역글로불린은 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 IgG1 서브클래스의 것이다. 또 다른 구현예에서 면역글로불린은 L234, L235, 및/또는 D265 에서의 돌연변이를 갖는, 및/또는 PVA236 돌연변이를 함유하는, IgG4 서브클래스, 또는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의 Fcγ 수용체 결합에 관한 것이다. 추가 구현예에서 면역글로불린은 S228P, L234A, L235A, L235E, SPLE (S228P 및 L235E), 및/또는 PVA236 (PVA236 은, IgG1 의 아미노산 위치 233 ~ 236 으로부터의 아미노산 서열 ELLG (1 글자 아미노산 코드로 주어짐) 또는 IgG4 의 EFLG 이 PVA 에 의해 대체되는 것을 의미함) 에서 선택되는 돌연변이를 갖는다. 한 구현예에서 면역글로불린은 IgG4 서브클래스의 것이고 IgG4 의 돌연변이 S228P 를 갖거나, 면역글로불린은 IgG1 서브클래스의 것이고 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는다.

면역글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 부분, 즉 4 개의 골격부 (FR) 및 3 개의 과가변부 (CDR) 를 포함한다.

"면역글로불린 단편" 은 면역글로불린 중쇄의 가변 도메인, C_H1 도메인, 힌지-부위, C_H2 도메인, C_H3 도메인, C_H4 도메인, 또는 면역글로불린 경쇄의 가변 도메인 또는 C_L 도메인을 포함하는 도메인의 군 중 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 이의 유도체 및 변이체가 포함된다. 추가적으로, 하나 이상의 아미노산 또는 아미노산 부위가 결실되는 가변 도메인이 존재할 수 있다.

"면역글로불린 접합체" 는 펩티드 결합을 통해 추가의 폴리펩티드에 접합된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 추가의 폴리펩티드는 비-면역글로불린 펩티드, 예컨대 호르몬, 성장 수용체, 핵융합형성 (antifusogenic) 펩티드 등이다.

하기 실시예, 도면 및 서열 목록은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되며, 이의 참된 범주는 첨부된 특허청구범위에서 설명된다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않고, 나타낸 절차에 변형을 가할 수 있다는 것이 이해된다.

서열 목록의 설명

SEQ ID NO: 01; 인간 CMV 주요 즉시-초기 (hCMV-MIE) 프로모터/인핸서의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 02; 전사 시작 부위에 대한 위치 -41 에서의 C - G 점 돌연변이를 갖는 hCMV-MIE 프로모터/인핸서의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 03; 전사 시작 부위에 대한 위치 -179 에서의 C - G 점 돌연변이를 갖는 hCMV-MIE 프로모터/인핸서의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 04; 불안정화 PEST 서열을 포함하는 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO: 05; 신호 펩티드를 포함하는 분비된 알칼리성 포스파타아제 (SEAP) 의 뉴클레오티드 서열.

SEQ ID NO: 06; 전사 시작 부위에 대한 위치 -41 및 -179 에서의 C - G 점 돌연변이를 갖는 hCMV-MIE 프로모터/인핸서의 뉴클레오티드 서열

도 1: 분비된 알칼리성 포스파타아제 (SEAP) 발현 플라스미드 p5532 의 플라스미드 맵
도 2: 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 발현 플라스미드 p16111 의 플라스미드 맵
도 3: 세포 배양 상청액의 희석 절차
도 4: DAC 처리가 부재하거나 (대각선 빗금 컬럼) 또는 DAC 처리가 존재하는 (수평 빗금 컬럼), 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 현탁액의 정규화된 SEAP 발현 수준. 트랜스펙션에 사용한 플라스미드가 표시된다. 에러 바 (Error bar) 는 8 개 (DAC 무) 또는 4 개 (DAC 유) 의 생물학적 반복물의 표준 편차를 나타낸다. 모방체 트랜스펙션된 CHO-K1 세포 (2 개의 생물학적 반복물) 의 배경 신호를 또한 나타낸다.
도 5: 전방 산란 (FSC)/측방 산란 (SSC) 도트 플롯에서의 미-트랜스펙션된 CHO-K1 세포의 생 게이트 (living gate). 동일 게이트를 동일 FACS 검정의 모든 샘플에 적용하였다.
도 6: 안정적으로 트랜스펙션된 CHO 세포의 배양에 의한 eGFP 형광의 생 게이트 히스토그램. 형광을 Alexa Fluor 488 채널로 여기 파장 488 nm 에서 측정하였다. 2 개의 피크는 비-eGFP 발현제 (좌측 피크) 및 고-eGFP 발현제 (우측 피크) 의 2 개 주요 하위집단을 나타내는 것으로 구별될 수 있다.
도 7: 플라스미드 16107, 16109 또는 16111 을 사용한 안정적 트랜스펙션 6 주 후 CHO 세포의 독립적 풀 (pool) 의 eGFP 발현 수준. 도트는 개별적 CHO 풀의 형광 세기의 기하 평균을 나타낸다.
도 8: 플라스미드 16107 또는 16111 을 사용한 안정적 트랜스펙션 6 주 후 CHO 세포의 독립적 풀의 eGFP 발현 수준. 도트는 개별적 CHO 풀의 형광 세기의 기하 평균을 나타낸다.
도 9: IgG 클래스 항체 발현 플라스미드 p21504 의 플라스미드 맵
도 10: 플라스미드 16134 (CGG), 16135 (CGC) 또는 16136 (CCG) 또는 21504 (CCC) 를 사용한 트랜스펙션 68 일 후 (A) 또는 트랜스펙션 134 일 후 (B) 의 안정적 트랜스펙션된 CHO 세포 풀의 항체 역가 (㎍/ml). 도트는 개별적 CHO 풀의 항체 역가의 기하 평균을 나타낸다.
도 11: 플라스미드 16134 (CGG), 16135 (CGC) 또는 16136 (CCG) 또는 21504 (CCC) 를 사용한 트랜스펙션 68 일 후 (A) 또는 트랜스펙션 131 일 후 (B), 안정적 트랜스펙션된 CHO 세포 풀의 특이적 생산성 (qP). 도트는 개별적 CHO 풀의 특이적 생산성의 기하 평균을 나타낸다.
도 12: 대조군에 대한 돌연변이체의 터키 (Tukey) HSD 시험으로의 평균 비교 (△qP 평균)

실시예 1

일반적 기법

재조합 DNA 기법

표준 방법을 사용하여 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)] 에 기재된 바와 같이 DNA 를 조작하였다. 제조사의 지시사항에 따라 분자 생물 시약을 사용하였다.

DNA 서열 결정

SequiServe GmbH (Vaterstetten, Germany) 에서 DNA 서열분석을 수행하였다.

DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리

EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite) 소프트웨어 패키지 및 Invitrogen 의 Vector NTI version 9.1 을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 및 설명에 사용하였다.

항체 분석을 위한 샘플 준비:

세포 농도를 계산하고 샘플 당 2 ml 를 원심분리하였다 (500 g, 20-30℃ 에서 5 분). 상청액을 새 96 딥 웰 플레이트에 옮기고 사용할 때까지 -20℃ 에서 보관하였다. 동결된 상청액을 4℃ 에서 밤새 해동하고, 6 x 인버팅 (inverting) 하고 원심분리하였다 (4000 rpm, 20-30℃ 에서 30 분). 310 ㎕ 을 원심분리 (1200 rpm, 20-30℃ 에서 3 분) 에 의해, 맨 위에 바코드처리된 96 라운드웰 플레이트인 멀티스크린 Millipore 플레이트로 여과하였다.

실시예 2

재조합 CHO 세포주의 생성

CHO-K1 현탁액 세포를, 야생형 (SEQ ID NO:01) 이거나 C - G 점 돌연변이를 포함하는 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 제어 하, 클래스 IgG 의 인간 항체 구축물 (WO 2014023752 에서 보고한 바와 같은 IgG 사이토카인 (IL2) 융합 단백질; 도 9), 또는 분비된 알칼리성 포스파타아제 (SEAP: 도 1; SEQ ID NO: 05) 또는 강화된 녹색 형광 단백질 (eGFP: 도 2) 중 어느 하나인 리포터 유전자를 운반하는 벡터로 일시적 또는 안정적으로 트랜스펙션하였다. hCMV-MIE 단편 내 CpG 디뉴클레오티드의 C - G 돌연변이 C-508, C-179 및 C-41 을 단독으로 또는 다양한 조합으로 삽입하여 장기간 안정성을 증가시켰다 (표 1). C - G 돌연변이는 전사 시작 부위 (TSS) 에 대한 그의 거리에 의해 확인된다. 돌연변이를 QuikChange Multi-Site-Directed Mutagnesis Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) 를 사용하여 삽입하였다. 벡터는 쥐과 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하였다 (도 1, 2 및 9). 세포의 트랜스펙션을 Amaxa nucleofection system (Lonza Cologne GmbH, Cologne, Germany) 에 의해 수행하였다.

표 1 : 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편 내 CpG 디뉴클레오티드의 C - G 점 돌연변이의 조합

f

예를 들어, CHO-K1 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 Nucleofector Kit V (Lonza Cologne GmbH, Cologne, Germany) 와 조합으로 Nucleofector 장치를 사용하여, SEAP 의 일시적 발현을 위해 원형 플라스미드 DNA 로, 또는 eGFP 의 안정적 발현을 위해 선형화 플라스미드 DNA 로, 또는 IgG 클래스 항체 융합 단백질의 안정적 발현을 위해 적절한 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 일시적으로 트랜스펙션된 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 시딩하고 5 일 동안 인큐베이션하였다. SEAP 농도를, 화학 반응의 색 변화에 의해 Tecan-Reader SECTRAFluor Plus (Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany) 로 검사하였다.

안정적으로 트랜스펙션된 세포 현탁액을, 선별제로서 250 내지 1600 nM 메토트렉세이트 (MTX) 와 함께 티미딘-불포함 배지를 함유하는 384 또는 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 3 내지 4 주 후, eGFP-발현 세포 풀 또는 항체-발현 세포 풀을 1~3 개월의 기간에 걸친 장기간 안정성에 대해 검사하였다. eGFP 발현 세기를 유세포 분석에 의해 검사하였다. 항체 발현 단일 세포 클론을 384 및 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 3 주 후, 항체-발현 세포주를 ELISA 에 의해 배양 배지 중 항체 역가를 측정함으로써 확인하였다. 성장하는 세포를 무작위하게 고르고 장기간 안정성 검정을 위해 세포 클론을 더 큰 부피로 확장시키고 (6 개 웰 플레이트에서 웰 당 3 ml), 항체 농도를 각 계대 말미에 단백질 A HPLC 및 ELISA 에 의해 측정하였다.

세포를 120 rpm/분 내지 150 rpm/분의 일정한 교반 속도로 표준 가습 조건 (95% rH, 37℃ 및 5% 내지 8% CO₂) 하에 일회용 125 ml 배기 진탕 플라스크에서 증식시켰다. 3-4 일마다 세포를 새 배지에 분할시켰다. 배양물의 밀도 및 생존성을 Cedex HiRes 세포 계수기 (Roche Innovates AG, Bielefeld, Germany) 를 사용하여 측정하였다. 또한, 예를 들어 [Current Protocols in Cell Biology, Binifacino, J.S. et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York (2000)] 에서 기재한 바와 같이 표준 세포 배양 기법을 적용하였다.

실시예 3

장기간 배양 및 생산

실시예 2 에 따라 수득한 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편 내 CpG 점 돌연변이 (표 1) 를 포함하는 다양한 CHO 세포 풀을 장기간 생산성에 대해 조사하였다.

선별제 MTX 의 존재 하 트랜스펙션 후 2 내지 3 개월 동안 생산 안정성에 대해 세포를 시험하였다. 세포를 선별제와 함께 20-40 ml 배지를 함유하는 배기 125 ml 진탕 플라스크에서 계속하여 배양하고, 1 주에 2 회 새 배지로 희석하였다. 시딩 밀도는 2 내지 3 x 10⁵ 개 세포/ml 이었다. 계대 전에 생존가능 세포 밀도 및 생존성을 측정하였다.

상청액의 항체 농도 (항체 역가) 를 각 계대 말미에 단백질 A HPLC 및 ELISA 에 의해 측정하였다. 이러한 데이터로부터, 각 계대에 대한 세포 특이적 생산성 (qP) 을 하기 식을 사용하여 계산하였다:

qP [pg/세포/d]: 세포 특이적 생산성,

P₁ [㎍/ml]: 계대 시작시 항체 역가,

P₂ [㎍/ml]: 계대 말미의 항체 역가,

D₁ [세포/ml]: 계대 시작시 생존가능 세포 밀도,

D₂ [세포/ml]: 계대 말미의 생존가능 세포 밀도,

△t [d]: 계대의 지속 기간.

qP 값을 세대에서의 각 계대 말미에 배양물의 연령 (age) 에 대하여 플롯팅하였다. 하기 식에 따라, 모든 qP 데이터점에 대한 선형의 추세선을 계산하였고, 기간에 걸친 qP 의 상대적 변동 (%) 을 인 하우스 (in house) 계산하였다:

△qP [%]: qP 의 변동%,

m [pg/세포/d/세대]: 선형 추세선의 기울기,

a [세대 번호]: 배양물의 연령,

qP₀: 선형 추세선의 y-축 절편.

hCMV-MIE 프로모터 변이체의 안정성 검정에서 수득한 낮은 수의 데이터점에 관하여, 각 샘플에 대해 마지막 3 개 qP 값의 평균을 처음 2 개 Qp 값의 평균에 의해 나누고 % 로 표시하여 △qP 를 얻었다.

평균 qP EOS: 마지막 3 개 qP 값의 평균

평균 qP PSB: 처음 2 개 qP 값의 평균

실시예 4

상이한 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 제어 하 리포터 유전자 발현의 정량

a) 상이한 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 제어 하 SEAP 발현의 정량

제조사의 프로토콜에 따라, Amaxa Shuttle 96 웰 플레이트에서 Nucleofector Kit V (Lonza Cologne GmbH, Cologne, Germany) 와 조합으로 Nucleofector 장치를 사용하여, CHO-K1 세포를 SEAP 의 일시적 발현을 위해 원형 플라스미드 DNA 로 트랜스펙션하였다. 플라스미드 당 12 개의 일시적 트랜스펙션된 세포 현탁액을 96 웰 플레이트에 시딩하고 5 일 동안 인큐베이션하였다. 제 2 일에, 5'-아자-2'-데옥시시티딘 (DAC) 을 최종 농도 1 μM 로 플라스미드 당 4 개 반복물에 첨가하여 DNA 를 탈메틸화하였다. SEAP 농도를 Tecan-Reader SECTRAFluor Plus (Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany) 에 의해 검사하였다.

SEAP 의 상대 농도를 하기 프로토콜에 따라 pNP (파라-니트로페놀) 에 대한 pNPP (파라-니트로페닐포스페이트) 의 대사 속도에 의해 검사하였다:

표 2: SEAP 검정용 용액:

150 ㎕ 의 원심분리한 세포 배양물 상청액을 다단계로 1:3 희석하였다 (도 3).

50 ㎕ 희석물을 새 96 웰 플레이트에 첨가하고 50 ㎕ 기질 용액과 조합하였다. 5 분 후, 405 nm 파장에서의 광학 밀도를 SECTRAFluor Plus photometer (Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany) 를 사용하여 측정하였다.

DAC 를 처리하지 않은 플라스미드 당 8 개 반복물의 평균 및 DAC 를 처리한 플라스미드 당 4 개 반복물의 평균 (표 1) 을 점 돌연변이를 갖지 않는 대조군 플라스미드 (p5532) 에 대해 정규화하였다 (도 4).

인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편에서 점 돌연변이를 갖는 플라스미드와 돌연변이되지 않은 대조군 플라스미드 5532 사이에는 유의차가 검출되지 않았다. 또한, DAC 를 처리한 샘플과 처리하지 않은 샘플 사이에 유의차가 관찰되지 않았으며, 이는 트랜스펙션 후 5 일 내에 유의한 프로모터 침묵화가 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 따라서, 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편 내로 도입된 점 돌연변이가 프로모터 강도에 영향을 주지 않는다는 것이 결론내려진다 (점 돌연변이는 인간 CMV 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 직접 효능에 대해 영향을 갖지 않음).

b) FACS 에 의한 상이한 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 제어 하 eGFP 발현의 정량

eGFP 를 발현하는 안정적으로 트랜스펙션된 세포 현탁액을 1-3 개월 기간에 걸쳐 배양하였다. eGFP 발현의 세기를 BD FACS Canto II 또는 BD FACS Calibur (BD, Heidelberg, Germany) 를 사용하여 측정하였다. BD FACS Diva 소프트웨어 v6.12 또는 Cell Quest Pro 소프트웨어 (BD, Heidelberg, Germany) 를 사용하여 데이터 수집을 수행하였다. 1 차 데이터 분석을 FlowJo 7.6.5 EN 소프트웨어 (TreeStar, Olten, Switzerland) 로 수행하였다.

예를 들어, CHO 세포 현탁액 16105, 16106, 16107, 16108, 16109, 16110 및 16111 을 BD FACS Calibur 를 사용하여 여러 시점에서 검사하여, eGFP 발현을 검출하였다. 모든 샘플을 3-4 개 생물학적 반복물로 검사하였다. 샘플 당 10000 개 이벤트가 측정되었다. 생 세포에 대한 게이트를 비트랜스펙션한 CHO-K1 세포를 사용하여 정의하고 동일한 FACS 실험의 모든 샘플에 적용하였다 (도 8).

생 세포의 eGFP 형광을 488 nm 의 여기 파장 (Alexa Fluor 488 채널) 및 대략 516 nm 의 방사 파장에서 측정하였다. 도 6 은 생 게이트 이벤트의 형광 세기의 히스토그램을 나타낸다.

FlowJo 7.6.5 EN 소프트웨어를 사용하여 형광 데이터를 분석하였다. 생 게이트 내 eGFP 발현의 기하 평균, 평균 및 중간값을 FlowJo 에서 계산하였다. JMP 소프트웨어 version 10 (SAS, Boeblingen, Germany) 을 사용하여 추가 통계적 분석을 수행하였다.

실시예 5

인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 C - G 점 돌연변이 및 eGFP 의 상관관계

안정적으로 트랜스펙션된 CHO 세포의 8 개 (플라스미드 16107) 또는 10 개 (플라스미드 16109 또는 16111) 풀을 생성시키고 실시예 2 에서 기재한 바와 같이 배양하였다. eGFP 세기를 실시예 4 에서 기재한 바와 같이 측정하였다.

eGFP 세기에 대한 기하 평균을 상관관계 연구에 사용하고 도표로 나타내었다 (도 7 & 8). 대조군 플라스미드 16111 과 비교하여 플라스미드 16107 및 16109 사이의 유의차를 측정하기 위해 던넷 (Dunnett) 시험을 사용하였다.

eGFP 세기의 기하 평균의 P-값을, 장기간 배양 동안 상이한 시점에 대해 계산하였다 (표 3). 유의차에 대한 제한을 p < 0.005 로 설정하였다.

표 3: 플라스미드 16107, 16109 또는 16111 로 트랜스펙션된 CHO 풀의 기하 평균의 p-값

예를 들어, 플라스미드 16109 및 대조군 플라스미드 16111 사이의 유의차는 트랜스펙션 후 6 주 내지 8 주에 검출되었다 (샘플링 일자 03-14 내지 03-25) (표 3 참조). SEAP 검정의 결과와 조합된 장기간 안정성 검정의 결과는, 프로모터 강도에 영향없는 리포터 유전자 발현의 안정성에 대한 C - G 점 돌연변이 C-41 의 긍정적 효과를 나타낸다.

플라스미드 16107 및 16111 을 두 번째 계산에서 쌍으로 비교하였다. 형광 세기의 기하 평균을 플로팅하고 던넷 시험을 사용하여 p-값을 계산하였다 (표 4 참조).

표 4: CHO 세포주 16107 및 16111 의 기하 평균의 p-값

플라스미드 16107 은 대조군 플라스미드와 비교하여 증가한 생성 안정성을 나타내며, 즉 C - G 점 돌연변이 C-179 는 프로모터 강도에 영향을 주지 않고 리포터 유전자 발현의 안정성을 증가시킨다.

실시예 6

상이한 인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 제어 하 항체 생성의 정량

a) HPLC 를 사용한 항체 생성의 정량:

크로마토그래피 방법을 사용하여 샘플에 존재하는 항체의 양을 정량하였다. 항체의 Fc-부위에 결합하는 PorosA 컬럼을 사용하였다. 항체를 컬럼에 결합시키고 이후 저 pH 조건에 의해 용리한다. 아미노산 서열을 기반으로 하여 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여, 320 nm 의 참조 파장으로, 280 nm 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 단백질 농도를 확립하였다.

b) ELISA 를 사용한 항체 생성의 정량:

ELISA (효소 결합 면역흡착 검정) 기법은 항체 샌드위치 원리를 기반으로 한다. 관심 분석물에 특이적인 포획 항체, 예를 들어 IgG 의 Fc 부분을 마이크로타이터 플레이트 (Maxisorp, Inhouse, Roche) 에 결합시켜 고체상을 생성한다. 블로킹 및 세정 단계 이후, 샘플, 표준물 (참조 Ab 의 연속 희석물) 및 대조군을, 분석물을 포획하는 고체상 항체와 함께 인큐베이션한다. 미결합 분석물을 세정해낸 후, 접합된 검출 항체 (예를 들어 POD 접합된) 를 첨가한다. 이러한 검출 항체는 측정하는 분자의 상이한 에피토프에 결합하여, 샌드위치를 완성한다. BM 화학발광 ELISA 기질 POD (Roche, Penzberg, Germany) 는 퍼옥시다아제-기반 (POD, HRP) 2 차 검출 시스템의 기질 용액을 제공한다. 면역검정에서의 신호 발생률은 고체상에 결합한 마커 효소의 양에 정비례한다.

실시예 7

인간 CMV 주요 즉시-초기 프로모터/인핸서 단편의 C - G 점 돌연변이 및 항체 생성/역가의 상관관계

항체 (IgG-IL2 융합 단백질) 농도를 ELISA 기법을 사용하여 검사하고, 항체 역가 (ug/ml) 뿐 아니라 세포 및 일 당 특이적 생산성 (qP) 을 계산하였다. 배양 단계의 시작 및 종료의 측정을 나타내어, 대조군에 대한 돌연변이체의 차이 및 배양 동안 발현의 변동을 가시화하였다. 그로써 배양 단계의 시작 및 종료 역가는 대조군과 비교하여 모든 돌연변이체에서 항체 생성의 개선을 나타낸다 (도 10 A 및 B).

클론 세포주의 역가를 터키 (Tukey) HSD 시험으로 비교하였다 (표 5). 미돌연변이화된 프로모터 변이체에 대한 돌연변이체의 역가 차이의 P-값을 계산하였다. 배양 단계 동안 역가를 비교하였다. 유의성 수준을 0.05 (5%) 로 설정하였다.

표 5

예를 들어, CGC 돌연변이체는 트랜스펙션 후 제 127 일을 제외하고는 전체 배양 단계 동안 대조군과 상당히 상이하였다.

역가의 비교는, 모든 돌연변이화된 세포 현탁액이 대조군보다 더 높은 부피 당 항체 생산성을 가졌다는 것을 나타내었다.

발현 강도 또는 세포 농도가 역가 차이의 주요 작동인자인지 여부를 명확히 할 필요가 있었다.

이러한 목적으로, 돌연변이체 및 대조군의 세포 및 일 당 항체 발현 (qP) 을 전체 배양 단계 동안 비교하였다. 배양 단계의 시작 (도 11 A) 및 말미 (도 11 B) 로부터의 qP 값의 실행물은 대조군에 대해 덜 분명한 차이를 갖는 역가치와 비슷하였다.

더 높은 역가가 배양 시작시 CGC 및 CGG 돌연변이체에 대해 수득되었다. 배양 말미에 CCG 및 CGG 돌연변이체는 대조군보다 약간 더 높은 qP 를 획득하였다. CGC 돌연변이화된 세포는 배양 단계 말미에 더 높은 qP 값을 가졌다.

돌연변이화 및 미돌연변이화된 세포주의 특이적 생산성을 터키 HSD 시험으로 비교하였다 (표 6). 그로써 미돌연변이화된 대조군에 대한 CGC 돌연변이체의 차이는 시간 흐름에 따라 증가한다. 또한 CCG 돌연변이에 대해서도 qP 값의 증가가 획득되었다.

표 6 미돌연변이화된 대조군과 비교한, hCMV-MIE 프로모터 돌연변이체 qP 의 터키 HSD 시험 계산 P-값

유의성 수준을 0.05 (5%) 로 설정하였다.

미돌연변이화된 세포주와 비교하여 단일 돌연변이화된 세포주에 대한 qP 값 차이의 시간 의존적 증가를 고려하여, 더 높은 안정성이 제시되었다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 특이적 생산성의 상대적 변동을 계산하였다.

제 1 일에, 및 특이적 생산성의 분할 의존적 변이를 처음 2 개 (PSB = 제 68 & 83 일) 및 마지막 3 개 (EOS = 제 124, 127 & 131 일) qP 값을 평균화하여 안정화시켰다. 제 2 단계에서 qP 의 변동을, 안정화된 종료점 대 안정화된 시작점의 백분율 비로서 정의하였다.

평균 qP EOS: 마지막 3 개 qP 의 평균

평균 qP PSB: 처음 2 개 qP 의 평균

CGC 및 CCG 프로모터 돌연변이체를 포함하는 단일클론 세포주의 장기간 안정성은 미돌연변이화된 대조군에 비해 더 높았다 (도 12). G-41 프로모터 돌연변이체는 전체 배양 단계 동안 안정했던 한편, G-179 점 돌연변이는 시간 흐름에 따라 IgG 발현 증가를 초래한다 (평균 %△qP). 이중 돌연변이 CGG 는 시작시 높은 발현 값을 가졌으나 이는 시간 흐름에 따라 감소한다.

표 7

클론 세포주의 %△qP 를 0.05 (5%) 의 유의성 수준에서 비교하였다.

hCMV-MIE 프로모터 변이체 CGC (16135) 및 CCG (16136) 를 포함하는 단일클론 세포주는 미돌연변이화된 대조군 (21504) 보다 상당히 더 안정적이다.

<110> F. 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Sequence <220> <223> hCMV-MIE mutant <400> 2 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta gggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600 g 601 <210> 3 <211> 601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV-MIE mutant <400> 3 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg 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caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtcc 720 ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg acggtaccgc gggcccggga 780 tccaccggat ctagacatgg cttcccgccg gaggtggagg agcaggatga tggcacgctg 840 cccatgtctt gtgcccagga gagcgggatg gaccgt 876 <210> 5 <211> 1524 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccatc 60 atcccagttg aggaggagaa tccggacttc tggaaccgcg aggcagccga ggccctgggt 120 gccgccaaga agctgcagcc tgcacagaca gccgccaaga acctcatcat cttcctgggc 180 gatgggatgg gggtgtctac ggtgacagct gccaggatcc taaaagggca gaagaaggac 240 aaactggggc 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ggacacgctg agcctcgtca ctgccgacca ctcccacgtc 1140 ttctccttcg gaggctaccc cctgcgaggg agctccatct tcgggctggc ccctggcaag 1200 gcccgggaca ggaaggccta cacggtcctc ctatacggaa acggtccagg ctatgtgctc 1260 aaggacggcg cccggccgga tgttaccgag agcgagagcg ggagccccga gtatcggcag 1320 cagtcagcag tgcccctgga cgaagagacc cacgcaggcg aggacgtggc ggtgttcgcg 1380 cgcggcccgc aggcgcacct ggttcacggc gtgcaggagc agaccttcat agcgcacgtc 1440 atggccttcg ccgcctgcct ggagccctac accgcctgcg acctggcgcc ccccgccggc 1500 accaccgacg ccgcgcaccc gggt 1524 <210> 6 <211> 601 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCMV-MIE mutant <400> 6 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattagc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420 aggggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540 aaatgggcgg taggcgtgta gggtgggagg tctatataag cagagctccg tttagtgaac 600 g 601

Claims

전사 시작 부위에 대한 뉴클레오티드 위치 -41 및/또는 -179 에서 뉴클레오티드 G 를 갖는 인간 CMV 프로모터.
SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 03 의 핵산 서열을 갖는 프로모터.
SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 03 의 핵산으로 이루어지며, SEQ ID NO: 04 의 핵산에 작동가능하게 연결되는 경우 SEQ ID NO: 01 의 인간 CMV-주요 즉시-초기 프로모터의 80% 이상의 프로모터 강도를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산.
하기 단계를 포함하며:
a) 폴리펩티드를 인코딩하는 제 2 핵산에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 03 의 제 1 핵산을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산으로 진핵세포를 트랜스펙션시키는 단계,
b) 단계 a) 에서 트랜스펙션된 세포를 선별하는 단계,
c) 단계 b) 의 선별된 세포를 배양하는 단계,
d) 세포 또는 배양 배지로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계,
그로써 폴리펩티드를 생성하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드의 생성 방법.
제 4 항에 있어서, 생성이 500 L 내지 10,000 L 의 최종 배양 부피에서의 생성인 폴리펩티드의 생성 방법.
제 4 항에 있어서, 폴리펩티드가 면역글로불린 경쇄 또는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 변이체 또는 이의 단편 또는 이의 융합물인 폴리펩티드의 생성 방법.
제 4 항에 있어서, 핵산이 선별 마커를 인코딩하는 추가의 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 생성 방법.
제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 진핵세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 생성 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CHO 세포, BHK 세포, HEK 세포, Sp2/0 세포 또는 Per.C6® 세포인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 생성 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CHO 세포 또는 HEK 세포인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 생성 방법.
제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 면역글로불린, 또는 면역글로불린-단편, 또는 면역글로불린-접합체인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 생성 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 선별 마커가 디히드로폴레이트 리덕타아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제 또는 히그로마이신-포스포트랜스퍼라아제인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 생성 방법.
폴리펩티드의 생성을 위해 사용되는 것을 특징으로 하는, SEQ ID NO: 02 또는 SEQ ID NO: 03 의 프로모터.
제 1 항에 따른 프로모터 또는 제 3 항에 따른 핵산을 포함하는 세포.