ES2811648T3

ES2811648T3 - Expresión de proteína biotecnológica mejorada que usa un activador CHEF1 híbrido

Info

Publication number: ES2811648T3
Application number: ES14727377T
Authority: ES
Inventors: Howard R Clarke
Original assignee: AGC Biologics Inc
Current assignee: AGC Biologics Inc
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: US20210340560A1; US20160177335A1; KR20150126399A; PT2971005T; US9957525B2; SI2971005T1; US9297024B2; HRP20201442T1; AU2014248936A1; PL2971005T3; EP3770263A1; DK2971005T3; LT2971005T; NZ711654A; HUE050362T2; US20190071691A1; CN110042122A; CN105209625A; CA2904125A1; CY1123336T1

Abstract

Un vector de expresión que comprende ADN regulador de la transcripción del factor 1α de elongación de hámster chino (CHEF1) 5' y un activador de citomegalovirus (CMV) que comprende: (1) Secuencia ID nº: 6; o (2) Secuencia ID nº: 7, en donde dicho vector de expresión presenta al menos dos veces mayor productividad específica en comparación con un vector de expresión de referencia que tiene el ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' pero que no comprende el activador de citomegalovirus (CMV).

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión de proteína biotecnológica mejorada que usa un activador chefl híbrido

Esta solicitud contiene, como parte separada de la descripción, una lista de secuencias en forma legible por ordenador (Nombre de archivo: 44744A_SeqListing.txt; Tamaño: 37.528 bytes; Creado: 11 de marzo de 2014).

Referencia cruzada con solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de EE.UU. n° de serie 61/777.603, presentada el 12 de marzo de 2013.

Campo de la invención

Esta invención está dirigida a vectores de expresión que comprenden una nueva combinación de activadorpotenciador que aumenta la expresión de proteínas heterólogas y tiene aplicación práctica en el campo de la producción de proteínas biotecnológicas.

Antecedentes de la invención

El aumento de la expresión de proteínas biotecnológicas mediante mejoras en la transcripción, traducción, plegamiento y/o secreción de proteínas es una prioridad fundamental para optimizar el rendimiento durante el desarrollo de la estirpe celular. El sistema de expresión del factor 1-a de alargamiento de ovario de hámster chino (CHEF1) se ha utilizado ampliamente para crear estirpes celulares clínicas para producir proteínas biotecnológicas. El gen del factor 1-a de alargamiento (EF-1a) se expresa mucho en la mayoría de los tipos de tejidos, y EF-1 es una de las proteínas más abundantes en las células humanas (Beck et al., Molecular Systems Biology 7: 549; 2011) Los vectores de expresión CHEF1 consiguen una expresión de proteína biotecnológica de alto nivel en células de ovario de hámster chino (CHO), así como en células que no son de hámster.

La expresión de CHEF1 se coordina con el crecimiento de tal manera que los aumentos del valor se deben a una mayor productividad volumétrica. Normalmente, la expresión de proteínas se inicia al principio en la fase exponencial de crecimiento y disminuye durante la fase estacionaria y el descenso. El vínculo entre la expresión de proteínas y el crecimiento celular es coherente con la regulación del gen EF-1 a natural, que se expresa constitutivamente para funcionar en complejos de proteínas ribosómicas. Se ha documentado que la expresión de EF-1 a aumenta en transformada (Sanders et al., Nucleic Acids Research 20: 5907; 1992) y células estimuladas por mitógenos (Thomas y Thomas, Journal of Cell Biology 103: 2137; 1986), coherente con la expresión constitutiva de EF-1 a en células en crecimiento activo. Además del control de la transcripción en las células en crecimiento, el factor de crecimiento insulina regula la traducción de EF-1 a a través de la región no traducida de ARNm 5' (5'UTR) (Hammond y Bowman, Journal of Biological Chemistry 25: 17785; 1988; Proud y Denton, Biochemical Journal 328: 329; 1997) Este control de la traducción se consigue mediante la secuencia del Tracto de Polipirimidina (TOP) que se encuentra en el 5'UTR (Mariottini y Amaldi, Molecular and Cellular Biology 10: 816; 1990).

Se ha demostrado que los sistemas de expresión CHEF1 son capaces de alcanzar niveles más altos de expresión de proteínas que los vectores que emplean otros activadores utilizados habitualmente, como los activadores de citomegalovirus (CMV), EF-1 a humano y el virus Simian 40 (SV40) (Running Deer and Allison, Biotechnology Progress 20: 880; 2004) El activador de CMV es uno de los activadores más utilizados para la expresión de proteínas biotecnológicas. Por ejemplo, el sistema de glutamina sintetasa (GS) utiliza un activador de CMV murino o humano (Kalwy, S.,”Towards stroger gene expression - a promoter tale”, 19a reunión de la Sociedad Europea de Tecnología de Células Animales (ESACT), 2005). El plásmido pcDNA™ 3 de expresión comercial (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) lleva un activador de CMV procedente del gen principal inmediato-inicial (IE) (Registro en GenBank n° K03104.1) descrito anteriormente (Boshart et al., Cell 1985; 4:521) Otro activador de CMV frecuentemente utilizado procede de la cepa AD 169 de CMV humano (n° de registro en GenBank X17403.1), también conocido como virus del herpes humano 5.

Los vectores que contienen ADN regulador CHEF1 producen una expresión mejorada de proteínas biotecnológicas que es hasta 280 veces mayor que la de los plásmidos controlados por CMV (Running Deer y Allison, 2004). Se ha conseguido una mayor expresión de una variedad de proteínas de interés, incluidas las proteínas segregadas y unidas a la membrana, en diferentes estirpes celulares eucariotas, incluidas las células que no son de hámster, usando vectores dirigidos por CHEF1. Las eficiencias de transfección entre los vectores CHEF1 y CMV son comparables, pero los niveles de expresión en clones transfectados con vectores CHEF1 son generalmente uniformemente más altos. El documento WO2007/081336A1 describe un vector de expresión que comprende un primer elemento regulador, una secuencia activadora, una secuencia principal, una secuencia de clonación múltiple, una señal de poliadenilación y un segundo elemento regulador, en donde el primer y segundo elementos reguladores comprenden secuencias de un factor-1 de elongación de mamífero que puede ser factor de elongación-1 humano, de hámster chino, gato o chimpancé. La secuencia activadora puede comprender un activador de CMV.

A pesar del éxito demostrado de los vectores CHEF1 para impulsar la expresión de alto nivel de proteínas biotecnológicas, continúa habiendo necesidad de desarrollar mejores sistemas de expresión.

Compendio de la invención

La descripción proporciona un vector de expresión para la expresión de alto nivel de proteínas biotecnológicas. El vector de expresión comprende elementos de ADN reguladores de la transcripción CHEF1 y un activador de CMV según la reivindicación 1.

En este documento se describe un vector de expresión que comprende ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1'. El ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1 , expuesto en la presente memoria, comprende la SEC ID n°: 1. El ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1,expuesto en la presente memoria, puede comprender el ADN situado entre la posición 1 y la posición 11.716 en la SEC ID n°: 1. El ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1 puede comprender el ADN situado entre las posiciones 10.744 y 11.716 en la SEC ID n°: 1. El ADN regulador de la transcripción 5' CHEF1 puede comprender la SEC ID n°: 2. El ADN regulador de la transcripción 5' CHEF1 puede comprender el ADN situado entre la posición 1 y la posición 4.057 en SEQ ID n°: 2.

Un vector de expresión, expuesto en la presente memoria, según la descripción comprende además el ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 puede comprender la SEC ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 puede comprender el ADN situ.ado entre la posición 1 y la posición 4.180 en la SEC ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 puede comprender el ADN situado entre la posición 1 y la posición 209 en la SEQ ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3’ CHEF1 'puede comprender aproximadamente 4,2 kilobases.

El vector de expresión según la descripción comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 y un activador de CMV. En diversas realizaciones, el vector de expresión comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 y una secuencia de AdTPL. En varios aspectos, el vector de expresión comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1, un activador de CMV y una secuencia de AdTPL.

En el vector de expresión según la descripción, se inserta un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL en el ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1. Debidamente, el vector de expresión puede comprender ADN dispuesto en la SEQ ID n°: 1, una o más bases entre la posición 1 y la posición 11.716 en la SEQ ID n°: 1, se eliminan/reemplazan con un activador de CMV y/o una secuencia AdTPL. Una o más bases entre la posición 10.512 y la posición 11.716 en SEQ ID n°: 1 pueden eliminarse y reemplazarse con un activador de CMV y/o secuencia AdTPL. Un vector de expresión según la descripción comprende uno o más de los polinucleótidos expuestos en SEQ ID n°: 6 y SEQ ID n°: 7.

En diversas realizaciones, un vector de expresión según la descripción comprende además un gen marcador seleccionable. Un vector de expresión, expuesto en la presente memoria, según la descripción puede comprender además un polinucleótido que codifica una proteína de interés que está operativamente unida al ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1, el ADN regulador de la transcripción 3’ CHEF1, el activador del CMV y/o la secuencia AdTPL.

La descripción también proporciona células anfitrionas transformadas, transducidas o transfectadas con un vector de expresión según la invención que comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 y un activador de CMV y/o una secuencia AdTPL según la reivindicación 1. En diversos aspectos, la célula anfitriona es una célula procariota o eucariota. En varios aspectos, la célula anfitriona es una célula de hámster, y en diversas realizaciones, la célula anfitriona es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En varios aspectos, la célula anfitriona es una célula de mamífero distinto del hámster. En diversas realizaciones, la célula anfitriona es una célula humana. El vector de expresión de la descripción que comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 en combinación con un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL consigue un aumento sinérgico en la capacidad de expresión de proteínas de las células anfitrionas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una cartografía del vector de expresión pDEF85 que comprende ADN regulador de la transcripción 5 'y 3' CHEF1 y un activador de CMV. El activador de CMV reemplaza 1.217 nucleótidos (desde la posición 2.866 a la posición 4.083) del ADN 5’ CHEF1 en el vector pDEF38 para crear pDEF85. Los genes indicadores GP1 y MAb1 se clonaron en las secuencias de clonación XhoI - XbaI para hacer los vectores de expresión pDEF85-GP1 y pDEF85-MAb1.

La figura 2 muestra una cartografía del vector de expresión pDEF86 que comprende ADN regulador de la transcripción 5' y 3' CHEF1, un activador de CMV y una secuencia AdTPL. El activador de CMV y la secuencia AdTPL reemplazan 1.217 nucleótidos (desde la posición 2.866 a la posición 4.083) del ADN 5' CHEF1en el vector pDEF38 para crear pDEF86. Los genes indicadores GP1 y MAb1 se clonaron en las secuencias de clonación XhoI - XbaI para hacer los vectores de expresión pDEF86-GP1 y pDEF86-MAb1.

La figura 3 muestra la viabilidad de las células anfitrionas CHO transfectadas con el vector pDEF38-GP1, pDEF85-GP1 o pDEF86-GP1. Las células se recuperaron durante 2-3 días en medios CD-CIM1 más HT no seleccionados y se volvieron a poner en suspensión en medios de selección que carecían de HT (Paso 0). Las células se pasaron cada 2 a 3 días a medida que lo permitía el número de células. El número de pasos se proporciona en el eje x, y el porcentaje de viabilidad celular se muestra en el eje y.

La figura 4 muestra la viabilidad y productividad de las células anfitrionas CHO transfectadas con el vector pDEF38-GP1, pDEF85-GP1 o pDEF86-GP1. Los grupos de transfección replicados se realizaron en modelos de producción de lotes alimentados 12 días y se alimentaron con Feed C los días 3, 5 y 7 y CB los días 0, 3, 5 y 7 en medios de base CD-CIM1. Las producciones se realizaron a 37°C y se cambiaron a 34°C el tercer día. La densidad de células viables, el porcentaje de viabilidad y la productividad se midieron los días 3, 5, 7, 10 y 12. La figura 4A muestra la densidad de células viables, con los días mostrados en el eje x y la densidad de células viables, medida en 105 células por mililitro, representada en el eje y. La figura 4B muestra el porcentaje de viabilidad, con los días mostrados en el eje x y el porcentaje de viabilidad celular representado en el eje y. La figura 4C muestra la productividad, con los días mostrados en el eje x y el valor de proteínas, en microgramos por mililitro, representados en el eje y.

La figura 5 muestra la productividad específica de las células anfitrionas CHO transfectadas con el vector pDEF38-GP1, pDEF85-GP1 o pDEF86-GP1. El área celular integrada (ICA), medida en millones de células por mililitro multiplicada por el día, se muestra en el eje x y el valor de proteína, medido en microgramos por mililitro, se representa en el eje y. Los valores de productividad específica se calcularon en picogramos de proteína por célula por día como promedio durante todo el cultivo celular.

La figura 6 muestra la productividad de las células anfitrionas CHO transfectadas con los vectores pDEF38-GP1, pDEF85-GP1 o pDEF86-GP1 cultivados en medios enriquecidos con BF1. Los grupos de transfección replicados se realizaron en modelos de producción de lotes alimentados de 12 días y alimentados con BF1 en medio base CD-CIM1 más CB los días 4, 6, 8, 10 y 12. Las producciones se realizaron a 37°C y se cambiaron a 34°C el día 3. Las muestras de valor se midieron los días 5, 7, 10 y 12. Los días se muestran en el eje x y el valor de proteína, medido en microgramos por mililitro, se representa en el eje y.

La figura 7 muestra el crecimiento y la productividad de las células anfitrionas CHO transfectadas con el vector pDEF38-MAb1, pDEF85-MAb1 o pDEF86-MAb1 cultivadas en medios enriquecidos con BF1. Los grupos de transfección replicados se realizaron en modelos de producción de lotes alimentados de 12 días y se alimentaron con BF1 en medio base CD-CIM1 más CB los días 4, 6, 8, 10 y 12. Las producciones se realizaron a 37°C y se cambiaron a 32,5°C el día 5. Las muestras de valores de anticuerpos se midieron los días 7, 10, 12 y 14. La figura 7A muestra el crecimiento, mostrándose los días en el eje x y la densidad de células viables, medida en 105 células por mililitro, representada en el eje y. La figura 7B muestra la productividad, mostrándose los días en el eje x y los valores de proteínas, medidos en microgramos por mililitro, representados en el eje y.

La figura 8 muestra el crecimiento y la productividad de las células anfitrionas CHO transfectadas con el vector pDEF38-MAb1 o pDEF85-MAb1. Doce clones seleccionados al azar que expresan MAb1 después de la transfección con pDEF38 o pDEF85 se realizaron en modelos de producción de lotes alimentados de 12 días y se alimentaron con BF1 en medios de base CD-CIM1 más CB los días 4, 6, 8, 10 y 12. Se realizaron las producciones a 37°C y se cambiaron a 32,5°C el día 5. La densidad de células viables y el valor de anticuerpos se midieron los días 4, 6, 11 y 13. La figura 8A muestra el crecimiento de cada clon, mostrándose los días en el eje x y la densidad de células viables, medida en 105 células por mililitro, representada en el eje y. La figura 8B muestra la productividad de cada clon, mostrándose los días en el eje x y los valores de anticuerpos, medidos en microgramos por mililitro, representados en el eje y.

La figura 9 muestra la productividad de las células anfitrionas CHO transfectadas con el vector pDEF38-GP1 o pDEF85-GP1. Se seleccionaron ocho clones que expresaban GP1 después de la transfección con pDEF38-GP1 o pDEF85-GP1 usando citometría de flujo y se realizaron en un modelo de producción de lotes alimentados de 12 días. Los clones se alimentaron con BF1 en medio base CD-CIM1 más CB los días 4, 6, 8, 10 y 12. Las producciones se realizaron a 37°C y se cambiaron a 32,5°C el día 3. Los valores se midieron los días 5, 7, 10, 12 y 14. La figura 9A muestra la productividad de los clones transfectados con el vector pDEF38-GP1 de CHEF1, mostrándose los días en el eje x y el valor de proteína, medido en microgramos por mililitro, representado en el eje y. La figura 9B muestra la productividad de los clones transfectados con el vector pDEF85-GP1 del CHEF1 -CMV, mostrándose los días en el eje x y el valor de proteína, medido en microgramos por mililitro, representado en el eje y.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

La presente descripción proporciona un vector de expresión que comprende una combinación de elementos de ADN reguladores para lograr una expresión proteica de alto nivel y una productividad mejorada en comparación con los vectores conocidos en el campo. La descripción también proporciona una célula anfitriona transformada con un vector de expresión descrito en la presente memoria. El vector de expresión de la descripción comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 combinado con un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL. El uso de elementos de ADN reguladores de la transcripción CHEF1 en un vector de expresión para lograr una expresión de alto nivel de proteínas biotecnológicas se ha descrito anteriormente (Patente de EE.UU. n° 5.888.809; Running Deer y Allison, 2004) Se ha demostrado que la expresión de proteínas de los vectores dirigidos por CHEF1 es significativamente mayor que la de los vectores controlados por el activador del CMV para una serie de proteínas diferentes y tipos de células anfitrionas, y el aumento puede ser mayor de 250 veces (Running Deer y Allison, 2004) . La secuencia AdTPL es una secuencia no codificante 5' de 200 nucleótidos que se encuentra en los ARNm víricos tardíos que mejora su traducción (Logan, PNAS 81: 3655; 1984).

Considerando la expresión de proteína mejorada obtenida usando vectores controlados por CHEF1, la adición de regiones de control distintas de CHEF1, tales como un activador de CMV o una secuencia de AdTPL, a un vector de expresión de CHEF1 sería ilógica. La presencia de dichas regiones de control distintas de CHEF1 podría interrumpir la acción cooperativa de cada uno de los elementos reguladores de la transcripción CHEF1 y no cabría esperar que actuara en concierto con el ADN regulador CHEF1 para producir una expresión de proteína mejorada. Sin embargo, el vector de expresión de la presente descripción, que comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 y un activador de CMV y/o una secuencia AdTPL, sorprendentemente produce un aumento de la expresión de proteína en comparación con los vectores que comprenden solo regiones de control CHEF1.

Como se emplea en el presente documento, las siguientes definiciones pueden ser útiles para ayudar al profesional experto a comprender la descripción:

La expresión "vector de expresión" se refiere a cualquier molécula utilizada para transferir información de codificación a una célula anfitriona. En varios aspectos, el vector de expresión es un ácido nucleico, un plásmido, un cósmido, un virus o un cromosoma artificial.

La expresión "célula anfitriona" se refiere a una célula que ha sido transformada, transfectada o transducida por un vector de expresión que lleva un gen de interés, que luego es expresado por la célula. Una célula anfitriona es, en varios aspectos, una célula procariota o eucariota. En varios aspectos, la célula anfitriona es una célula bacteriana, una célula protista, una célula fúngica, una célula vegetal o una célula animal. La expresión también se refiere a la descendencia de la célula madre anfitriona, independientemente de si la descendencia es idéntica en genotipo o fenotipo a la madre, siempre que el gen de interés esté presente.

La expresión "activador de CMV" se refiere a secuencias de activador de CMV conocidas en la técnica. En varios aspectos, el activador de CMV es de cualquier origen, incluyendo murino (mCMV) o humano (hCMV). En varios aspectos, un hCMV procede de cualquier cepa de CMV. En varios aspectos, la cepa de CMV es AD169, Davis, Toledo o Towne. En diversas realizaciones de la descripción, el activador de CMV contiene el polinucleótido expuesto en la SEC ID n2: 4.

La expresión "secuencia de AdTPL" se refiere a la secuencia no codificante 5' de aproximadamente 200 nucleótidos presente en los ARNm víricos tardíos de adenovirus humano que se conoce en la técnica. En diversas realizaciones, la secuencia de AdTPL contiene el polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 5.

La expresión "ADN regulador de la transcripción CHEF1" se refiere a secuencias no codificantes que contienen elementos reguladores que actúan en cis capaces de controlar la transcripción del gen CHEF 1, tal como la región activadora y elementos tales como potenciadores, aislantes y regiones de unión a la estructura/matriz.

La expresión "ADN regulador de la transcripción CHEF1 5'" se refiere al ADN, cuando está en la naturaleza, está situado en 5', es decir, aguas arriba, del codón de iniciación en el gen CHEF1 en el genoma del hámster chino.

La expresión "ADN regulador de la transcripción CHEF1 3'" se refiere al ADN, cuando en la naturaleza, está situado en 3', es decir, aguas abajo, del codón de terminación en el gen CHEF1 en el genoma del hámster chino.

Los términos "aproximadamente" y "alrededor de" se refieren a cantidades que están dentro del intervalo cercano de una cantidad de referencia. Con respecto a los polinucleótidos, una secuencia que es o está aproximadamente/alrededor de una longitud especificada está dentro del 5% de la longitud citada.

En varios aspectos, un vector de expresión según la descripción comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 y un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL. En varios aspectos, el ADN regulador de la transcripción CHEF1 comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' y/o ADN regulador de la transcripción CHEF1 3'.

El ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' expuesto en la presente memoria, comprende el polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 1. La descripción también proporciona ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, a al menos 96%, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos un 70% idéntico al polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 1. El ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' expuesto en la presente memoria, comprende el ADN situado entre la posición 1 y la posición 11.716 de la SEQ ID n°: 1, es decir, una porción de la SEQ ID n°: 1. La descripción también proporciona ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96%, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos 70% idéntico al ADN situado entre la posición 1 y la posición 11.716 en la SEQ ID n°: 1. El ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' puede comprender ADN situado entre la posición 10.744 y la posición 11.716 en la SEC ID n°: 1. La descripción también proporciona ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96 %, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos 70 % idéntico al ADN situado entre la posición 10.744 y la posición 11.716 en la SEQ ID n°: 1. Como se expuso en la presente memoria, el ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' puede comprender el polinucleótido expuesto en la SEC ID n°: 2. Como se expuso en la presente memoria también proporciona ADN regulador de la transcripción 5' CHEF1que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96%, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos 70% idénticos al polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 2. Como se expuso en la presente memoria, el ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' puede comprender ADN situado entre la posición 1 y la posición 4.057 de la SEC ID n°: 2, es decir, una porción de la SEC ID n°: 2. La descripción también proporciona ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' ADN que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96%, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos 70% idénticos al ADN situado entre la posición 1 y la posición 4.057 de la SEQ ID n2: 2.

Como se expuso en la presente memoria, el vector de expresión además puede comprender ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 puede comprender el polinucleótido expuesto en la SEC ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 expuesto en la presente memoria, puede ser al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96 %, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos 70 % idéntico al polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 puede comprender el ADN situado entre la posición 1 y la posición 4.180 en la SEQ ID n°: 3, es decir, una porción de la SEQ ID n°: 3. La descripción también proporciona ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96%, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92% , al menos el 91%, al menos el 90%, al menos el 85%, al menos el 80%, al menos el 75% o al menos el 70% idéntico al ADN situado entre la posición 1 y la posición 4.180 en SEQ ID n°: 3, es decir, un porción de SEQ ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 puede comprender ADN situado entre la posición 1 y la posición 209 en la SEQ ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3' HEF expuesto en la presente memoria, puede ser al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96% , al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos 70% idéntico al ADN situado entre la posición 1 y la posición 209 en SEQ ID n°: 3. El ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1 puede comprender aproximadamente 4,2 kilobases.

El vector de expresión expuesto en la presente memoria puede comprender elementos de ADN regulador de la transcripción CHEF1 y un activador de CMV. El activador de CMV expuesto en la presente memoria, puede comprender el polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 4. La descripción también proporciona un activador de CMV que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96%, al menos 95%, al menos 94%, al menos 93%, al menos 92%, al menos 91%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75% o al menos 70% idéntico al polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 4. En varios aspectos, el vector de expresión que comprende ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1 y un activador de CMV comprende el polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 6. La descripción también proporciona un vector que comprende ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1 y un activador de CMV idéntico al polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 6. El vector de expresión expuesto en la presente memoria, comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 y una secuencia AdTPL. En varios aspectos, la secuencia AdTPL comprende el polinucleótido expuesto en la SEC ID n°: 5. El vector de expresión expuesto en la presente memoria, comprende ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1, un activador de CMV y una secuencia AdTPL. El vector de expresión expuesto en la presente memoria, comprende ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1, un activador de CMV, y una secuencia de AdTPL comprende el polinucleótido expuesto en la SEC ID n°: 7. La descripción también expone un vector que comprende ADN regulador de la transcripción 5' CHEF1, un activador de CMV, y una secuencia de AdTPL que es al menos 99%, al menos 98%, al menos 97%, al menos 96% o al menos 95% idéntica al polinucleótido expuesto en la SEQ ID n°: 7.

Se inserta un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL en el ADN regulador de la transcripción 5' CHEF1 en un plásmido de expresión según la descripción. Un vector de expresión expuesto en la presente memoria comprende ADN expuesto en la SEQ ID n°: 1, en donde una o más bases entre la posición 1 y la posición 11.716 de la SEQ ID n°: 1 se eliminan y reemplazan por un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL. La región proximal del activador 5’ CHEF1 se reemplaza por un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL. Por ejemplo y sin limitación, una o más bases entre la posición 10.512 y la posición 11.716 de la SEC ID N°: 1 se eliminan y se reemplazan por un activador de CMV, una secuencia de AdTPL o un activador de CMV y una secuencia de AdTPL.

El vector de expresión según la descripción comprende además un polinucleótido que codifica una proteína de interés. El polinucleótido puede estar operativamente unido al ADN regulador de la transcripción 5’ CHEF1, el ADN regulador de la transcripción 3' CHEF1, el activador de CMV y/o la secuencia de AdTPL. El vector de expresión es útil para cualquier proteína y se espera que proporcione una expresión de proteína mayor que CHEF1 o CMV solo. En varios aspectos, el vector de expresión comprende además un gen marcador seleccionable para la identificación de células transformadas. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, neomicina fosfotransferasa (npt II), higromicina fosfotransferasa (hpt), dihidrofolato reductasa (dhfr), zeocina, fleomicina, gen de resistencia a bleomicina (ble), gentamicina acetiltransferasa, estreptmicin fosfotransferasa forma mutante de acetolactato sintasa (als), bromoxinil nitrilasa, fosfinotricin acetil transferasa (bar), enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa (aro A), molécula del receptor de tirosina cinasa específica de músculo (MuSK-R), superóxido de cobre-zinc dismutasa (sod1), metalotioneínas (cupl, MT1), beta-lactamasa (BLA), puromicin N-acetil-transferasa (pac), blasticidin acetil transferasa (bls), blasticidin desaminasa (bsr), histidinol deshidrogenasa (HDH), N-succinil-5aminoimidazol-4-carboxamida ribotida (SAICAR) sintetasa (adel), argininosuccinato liasa (arg4), beta-isopropilmalato deshidrogenasa (leu2), invertasa (suc2), orotidina-5'-fosfato (OMP) descarboxilasa (ura3) y ortólogos de cualquiera de los anteriores.

La descripción también proporciona células anfitrionas transformadas, transducidas o transfectadas con un vector de expresión de la invención que comprende ADN regulador de la transcripción CHEF1 y un activador de CMV y/o una secuencia de AdTPL. En varios aspectos, la célula anfitriona es una célula procariota o eucariota. En varios aspectos, la célula anfitriona es una célula de hámster. En varios aspectos, la célula de hámster es una célula CHO. En diversas realizaciones, la célula anfitriona es una célula de mamífero destinto de hámster, y en diversos aspectos, la célula es una célula humana.

Un plásmido de expresión según la descripción se describe con más detalle en el siguiente ejemplo. El ejemplo sirve solo para ilustrar la invención y no pretende limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplo

Secuencia génica y vectores de expresión - Los fragmentos de ADN que codifican el activador de CMV (SEQ ID n°: 4) y el activador de CMV-AdTPL (SEQ ID n°: 5) se sintetizaron químicamente y se clonaron en pDEF38, un vector de expresión CHEF1 descrito previamente (Running Deer y Allison, 2004), creando el vector activador CHEF1-CMV denominado pDEF85 (figura 1) y el vector activador CHEF1 -CMV-AdTPL denominado pDEF86 (figura 2). Los vectores derivados que expresan una fusión de glucoproteína-Fc (GP1) y un anticuerpo IgG1 (MAb1) se crearon utilizando técnicas habituales de biología molecular (Maniatis et al., J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 545, 1982) y se denominaron pDEF38-GP1, pDEF85-GP1, pDEF86-GP1, pDEF38-MAb1, pDEF85-MAb1 y pDEF86-MAb1.

Construcción de estirpe celular - Los vectores de expresión pDEF38-GP1, pDEF85-GP1, pDEF86-GP1, pDEF38-MAb1, pDEF85-MAb1 y pDEF86-MAb1 se transfectaron individualmente en células CHO DG44 mediante métodos habituales de electroporación, se cultivaron durante dos días en medios no seleccionados que contienen hipoxantina y timidina (HT), y a continuación se seleccionaron durante aproximadamente dos semanas en medios que carecen de HT. Las poblaciones de células seleccionadas, o grupos de transfección, se expandieron y se dividieron en cultivos modelo de producción para evaluar la productividad y también se dividieron simultáneamente en cultivos para la clonación de células individuales.

Modelos de producción - Se realizaron modelos de producción de lotes alimentados a pequeña escala para evaluar la productividad del cultivo (valor) siguiendo los procesos habituales de fabricación de productos biológicos. Los cultivos se inocularon a densidades de siembra de 0,5 millones de células por mililitro en matraces de agitación de medios químicamente definidos (CD-CIM1, CMC Biologics, Bothell, WA) que carecen de HT. Los cultivos se realizaron durante 3 a 5 días a 37°C y luego se cambiaron a temperaturas más bajas (30°C a 34°C) para ralentizar el crecimiento y favorecer la producción. Los cultivos se alimentaron con los complementos Balanced Feed 1 (BF1, CMC Biologics), Efficient Feed C (Feed C, Life Technologies, Grand Island, NY) o Cell Boost (CB, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) para prolongar la salud del cultivo. Las muestras para el valor y las densidades celulares se recogieron los días 3, 5, 7, 10, 12, 14 y 16. El estudio se concluyó del día 12 al 16. Los sobrenadantes de la cosecha se filtraron a través de filtros de 0,2 micrómetros y luego se analizaron para determinar la producción de GP1 o MAb1 por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de Proteína A.

Clonación de estirpes celulares - Grupos de transfección seleccionados que expresan GP1 y MAb1 se diluyeron para sembrar células aisladas en cada uno de los pocillos de placas de 96 pocillos. Se tomaron imágenes de las placas desde la inoculación hasta dos semanas para identificar estirpes celulares monoclonales que se originan a partir de células aisladas. Los pocillos que contenían colonias monoclonales se expandieron y se eligieron al azar o se seleccionaron usando citometría de flujo para identificar células muy expresadas de cada grupo de transfección. Las estirpes celulares se expandieron para crecer en cultivo en suspensión y se dividieron en cultivos modelo de producción para evaluar la productividad.

Citometría de flujo - El análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) se realizó con células de crecimiento normal del día 2 que se cosecharon y se tiñeron con anticuerpo fluorescente anti-IgG1 Fc (RPE) para detectar la expresión biotecnológica de GP1 y MAb1.

Resultados y exposición

Las estirpes celulares estables que expresan la proteína indicadora GP1 o MAb1 se hicieron usando los vectores de expresión pDEF38, pDEF85 y pDEF86 usando métodos habituales de selección DHFRr. Los grupos de transfección se seleccionaron en medios que carecían de hipoxantina y timidina (HT) sin usar metotrexato. Las viabilidades celulares disminuyeron en los medios que carecían de HT y luego se recuperaron a medida que las células con vectores DHFR crecieron en la población. Los cultivos de transfección disminuyeron inicialmente desde aproximadamente 10% a aproximadamente 30% de viabilidad y luego alcanzaron más de 90% de viabilidad alrededor del día 12 (Paso 6). El crecimiento de células transfectadas con un vector CHEF1-CMV (pDEF85-GP1) o un vector CHEF1-CMV-AdTPL (pDEF86-GP1) en comparación con las células transfectadas con un solo vector CHEF1 (pDEF38-GP1) mostró una recuperación similar para los montajes que expresan GP1, con un crecimiento constante de alta viabilidad después del período de recuperación (figura 3). Se obtuvieron resultados similares para estirpes celulares que expresan anticuerpos (datos no mostrados).

Se colocaron grupos de transfección directamente en modelos de producción o se avanzó en la clonación de células aisladas y luego las estirpes celulares clonales se compararon en modelos de producción. La figura 4 demuestra que el crecimiento del modelo de producción del matraz en agitación alimentado por lotes era comparable para los grupos que expresan GP1 (figura 4A); sin embargo, la expresión de proteínas (valor) en la cosecha, normalmente de 12 a 16 días desde la inoculación, fue significativamente diferente. Los valores de cosecha del día 12 para los vectores de expresión CHEF1 -CMV o CHEF1 -CMV-AdTPL (pDEF85 y pDEF86) fueron mucho mayores que para el vector CHEF1 estándar (pDEF38) (figura 4C). La cantidad de proteína GP1 biotecnológica producida a partir de transfectantes agrupados en matraces en agitación alimentados por lotes de los vectores CHEF1-CMV o CHEF1-CMV-AdTPL fue aproximadamente el doble del vector CHEF1 estándar. El crecimiento de los grupos CHEF1-CMV y CHEF1-CMV-AdTPL alcanzó su punto máximo un poco antes y mostró una disminución más rápida de la viabilidad (figura 4B). No estaba previsto que la caída de la viabilidad mejorara la expresión y, en cambio, podría ser perjudicial. Experimentos posteriores demostraron que mejorar la viabilidad final aumentaba el valor para los cultivos CHEF1-CMV.

El aumento en el valor observado con los vectores CHEF1 -CMV y CHEF1 -CMV-AdTPL fue el resultado de una mayor productividad específica, como se ve en la figura 5. La productividad específica se calculó en picogramos de proteína por célula por día en promedio durante toda la duración del cultivo. Hubo una ligera diferencia de expresión entre los montajes CHEF1 -CMV (pDEF85) y CHEF1 -CMV-AdTPL (pDEF86), lo que indica una posible ventaja de la adición de la secuencia AdTPL con respecto a la productividad específica. Las productividades específicas en picogramos por célula por día (PCD) se muestran en la Tabla 1. La productividad específica lograda usando los vectores CHEF1-CMV o CHEF1 -CMV-AdTPL fue más de dos veces mayor que la productividad específica del vector CHEF1.

Tabla 1

Se confirmó la expresión mejorada con los vectores CHEF1-CMV y CHEF1-CMV-AdTPL usando diferentes proteínas indicadoras y diversas condiciones de producción de lotes alimentados. Las células cultivadas en medios de base CD-CIM1 enriquecidos con CB que fueron alimentados con un complemento patentado BF1 los días 4, 6, 8, 10 y 12 demostraron características de productividad de GP1 similares en comparación con las células enriquecidas con medios comerciales (Feed C). La figura 6 muestra que los cultivos del vector CHEF1-CMV y CHEF1-CMV-AdTPL habían aumentado los valores de GP1 sobre el vector CHEF1 de referencia en el proceso BF1.

La producción de anticuerpos (MAb1) que utiliza los vectores CHEF1-CMV y CHEF1-CMV-AdTPL se probó también en el proceso BF1. Los grupos de transfección de MAb1 se crearon con la misma metodología que los grupos GP1 y, una vez recuperados completamente de la selección, se introdujeron en modelos de producción con matraces en agitación alimentados por lotes. Como se muestra en la figura 7, los grupos CHEF1-CMV y CHEF1-CMV-AdTPL MAb1 produjeron anticuerpos de valores mayores que las referencias pDEF38 después del día 12. La curva de productividad en los grupos de transfección que expresan anticuerpos fue novedosa en comparación con la producción de glucoproteínas porque la productividad de anticuerpos aumentó drásticamente a medida que las células entraban en la fase estacionaria. Se observó un valor inicial menor (Día 7) para los grupos de MAb1 CHEF1 -CMV y CHEF1 -CMV-AdTPL en comparación con el grupo de MAb1 CHEF1 a medida que los cultivos celulares crecían activamente, seguido de rápidos aumentos en la productividad para los cultivos de CHEF1-CMV y CHEF1 -CMV-AdTPL a medida que el crecimiento se desaceleró y finalmente disminuyó después del día 10 (figura 7B). Aun cuando la densidad de células viables disminuyó (figura 7A), la productividad aumentó hasta el día 14 en los grupos CHEF1-CMV y CHEF1-CMV-AdTPL, mientras que comenzó a disminuir en el grupo CHEF1, aunque las viabilidades terminales por ciento del día 14 fueron similares para todos los cultivos (aproximadamente 80% viable, datos no mostrados).

Se desarrollaron cultivos clonales a partir de grupos de transfección que expresan tanto a GP1 como a MAb1. Las estirpes celulares monoclonales se identificaron mediante imágenes de placas de dilución reducida y luego se expandieron en cultivo en suspensión. Se seleccionaron al azar doce cultivos clonales de MAb1 de cada uno de los grupos de transfección pDEF38-MAb1 y pDEF85-MAb1 y se realizaron en modelos de producción en matraces agitados alimentados por lotes. La producción de anticuerpos del activador de CHEF1 clonal (pDEF38-MAb1) coincidió con las curvas del grupo de transfección, mostrando una mayor expresión que los clones pDEF85-MAb1 durante la fase de crecimiento y luego una producción más lenta a medida que los cultivos entraron en la fase estacionaria (figura 8B). La producción de anticuerpos a partir de los clones del vector CHEF1 -CMV (pDEF85-MAb1) parecía muy similar a la del grupo de transfección, en donde la mayoría de la expresión de anticuerpos se produjo después del día 6 después de que el crecimiento exponencial se ralentizó y las células pasaron a la fase estacionaria (figura 8A).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector de expresión que comprende ADN regulador de la transcripción del factor 1 a de elongación de hámster chino (CHEF1) 5' y un activador de citomegalovirus (CMV) que comprende: (1) Secuencia ID n°: 6; o (2) Secuencia ID n°: 7, en donde dicho vector de expresión presenta al menos dos veces mayor productividad específica en comparación con un vector de expresión de referencia que tiene el ADN regulador de la transcripción CHEF1 5' pero que no comprende el activador de citomegalovirus (CMV).

2. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende la Secuencia ID n°: 6.

3. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende la Secuencia ID n°: 7.

4. El vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un gen marcador seleccionable.

5. Una célula anfitriona transformada, transducida o transfectada in vitro con un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. La célula anfitriona de la reivindicación 5, en donde la célula anfitriona es una célula eucariota.

7. La célula anfitriona de la reivindicación 5 o 6, en donde la célula anfitriona es una célula de ovario de hámster chino (CHO), opcionalmente una célula DG44 de CHO.

8. La célula anfitriona de la reivindicación 5 o 6, en donde la célula anfitriona es una célula de mamífero distinto del hámster, opcionalmente una célula humana.