JP2017515492A - ポリペプチドの産生の方法 - Google Patents
ポリペプチドの産生の方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017515492A JP2017515492A JP2016568645A JP2016568645A JP2017515492A JP 2017515492 A JP2017515492 A JP 2017515492A JP 2016568645 A JP2016568645 A JP 2016568645A JP 2016568645 A JP2016568645 A JP 2016568645A JP 2017515492 A JP2017515492 A JP 2017515492A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- cell
- nucleic acid
- seq
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 84
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 84
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 167
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 76
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 76
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 63
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 34
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 34
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 claims description 11
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 claims description 11
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 claims description 11
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 claims description 11
- 102000006646 aminoglycoside phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 9
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 50
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 abstract description 28
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 15
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 14
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 7
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 6
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108020004217 Aminoglycoside phosphotransferase Proteins 0.000 description 4
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 2
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 2
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 2
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- RSWGJHLUYNHPMX-UHFFFAOYSA-N 1,4a-dimethyl-7-propan-2-yl-2,3,4,4b,5,6,10,10a-octahydrophenanthrene-1-carboxylic acid Chemical compound C12CCC(C(C)C)=CC2=CCC2C1(C)CCCC2(C)C(O)=O RSWGJHLUYNHPMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- FICVQGAXQTVNNK-JHYUDYDFSA-N 4-amino-1-[(2r,4s,5s)-4-hydroxy-5-(hydroxyamino)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](NO)[C@@H](O)C1 FICVQGAXQTVNNK-JHYUDYDFSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070255 Aspartate-ammonia ligase Proteins 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 1
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108700025832 Serum Response Element Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- 108010075344 Tryptophan synthase Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000013523 data management Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N m-aminophenylboronic acid Chemical compound NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037323 metabolic rate Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 promoters Proteins 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
- C12N2710/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、転写開始部位に対する-41位および／または-179位にC→G点変異を有するヒトCMV主要前初期（hCMV-MIE）プロモーター／エンハンサーである、SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸配列を有するプロモーターを報告する。この新しいプロモーターは、低下したプロモーターサイレンシングおよび改善されたポリペプチド産生を示すため、ポリペプチドの大規模産生のために特に有用である。
Description
本発明はタンパク質発現の領域にある。少なくとも1個の点変異を有するプロモーター、およびポリペプチドを産生するためにこのプロモーターを使用する方法が、本明細書に報告される。
発明の背景
タンパク質の発現は、生細胞における基本の過程である。タンパク質発現のために必要とされる情報は、全て、単一の核酸によって提供される。この核酸は、タンパク質のアミノ酸配列の情報を含有するのみならず、プロモーター／プロモーター配列を含む、必要とされる制御的情報（例えば、リボソーム結合部位、転写の開始シグナルおよび終結シグナル、スプライスシグナル、エンハンサー要素等）も提供する。
タンパク質の発現は、生細胞における基本の過程である。タンパク質発現のために必要とされる情報は、全て、単一の核酸によって提供される。この核酸は、タンパク質のアミノ酸配列の情報を含有するのみならず、プロモーター／プロモーター配列を含む、必要とされる制御的情報（例えば、リボソーム結合部位、転写の開始シグナルおよび終結シグナル、スプライスシグナル、エンハンサー要素等）も提供する。
プロモーターとは、機能的に連結された核酸、例えば、ポリペプチドをコードする核酸の、プレmRNAへの転写の量を制御する核酸である。それは、機能的に連結されたコード配列の5'末端のRNAポリメラーゼ開始部位の周辺に位置する転写調節要素である。SV40初期プロモーターの分析から、転写活性化因子のための認識／結合部位は、プロモーター内の7〜20塩基対からなるセグメントに含有されていることが公知である。1個のセグメントは、RNA合成のための開始部位、例えば、周知のTATAボックスである。RNA合成のための開始部位のおよそ30〜110塩基対5'側、即ち、上流に位置する他のセグメントが、転写開始の頻度を規定する。プロモーターは、特定の部位において、規定された方向に、即ち、5'→3'方向にRNA合成を開始する1個のセグメントを少なくとも必要とする。
長期培養における産生量の徐々の減少は、製造細胞株の開発における一般的な問題である（Barnes,L.M.,et al.Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639(非特許文献1)）。組換えタンパク質発現の減少は、トランスジーンコピーの減少および／またはトランスジーンプロモーターのサイレンシングによるものであり得る（例えば、Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365(非特許文献2)；Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108(非特許文献3)；Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185(非特許文献4)を参照すること）。プロモーターのサイレンシングは、ヒストンの翻訳後修飾およびCpG部位におけるプロモーターDNAの直接メチル化のようなクロマチンのエピジェネティック修飾によって引き起こされる（例えば、Cedar,H.and Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304(非特許文献5)；De Carvalho,D.D.et al.,Trends Cell Biol 20(2010):609-617(非特許文献6)；Klose;R.J.and Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97(非特許文献7)を参照すること）。メチル化されたプロモーターは、一般に、不活性となる。
ヒトサイトメガロウイルスの主要前初期遺伝子の極めて強力なプロモーターおよびエンハンサー（hCMV-MIE）は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの組換え発現のために使用されている。このプロモーターは、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞においても、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞においても、メチル化によるサイレンシングを受けやすいことが示されている（例えば、Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365(非特許文献2)；Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108(非特許文献3)；Proesch,S.et al.,Biol Chem Heppe Seyler 377(1996):195-201(非特許文献8)；Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185(非特許文献4)を参照すること）。
hCMV-MIEプロモーターの直接メチル化は、組換えCHO細胞株の産生不安定性を予測するための初期マーカーとして使用され得ることが、WO 2011/128377(特許文献1)において以前に証明されている。
Osterlehner,A.らは、プロモーターメチル化およびトランスジーンコピー数が、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株における不安定なタンパク質産生を予測することを報告し、異なるCpG部位が異なる頻度でメチル化されることを記載している（Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681(非特許文献9)）。
Barnes,L.M.,et al.Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639
Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365
Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108
Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185
Cedar,H.and Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304
De Carvalho,D.D.et al.,Trends Cell Biol 20(2010):609-617
Klose;R.J.and Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97
Proesch,S.et al.,Biol Chem Heppe Seyler 377(1996):195-201
Osterlehner,A.,et al.,Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681
hCMV-MIEプロモーターの特定の部位におけるC→G点変異、即ち、単一のC→G変異が、低下したプロモーターサイレンシングをもたらし、改善された産生安定性ももたらすことが見出された。さらに、産生されたポリペプチドのより高い力価が達成され得ることが見出された。転写開始部位に対する-41位および／または-179位におけるC→Gの変異が特に効果的であることが示された。
本明細書に報告される一つの局面は、転写開始部位に対するヌクレオチド-41位（および／）または-179位にヌクレオチドGを有する（SEQ ID NO:01のプロモーターに基づく）ヒトCMVプロモーターである。
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターは、（転写開始部位に対する-41位および／または-179位に、C→G点変異を有しないヒトCMVプロモーターと比較された時）改善された産生安定性および／または改善された産物力価を有する。
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターは、SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸配列を有する。
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸配列を有するプロモーターである。
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。
この局面の一つの態様において、核酸は選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。この局面の一つの態様において、核酸は、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖をコードするさらなる発現カセットを含む。
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
本明細書に報告される一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:02のプロモーターの使用である。
本明細書に報告される一つの局面は、本明細書に報告されるプロモーターまたは本明細書に報告される核酸を含む細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸配列を有するプロモーターである。
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。
この局面の一つの態様において、核酸は選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。この局面の一つの態様において、核酸は、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖をコードするさらなる発現カセットを含む。
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
本明細書に報告される一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:03のプロモーターの使用である。
本明細書に報告される一つの局面は、本明細書に報告されるプロモーターまたは本明細書に報告される核酸を含む細胞である。
本明細書に報告される一つの局面は、転写開始部位に対するヌクレオチド-41位にヌクレオチドGを有するヒトCMVプロモーターである。
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターはヒトCMV主要前初期プロモーターである。
本明細書に報告される一つの局面は、転写開始部位に対するヌクレオチド-179位にヌクレオチドGを有するヒトCMVプロモーターである。
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターはヒトCMV主要前初期プロモーターである。
発明の詳細な説明
分泌型タンパク質、細胞内レポータータンパク質、または細胞表面マーカーのような組換えポリペプチドの産生／発現のために安定的にトランスフェクトされた真核細胞株を使用する時、長期培養における産生量の徐々の減少は、製造細胞株の開発における一般的な問題である（Barnes,L.M.,et al.Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639）。産生細胞株／細胞クローン、即ち、例えば、抗体のようなポリペプチドの大規模組換え産生のために使用される細胞クローン／細胞株について、細胞クローン／細胞株の産生安定性、即ち、世代毎の産生量の減少は、重要である。従って、組換えタンパク質産生のための哺乳動物細胞株は、長期の培養時間にわたり産生量を維持する必要がある。一般に、細胞クローン／細胞株の産生安定性は、長期間にわたり細胞クローン／細胞株を培養することによって決定される。定期的な間隔で、培地を新鮮な培地で希釈し、産物力価および生存細胞密度に基づき、1細胞当たりの比産生量を決定する。比産生量の変化（通常、低下）は、細胞クローン／細胞株の長期産生安定性の指標となる。
分泌型タンパク質、細胞内レポータータンパク質、または細胞表面マーカーのような組換えポリペプチドの産生／発現のために安定的にトランスフェクトされた真核細胞株を使用する時、長期培養における産生量の徐々の減少は、製造細胞株の開発における一般的な問題である（Barnes,L.M.,et al.Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639）。産生細胞株／細胞クローン、即ち、例えば、抗体のようなポリペプチドの大規模組換え産生のために使用される細胞クローン／細胞株について、細胞クローン／細胞株の産生安定性、即ち、世代毎の産生量の減少は、重要である。従って、組換えタンパク質産生のための哺乳動物細胞株は、長期の培養時間にわたり産生量を維持する必要がある。一般に、細胞クローン／細胞株の産生安定性は、長期間にわたり細胞クローン／細胞株を培養することによって決定される。定期的な間隔で、培地を新鮮な培地で希釈し、産物力価および生存細胞密度に基づき、1細胞当たりの比産生量を決定する。比産生量の変化（通常、低下）は、細胞クローン／細胞株の長期産生安定性の指標となる。
組換えタンパク質発現の減少は、トランスジーンコピーの減少および／またはトランスジーンプロモーターのサイレンシングによるものであり得る（例えば、Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108；Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185を参照すること）。プロモーターのサイレンシングは、ヒストンの翻訳後修飾およびCpG部位におけるプロモーターDNAの直接メチル化のようなクロマチンのエピジェネティック修飾によって引き起こされる（例えば、Cedar,H.and Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304；De Carvalho,D.D.et al.,Trends Cell Biol 20(2010):609-617；Klose;R.J.and Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97を参照すること）。メチル化されたプロモーターは、一般に、不活性となる。
Osterlehner,A.らは、プロモーターメチル化およびトランスジーンコピー数が、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株において不安定なタンパク質産生を予測することを以前に示し、異なるCpG部位が異なる頻度でメチル化されることを記載している（Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681）。
本発明において、異なるCpG部位を、単独で、または組み合わせて、調査した。ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー内にCpG点変異を含有している様々な細胞株を生成し、長期産生量について試験した。
プロモーターにおける変異が遺伝子発現の効力に有意に影響を及ぼさないこと、即ち、プロモーター強度が影響を受けないことは、重要である。
本明細書に報告されるようになされた点変異によって、hCMV-MIEプロモーターにおけるプロモーター強度は影響を受けないことが、本発明において見出された。ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片に点変異を有するプラスミドと、非変異型対照プラスミドとの間に、有意差を検出することはできなかった。
本発明は、ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサーの特定のCpG部位におけるCからGへの点変異によって、プロモーターのサイレンシングを低下させることができるという発見に少なくとも一部分基づく。それによって、細胞株の長期産生安定性を改善することができ、高い／より高い収量で、長期間にわたり、組換えポリペプチドを産生することができる。
例示的なCHO細胞に、（点変異C-179→Gを有する）プラスミド16107または（点変異C-41→Gを有する）プラスミド16109を安定的にトランスフェクトし、これを培養した。各プラスミドについて8〜10の独立の安定的にトランスフェクトされた細胞プールのeGFP強度を、長期の培養時間にわたり決定した。
プラスミド16109または対照プラスミド16111のいずれかをトランスフェクトされた細胞の間に、トランスフェクトされた細胞の長期産生量の統計的に有意な差が検出された（p値＜0.05；下記表を参照すること）。
転写開始部位に対する-41位にC→Gの点変異が導入される時、即ち、メチル化部位が排除される時、レポーター遺伝子発現の安定性に対する正の効果が達成され得ることが見出された。
（表）プラスミド16107、16109、または16111をトランスフェクトされたCHO細胞プールの蛍光幾何平均の最小有意差（LSD）についてのp値
従って、本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸配列を有するプロモーター、即ち、C-41→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーターである。一つの態様において、プロモーターは、少なくとも1個のC→Gの点変異を有する。一つの態様において、プロモーターは、2個のC→Gの点変異を有する。一つの態様において、プロモーターは、3個のC→Gの点変異を有する。一つの好ましい態様において、プロモーターは、単一のCからGへの点変異を有する。一つの好ましい態様において、プロモーターは、転写開始部位に対する-41位に単一のCからGへの点変異を有する。一つの好ましい態様において、プロモーターは、転写開始部位に対する-179位に単一のCからGへの点変異を有する。
本明細書に報告されるもう一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02の第1の核酸（即ち、C-41→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター）を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02の第1の核酸（即ち、C-41→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター）を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。完全な免疫グロブリン分子を産生すべき場合には、それぞれの他方の免疫グロブリン鎖をコードする核酸を有するさらなる発現カセットを含める必要があることが理解される。例えば、ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖である場合には、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸を有するさらなる発現カセットが導入される。この局面の一つの態様において、核酸は、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖をコードするさらなる発現カセットを含む。
この局面の一つの態様において、核酸は、選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。本明細書に報告されるもう一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:02のプロモーターの使用である。
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
さらに、細胞株16107および16111を直接比較した。細胞株16107の、対照細胞株16111と比較して、より高いeGFP発現の傾向は、転写開始部位に対するC-179位におけるC→G点変異の、eGFP発現遺伝子の安定性に対する正の効果を示す。
転写開始部位に対する-41位は、SEQ ID NO:01の561位に相当する。転写開始部位に対する-179位は、SEQ ID NO:01の423位に相当する。
従って、本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸配列を有するプロモーター、即ち、C-179→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーターである。
本明細書に報告されるもう一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
本明細書に報告されるもう一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。
この局面の一つの態様において、核酸は、選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
本明細書に報告されるもう一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:03のプロモーターの使用である。
定義
「プロモーター」とは、機能的に連結された核酸の転写を調節する核酸、即ち、ポリヌクレオチド配列をさす。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含み得る。使用されるプロモーターは、機能的に連結された核酸の発現が企図される宿主細胞の細胞型において機能性のものであろう。多様な異なる起源に由来する構成性プロモーター、誘導可能プロモーター、および抑制可能プロモーターを含む多数のプロモーターが、当技術分野において周知である（GenBankのようなデータベースにおいて同定される）。それらは、（例えば、ATCCのような寄託機関、および商業的または個人的な供給元から）クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中に、入手可能である。「プロモーター」は、例えば、機能的に連結された構造遺伝子の転写を指図するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の遺伝子の5'非コード領域または5'非翻訳領域（5'UTR）に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらの配列要素には、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的要素（DSE；McGehee,R.E.,et al.,Mol.Endocrinol.7(1993)551）、サイクリックAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE；Treisman,R .,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47）、グルココルチコイド応答要素（GRE）、ならびにCRE/ATF（O'Reilly,M.A.,et al.,J.Biol.Chem.267(1992)19938）、AP2（Ye,J.,et al.,J.Biol.Chem.269(1994)25728）、SP1、cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253-264）、およびオクタマー因子のような他の転写因子のための結合部位（一般に、Watson et al.,eds.,Molecular Biology of the Gene,4th ed.,The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.1987およびLemaigre,F.P.and Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14を参照すること）が含まれる。プロモーターが誘導可能プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤によって制御されない。抑制可能プロモーターも公知である。例えば、c-fosプロモーターは、成長ホルモンが細胞表面上の受容体に結合することによって特異的に活性化される。テトラサイクリン（tet）によって制御される発現は、例えば、CMVプロモーターに2個のTetオペレーター部位が後続するものからなる人工ハイブリッドプロモーターによって達成され得る。Tetリプレッサーが2個のTetオペレーター部位に結合し、転写を阻止する。誘導剤テトラサイクリンが添加されると、TetリプレッサーがTetオペレーター部位から放出され、転写が進行する（Gossen,M.and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)5547-5551）。メタロチオネインプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むその他の誘導可能プロモーターについては、例えば、Sambrook,et al.（前記）およびGossen,M.,et al.,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520を参照すること。高レベル発現のための強力なプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネインIプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1α（CHEF-1、例えば、US 5,888,809を参照すること）、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター（CMV-MIE）が含まれる。「エンハンサー」（即ち、転写を増加させるためにプロモーターに作用するシス作用性のDNA要素）は、プロモーター単独で入手される発現のレベルを増加させるため、プロモーターと協力して機能するよう必要とされる場合があり、転写制御要素として含まれ得る。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列も含むであろう（例えば、CMVまたはSV40）。
「プロモーター」とは、機能的に連結された核酸の転写を調節する核酸、即ち、ポリヌクレオチド配列をさす。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含み得る。使用されるプロモーターは、機能的に連結された核酸の発現が企図される宿主細胞の細胞型において機能性のものであろう。多様な異なる起源に由来する構成性プロモーター、誘導可能プロモーター、および抑制可能プロモーターを含む多数のプロモーターが、当技術分野において周知である（GenBankのようなデータベースにおいて同定される）。それらは、（例えば、ATCCのような寄託機関、および商業的または個人的な供給元から）クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中に、入手可能である。「プロモーター」は、例えば、機能的に連結された構造遺伝子の転写を指図するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の遺伝子の5'非コード領域または5'非翻訳領域（5'UTR）に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらの配列要素には、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的要素（DSE；McGehee,R.E.,et al.,Mol.Endocrinol.7(1993)551）、サイクリックAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE；Treisman,R .,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47）、グルココルチコイド応答要素（GRE）、ならびにCRE/ATF（O'Reilly,M.A.,et al.,J.Biol.Chem.267(1992)19938）、AP2（Ye,J.,et al.,J.Biol.Chem.269(1994)25728）、SP1、cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253-264）、およびオクタマー因子のような他の転写因子のための結合部位（一般に、Watson et al.,eds.,Molecular Biology of the Gene,4th ed.,The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.1987およびLemaigre,F.P.and Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14を参照すること）が含まれる。プロモーターが誘導可能プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤によって制御されない。抑制可能プロモーターも公知である。例えば、c-fosプロモーターは、成長ホルモンが細胞表面上の受容体に結合することによって特異的に活性化される。テトラサイクリン（tet）によって制御される発現は、例えば、CMVプロモーターに2個のTetオペレーター部位が後続するものからなる人工ハイブリッドプロモーターによって達成され得る。Tetリプレッサーが2個のTetオペレーター部位に結合し、転写を阻止する。誘導剤テトラサイクリンが添加されると、TetリプレッサーがTetオペレーター部位から放出され、転写が進行する（Gossen,M.and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)5547-5551）。メタロチオネインプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むその他の誘導可能プロモーターについては、例えば、Sambrook,et al.（前記）およびGossen,M.,et al.,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520を参照すること。高レベル発現のための強力なプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネインIプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1α（CHEF-1、例えば、US 5,888,809を参照すること）、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター（CMV-MIE）が含まれる。「エンハンサー」（即ち、転写を増加させるためにプロモーターに作用するシス作用性のDNA要素）は、プロモーター単独で入手される発現のレベルを増加させるため、プロモーターと協力して機能するよう必要とされる場合があり、転写制御要素として含まれ得る。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列も含むであろう（例えば、CMVまたはSV40）。
「CpG部位」という用語は、細胞のメチル化酵素によって認識され、シトシンが5-メチルシトシンに変換され得る、核酸内のジヌクレオチドCGを示す。一つの態様において、CpG部位はプロモーター核酸内にある。
「核酸」という用語は、本明細書において使用されるように、個々のヌクレオチドからなるポリマー、即ち、ポリヌクレオチドである。それは、例えば、組換え産生され得るポリペプチドをコードする、天然に存在する核酸、または部分的にもしくは完全に天然には存在しない核酸をさす。核酸は、化学的手段によって単離されるかまたは合成されるDNA断片の集まりであり得る。核酸は、もう一つの核酸、例えば、発現プラスミドまたは宿主細胞のゲノム／染色体へ組み込まれていてもよい。プラスミドには、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミドは、それぞれ、細菌におけるベクターの複製および選択のための、複製起点（例えば、ColE1複製起点）および選択可能マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子）を含む原核生物繁殖単位も含むであろう。
「プロモーター強度」という用語およびその文法上の相当語句は、本発明において使用されるように、機能的に連結された核酸の転写におけるプロモーターの効力を示す。プロモーターのプロモーター強度は、SEQ ID NO:01の野生型hCMV-MIEプロモーターのプロモーター強度と比較した場合、高く、即ち、75％から100％超であるか、または中程度、即ち、40％から75％未満であるか、または低く、即ち、40％未満であり得る。この値は、同一の細胞型において、当該プロモーターに機能的に連結された異種ポリペプチドの発現の量を、野生型SV40プロモーターに機能的に連結された異種ポリペプチドの発現の量と比較することによって決定され得る。これは、例えば、ELISAアッセイによって、異種ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された当該プロモーターからなる発現カセットをトランスフェクトされたCHO細胞またはHEK細胞において、異種ポリペプチドの発現の量を決定することによって行われ得る。この量を、同一のELISAアッセイによって決定された、異種ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された野生型SV40プロモーターからなる発現カセットをトランスフェクトされた同一の細胞株における同一の異種ポリペプチドの発現の量と比較することによって、即ち、プロモーターのみを変化させた、同一の発現プラスミドを有する同一の細胞において、異種ポリペプチドの量を比較することによって、相対的なプロモーター強度を決定することができる。
「機能的に連結された」とは、そのように記載された成分が、意図された様式で機能することを可能にする関係にある2個以上の成分の並置をさす。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、連結されたコード配列の転写を調節するかまたはモジュレートするためにシス作用する場合、そのコード配列に機能的に連結されている。一般に、必ずではないが、「機能的に連結された」DNA配列は、連続しており、分泌リーダー／シグナル配列およびポリペプチドのような2個のタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、連続しておりかつリーディングフレーム内にある。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは、一般に、コード配列の上流に位置するが、必ずしも隣接していない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーがコード配列の転写を増加させる場合、そのエンハンサーはそのコード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に、プロモーターからの相当な距離に位置し得る。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通ってポリアデニル化配列へと進行するよう、コード配列の下流末端に位置する場合、そのコード配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えば、PCR方法論を使用して、かつ／または便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。便利な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣習的な実務に従って使用される。
本発明の範囲内で、トランスフェクトされた細胞は、当技術分野において公知の実質的に任意の種類のトランスフェクション法によって入手され得る。例えば、核酸は電気穿孔または微量注入によって細胞へ導入され得る。あるいは、FuGENE 6（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、X-tremeGENE（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、およびLipofectAmine（Invitrogen Corp.,USA）のようなリポフェクション試薬が使用されてもよい。あるいは、核酸は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクター系によっても細胞へ導入され得る（Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314）。
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、核酸、例えば、異種ポリペプチドをコードする核酸またはshRNAを構成する核酸が、導入／トランスフェクトされ得る細胞、または導入／トランスフェクトされた細胞をさす。宿主細胞には、ベクター／プラスミドの繁殖のために使用される原核細胞および核酸の発現のために使用される真核細胞の両方が含まれる。一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。もう一つの態様において、哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞（例えば、CHO K1またはCHO DG44）、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞より選択される。さらなる態様において、哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、および齧歯類細胞を含む群より選択される。骨髄腫細胞には、ラット骨髄腫細胞（例えば、YB2）およびマウス骨髄腫細胞（例えば、NS0、SP2/0）が含まれる。薬学的適用において使用するためのポリペプチドは、一つの態様において、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6（登録商標）細胞等のような哺乳動物細胞において産生される。宿主細胞の発酵のため、従って、関心対象のポリペプチドの発現のため、培養培地が使用される。現在、CHO細胞は、実験室において小規模にも、産生過程において大規模にも、薬学的ポリペプチドの発現のために広く使用されている。広い流通および使用のため、CHO細胞の特徴的特性および遺伝的背景は周知である。従って、CHO細胞は、ヒトへ適用するための治療用タンパク質の産生のため、規制機関によって承認されている。一つの態様において、哺乳動物細胞はCHO細胞である。
「発現カセット」とは、少なくとも含有されている構造遺伝子の宿主細胞における発現および分泌のために必要な要素を含有している核酸をさす。核酸は、個々のヌクレオチドからなる配列、または核酸分子によってコードされたアミノ酸配列によっても特徴決定される。
「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を達成することができる、例えば、染色体上またはプラスミド上の、セグメントである核酸を示す。コード領域、即ち、構造遺伝子の他に、遺伝子は、他の機能的要素、例えば、シグナル配列、プロモーター、イントロン、および／またはターミネーターを含む。
「構造遺伝子」とは、シグナル配列なしの遺伝子の領域、即ち、コード領域を示す。
「発現」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞内で起こる転写および／または翻訳をさす。宿主細胞における所望の産物の転写のレベルは、細胞に存在する対応するmRNAの量に基づき決定され得る。例えば、選択された核酸から転写されたmRNA を、PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化することができる（Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照すること）。選択された核酸によってコードされたタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、またはウエスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイのようなそのような活性とは無関係のアッセイを利用することによって、タンパク質を認識しそれに結合する抗体を使用することによって、定量化され得る（Sambrook,et al.,1989（前記）を参照すること）。
「ポリペプチド」とは、天然に産生されたものであってもよいしまたは合成的に産生されたものであってもよい、ペプチド結合によって接合されたアミノ酸残基のポリマーである。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」とも呼ばれる。2本以上のアミノ酸鎖を含むか、または100アミノ酸以上の長さのアミノ酸鎖を含むポリペプチドは、「タンパク質」とも呼ばれる。ポリペプチドまたはタンパク質は、炭水化物基または金属イオンのような非ペプチド成分も含み得る。炭水化物およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加され、細胞の型によって変動し得る。タンパク質およびポリペプチドは、アミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義され；炭水化物基のような付加は、一般に明示されないが、にも関わらず存在し得る。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖、またはそれらの断片、融合物、もしくはコンジュゲートである。
「選択可能マーカー」という用語は、対応する「選択剤」の存在下で、この核酸を保持する細胞が特異的にポジティブにまたはネガティブに選択されることを可能にする核酸を示す。有用なポジティブ選択可能マーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。選択可能マーカーは、それによって形質転換された細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブに選択されることを可能にし；非形質転換細胞は、選択培養条件の下で、即ち、選択剤の存在下で、増殖するかまたは生存することができない。選択可能マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択可能マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にし、ネガティブ選択可能マーカーは、マーカーを保持する細胞が選択的に排除されることを可能にする。典型的には、選択可能マーカーは、薬物に対する耐性を付与するか、または細胞における代謝もしくは異化の欠陥を補うであろう。真核細胞において有用な選択可能マーカーには、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HYG）、ネオマイシンAPH、およびG418 APHのようなアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チミジンキナーゼ（TK）、グルタミン合成酵素（GS）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（選択剤インドール）、ヒスチジノール脱水素酵素（選択剤ヒスチジノールD）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性を提供する遺伝子が含まれる。さらに、選択可能マーカーは、WO 92/08796およびWO 94/28143に報告されている。
「ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で」という用語は、異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の培養のために使用され、当業者に公知であるかまたは当業者によって容易に決定され得る条件を示す。これらの条件が、培養される哺乳動物細胞の型および発現されるタンパク質の型に依って変動し得ることも、当業者に公知である。一般に、哺乳動物細胞は、例えば、20℃〜40℃の温度で、効果的なタンパク質産生を可能にするのに十分な期間、例えば、4〜28日間、0.1リットル〜107リットルの体積で培養される。
「ポリペプチドの回収」という用語は、本願において使用されるように、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、濃縮溶液を入手するための溶媒体積減少、またはクロマトグラフィを示す。一般に、クロマトグラフィ過程が、ポリペプチドの分離および精製のために使用される。微生物タンパク質によるアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインAアフィニティクロマトグラフィまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合型交換）、（例えば、βメルカプトエタノールおよびその他のSHリガンドによる）チオフィリック（thiophilic）吸着、（例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸による）疎水性相互作用クロマトグラフィまたは芳香族吸着クロマトグラフィ、（例えば、Ni(II)アフィニティ材料およびCu(II)アフィニティ材料による）金属キレートアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ならびに（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動のような）電気泳動法のような、種々の方法が、十分に確立され、タンパク質の回収および精製のために広範囲に使用されている（Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102）。
「免疫グロブリン」という用語は、少なくとも2本のいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および2本のいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む分子を示す。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、各々、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、各々、定常領域（一般に、カルボキシ末端部分）も含む。重鎖の定常領域は、（i）食細胞のようなFcγ受容体（FcγR）を保持する細胞または（ii）ブランベル（Brambell）受容体としても公知の新生児型Fc受容体（FcRn）を保持する細胞との免疫グロブリンの結合を媒介する。それは、成分（C1q）のような古典的補体系の因子を含むいくつかの因子との結合も媒介する。
「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において、最も広義に使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および免疫グロブリン断片を含むが、これらに限定されない、様々な免疫グロブリン構造を包含する。
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依って、免疫グロブリンは、異なるクラス：IgAクラス、IgDクラス、IgEクラス、IgGクラス、およびIgMクラスに分類される。これらのクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）へさらに分類され、即ち、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に、またはIgAは、IgA1およびIgA2に分類される。免疫グロブリンが属するクラスに依って、重鎖定常領域は、それぞれ、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、およびμ（IgM）と呼ばれる。一つの態様において、免疫グロブリンは、IgGクラスの免疫グロブリンである。もう一つの態様において、免疫グロブリンは、ヒト定常領域またはヒト起源に由来する定常領域である。さらなる態様において、免疫グロブリンは、IgG4サブクラス、またはFcγ受容体（例えば、FcγRIIIa）結合および／もしくはC1q結合が検出され得ないよう修飾されたIgG1サブクラス、IgG2サブクラス、もしくはIgG3サブクラスのものである。一つの態様において、免疫グロブリンは、ヒトIgG4サブクラスまたは変異型ヒトIgG1サブクラスのものである。一つの態様において、免疫グロブリンは、変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラスのものである。もう一つの態様において、免疫グロブリンは、Fcγ受容体結合に関して、IgG4サブクラスのものであるか、またはL234、L235、および／もしくはD265に変異を有するIgG1サブクラスもしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ／またはPVA236変異を含有している。さらなる態様において、免疫グロブリンは、S228P、L234A、L235A、L235E、SPLE（S228PおよびL235E）、ならびに／またはPVA236（PVA236とは、IgG1のアミノ酸233〜236位の（一文字アミノ酸コードで与えられた）アミノ酸配列ELLGまたはIgG4のEFLGがPVAに置換されていることを意味する）より選択される変異を有する。一つの態様において、免疫グロブリンは、IgG4サブクラスのものであり、IgG4の変異S228Pを有するか、または免疫グロブリンは、IgG1サブクラスのものであり、変異L234AおよびL235Aを有する。
次に、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、即ち、4個のフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（CDR）を含む。
「免疫グロブリン断片」とは、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、または免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメインもしくはCLドメインを含むドメインの群の少なくとも1個のドメインを含むポリペプチドを示す。それらの誘導体およびバリアントも含まれる。さらに、1個以上のアミノ酸またはアミノ酸領域が欠失している可変ドメインが存在してもよい。
「免疫グロブリンコンジュゲート」とは、ペプチド結合を介してさらなるポリペプチドにコンジュゲートされた免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の少なくとも1個のドメインを含むポリペプチドを示す。さらなるポリペプチドは、ホルモン、増殖受容体、抗融合性（antifusogenic）ペプチド等のような非免疫グロブリンペプチドである。
以下の実施例、図面、および配列表は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の本旨から逸脱することなく、示された手法に修飾を施し得ることが理解される。
配列表の説明
SEQ ID NO:01 ヒトCMV主要前初期（hCMV-MIE）プロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:02 転写開始部位に対する-41位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:03 転写開始部位に対する-179位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:04 不安定化PEST配列を含む高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）のヌクレオチド配列
SEQ ID NO:05 シグナルペプチドを含む分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）のヌクレオチド配列
SEQ ID NO:06 転写開始部位に対する-41位および-179位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:01 ヒトCMV主要前初期（hCMV-MIE）プロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:02 転写開始部位に対する-41位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:03 転写開始部位に対する-179位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:04 不安定化PEST配列を含む高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）のヌクレオチド配列
SEQ ID NO:05 シグナルペプチドを含む分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）のヌクレオチド配列
SEQ ID NO:06 転写開始部位に対する-41位および-179位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
実施例1
一般的な技術
組換えDNA技術
Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)に記載されるような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。製造業者の説明書に従って分子生物学用試薬を使用した。
一般的な技術
組換えDNA技術
Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)に記載されるような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。製造業者の説明書に従って分子生物学用試薬を使用した。
DNA配列決定
DNA配列決定は、SequiServe GmbH（Vaterstetten,Germany）で実施された。
DNA配列決定は、SequiServe GmbH（Vaterstetten,Germany）で実施された。
DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
EMBOSS（European Molecular Biology Open Software Suite）ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン9.1を、配列の作成、マッピング、分析、アノテーション、および図示のために使用した。
EMBOSS（European Molecular Biology Open Software Suite）ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン9.1を、配列の作成、マッピング、分析、アノテーション、および図示のために使用した。
抗体分析のための試料調製
細胞濃度を計算し、各試料2mlを遠心分離した（500g、5分、20〜30℃）。上清を新しい96穴ディープウェルプレートに移し、使用まで-20℃で保管した。凍結上清を、4℃で一晩解凍し、6回反転させ、遠心分離した（4000rpm、30分、20〜30℃）。バーコード付き96穴丸型ウェルプレート上のマルチスクリーンMilliporeプレートで、遠心分離（1200rpm、3分、20〜30℃）によって、310μlをろ過した。
細胞濃度を計算し、各試料2mlを遠心分離した（500g、5分、20〜30℃）。上清を新しい96穴ディープウェルプレートに移し、使用まで-20℃で保管した。凍結上清を、4℃で一晩解凍し、6回反転させ、遠心分離した（4000rpm、30分、20〜30℃）。バーコード付き96穴丸型ウェルプレート上のマルチスクリーンMilliporeプレートで、遠心分離（1200rpm、3分、20〜30℃）によって、310μlをろ過した。
実施例2
組換えCHO細胞株の生成
野生型（SEQ ID NO:01）であるかまたはC→G点変異を含むヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下で、レポーター遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP：図1；SEQ ID NO:05）または高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP：図2）またはクラスIgGのヒト抗体構築物（WO 2014023752に報告されたようなIgGサイトカイン（IL2）融合タンパク質；図9）のいずれかを保持するベクターを、一過性にまたは安定的にCHO-K1懸濁細胞にトランスフェクトした。長期安定性を増加させるため、hCMV-MIE断片内のCpGジヌクレオチドのC→G変異C-508、C-179、およびC-41を、単独でまたは様々に組み合わせて挿入した（表1）。C→G変異は、転写開始部位（TSS）との距離によって同定される。QuikChange Multi-Site-Directed Mutagnesis Kit（Agilent Technologies,Waldbronn,Germany）によって、変異を挿入した。ベクターは、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）をコードする核酸配列をさらに含んでいた（図1、2、および9）。Amaxaヌクレオフェクション系（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）によって、細胞のトランスフェクションを実施した。
組換えCHO細胞株の生成
野生型（SEQ ID NO:01）であるかまたはC→G点変異を含むヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下で、レポーター遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP：図1；SEQ ID NO:05）または高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP：図2）またはクラスIgGのヒト抗体構築物（WO 2014023752に報告されたようなIgGサイトカイン（IL2）融合タンパク質；図9）のいずれかを保持するベクターを、一過性にまたは安定的にCHO-K1懸濁細胞にトランスフェクトした。長期安定性を増加させるため、hCMV-MIE断片内のCpGジヌクレオチドのC→G変異C-508、C-179、およびC-41を、単独でまたは様々に組み合わせて挿入した（表1）。C→G変異は、転写開始部位（TSS）との距離によって同定される。QuikChange Multi-Site-Directed Mutagnesis Kit（Agilent Technologies,Waldbronn,Germany）によって、変異を挿入した。ベクターは、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）をコードする核酸配列をさらに含んでいた（図1、2、および9）。Amaxaヌクレオフェクション系（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）によって、細胞のトランスフェクションを実施した。
（表１）ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片内のCpGジヌクレオチドのC→G点変異の組み合わせ
例えば、製造業者のプロトコルに従って、Nucleofector Kit V（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）と組み合わせてNucleofector装置を使用して、SEAPの一過性発現のための環状プラスミドDNA、またはeGFPの安定的発現のための直鎖化されたプラスミドDNA、またはIgGクラス抗体融合タンパク質の安定的発現のための適切なプラスミドを、CHO-K1細胞にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、96穴プレートに播種し、5日間インキュベートした。SEAP濃度を、化学反応の色変化によって、Tecan-Reader SECTRAFluor Plus（Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany）において調査した。
安定的にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、選択剤として250〜1600nMメトトレキサート（MTX）を含むチミジン不含培地を含有している384穴プレートまたは6穴プレートに播種した。3〜4週間後、eGFP発現細胞プールまたは抗体発現細胞プールを、1〜3ヶ月の期間にわたる長期安定性について調査した。eGFP発現の強度をフローサイトメトリーによって調査した。抗体発現単細胞クローンを384穴プレートおよび96穴プレートに播種した。3週間後、抗体発現細胞株を、ELISAによって培養培地中の抗体力価を測定することによって同定した。増殖中のウェルをランダムに選び、長期安定性アッセイのため、細胞クローンをより高い体積で増大させ（6穴プレートにおいて1ウェル当たり3ml）、各継代の終わりにプロテインA HPLCおよびELISAによって抗体濃度を決定した。
120rpm/分〜150rpm/分の一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件（95％rH、37℃、および5％〜8％CO2）の下で、使い捨て125mlベント付き振とうフラスコにおいて細胞を繁殖させた。3〜4日毎に細胞を新鮮な培地に分割した。培養物の密度および生存率を、Cedex HiResセルカウンター（Roche Innovates AG,Bielefeld,Germany）を使用して決定した。さらに、例えば、Current Protocols in Cell Biology,Binifacino,J.S.et al.(eds),John Wiley & Sons,Inc.,New York(2000)に記載されるような、標準的な細胞培養技術を適用した。
実施例3
長期の培養および産生
実施例2に従って入手された、ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片内のCpG点変異（表1）を含有している様々なCHO細胞プールを、長期産生量について調査した。
長期の培養および産生
実施例2に従って入手された、ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片内のCpG点変異（表1）を含有している様々なCHO細胞プールを、長期産生量について調査した。
選択剤MTXの存在下で、トランスフェクション後、2〜3ヶ月間、産生安定性について細胞を試験した。細胞を、選択剤を含む20〜40mlの培地を含有しているベント付き125ml振とうフラスコにおいて連続的に培養し、週2回、新鮮な培地で希釈した。播種密度は2〜3×105細胞/mlであった。継代前に生存細胞密度および生存率を決定した。
各継代の終わりにプロテインA HPLCおよびELISAによって上清の抗体濃度（抗体力価）を決定した。これらのデータから、各継代についての細胞比産生量（qP）を、以下の式を使用して計算した：
qP[pg/細胞/d]：細胞比産生量、
P1[μg/ml]：継代の最初の抗体力価、
P2[μg/ml]：継代の最後の抗体力価、
D1[細胞/ml]：継代の最初の生存細胞密度、
D2[細胞/ml]：継代の最後の生存細胞密度、
Δt[d]：継代の期間。
P1[μg/ml]：継代の最初の抗体力価、
P2[μg/ml]：継代の最後の抗体力価、
D1[細胞/ml]：継代の最初の生存細胞密度、
D2[細胞/ml]：継代の最後の生存細胞密度、
Δt[d]：継代の期間。
世代毎にそれぞれの継代の最後に培養齢に対してqP値をプロットした。線形傾向線を全てのqPデータ点において計算し、期間中のqP（％）の相対変動を、以下の方程式に従って社内で計算した：
ΔqP[％]：qPの変動率（％）、
m[pg/細胞/d/世代]：線形傾向線、
[世代の番号]：培養齢、
qP0：線形傾向線のy軸切片。
m[pg/細胞/d/世代]：線形傾向線、
[世代の番号]：培養齢、
qP0：線形傾向線のy軸切片。
hCMV-MIEプロモーターバリアントの安定性アッセイにおいて入手されたデータ点の数は比較的少なかったため、各試料について、最後の3つのqP値の平均値を、最初の2つのQp値の平均値によって割り、ΔqPを入手するため、パーセントで示した。
平均qP EOS：最後の3つのqP値の平均値
平均qP PSB：最初の2つのqP値の平均値
平均qP PSB：最初の2つのqP値の平均値
実施例4
異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのレポーター遺伝子発現の定量化
（a）異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのSEAP発現の定量化
製造業者のプロトコルに従って、Amaxa Shuttle 96穴プレートにおいて、Nucleofector Kit V（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）と組み合わせてNucleofector装置を使用して、SEAPの一過性発現のための環状プラスミドDNAを、CHO-K1細胞にトランスフェクトした。各プラスミド12を一過性にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、96穴プレートに播種し、5日間インキュベートした。2日目、DNAを脱メチルするため、5'-アザ-2'-デオキシシチジン（DAC）を1μMの最終濃度で各プラスミド4反復で添加した。SEAP濃度をTecan-Reader SECTRAFluor Plus（Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany）で調査した。
異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのレポーター遺伝子発現の定量化
（a）異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのSEAP発現の定量化
製造業者のプロトコルに従って、Amaxa Shuttle 96穴プレートにおいて、Nucleofector Kit V（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）と組み合わせてNucleofector装置を使用して、SEAPの一過性発現のための環状プラスミドDNAを、CHO-K1細胞にトランスフェクトした。各プラスミド12を一過性にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、96穴プレートに播種し、5日間インキュベートした。2日目、DNAを脱メチルするため、5'-アザ-2'-デオキシシチジン（DAC）を1μMの最終濃度で各プラスミド4反復で添加した。SEAP濃度をTecan-Reader SECTRAFluor Plus（Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany）で調査した。
以下のプロトコルに従って、pNPP（パラニトロフェニルホスフェート）のpNP（パラニトロフェノール）への代謝速度によって、SEAPの相対濃度を調査した。
（表２）SEAPアッセイのための溶液
150μlの遠心分離された細胞培養上清を1:3で段階希釈した（図3）。
50μlの希釈物を新しい96穴プレートに添加し、50μlの基質溶液と合わせた。5分後、405nmの波長での光学濃度を、SECTRAFluor Plus光度計（Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany）を使用して測定した。
DAC処理なしのプラスミドについては8反復の平均値、DAC処理されたプラスミドについては4反復の平均値（表1）を、点変異なしの対照プラスミド（p5532）に対して標準化した（図4）。
ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片内の点変異を含むプラスミドと、非変異型対照プラスミド5532との間に、有意差は検出されなかった。さらに、DAC処理された試料と、DAC処理なしの試料との間に、有意差は観察されず、このことから、トランスフェクション後5日以内に有意なプロモーターサイレンシングが起こらないことが示された。従って、ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片へ導入された点変異は、プロモーター強度に影響を与えない（点変異は、ヒトCMV前初期プロモーター／エンハンサー断片の直接の効力に対して影響を及ぼさない）と、結論付けられる。
（b）FACSによる異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのeGFP発現の定量化
eGFPを発現する安定的にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、1〜3ヶ月の期間にわたり培養した。BD FACS Canto IIまたはBD FACS Calibur（BD,Heidelberg,Germany）を使用して、eGFP発現の強度を測定した。BD FACS Diva Software v6.12またはCell Quest Pro Software（BD,Heidelberg,Germany）を使用して、データ収集を実施した。FlowJo 7.6.5 ENソフトウェア（TreeStar,Olten,Switzerland）によって、一次データ分析を実施した。
eGFPを発現する安定的にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、1〜3ヶ月の期間にわたり培養した。BD FACS Canto IIまたはBD FACS Calibur（BD,Heidelberg,Germany）を使用して、eGFP発現の強度を測定した。BD FACS Diva Software v6.12またはCell Quest Pro Software（BD,Heidelberg,Germany）を使用して、データ収集を実施した。FlowJo 7.6.5 ENソフトウェア（TreeStar,Olten,Switzerland）によって、一次データ分析を実施した。
例えば、CHO細胞懸濁液16105、16106、16107、16108、16109、16110、および16111を、eGFP発現を検出するため、多数の時点で、BD FACS Caliburによって調査した。全ての試料を3〜4生物学的反復で調査した。各試料10000イベントを測定した。生細胞のためのゲートを、トランスフェクトされていないCHO-K1細胞によって規定し、同一のFACS実験の全ての試料に適用した（図8）。
生細胞のeGFP蛍光を、488nmの励起波長（Alexa Fluor 488チャンネル）およびおよそ516nmの放射波長で測定した。図6は、リビングゲートイベントの蛍光強度のヒストグラムを示す。
蛍光データをFlowJo 7.6.5 ENソフトウェアによって分析した。リビングゲート内のeGFP発現の幾何平均、平均、およびメジアンを、FlowJoにおいて計算した。さらなる統計分析を、JMPソフトウェアバージョン10（SAS,Boblingen,Germany）で行った。
実施例5
eGFP発現とヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片のC→G点変異との相関
実施例2に記載されるように、安定的にトランスフェクトされたCHO細胞の8（プラスミド16107）または10（プラスミド16109もしくは16111）のプールを生成し培養した。実施例4に記載されるように、eGFP強度を測定した。
eGFP発現とヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片のC→G点変異との相関
実施例2に記載されるように、安定的にトランスフェクトされたCHO細胞の8（プラスミド16107）または10（プラスミド16109もしくは16111）のプールを生成し培養した。実施例4に記載されるように、eGFP強度を測定した。
eGFP強度の幾何平均を相関研究のために使用し、図に示した（図7＆8）。対照プラスミド16111と比較したプラスミド16107および16109の有意差を決定するため、ダネット検定を使用した。
eGFP強度の幾何平均のP値を、長期培養中の異なる時点について計算した（表3）。有意差の限界はp＜0.005に設定された。
（表３）プラスミド16107、16109、または16111のいずれかをトランスフェクトされたCHOプールの幾何平均のp値
例えば、プラスミド16109と対照プラスミド16111との間の有意差は、トランスフェクションの6週間後〜8週間後（サンプリング日03-14〜03-25）に検出された（表3を参照すること）。SEAPアッセイの結果と合わせた、長期安定性アッセイの結果は、C→G点変異C-41が、プロモーター強度に影響を与えることなく、レポーター遺伝子発現の安定性に対して正の効果を及ぼすことを示している。
プラスミド16107および16111を、第2の計算において対比較した。蛍光強度の幾何平均をプロットし、p値をダネット検定を使用して計算した（表4を参照すること）。
（表４）CHO細胞株16107および16111の幾何平均のp値
プラスミド16107は、対照プラスミドと比較して増加した産生安定性を示す。即ち、C→G点変異C-179は、プロモーター強度に影響を与えることなく、レポーター遺伝子発現の安定性を増加させる。
実施例6
異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下での抗体産生の定量化
（a）HPLCによる抗体産生の定量化：
試料中に存在する抗体の量を定量化するため、クロマトグラフィ法を使用した。抗体のFc領域に結合するPorosAカラムを使用した。抗体は、カラムに結合し、その後、低pH条件によって溶出する。アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、320nmの参照波長で、280nmでの光学濃度（OD）を決定することによって、タンパク質濃度を確立した。
異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下での抗体産生の定量化
（a）HPLCによる抗体産生の定量化：
試料中に存在する抗体の量を定量化するため、クロマトグラフィ法を使用した。抗体のFc領域に結合するPorosAカラムを使用した。抗体は、カラムに結合し、その後、低pH条件によって溶出する。アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、320nmの参照波長で、280nmでの光学濃度（OD）を決定することによって、タンパク質濃度を確立した。
（b）ELISAによる抗体産生の定量化：
ELISA（酵素連結免疫吸着アッセイ）技術は、抗体サンドイッチ原理に基づく。関心対象の分析物、例えば、IgGのFc部分に特異的なキャプチャー抗体を、固相を作出するため、マイクロタイタープレート（Maxisorp、社内、Roche）に結合させる。次いで、ブロッキングおよび洗浄の工程の後、試料、標準物（参照Abの段階希釈物）、および対照を、固相抗体と共にインキュベートし、抗体に分析物を捕獲させる。未結合の分析物を洗浄した後、コンジュゲートされた検出抗体（例えば、PODコンジュゲート）を添加する。この検出抗体は測定されている分子の異なるエピトープに結合し、サンドイッチを完成させる。BM Chemiluminescence ELISA Substrate POD（Roche,Penzberg,Germany）が、ペルオキシダーゼに基づく（POD、HRP）二次検出系の基質溶液を提供している。イムノアッセイにおけるシグナル生成の速度は、固相に結合したマーカー酵素の量に直接比例する。
ELISA（酵素連結免疫吸着アッセイ）技術は、抗体サンドイッチ原理に基づく。関心対象の分析物、例えば、IgGのFc部分に特異的なキャプチャー抗体を、固相を作出するため、マイクロタイタープレート（Maxisorp、社内、Roche）に結合させる。次いで、ブロッキングおよび洗浄の工程の後、試料、標準物（参照Abの段階希釈物）、および対照を、固相抗体と共にインキュベートし、抗体に分析物を捕獲させる。未結合の分析物を洗浄した後、コンジュゲートされた検出抗体（例えば、PODコンジュゲート）を添加する。この検出抗体は測定されている分子の異なるエピトープに結合し、サンドイッチを完成させる。BM Chemiluminescence ELISA Substrate POD（Roche,Penzberg,Germany）が、ペルオキシダーゼに基づく（POD、HRP）二次検出系の基質溶液を提供している。イムノアッセイにおけるシグナル生成の速度は、固相に結合したマーカー酵素の量に直接比例する。
実施例7
抗体産生／力価とヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片のC→G点変異との相関
抗体（IgG-IL2融合タンパク質）濃度をELISAテクノロジーを使用することによって調査し、抗体力価（ug/ml）および1細胞当たり1日当たりの比産生量（qP）を計算した。変異体と対照との差および培養中の発現の変動を可視化するため、培養期の最初および最後の測定を示した。それによって、培養期の最初および最後の力価は、対照と比較した、全ての変異体における抗体産生の改善を示す（図10AおよびB）。
抗体産生／力価とヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片のC→G点変異との相関
抗体（IgG-IL2融合タンパク質）濃度をELISAテクノロジーを使用することによって調査し、抗体力価（ug/ml）および1細胞当たり1日当たりの比産生量（qP）を計算した。変異体と対照との差および培養中の発現の変動を可視化するため、培養期の最初および最後の測定を示した。それによって、培養期の最初および最後の力価は、対照と比較した、全ての変異体における抗体産生の改善を示す（図10AおよびB）。
クローン細胞株の力価をチューキーのHSD検定によって比較した（表5）。変異型プロモーターバリアントと非変異型プロモーターバリアントとの力価差のP値を計算した。培養期の間、力価を比較した。有意水準は0.05（5％）に設定された。
（表５）
例えば、CGC変異体は、トランスフェクション後127日目を除き、培養期の間中、対照と有意に異なっていた。
力価の比較は、全ての変異型細胞懸濁液が、対照より高い体積当たりの抗体産生量を有することを示した。
力価差の主要なエフェクターが発現強度であるかそれとも細胞濃度であるかを解明する必要があった。
この目的のため、変異体および対照の1細胞当たり1日当たりの抗体発現（qP）を、培養期の間中、比較した。培養期の最初（図11A）および最後（図11B）のqP値のパフォーマンスは力価値と比較可能であり、対照との差は比較的不明瞭であった。
CGC変異体およびCGG変異体については、培養の最初に、より高い力価が入手された。培養の最後に、CCG変異体およびCGG変異体は、対照よりわずかに高いqPを入手した。CGC変異型細胞は、培養期の最後に、より高いqP値を有した。
変異型細胞株および非変異型細胞株の比産生量を、チューキーのHSD検定によって比較した（表6）。それによって、CGC変異体の非変異型対照との差は次第に増加する。CCG変異についても、qP値の増加が入手された。
（表６）非変異型対照と比較されたhCMV-MIEプロモーター変異体のqPのチューキーのHSD検定によって計算されたP値
有意水準は0.05（5％）に設定された。
非変異型細胞株と比較された単一の変異型細胞株についてのqP値の差の時間依存的な増加を考慮すると、より高い安定性が提唱された。この仮説を試験するため、比産生量の相対変動を計算した。
最初に、最初の2つ（PSB＝68日目＆83日目）および最後の3つ（EOS＝124日目、127日目、＆131日目）のqP値を平均化することによって、日および分裂に依存性の比産生量の変動を安定化した。第2工程で、qPの変動を、安定化された終点と安定化された始点との比（％）として定義した。
平均qP EOS：最後の3つのqPの平均
平均qP PSB：最初の2つのqPの平均
平均qP PSB：最初の2つのqPの平均
CGCプロモーター変異体およびCCGプロモーター変異体を含むモノクローナル細胞株の長期安定性は、非変異型対照と比較して、より高かった（図12）。G-41プロモーター変異体は、培養期の間中、安定していたが、G-179点変異は、次第に増加するIgG発現（平均％ΔqP）をもたらす。二重変異CGGは、最初に高い発現値を有したが、次第に減少する。
（表７）
クローン細胞株の％ΔqPを、0.05（5％）の有意水準で比較した。
hCMV-MIEプロモーターバリアントCGC（16135）およびCCG（16136）を含むモノクローナル細胞株は、非変異型対照（21504）より有意に安定している。
Claims (14)
- 転写開始部位に対するヌクレオチド-41位および／または-179位にヌクレオチドGを有するヒトCMVプロモーター。
- SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸配列を有するプロモーター。
- SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸からなり、SEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸。
- 以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。 - 産生が大規模産生である、請求項4記載の方法。
- ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である、請求項4〜5のいずれか一項記載の方法。
- 核酸が、選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含むことを特徴とする、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
- 真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項4〜7のいずれか一項記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞であることを特徴とする、請求項8記載の方法。
- 哺乳動物細胞が、CHO細胞またはHEK細胞であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- ポリペプチドが、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、請求項4〜10のいずれか一項記載の方法。
- 選択可能マーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項8〜11のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03のプロモーターの使用。
- 請求項1記載のプロモーターまたは請求項3記載の核酸を含む、細胞。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14168901 | 2014-05-19 | ||
| EP14168901.8 | 2014-05-19 | ||
| EP14191705 | 2014-11-04 | ||
| EP14191705.4 | 2014-11-04 | ||
| PCT/EP2015/060880 WO2015177084A1 (en) | 2014-05-19 | 2015-05-18 | Method for production of polypeptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017515492A true JP2017515492A (ja) | 2017-06-15 |
| JP6661549B2 JP6661549B2 (ja) | 2020-03-11 |
Family
ID=53199978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016568645A Active JP6661549B2 (ja) | 2014-05-19 | 2015-05-18 | ポリペプチドの産生の方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10329595B2 (ja) |
| EP (1) | EP3146057B1 (ja) |
| JP (1) | JP6661549B2 (ja) |
| KR (1) | KR102337049B1 (ja) |
| CN (1) | CN106255757B (ja) |
| BR (1) | BR112016024103B1 (ja) |
| CA (1) | CA2943719A1 (ja) |
| ES (1) | ES2821940T3 (ja) |
| HK (1) | HK1232253A1 (ja) |
| HR (1) | HRP20201468T1 (ja) |
| MX (1) | MX2016014473A (ja) |
| PL (1) | PL3146057T3 (ja) |
| RU (1) | RU2699715C2 (ja) |
| SG (1) | SG11201609639VA (ja) |
| SI (1) | SI3146057T1 (ja) |
| WO (1) | WO2015177084A1 (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012099540A1 (en) * | 2011-01-17 | 2012-07-26 | Agency For Science, Technology And Research | Cmv promoter variants |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2318063T3 (es) * | 2001-02-23 | 2009-05-01 | The Scripps Research Institute | Polipeptidos derivados de la triptofanil arnt sintetasa utiles para la regulacion de la angiogenesis. |
| US7824907B2 (en) * | 2003-03-11 | 2010-11-02 | Merck Serono Sa | Expression vectors comprising the mCMV IE2 promoter |
| AU2007331463B2 (en) * | 2006-12-15 | 2014-03-27 | Ribovax Biotechnologies Sa | Antibodies against human cytomegalovirus (hCMV) |
| TW201120210A (en) * | 2009-11-05 | 2011-06-16 | Hoffmann La Roche | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
| CN102859001B (zh) * | 2010-04-14 | 2014-12-10 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于选择长期生产性细胞的方法 |
| SG191246A1 (en) * | 2010-12-24 | 2013-07-31 | Agency Science Tech & Res | Modified human cmv promoters that are resistant to gene silencing |
-
2015
- 2015-05-18 CN CN201580021834.3A patent/CN106255757B/zh active Active
- 2015-05-18 CA CA2943719A patent/CA2943719A1/en active Pending
- 2015-05-18 WO PCT/EP2015/060880 patent/WO2015177084A1/en active Application Filing
- 2015-05-18 MX MX2016014473A patent/MX2016014473A/es active IP Right Grant
- 2015-05-18 JP JP2016568645A patent/JP6661549B2/ja active Active
- 2015-05-18 BR BR112016024103-7A patent/BR112016024103B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2015-05-18 SI SI201531373T patent/SI3146057T1/sl unknown
- 2015-05-18 RU RU2016149411A patent/RU2699715C2/ru active
- 2015-05-18 SG SG11201609639VA patent/SG11201609639VA/en unknown
- 2015-05-18 PL PL15723910T patent/PL3146057T3/pl unknown
- 2015-05-18 KR KR1020167035518A patent/KR102337049B1/ko active IP Right Grant
- 2015-05-18 ES ES15723910T patent/ES2821940T3/es active Active
- 2015-05-18 EP EP15723910.4A patent/EP3146057B1/en active Active
-
2016
- 2016-11-18 US US15/356,091 patent/US10329595B2/en active Active
-
2017
- 2017-06-13 HK HK17105828.8A patent/HK1232253A1/zh unknown
-
2019
- 2019-05-03 US US16/402,545 patent/US20190360014A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-09-14 HR HRP20201468TT patent/HRP20201468T1/hr unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012099540A1 (en) * | 2011-01-17 | 2012-07-26 | Agency For Science, Technology And Research | Cmv promoter variants |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| OSTERLEHNER, A., ET AL.: ""Promoter methylation and transgene copy numbers predict unstable protein production in recombinant", BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 108, JPN6019008531, 2011, pages 2670 - 2681, XP055153387, ISSN: 0003996132, DOI: 10.1002/bit.23216 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2821940T3 (es) | 2021-04-28 |
| MX2016014473A (es) | 2017-01-23 |
| PL3146057T3 (pl) | 2020-12-14 |
| CA2943719A1 (en) | 2015-11-26 |
| JP6661549B2 (ja) | 2020-03-11 |
| CN106255757A (zh) | 2016-12-21 |
| WO2015177084A1 (en) | 2015-11-26 |
| RU2016149411A (ru) | 2018-06-20 |
| KR102337049B1 (ko) | 2021-12-08 |
| SI3146057T1 (sl) | 2020-11-30 |
| EP3146057A1 (en) | 2017-03-29 |
| HK1232253A1 (zh) | 2018-01-05 |
| HRP20201468T1 (hr) | 2020-12-11 |
| BR112016024103B1 (pt) | 2022-12-27 |
| CN106255757B (zh) | 2020-08-11 |
| EP3146057B1 (en) | 2020-07-29 |
| KR20170003699A (ko) | 2017-01-09 |
| SG11201609639VA (en) | 2016-12-29 |
| RU2699715C2 (ru) | 2019-09-09 |
| US20190360014A1 (en) | 2019-11-28 |
| BR112016024103A2 (pt) | 2018-01-23 |
| US10329595B2 (en) | 2019-06-25 |
| RU2016149411A3 (ja) | 2019-04-25 |
| US20170067087A1 (en) | 2017-03-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2008271658B8 (en) | Promoter | |
| JP2010536396A (ja) | タンパク質力価を増加させる方法 | |
| EP2938728B1 (en) | Artificial introns | |
| JP7450647B2 (ja) | Ｓｉｒｔ－１遺伝子ノックアウトを有する哺乳類細胞株 | |
| Doan et al. | Effects of ubiquitous chromatin opening element (UCOE) on recombinant anti-TNFα antibody production and expression stability in CHO-DG44 cells | |
| JP6661549B2 (ja) | ポリペプチドの産生の方法 | |
| WO2014126254A1 (ja) | 膜結合型タンパク質発現ベクター | |
| EP1957660B1 (en) | Materials and methods to increase peptide chain expression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180502 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190313 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190313 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190606 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190911 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200116 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200212 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6661549 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |