WO2011118058A1 - Ｅｒボディ形成能を有する遺伝子およびその利用 - Google Patents

Ｅｒボディ形成能を有する遺伝子およびその利用 Download PDF

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WO2011118058A1
WO2011118058A1 PCT/JP2010/065711 JP2010065711W WO2011118058A1 WO 2011118058 A1 WO2011118058 A1 WO 2011118058A1 JP 2010065711 W JP2010065711 W JP 2010065711W WO 2011118058 A1 WO2011118058 A1 WO 2011118058A1
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WO
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protein
seq
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dna
amino acid
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PCT/JP2010/065711
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健志 山田
幹夫 西村
いくこ 西村
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大学共同利用機関法人自然科学研究機構
国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis

Definitions

  • the present invention relates to a gene having an ER body-forming ability and use thereof, and more particularly to a gene capable of forming an ER body, which is an organelle present only in Brassicaceae plants, in non-Brassic plants and use thereof. .
  • Plant cells unlike animal cells, produce various structures derived from the endoplasmic reticulum (ER).
  • the ER body which is one of such ER-derived structures, is an ER-derived structure found in Arabidopsis thaliana (hereinafter referred to as Arabidopsis thaliana), and is an organelle that accumulates glucosidase in plants belonging to the order of Brassica. Yes (see Non-Patent Document 1).
  • the ER body has a characteristic shape and size that is very long and large.
  • Non-Patent Document 2 In Arabidopsis thaliana, ER bodies are observed in epidermal cells of seedlings (see Non-Patent Document 2). In addition, a plant lacking the ER body exhibits overinfection with the fungus Piriformospora indica (see Non-Patent Document 3). These suggest that the ER body is involved in the defense system against fungal infection. Furthermore, the ER body is induced by wounds and jasmonic acid, which suggests that the ER body is involved in pest resistance (see Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Plants are known to use secondary metabolites as repellents, and some of them are also known to accumulate in vacuoles as glycoside precursors.
  • the ER body is a unique organelle that is observed only in the plants of the Brassicaceae, and is considered to be involved in a defense system against fungal infection and resistance to pest damage.
  • NAI2 a ER body protein so far, that this protein is required for ER body formation and is responsible for the accumulation of ⁇ -glucosidase in the ER body (See Non-Patent Document 2). From these findings, it is considered that when plant cells are destroyed by insects or the like, ⁇ -glucosidase contained in the ER body removes sugar from the glycoside and produces an active repellent substance.
  • the ER body is a very important organelle.
  • the ER body that is considered to be involved in pest damage resistance and the like is a structure that is formed only in a very limited aspect, specifically, only the seedlings of the cruciferous plants. It is a unique organelle that is observed only when it has been observed and grown and has been damaged by insects. NAI2 and its counterpart necessary for the formation of such an ER body do not exist in other plants. Furthermore, it is completely unknown how NAI2, a non-membrane protein, regulates ER body formation. If the formation mechanism of the ER body can be elucidated, disease resistance and the like can be imparted to the grown Brassicaceae plant.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to elucidate the formation mechanism of the ER body and provide a technique for imparting a new character to the plant body.
  • NAI2 is necessary for ER body formation and is responsible for the accumulation of PYK10 having ⁇ -glucosidase activity in the ER body.
  • PYK10 like NAI2, is a protein specific to Brassica and is a soluble protein having an ER retention signal.
  • NAI2 deficiency does not affect PYK10 mRNA levels, but reduces PYK10 protein levels, and PYK10 protein is uniformly dispersed throughout the ER (see Non-Patent Document 2). According to these findings, the presence of NAI2 forms an ER body in the order of Brassica, accumulates PYK10 as an ER body protein in the ER body, and produces an active repellent substance with cell destruction. Conceivable.
  • the present inventors performed a transcriptome analysis using a mutant in which an ER body is not formed (nai1 mutant).
  • NAI1 encoding a bHLH type transcriptional regulatory factor is found to control the expression of PYK10 and NAI2, and also controls the expression of MEB (membrane protein of ER body) 1 and 2 encoding transmembrane proteins. I found.
  • PYK10 was known to be a soluble protein that accumulates in the formed ER body, PYK10, which was thought to have only such ER body accumulation ability, is essential for ER body formation. That is, a person skilled in the art cannot predict or expect.
  • the DNA construct according to the present invention includes a gene encoding a protein having an ER body-forming ability and a gene encoding a protein having an ER body accumulation ability.
  • the protein having the ability to form an ER body is (i) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, or (ii) SEQ ID NO: It is preferably a protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in 1, 3, 5 or 7 are substituted, added or deleted, and having an ER body-forming ability
  • a protein having a body accumulation ability is (iii) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13 or 15, or (iv) shown in SEQ ID NO: 11, 13 or 15.
  • An amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added or deleted, and ER body accumulation Is preferably a protein having.
  • the DNA construct according to the present invention includes a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 as a gene encoding a further protein (also referred to as a third polypeptide) having an ER body accumulation ability, or a sequence It may further comprise a gene consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in No. 9 are substituted, added or deleted, and encoding a protein having an ER body accumulation ability. In this case, a large amount of membrane protein can be accumulated in the ER body.
  • a gene encoding a protein having an ER body-forming ability is (A) DNA comprising a polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4, or 6, (B) A DNA comprising a polynucleotide sequence in which one or several nucleotides of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 are deleted, substituted or added, and encodes a protein having an ER body-forming ability (C) a DNA that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and encodes a protein having an ER body-forming ability, Or (D) the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 And a DNA encoding a protein having an ER body-forming ability, and preferably a DNA encoding a protein having an ER body-forming ability
  • the DNA construct according to the present invention is a DNA comprising a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10 as a gene (also referred to as a third gene) encoding a further protein having ER body accumulation ability; DNA consisting of a polynucleotide sequence in which one or several nucleotides of the nucleotide sequence are deleted, substituted or added, and encoding a protein having an ER body accumulation ability; the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 10 DNA that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the sequence and encodes a protein having the ability to accumulate ER bodies; or 80% of the polynucleotide consisting of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10
  • the above homology A DNA having, and DNA encoding a protein having an ER body integrated ability, may further include a gene that contains a. In this case, a large amount of
  • the DNA construct according to the present invention preferably further includes a promoter.
  • the promoter is operably linked to the first gene and the second gene, and a plurality of promoters are included.
  • the first promoter is operably linked to the first gene and the second promoter is operably linked to the second gene.
  • the first gene is a gene encoding a protein having an ER body forming ability
  • the second gene is a gene encoding a protein having an ER body accumulating ability.
  • the second promoter may be the same as or different from the first promoter.
  • the third gene may be operably linked to a single promoter together with the first gene and the second gene. It may be connected as possible.
  • the third promoter may be the same as or different from the first promoter and the second promoter.
  • the DNA construct according to the present invention preferably further includes a gene (also referred to as a target gene) encoding a target protein to be accumulated in the ER body.
  • a gene also referred to as a target gene
  • the second gene and the target gene are preferably linked in frame so as to generate a fusion protein of the second polypeptide and the target protein.
  • the additional gene and the target gene are generated so as to generate a fusion protein of the additional protein and the target protein. They may be connected in-frame.
  • the composition according to the present invention is characterized by containing the above-described DNA construct in order to produce an ER body in a plant body.
  • the kit according to the present invention is characterized by comprising the above-described DNA construct in order to generate a ER body in a plant body.
  • said DNA construct further contains the target gene, the composition concerning this invention can be used for the objective of storing the target protein in a plant body.
  • composition according to the present invention encodes a first DNA construct containing a gene encoding a protein having an ER body-forming ability and a protein having an ER body accumulation ability in order to generate an ER body in a plant. And a second DNA construct containing the gene to be treated.
  • the kit according to the present invention encodes a first DNA construct containing a gene encoding a protein having an ER body-forming ability and a protein having an ER body accumulation ability in order to generate an ER body in a plant. And a second DNA construct containing the gene.
  • the protein having an ER body-forming ability is (i) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, or (ii) SEQ ID NO: 1, 3 It is preferably a protein having an ER body-forming ability, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in 5 or 7 are substituted, added or deleted, and having an ER body-forming ability.
  • a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13 or 15, or (iv) one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13 or 15 It is preferably a protein consisting of an amino acid sequence that is substituted, added or deleted and having the ability to accumulate ER bodies. Arbitrariness.
  • composition according to the present invention may further contain a third DNA construct containing a further gene encoding an additional protein (also referred to as a third polypeptide) having an ER body accumulation ability.
  • kit according to the present invention may further include a third DNA construct containing an additional gene encoding an additional protein having an ER body accumulation ability.
  • the gene includes a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or an amino acid in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are substituted, added or deleted
  • a gene encoding a protein consisting of a sequence and having the ability to accumulate ER bodies can be mentioned.
  • the gene encoding the protein having the ability to form ER is (A) DNA comprising the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and (B) SEQ ID NO: DNA comprising a polynucleotide sequence in which one or several nucleotides of the polynucleotide sequence shown in 2, 4 or 6 are deleted, substituted or added, and encoding a protein having an ER body-forming ability (C) DNA encoding a protein that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 and has the ability to form an ER body, or (D) a polynucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 And a DNA encoding a protein having an ER body-forming ability, and a gene encoding a protein having an ER body-accumulating ability is
  • A DNA comprising the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14 or 16; (b) one or several nucleotides of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14 or 16 are deleted or substituted Or a DNA consisting of an added polynucleotide sequence and a DNA encoding a protein having the ability to accumulate ER bodies, (c) a polynucleotide consisting of a complementary sequence of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14 or 16 Hybridize under stringent conditions DNA encoding a protein having an ER body accumulation ability, or (d) DNA having a homology of 80% or more with a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14 or 16, and ER body It preferably contains DNA encoding a protein having an accumulation ability.
  • composition according to the present invention may further contain a third DNA construct containing a further gene (also referred to as a third gene) encoding a further protein having an ER body accumulation ability.
  • the kit according to the present invention may further include a third DNA construct containing an additional gene encoding an additional protein having an ER body accumulation ability.
  • the gene includes a DNA comprising the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10; a polynucleotide sequence in which one or several nucleotides of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 are deleted, substituted or added.
  • DNA which is a DNA and encodes a protein having ER body accumulation ability hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10, and has ER body accumulation ability Or a DNA encoding a protein having a ER body accumulation ability, or a DNA having a homology of 80% or more with a polynucleotide comprising the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10
  • each of the first DNA construct and the second DNA construct preferably further contains a promoter, and the first promoter is operably linked to the first gene in the first DNA construct, In the second DNA construct, the second promoter is operably linked to the second gene.
  • the first gene is a gene encoding a protein having an ER body forming ability
  • the second gene is a gene encoding a protein having an ER body accumulating ability.
  • the second promoter may be the same as or different from the first promoter.
  • the third promoter is operably linked to the third gene in the third DNA construct.
  • the third promoter may be the same as or different from the first promoter and the second promoter.
  • the second DNA construct preferably further contains a target gene encoding a target protein to be accumulated in the ER body.
  • the second gene and the target gene are linked in frame so as to generate a fusion protein of the second polypeptide and the target protein.
  • the composition or kit having such a configuration can be used for the purpose of storing the target protein in a plant.
  • the target gene may be contained in the 3rd DNA construct.
  • the additional gene and the target gene are linked in-frame so as to generate a fusion protein of the additional protein and the target protein.
  • a large amount of membrane protein can be accumulated in the ER body.
  • the composition or kit having such a configuration can be used for the purpose of storing the target protein in a plant.
  • the plant body to which the present invention is applied may be a monocotyledonous plant or a dicotyledonous plant.
  • ER is an organelle for the synthesis of secreted proteins, and the synthesized protein is rapidly delivered from the ER to the target site. It has become clear from many examples that such ER is used as a place for protein accumulation in plants. This is expected to use the ER body as a storage place.
  • the ER body is a unique organelle that is observed only in plants of the order Brassica, and NAI2 and its counterpart necessary for ER body formation do not exist in other plants. These items suggest that it is not easy to form ER bodies in plants other than the Brassicaceae. Moreover, it is particularly remarkable that the formation of ER bodies in monocotyledonous plants (rice, onions, etc.) that have no technical correlation with Brassicaceae exceeds the range that can be predicted by those skilled in the art. Is.
  • the plant according to the present invention is characterized by expressing a protein having an ER body forming ability and a protein having an ER body accumulating ability.
  • natural cruciferous plants for example, Arabidopsis thaliana
  • the above-described additional protein having the ability to accumulate ER bodies may be further expressed.
  • the method for producing a plant according to the present invention is characterized by including the step of introducing the above-described DNA construct into the plant.
  • the DNA construct to be introduced into the plant body may be provided as the above-described composition or as the above-described kit.
  • the method for producing a plant according to the present invention may be a method for generating an ER body in a plant.
  • the plant according to the present invention may express a protein having an ER body-forming ability and a fusion protein of a protein having an ER body accumulation ability and a target protein.
  • the plant according to the present invention may express a protein having an ER body forming ability, a protein having an ER body accumulation ability, and a fusion protein of a target protein and a further protein having an ER body accumulation ability.
  • the protein having the ER body forming ability, the protein having the ER body accumulating ability, and the additional protein having the ER body accumulating ability may have the above-described configuration.
  • natural cruciferous plants for example, Arabidopsis thaliana
  • expressing a fusion protein of an endogenous first polypeptide and a second polypeptide with any polypeptide are included in the plants of the present invention. Absent.
  • the method for producing a plant according to the present invention is characterized by including a step of introducing a DNA construct containing the target gene described above into the plant.
  • the DNA construct to be introduced into the plant body may be provided as the composition or the kit.
  • the method for producing a plant according to the present invention may be a method for storing a target protein in the plant.
  • ER body which is one of the structures derived from the endoplasmic reticulum (ER)
  • ER bodies that exist only in Brassicaceae plants can be formed in other plants, particularly monocotyledonous plants. Thereby, the storage site
  • the fluorescent image shown shows a green fluorescent protein targeted to ER in onion epithelial cells. It is a figure which shows the high magnification image (left) of the endogenous ER body of Arabidopsis thaliana, and the high magnification image (right) of the ER body artificially induced
  • the ER body that is considered to be involved in pest resistance and the like is a structure that is formed only in very limited aspects in the Brassicaceae plants. Specifically, it is observed only in the seedlings of the Brassicaceae plants. It is a unique organelle that is observed only when it has been damaged by insects.
  • NAI2 which is an ER body protein
  • ER body is not formed by nai2 mutant (see Non-Patent Document 2).
  • the present inventors have found that expression of NAI2 alone in onion epithelial cells is not sufficient for the formation of ER bodies.
  • ER bodies were induced in onion epithelial cells by simultaneously introducing NAI2 and PYK10. This suggests that NAI2 and PYK10 proteins can interact to form a concentrated matrix of the ER body, thereby controlling the shape of the ER body.
  • NAI2 and PYK10 induced an ER body having the same shape and size as the endogenous ER body of Arabidopsis thaliana. Furthermore, expression of NAI2 and PYK10 in onion epithelial cells not only induces the formation of ER bodies, but also the membrane protein of ER bodies, MEB2, localizes to ER bodies induced in the cells. . Thus, NAI2 and PYK10 are thought to control the shape of the ER body and accumulate the ER body membrane proteins to establish the original properties of the ER body membrane. In the present specification, the endogenous ER body is described using Arabidopsis thaliana.
  • native ER body-like structures may be obtained from plants of the order of Brassica other than Arabidopsis (for example, ArabisAralpina, Brassica oleracea, Raphanus). sativus, Capparis spinosa, Cleome spinosa, etc.).
  • the NAI2 protein consists of 772 amino acids and has a signal peptide at its amino terminus, so the NAI2 protein is considered to be a secreted protein.
  • the region of the N-terminal half of the NAI2 protein has a Glu-Phe-Glu (EFE) motif that repeats about 40 amino acid sequences including the characteristic Glu-Phe-Glu sequence 10 times.
  • the EFE motif region of NAI2 protein is hydrophilic.
  • the region of the C-terminal half of the NAI2 protein is unique and we have called the NAI2 domain.
  • the NAI2 protein having such a structure can be referred to as a protein having an ER body-forming ability because an ER body is not formed in the nai2 mutant.
  • NAI2 (SEQ ID NOs: 1 and 2) having such a unique structure forms a family.
  • proteins structurally related to NAI2 in Arabidopsis include TSK binding protein 1 (TSA1 / At1g52410 (SEQ ID NOs: 3 and 4)) and At3g15960 (SEQ ID NOs: 5 and 6).
  • TSA1 has a signal peptide, 10 EFE repeats, and a NAI2 domain.
  • At3g15960 is a smaller protein than NAI2 or TSA1, has a signal peptide and a NAI2 domain, but does not have an EFE repeat.
  • a protein having a signal peptide, 9 EFE repeats, and a NAI2 domain (TC74287 (SEQ ID NOs: 7 and 8)) in B. napus is also exemplified as a protein structurally related to NAI2.
  • NAI2 homologues were identified in Brassicaceae plants (for example, B. rapa (AC189268, AC189514), B. oleracea (BZ479594, BZ006167), etc.).
  • B. rapa AC189268, AC1895144
  • B. oleracea BZ479594, BZ006167
  • NAI2 homologs were not found not only in animals and fungi but also in rice and poplar.
  • PYK10 SEQ ID NO: 11 and 12
  • KDEL ER retention signal
  • PYK10 also forms a family of structurally related proteins. Examples of PYK10 homologues include BGLU18 (SEQ ID NOs: 13 and 14) and BGLU21 (SEQ ID NOs: 15 and 16) which also have ⁇ -glucosidase functions.
  • BGLU18 is also a soluble protein with a similar sequence (REEL (SEQ ID NO: 18)) and, like PYK10, accumulates in the ER body induced by wounds (data not shown).
  • the present invention provides a DNA construct for forming an ER body, which is an organelle present only in Brassicaceae plants, in non-Brassic plants.
  • the DNA construct according to the present invention includes a gene encoding a protein having an ER body-forming ability and a gene encoding a protein having an ER body-accumulating ability.
  • NAI2 family molecule As used herein, the “NAI2 family molecule” described above is intended as the “protein having the ability to form an ER body”.
  • ER body-forming ability intends the ability (activity) capable of forming an ER body when expressed in a Brassicaceae plant in which formation of the ER body is inhibited.
  • protein having ER body accumulation ability is intended to be the above-described PYK10 family molecule.
  • ER body accumulation ability intends the ability (activity) that can be accumulated in the formed ER body when an ER body is formed in a Brassicaceae plant in which formation of the ER body is inhibited.
  • the protein having an ER body-forming ability (also referred to as a first polypeptide) is (i) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, or (ii) a sequence It may be a protein having an ER body-forming ability, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence shown in Nos. 1, 3, 5 or 7 are substituted, added or deleted.
  • a protein having an ER body accumulation ability is (iii) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, 13 or 15, or (iv) SEQ ID NO: 11, 13 or 15 may be a protein having an ER body accumulation ability, consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, added, or deleted.
  • polypeptide amino acid
  • “one or several” is preferably in the range of 1 to 30, more preferably in the range of 1 to 20, and more preferably 1 to 10 More preferably, it is in the range of 1 to 5, and still more preferably in the range of 1 to 5.
  • a person skilled in the art can easily understand the extent of the number of amino acids indicated by the term “one or several” depending on the length of the target polypeptide.
  • polypeptide is used interchangeably with “peptide” or “protein” and is intended to be a polymer of amino acids.
  • a polypeptide “fragment” is intended to be a partial fragment of the polypeptide.
  • the polypeptides according to the invention may also be produced recombinantly, chemically synthesized or isolated from natural sources.
  • a gene encoding a protein having an ER body-forming ability is (A) DNA comprising a polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, (B) A DNA comprising a polynucleotide sequence in which one or several nucleotides of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 are deleted, substituted or added, and encodes a protein having an ER body-forming ability (C) a DNA that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and encodes a protein having an ER body-forming ability, Or (D) the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, 4 or 6 Ranaru polynucleotide is DNA having a homology of 80% or more, and contains a DNA, which encodes a protein having an ER body-forming ability
  • a gene encoding a protein having an ER body accumulation ability is (a) DNA consisting of a polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14 or 16, (b) SEQ ID NO: 12, A DNA consisting of a polynucleotide sequence in which one or several nucleotides of the polynucleotide sequence shown in 14 or 16 are deleted, substituted or added, and encoding a protein having an ER body accumulation ability; c) DNA that hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12, 14, or 16 and encodes a protein having the ability to accumulate ER bodies, or (d ) Polynucleotide shown in SEQ ID NO: 12, 14 or 16 A DNA having a polynucleotide homology of 80% or more consisting of sequence and DNA encoding a protein having an ER body integrated
  • one or several is preferably in the range of 1 to 100, more preferably in the range of 1 to 50, and 1 to 30 More preferably, it is within the range of 1 to 15, and still more preferably within the range of 1 to 15.
  • the term “one or several” is preferably in the range of 1-10, more preferably in the range of 1-7, and in the range of 1-5. More preferably, it is more preferably in the range of 1 to 3.
  • polynucleotide is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • a “fragment” of a polynucleotide is intended to be a partial fragment of the polynucleotide.
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “base sequence”.
  • the polynucleotide according to the present invention may exist in the form of RNA (for example, mRNA) or in the form of DNA (for example, cDNA or genomic DNA).
  • DNA can be double-stranded or single-stranded.
  • Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • oligonucleotide is intended to be a combination of several to several tens of nucleotides, and is used interchangeably with “polynucleotide”.
  • the term “stringent (hybridization) conditions” refers to a hybridization solution (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM phosphorous. After overnight incubation at 42 ° C. in sodium acid (pH 7.6), 5 ⁇ Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / ml denatured sheared salmon sperm DNA, Although it is intended to wash the filter in 1 ⁇ SSC, the washing conditions at high stringency are appropriately changed depending on the polynucleotide to be hybridized. For example, when using mammalian DNA, 0.1% SDS Washing at 65 ° C.
  • the homology for the polypeptide or polynucleotide of interest is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and more preferably 90% or more. Preferably, it is more preferably 95% or more.
  • the DNA construct according to the present invention preferably further includes a promoter.
  • the promoter is operably linked to the first gene and the second gene, and a plurality of promoters are included.
  • the first promoter is operably linked to the first gene and the second promoter is operably linked to the second gene.
  • the first gene is a gene encoding a protein having an ER body forming ability
  • the second gene is a gene encoding a protein having an ER body accumulating ability.
  • the second promoter may be the same as or different from the first promoter.
  • the promoter used in the present invention is not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately select a promoter that is well-known as a preferred promoter for protein expression in plants.
  • the DNA construct according to the present invention may further include a gene (also referred to as a target gene) encoding a target protein to be accumulated in the ER body.
  • a gene also referred to as a target gene
  • the gene encoding the protein having the ER body accumulation ability and the gene encoding the target protein are linked in frame so as to generate a fusion protein of the protein having the ER body accumulation ability and the target protein.
  • DNA construct having such a structure a protein storage site that could not be expected so far can be formed in various plants. That is, the DNA construct of the present invention can be used for the purpose of storing a target protein in a plant body.
  • the DNA construct according to the present invention may contain two or more genes encoding a protein having an ER body accumulation ability, at least one of which contains a PYK10 family molecule. Any gene may be used as long as it encodes, and the other gene may encode, for example, a MEB2 family molecule. From the viewpoint that MEB2, which is a membrane protein of the ER body, is localized in the ER body induced in cells, MEB2 can also be said to be a protein having an ER body accumulation ability.
  • a target protein When a target protein is accumulated in an ER body using a DNA construct having such a configuration, at least one gene encoding a protein having an ER body accumulation ability and a gene encoding the target protein are linked in frame.
  • a fusion protein of at least one protein having an ER body accumulation ability and a target protein may be generated.
  • MEB2 protein is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 are substituted. It is a protein consisting of an added or deleted amino acid sequence and having ER body accumulation ability.
  • the MEB2 gene is a DNA comprising the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10; from a polynucleotide sequence in which one or several nucleotides of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 are deleted, substituted or added.
  • a DNA encoding a protein having the ability to accumulate ER bodies hybridizing under stringent conditions to a polynucleotide comprising a complementary sequence of the polynucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10, and capable of accumulating ER bodies
  • composition and kit As used herein, a “composition” is intended to be a form in which various components are contained in one substance. In addition, as used herein, a “kit” is intended to be a form in which at least one of various components is contained in another substance.
  • a composition is intended to be “one or more components that are homogeneously present as a whole and grasped as a single substance”.
  • a single composition containing substance A as a main component, as a main component The single composition containing the substance A and the substance B can be a single composition.
  • These compositions may contain other components other than the substance A and the substance B within a range not inhibiting the function of the main component.
  • the composition according to the present invention may be used alone or in combination with other substances or compositions. In this case, other substances or compositions to be used together may or may not be provided in the composition according to the present invention. In the latter case, these cannot be recognized as a composition as a whole, but in this case, those skilled in the art can easily fall into the category of “kits” described later and be provided as a kit rather than as a composition. To understand.
  • kit is intended to include packaging with containers (eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.) containing specific materials. Preferably, instructions for using each material are provided.
  • container eg, bottles, plates, tubes, dishes, etc.
  • “comprising” is intended to mean being contained in any of the individual containers that make up the kit.
  • the kit according to the present invention may be a package in which a plurality of different compositions are packed together, where the form of the composition may be a form as described above, or in the case of a solution form in a container. It may be included.
  • the kit according to the present invention may comprise substance A and substance B mixed in the same container or in separate containers.
  • the “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. .
  • the present invention provides a composition for forming an ER body in a non-brassic plant.
  • the composition according to the invention contains a single DNA construct as described above.
  • the present invention also provides a kit for forming ER bodies in non-brassic plants.
  • the composition according to the invention comprises a single DNA construct as described above.
  • the structure of the single DNA construct described above may be included in a separate DNA construct. That is, in one embodiment, the composition according to the present invention includes a first DNA construct containing a gene encoding a protein having an ER body-forming ability and a gene encoding a protein having an ER body-accumulating ability. And a second DNA construct. The composition concerning this embodiment may further contain the 3rd DNA construct containing the additional gene which codes the additional protein which has ER body integration
  • the kit according to the present invention includes a first DNA construct containing a gene encoding a protein having ER body-forming ability and a gene encoding a protein having ER body-accumulating ability. 2 DNA construct. The kit according to the present embodiment may further include a third DNA construct containing an additional gene encoding an additional protein having an ER body accumulation ability.
  • the second DNA construct or the third DNA construct may further include a target gene encoding a target protein to be accumulated in the ER body as described above.
  • the composition or kit having such a configuration can be used for the purpose of storing the target protein in a plant.
  • Plant body and production method thereof By using the DNA construct, composition and kit as described above, a plant having an ER body can be produced. That is, this invention provides the plant body which has ER body, and its production method.
  • the plant according to the present invention only needs to express the protein encoded by the gene (polynucleotide) contained in each DNA construct as a result of introducing the above-described DNA construct into the plant. That is, the method for producing a plant according to the present invention may include a step of introducing the above-described DNA construct into the plant.
  • a technique well known in the art may be used, and a so-called “transformant plant” production method may be employed.
  • the said DNA construct may be provided as a composition or kit mentioned above.
  • the term “transformant” is intended not only to a cell, tissue or organ, but also to an individual organism.
  • the transformant according to the present invention is only required to express at least the gene contained in the DNA construct according to the present invention and express the protein encoded by this gene. That is, it should be noted that transformants generated by means other than expression vectors are also included in the technical scope of the present invention.
  • the desired protein is stably expressed in the plant body (transformant) according to the present invention.
  • gene introduced or “gene introduced” is expressed in a target cell (host cell) by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique). It is intended to be introduced (ie, transformant).
  • a target cell host cell
  • genetic engineering technique gene manipulation technique
  • transformant ie, transformant
  • various crops plants and crops produced in the agriculture, forestry and fisheries industry
  • Specific examples include cereals (rice, wheat, corn, etc.), timbers (pine, cedar, cypress, etc.), various vegetables, and flower buds.
  • Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, It means any of a palisade tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant culture cell, or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • the plant used for transformation is not particularly limited, and may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
  • the plant according to the present invention may be a grown plant individual, a plant cell, a plant tissue, a callus, or a seed.
  • transformation methods known to those skilled in the art for example, the Agrobacterium method, gene gun (particle bombardment), PEG method, electroporation method, etc.
  • the method of directly introducing into plant cells When the Agrobacterium method is used, the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate Agrobacterium, and this strain is infected with a sterile cultured leaf piece according to a method well known in the art (for example, the leaf disc method). Good.
  • Electroporation and gene gun methods are known as methods for directly introducing genes into plant cells or plant tissues.
  • a plant body, a plant organ, and a plant tissue itself may be used as they are, or may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used. It should be noted that regeneration of a plant body from a cell or plant tissue into which a gene has been introduced can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
  • the recombinant vector can be obtained by, for example, microinjection, electroporation (electroporation), polyethylene glycol, gene gun (particle gun), protoplast fusion, calcium phosphate, etc. Introduced into cultured cells. Callus and the like obtained as a result of transformation can be used as they are for cell culture, tissue culture or organ culture as they are, and a plant hormone culture method (auxin, Cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.) can be regenerated into plants.
  • a plant hormone culture method auxin, Cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.
  • Whether or not a gene has been introduced into a plant can be confirmed by detecting the target gene using a PCR method, Southern hybridization method, Northern hybridization method or the like. Detection of the target gene can be a step of hybridizing the nucleic acid probe to the target gene.
  • the “nucleic acid probe” is not particularly limited as long as it can hybridize to a target nucleic acid, and may be a so-called hybridization probe or a PCR primer. Hybridization techniques and PCR techniques are well known in the art and can be easily performed by those skilled in the art.
  • the nucleic acid probe is not particularly limited as long as it is an oligonucleotide containing a partial sequence of the target gene (or its complementary strand).
  • the nucleic acid probe is preferably an oligonucleotide consisting of 15 to 50 consecutive bases of the nucleotide sequence described in the sequence listing or its complementary sequence, more preferably 20 to 50, and even more preferably 20 An oligonucleotide consisting of ⁇ 45, most preferably 25 to 40 consecutive bases.
  • the nucleic acid probe is preferably an oligonucleotide composed of 15 to 50 consecutive bases of the nucleotide sequence described in the sequence listing or its complementary sequence, more preferably 15 to The oligonucleotide is composed of 40, more preferably 15 to 35, most preferably 25 to 35 consecutive bases.
  • the oligonucleotide used in the Example mentioned later may be sufficient.
  • the present invention also includes a plant into which a desired protein is introduced so that it can be expressed, or a progeny of the plant having the same properties as the plant, or a tissue derived therefrom.
  • Such a method for producing a plant can be a method for generating an ER body in a plant. That is, the present invention also provides a method for generating an ER body in a plant body.
  • a plant body in which the target protein is stored in the ER body can be produced using the present invention. That is, this invention provides the plant body which stored the target protein in ER body, and its production method. Similarly, the present invention provides a method for storing a target protein in a plant.
  • a well-known method for example, a method in which cells or tissues are disrupted and then centrifuged to recover a soluble fraction
  • well-known methods for example, affinity purification using an antibody against the protein of interest, ammonium sulfate precipitation or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction Chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and lectin chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Non-Patent Document 2 using the primers and template EST clones (U21078 for MEB1, U23495 for MEB2, U16255 for NAI2) or mRNA as described in Table 1, or cDNA containing the gene of interest The fragments were PCR amplified and inserted into the expression vector pUGW2, respectively.
  • the EST clone used is a Salk / Stanford / PGEC Consortium full-length cDNA / ORF clone obtained from the Arabidopsis Biological Resource Center.
  • the obtained expression vector was introduced into onion epithelial cells or tobacco callus by particle bombardment according to the procedure described in Non-Patent Document 2.
  • an expression vector, pBI221 • SP-GFP-HDEL was simultaneously introduced. Observation was performed with a confocal laser microscope according to the procedure described in Non-Patent Document 2 6 to 12 hours after gene introduction.
  • NAI2 is a protein having an ER body-forming ability that is essential for the formation of endogenous ER bodies. It was confirmed whether such NAI2 could induce ER body formation in non-brassic plants. However, no ER body was observed when NAI2 was introduced into onion epithelial cells (upper right of FIG. 1). Similarly, when PYK10 having ER body accumulation ability was introduced into onion epithelial cells, no ER body was observed (upper left in FIG. 1).
  • this artificially derived structure was the same size and shape as the endogenous ER body in Arabidopsis (FIG. 2).
  • An ER body was formed only by expressing NAI2 and PYK10 proteins not only in onion epithelial cells but also in tobacco cultured cells (FIG. 4).
  • this artificially induced structure is an ER body
  • MEB2 which is a membrane protein of the ER body
  • NAI2 and PYK10 changes depending on the presence or absence of NAI2 and PYK10.
  • a cDNA fragment containing the MEB2 gene was PCR amplified and inserted into an expression vector pUGW6 containing the GFP gene.
  • the obtained vector was introduced into an onion epithelial cell together with a vector containing the NAI2 gene or PYK10 gene.
  • the expression vector pBI221 • SP-tdTOM-KDEL was introduced simultaneously.
  • NAI2 is an ER body component for ER body formation.
  • the inventors have found that mutations in PYK10, the major ER body component, change the morphology of the ER body (not shown). This suggests that PYK10 also regulates ER body formation, but is consistent with the above results.
  • PYK10 protein is easily detected by CBB staining, but NAI2 protein is not detected. This indicates that PYK10 is more abundant than NAI2. This suggests that NAI2 functions as a chaperone of PYK10, facilitating PYK10 accumulation and enrichment.

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Abstract

　小胞体に由来する構造物の１つであるＥＲボディの形成機構を解明し、植物体に新たな形質を付与するために、植物体にＥＲボディを生成させるための、配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡと、配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡとを含んでいるＤＮＡ構築物、または該ＤＮＡ構築物を含有している組成物、あるいは配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする第１遺伝子を含んでいる第１ＤＮＡ構築物と、配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする第２遺伝子を含んでいる第２ＤＮＡ構築物とを含有している組成物を提供する。

Description

ＥＲボディ形成能を有する遺伝子およびその利用
　本発明は、ＥＲボディ形成能を有する遺伝子およびその利用に関し、より詳細には、アブラナ目植物にのみ存在するオルガネラであるＥＲボディを、非アブラナ目植物において形成させることができる遺伝子およびその利用に関する。
　植物細胞は、動物細胞とは異なり、小胞体（ＥＲ）に由来する種々の構造物を生成する。このようなＥＲ由来の構造物の１つであるＥＲボディは、Arabidopsis thaliana（以下、シロイヌナズナ）において見出されたＥＲ由来の構造物であり、アブラナ目に属する植物において、グルコシダーゼを集積するオルガネラである（非特許文献１参照）。ＥＲ由来の他の構造物とは異なり、ＥＲボディは非常に長くそして大きいという特徴的な形状およびサイズを有している。
　シロイヌナズナにおいて、ＥＲボディは幼植物体の表皮細胞にて観察される（非特許文献２参照）。また、ＥＲボディを欠いた植物体では、真菌Piriformospora indicaの過剰感染を示す（非特許文献３参照）。これらのことは、ＥＲボディが真菌感染に対する防御システムに関与することを示唆する。さらに、ＥＲボディは、創傷やジャスモン酸によって誘導され、このことは、ＥＲボディが病虫害耐性に関与することを示唆する（非特許文献４および５参照）。
　植物は二次代謝産物を忌避物質として利用していることが知られており、それらのいくつかは配糖体型の前駆体として液胞に蓄積していることも知られている。上述したように、ＥＲボディは、アブラナ目の植物にのみ観察される独特なオルガネラであり、真菌感染に対する防御システムや病虫害耐性に関与すると考えられている。シロイヌナズナにおいて、本発明者らは、これまでにＥＲボディタンパク質であるＮＡＩ２を同定し、このタンパク質が、ＥＲボディ形成に必要であること、そして、β－グルコシダーゼのＥＲボディへの集積を担っていることを示している（非特許文献２参照）。これらの知見から、虫などによって植物の細胞が破壊された際に、ＥＲボディに含まれるβ－グルコシダーゼがその配糖体から糖を外して活性型の忌避物質を生産していると考えられる。
Y. Hayashi et al., Plant Cell Physiol. 42: 894-899 (2001) K. Yamada et al., Plant Cell 20: 2529 (2008) I. Sherameti et al., Plant J. 54: 428-439 (2008) R. Matsushima et al., Plant Physiol. 130: 1807-1814 (2002) I. Hara-Nishimura and R. Matsushima, Curr. Opin. Plant Biol. 6: 583-588 (2003)
　このようにＥＲボディは非常に重要なオルガネラである。しかしながら、上述したように、病虫害耐性等に関与すると考えられるＥＲボディは、非常に限定された局面でのみ形成される構造物であり、具体的には、アブラナ目の植物の幼植物体にのみ観察され、生長した植物体では虫害を被った際にのみ観察される独特なオルガネラである。このようなＥＲボディの形成に必要なＮＡＩ２およびそのカウンターパートは、他の植物に存在しない。さらには、非膜タンパク質であるＮＡＩ２がどのようにしてＥＲボディの形成を調節しているのかは全く不明である。ＥＲボディの形成機構を解明することができれば、生長したアブラナ目の植物体に病虫害耐性等が付与することができる。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＥＲボディの形成機構を解明するとともに、植物体に新たな形質を付与する技術を提供することにある。
　ＮＡＩ２は、ＥＲボディ形成に必要であり、β－グルコシダーゼ活性を有するＰＹＫ１０のＥＲボディへの集積を担っている。ＰＹＫ１０は、ＮＡＩ２と同様にアブラナ目に特異的なタンパク質であり、ＥＲ貯留シグナルを有する可溶性タンパク質である。ＮＡＩ２の欠損は、ＰＹＫ１０　ｍＲＮＡレベルに影響しないが、ＰＹＫ１０タンパク質レベルを低減させ、ＰＹＫ１０タンパク質はＥＲ全体を通して均一に分散される（非特許文献２参照）。これらの知見によれば、ＮＡＩ２の存在は、アブラナ目においてＥＲボディを形成させ、ＰＹＫ１０をＥＲボディタンパク質としてＥＲボディへ集積させ、細胞の破壊に伴って活性型の忌避物質を生産させていると考えられる。
　ＥＲボディが細胞内での構造物として形成されるためには、膜タンパク質の存在が強く示唆される。特に、ＥＲ貯留シグナル（ＫＤＥＬ）を有していないＮＡＩ２がＥＲボディに局在することは、結合パートナーとしての膜タンパク質の存在が強く示唆される。そこで、本発明者らは、ＥＲボディが形成されない変異体（ｎａｉ１変異体）を用いたトランスクリプトーム解析を行った。その結果、ｂＨＬＨ型転写制御因子をコードするＮＡＩ１が、ＰＹＫ１０およびＮＡＩ２の発現を制御することを見出すとともに、膜貫通タンパク質をコードするＭＥＢ（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ＥＲ　ｂｏｄｙ）１および２の発現を制御することを見出した。また、ＮＡＩ２を枯渇させると、ＭＥＢ１およびＭＥＢ２の局在が変化し、ＥＲネットワーク内に分散した。これらの知見は、ＥＲボディ膜が特異的な特性を有していること、および、ＭＥＢ１およびＭＥＢ２の集積を制御することによってＮＡＩ２がこのＥＲボディ膜の形成を調節していることが示唆された。そこで、本発明者らは、ＮＡＩ２とＭＥＢとを用いてＥＲボディの形成を試みた。しかし、これらのタンパク質を用いてＥＲボディを形成することはできなかった。
　このような試行錯誤を繰り返す中で、本発明者らは独自の観点に基づいて、ＰＹＫ１０をＮＡＩ２とともに用いることによってＥＲボディが首尾よく形成されることを見出し、本発明を完成するに至った。ＰＹＫ１０が、形成されたＥＲボディへ集積する可溶性タンパク質であることは知られていたが、このようなＥＲボディ集積能を有するに過ぎないと考えられていたＰＹＫ１０が、ＥＲボディ形成に不可欠であるということを、当業者は予測も期待もし得ない。
　すなわち、本発明にかかるＤＮＡ構築物は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子とを含んでいる。
　本発明において、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質（第１ポリペプチドともいう。）は、（i）配列番号１、３、５または７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、（ii）配列番号１、３、５または７に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質であることが好ましく、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質（第２ポリペプチドともいう。）は、（iii）配列番号１１、１３または１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、（iv）配列番号１１、１３または１５に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質であることが好ましい。
　本発明にかかるＤＮＡ構築物は、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質（第３ポリペプチドともいう。）をコードする遺伝子として、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、あるいは、配列番号９に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでいてもよい。この場合、膜タンパク質をＥＲボディ内に大量蓄積することができる。
　また、本発明において、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子（第１遺伝子ともいう。）は、（Ａ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（Ｃ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、（Ｄ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいることが好ましく、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子（第２遺伝子ともいう。）は、（ａ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、（ｄ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいることが好ましい。
　本発明にかかるＤＮＡ構築物は、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードする遺伝子（第３遺伝子ともいう。）として、配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；あるいは、配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいる遺伝子をさらに含んでいてもよい。この場合、膜タンパク質をＥＲボディ内に大量蓄積することができる。
　本発明にかかるＤＮＡ構築物は、プロモータをさらに含んでいることが好ましく、単一のプロモータを含んでいる場合、該プロモータは第１遺伝子および第２遺伝子と作動可能に連結されており、複数のプロモータを含んでいる場合、第１プロモータが第１遺伝子と作動可能に連結されており、第２プロモータが第２遺伝子と作動可能に連結されている。ここで、第１遺伝子は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、第２遺伝子は、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、第２プロモータは第１プロモータと同一であっても異なってもよい。
　本発明にかかるＤＮＡ構築物が、第３遺伝子を含んでいる場合、第３遺伝子は、第１遺伝子および第２遺伝子とともに単一のプロモータと作動可能に連結されていてもよく、第３プロモータと作動可能に連結されていてもよい。また、第３プロモータは第１プロモータおよび第２プロモータと同一であっても異なってもよい。
　本発明にかかるＤＮＡ構築物は、ＥＲボディに集積させるための目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子ともいう。）をさらに含んでいることが好ましい。この場合、第２ポリペプチドと該目的タンパク質との融合タンパク質を生成するように第２遺伝子と目的遺伝子とがインフレームにて連結されていることが好ましい。第２遺伝子以外にＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードする遺伝子がさらに含まれている場合は、該さらなるタンパク質と該目的タンパク質との融合タンパク質を生成するように該さらなる遺伝子と目的遺伝子とがインフレームにて連結されていてもよい。
　本発明にかかる組成物は、植物体にＥＲボディを生成させるために上記のＤＮＡ構築物を含有していることを特徴としている。また、本発明にかかるキットは、植物体にＥＲボディを生成させるために上記のＤＮＡ構築物を備えていることを特徴としている。なお、上記のＤＮＡ構築物が目的遺伝子をさらに含んでいる場合は、本発明にかかる組成物は、目的タンパク質を植物体に貯蔵する目的に用いられ得る。
　さらに、本発明にかかる組成物は、植物体にＥＲボディを生成させるために、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第１ＤＮＡ構築物と、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第２ＤＮＡ構築物とを含有していることを特徴としている。また、本発明にかかるキットは、植物体にＥＲボディを生成させるために、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第１ＤＮＡ構築物と、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第２ＤＮＡ構築物とを備えていることを特徴としている。
　本発明にかかる組成物またはキットにおいて、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質は、（i）配列番号１、３、５または７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、（ii）配列番号１、３、５または７に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質であることが好ましく、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質は、（iii）配列番号１１、１３または１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、（iv）配列番号１１、１３または１５に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質であることが好ましい。
　本発明にかかる組成物は、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質（第３ポリペプチドともいう。）をコードするさらなる遺伝子を含んでいる第３ＤＮＡ構築物をさらに含有していてもよい。また、本発明にかかるキットは、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含んでいる第３ＤＮＡ構築物をさらに備えていてもよい。該遺伝子としては、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、あるいは、配列番号９に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
　また、本発明にかかる組成物またはキットにおいて、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、（Ａ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（Ｃ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、（Ｄ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいることが好ましく、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子は、（ａ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、（ｄ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいることが好ましい。
　本発明にかかる組成物は、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードするさらなる遺伝子（第３遺伝子ともいう。）を含んでいる第３ＤＮＡ構築物をさらに含有していてもよい。また、本発明にかかるキットは、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含んでいる第３ＤＮＡ構築物をさらに備えていてもよい。該遺伝子としては、配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；あるいは、配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいる遺伝子が挙げられる。
　本発明にかかる組成物またはキットにおいて、第１ＤＮＡ構築物および第２ＤＮＡ構築物はそれぞれプロモータをさらに含んでいることが好ましく、第１ＤＮＡ構築物において、第１プロモータが第１遺伝子と作動可能に連結されており、第２ＤＮＡ構築物において、第２プロモータが第２遺伝子と作動可能に連結されている。ここで、第１遺伝子は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、第２遺伝子は、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、第２プロモータは第１プロモータと同一であっても異なってもよい。第３ＤＮＡ構築物がさらに用いられる場合は、第３ＤＮＡ構築物において、第３プロモータが、第３遺伝子と作動可能に連結されている。また、第３プロモータは第１プロモータおよび第２プロモータと同一であっても異なってもよい。
　本発明にかかる組成物またはキットにおいて、第２ＤＮＡ構築物はＥＲボディに集積させるための目的タンパク質をコードする目的遺伝子をさらに含んでいることが好ましい。この場合、第２ポリペプチドと該目的タンパク質との融合タンパク質を生成するように第２遺伝子と目的遺伝子とがインフレームにて連結されている。このような構成を有する組成物またはキットは、目的タンパク質を植物体に貯蔵する目的に用いられ得る。
　なお、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含んでいる第３ＤＮＡ構築物がさらに用いられる場合は、目的遺伝子は第３ＤＮＡ構築物に含まれていてもよい。この場合、該さらなるタンパク質と該目的タンパク質との融合タンパク質を生成するように、該さらなる遺伝子と目的遺伝子とがインフレームにて連結されている。この場合、膜タンパク質をＥＲボディ内に大量蓄積することができる。このような構成を有する組成物またはキットは、目的タンパク質を植物体に貯蔵する目的に用いられ得る。
　本発明が適用されるべき植物体は、単子葉植物であっても双子葉植物であってもよい。
　ＥＲは分泌タンパク質の合成のためのオルガネラであり、合成されたタンパク質はＥＲから目的部位へ速やかに送達される。このようなＥＲが、植物ではタンパク質の蓄積の場として利用されていることが多くの例から明らかになってきている。このことは、蓄積の場としてのＥＲボディの利用を期待させる。
　しかし、上述したように、ＥＲボディはあくまでもアブラナ目の植物にのみ観察される独特なオルガネラであり、ＥＲボディ形成に必要なＮＡＩ２およびそのカウンターパートは、他の植物に存在しない。これらの事項は、アブラナ目以外の植物にてＥＲボディを形成させることが容易ではないことを示唆する。しかも、アブラナ目とは技術的な相関が何ら存在しない単子葉植物（イネ、タマネギ等）にてＥＲボディを形成させることが実現することは、当業者が予測し得る範囲を超えた格別顕著なものである。
　本発明にかかる植物体は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質およびＥＲボディ集積能を有するタンパク質を発現していることを特徴としている。なお、内因性の第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを発現している天然のアブラナ目の植物体（例えばArabidopsis thaliana）は、本発明の植物体に含めない。また、上述した、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をさらに発現していてもよい。本発明にかかる植物体の作製方法は、上述したＤＮＡ構築物を植物体に導入する工程を包含することを特徴としている。植物体に導入されるべき上記ＤＮＡ構築物は、上述した組成物として提供されても、上述したキットとして提供されてもよい。
　また、本発明にかかる植物体の作製方法は、植物体にＥＲボディを生成させる方法でもあり得る。本発明にかかる植物体は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質、およびＥＲボディ集積能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を発現していてもよい。あるいは、本発明にかかる植物体は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質、およびＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を発現していてもよい。本発明において、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質、およびＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質は、上述した構成を有していればよい。なお、内因性の第１ポリペプチド、および第２ポリペプチドと任意のポリペプチドとの融合タンパク質を発現している天然のアブラナ目の植物体（例えばArabidopsis thaliana）は、本発明の植物体に含めない。
　本発明にかかる植物体の作製方法は、上述した目的遺伝子を含んでいるＤＮＡ構築物を植物体に導入する工程を包含することを特徴としている。植物体に導入されるべき上記ＤＮＡ構築物は、上記組成物として提供されても、上記キットとして提供されてもよい。また、本発明にかかる植物体の作製方法は、目的タンパク質を植物体内に貯蔵する方法でもあり得る。
　本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
　本発明を用いれば、小胞体（ＥＲ）に由来する構造物の１つであるＥＲボディの形成機構を解明し、植物体に新たな形質を付与するための技術を提供することができる。具体的には、アブラナ目の植物にのみ存在するＥＲボディを他の植物、特に単子葉植物において形成させることができる。これにより、これまで期待することができなかったタンパク質の貯蔵部位を、種々の植物体にて形成させることができる。
ＮＡＩ２とＰＹＫ１０との同時発現が、ＥＲボディの形成に十分であることを示す図である。示した蛍光イメージは、タマネギ上皮細胞におけるＥＲに標的化された緑色蛍光タンパク質を示す。 シロイヌナズナの内因性のＥＲボディの高倍率像（左）、およびタマネギに人工的に誘導したＥＲボディの高倍率像（右）を示す図である。 タマネギ上皮細胞にて誘導されたＥＲボディにＭＥＢ２が集積されたことを示す図である。ＮＡＩ２遺伝子およびＰＹＫ１０遺伝子をタマネギ上皮細胞へ一緒に導入してＥＲボディ形成を誘導した（下部パネル）。バーは５μｍである。 ＮＡＩ２遺伝子およびＰＹＫ１０遺伝子を一緒に導入することによってタバコカルスにてＥＲボディ形成が誘導されたことを示す図である。
　〔ＥＲボディ〕
　病虫害耐性等に関与すると考えられるＥＲボディは、アブラナ目の植物において、非常に限定された局面でのみ形成される構造物であり、具体的には、アブラナ目の植物の幼植物体にのみ観察され、生長した植物体では虫害を被った際にのみ観察される独特なオルガネラである。
　ＥＲボディタンパク質であるＮＡＩ２はＥＲボディ形成に重要であり、ＥＲボディはｎａｉ２変異体では形成されない（非特許文献２参照）。しかし、本発明者らは、タマネギ上皮細胞にてＮＡＩ２を単独で発現させてもＥＲボディの形成に十分ではないことを見出した。ところが、ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０を同時に導入することで、ＥＲボディがタマネギ上皮細胞に誘導された。このことは、ＮＡＩ２タンパク質およびＰＹＫ１０タンパク質がＥＲボディの濃縮したマトリクスを形成するために相互作用し得、これによってＥＲボディの形状を制御し得ることを示唆する。
　タマネギ上皮細胞において、ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０は、シロイヌナズナの内因性のＥＲボディと同じ形状かつ同じサイズのＥＲボディを誘導した。さらに、タマネギ上皮細胞中にＮＡＩ２およびＰＹＫ１０を発現させると、ＥＲボディの形成が誘導されるだけでなく、ＥＲボディの膜タンパク質であるＭＥＢ２が、細胞中に誘導されたＥＲボディに局在化する。したがって、ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０は、ＥＲボディの形状を制御し、ＥＲボディの膜タンパク質を集積させてＥＲボディの膜の本来の特性を確立させると考えられる。なお、本明細書中において、内因性のＥＲボディについてシロイヌナズナを用いて説明しているが、ＥＲボディ様のネイティブな構造物はシロイヌナズナ以外のアブラナ目の植物（例えば、Arabis alpina、Brassica oleracea、Raphanus sativus、Capparis spinosa、Cleome spinosa等）において見出されている。
　ＮＡＩ２タンパク質は７７２アミノ酸からなり、そのアミノ末端にシグナルペプチドを有していることから、ＮＡＩ２タンパク質は分泌タンパク質であると考えられる。ＮＡＩ２タンパク質のＮ末端側半分の領域は、特徴的なＧｌｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ配列を含む約４０アミノ酸配列を１０回反復するＧｌｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ（ＥＦＥ）モチーフを有している。ＮＡＩ２タンパク質のＥＦＥモチーフ領域は親水性である。ＮＡＩ２タンパク質のＣ末端側半分の領域は独特であり、本発明者らはＮＡＩ２ドメインと称している。このような構造を有するＮＡＩ２タンパク質は、ｎａｉ２変異体ではＥＲボディが形成されないことから、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質と称することができる。
　このような独特の構造を有しているＮＡＩ２（配列番号１および２）は、ファミリーを形成している。シロイヌナズナにおけるＮＡＩ２と構造的に関連するタンパク質として、ＴＳＫ結合タンパク質１（ＴＳＡ１／Ａｔ１ｇ５２４１０（配列番号３および４））、Ａｔ３ｇ１５９６０（配列番号５および６）が挙げられる。ＴＳＡ１は、シグナルペプチド、１０回のＥＦＥリピート、およびＮＡＩ２ドメインを有している。Ａｔ３ｇ１５９６０は、ＮＡＩ２やＴＳＡ１よりも小さいタンパク質であり、シグナルペプチドおよびＮＡＩ２ドメインを有しているが、ＥＦＥリピートを有していない。また、B. napusにおける、シグナルペプチド、９回のＥＦＥリピート、およびＮＡＩ２ドメインを有しているタンパク質（TC74287（配列番号７および８））もまた、ＮＡＩ２と構造的に関連するタンパク質として挙げられる。他にもＮＡＩ２ホモログをアブラナ目植物（例えば、B. rapa （AC189268、AC189514）、B. oleracea（BZ479594、BZ006167）等）にて同定した。しかし、動物や真菌だけでなく、イネやポプラにおいても、ＮＡＩ２ホモログは見出されなかった。
　ＮＡＩ２と同様にアブラナ目に特異的なタンパク質であり、ＥＲ貯留シグナル（ＫＤＥＬ（配列番号１７））を有する可溶性タンパク質であるＰＹＫ１０（配列番号１１および１２）は、ｎａｉ２変異体ではＥＲ全体に分散するが野生型ではＥＲボディに集積していることから、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質と称することができる。ＰＹＫ１０もまた、構造的に関連するタンパク質のファミリーを形成している。ＰＹＫ１０ホモログとしては、同様にβ－グルコシダーゼの機能を有するＢＧＬＵ１８（配列番号１３および１４）およびＢＧＬＵ２１（配列番号１５および１６）が挙げられる。ＢＧＬＵ１８もまた、同様の配列（ＲＥＥＬ（配列番号１８））を有する可溶性タンパク質であり、ＰＹＫ１０と同様に、創傷によって誘導されたＥＲボディに集積する（データは示さず）。
　〔ＤＮＡ構築物〕
　本発明は、アブラナ目植物にのみ存在するオルガネラであるＥＲボディを、非アブラナ目植物において形成させるためのＤＮＡ構築物を提供する。本発明にかかるＤＮＡ構築物は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子とを含んでいる。
　本明細書中にて使用される場合、「ＥＲボディ形成能を有するタンパク質」は、上述したＮＡＩ２ファミリー分子が意図される。用語「ＥＲボディ形成能」は、ＥＲボディの形成が阻害されたアブラナ目植物に発現させた際にＥＲボディを形成し得る能力（活性）が意図される。
　本明細書中にて使用される場合、「ＥＲボディ集積能を有するタンパク質」は、上述したＰＹＫ１０ファミリー分子が意図される。用語「ＥＲボディ集積能」は、ＥＲボディの形成が阻害されたアブラナ目植物にＥＲボディを形成させた際に、形成されたＥＲボディへ集積し得る能力（活性）が意図される。
　一実施形態において、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質（第１ポリペプチドともいう。）は、（i）配列番号１、３、５または７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、（ii）配列番号１、３、５または７に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質であり得る。また、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質（第２ポリペプチドともいう。）は、（iii）配列番号１１、１３または１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、（iv）配列番号１１、１３または１５に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質であり得る。
　ポリペプチド（アミノ酸）の観点で用いられる場合、「１または数個」は、１～３０個の範囲内であることが好ましく、１～２０個の範囲内であることがより好ましく、１～１０個の範囲内であることがさらに好ましく、１～５個の範囲内であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリペプチドの長さに応じて、用語「１または数個」によって示されるアミノ酸数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得る。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用され、アミノ酸の重合体が意図される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明にかかるポリペプチドはまた、組換え的に生成されても、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。
　他の実施形態において、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子（第１遺伝子ともいう。）は、（Ａ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、（Ｂ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（Ｃ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、（Ｄ）配列番号２、４または６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいる。また、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子（第２遺伝子ともいう。）は、（ａ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、（ｃ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、（ｄ）配列番号１２、１４または１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいる。
　ポリヌクレオチド（塩基）の観点で用いられる場合、「１または数個」は、１～１００個の範囲内であることが好ましく、１～５０個の範囲内であることがより好ましく、１～３０個の範囲内であることがさらに好ましく、１～１５個の範囲内であることがなおさらに好ましい。なお、当業者は、目的のポリヌクレオチドの長さに応じて、用語「１または数個」によって示される塩基数の範囲がどの程度であるのかを容易に理解し得る。例えば、オリゴヌクレオチドの場合、用語「１または数個」は、１～１０個の範囲内であることが好ましく、１～７個の範囲内であることがより好ましく、１～５個の範囲内であることがさらに好ましく、１～３個の範囲内であることがなおさらに好ましい。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、該ポリヌクレオチドの部分断片が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用される。
　本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
　本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。
　本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。
　本明細書中で使用される場合、目的のポリペプチドまたはポリヌクレオチドについての相同性は、８０％以上であることが好ましく、８５％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましく、９５％以上であることがなおさらに好ましい。
　本発明にかかるＤＮＡ構築物は、プロモータをさらに含んでいることが好ましく、単一のプロモータを含んでいる場合、該プロモータは第１遺伝子および第２遺伝子と作動可能に連結されており、複数のプロモータを含んでいる場合、第１プロモータが第１遺伝子と作動可能に連結されており、第２プロモータが第２遺伝子と作動可能に連結されている。ここで、第１遺伝子は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子であり、第２遺伝子は、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子である。また、第２プロモータは第１プロモータと同一であっても異なってもよい。
　本発明において用いられるプロモータとしては特に限定されず、当業者であれば、植物におけるタンパク質発現に好ましいプロモータとして周知のものが適宜選択することができる。
　本発明にかかるＤＮＡ構築物は、ＥＲボディに集積させるための目的タンパク質をコードする遺伝子（目的遺伝子ともいう。）をさらに含んでいてもよい。この場合、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質を生成するようにＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子とがインフレームにて連結されている。
　このような構成を有しているＤＮＡ構築物を用いれば、これまで期待することができなかったタンパク質の貯蔵部位を、種々の植物体にて形成させることができる。すなわち、本発明のＤＮＡ構築物は、目的タンパク質を植物体に貯蔵する目的に用いられ得る。
　目的タンパク質を植物体に貯蔵する目的に用いられる場合、本発明にかかるＤＮＡ構築物は、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子を２つ以上含んでいてもよく、少なくとも１つがＰＹＫ１０ファミリー分子をコードする遺伝子であればよく、他方は例えばＭＥＢ２ファミリー分子をコードする遺伝子であってもよい。ＥＲボディの膜タンパク質であるＭＥＢ２が、細胞中に誘導されたＥＲボディに局在化するという観点から、ＭＥＢ２もまたＥＲボディ集積能を有するタンパク質といえる。このような構成を有するＤＮＡ構築物を用いて目的タンパク質をＥＲボディに集積させる場合は、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つと目的タンパク質をコードする遺伝子とがインフレームにて連結されて、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質の少なくとも１つと目的タンパク質との融合タンパク質を生成されればよい。
　なお、本明細書中にて使用される場合、ＭＥＢ２タンパク質は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、あるいは、配列番号９に示されるアミノ酸配列の、１または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質である。また、ＭＥＢ２遺伝子は、配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；あるいは、配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、を含んでいる遺伝子である。
　〔組成物およびキット〕
　本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。
　一般に、組成物は「二種以上の成分が全体として均質に存在し、一物質として把握されるもの」が意図され、例えば、物質Ａを主成分として含有する単一の組成物、主成分としての物質Ａと物質Ｂとを含有する単一の組成物であり得る。これらの組成物は、主成分の機能を阻害しない範囲内で物質Ａおよび物質Ｂ以外の他の成分を含有してもよい。本発明にかかる組成物は、単独で使用されても、他の物質または組成物と併用されてもよい。この場合、併用されるべき他の物質または組成物が本発明にかかる組成物中に提供されてもされなくてもよい。後者の場合は、これらを全体として一組成物として認識し得ないが、この場合は、後述する「キット」の範疇に入り得、組成物としてではなくキットとして提供され得ることを当業者は容易に理解する。
　本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明にかかるキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明にかかるキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。
　本発明は、ＥＲボディを非アブラナ目植物にて形成させるための組成物を提供する。一実施形態において、本発明にかかる組成物は、上述した単一のＤＮＡ構築物を含有している。また、本発明は、ＥＲボディを非アブラナ目植物にて形成させるためのキットを提供する。一実施形態において、本発明にかかる組成物は、上述した単一のＤＮＡ構築物を備えている。
　本発明の別の実施形態において、上述した単一のＤＮＡ構築物の構成が、別々のＤＮＡ構築物中に含まれていてもよい。すなわち、一実施形態において、本発明にかかる組成物は、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第１ＤＮＡ構築物と、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第２ＤＮＡ構築物とを含有していることを特徴としている。本実施形態にかかる組成物は、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含んでいる第３ＤＮＡ構築物をさらに含有していてもよい。また、一実施形態において、本発明にかかるキットは、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第１ＤＮＡ構築物と、ＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる第２ＤＮＡ構築物とを備えていることを特徴としている。本実施形態にかかるキットは、ＥＲボディ集積能を有するさらなるタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含んでいる第３ＤＮＡ構築物をさらに備えていてもよい。
　本発明にかかる組成物およびキットにおいて、第２ＤＮＡ構築物または第３ＤＮＡ構築物は、上述したように、ＥＲボディに集積させるための目的タンパク質をコードする目的遺伝子をさらに含んでいる構成であってもよい。このような構成を有する組成物またはキットは、目的タンパク質を植物体に貯蔵する目的に用いられ得る。
　〔植物体およびその作製方法〕
　上述したようなＤＮＡ構築物、組成物およびキットを用いれば、ＥＲボディを有する植物体を作製することができる。すなわち、本発明は、ＥＲボディを有する植物体およびその作製方法を提供する。
　本発明にかかる植物体は、上述したＤＮＡ構築物が植物体に導入され、その結果、各ＤＮＡ構築物に含まれている遺伝子（ポリヌクレオチド）によってコードされるタンパク質を発現していればよい。すなわち、本発明にかかる植物体の作製方法は、上述したＤＮＡ構築物を植物体に導入する工程を包含すればよい。本発明における遺伝子導入の手順は、当該分野にて周知の技術が用いられればよく、いわゆる「形質転換体植物」の作製方法が採用され得る。なお、上記ＤＮＡ構築物は、上述した組成物またはキットとして提供されてもよい。
　本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体もまた意図される。なお、本発明にかかる形質転換体は、少なくとも、本発明にかかるＤＮＡ構築物中に含まれている遺伝子が導入されており、この遺伝子によってコードされるタンパク質を発現していればよいといえる。すなわち、発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。また、本発明にかかる植物体（形質転換体）は、所望のタンパク質が安定的に発現していることが好ましい。
　本明細書中で使用される場合、「遺伝子が導入された」または「遺伝子が導入されている」は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されていること（すなわち、形質転換体）が意図される。植物を用いた産業分野に本発明を適用する場合は、各種作物（農林水産業で生産される植物、農作物）が適用対象として挙げられる。具体的には、例えば、穀物（イネ、コムギ、トウモロコシ等）、材木類（マツ、スギ、ヒノキ等）、各種野菜類、花卉類が挙げられる。
　本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。一実施形態において、本発明にかかる植物体は、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかであり得る。
　植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃（粒子ボンバードメント）、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウムに導入し、この株を当該分野において周知の方法（例えばリーフディスク法など）に従って無菌培養葉片に感染させればよい。また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。なお、遺伝子が導入された細胞または植物組織から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
　植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法などによって組換えベクターが培養細胞に導入される。形質転換の結果として得られるカルスなどは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
　遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などを用いて目的遺伝子の検出を行えばよい。目的遺伝子の検出が、核酸プローブを、目的遺伝子にハイブリダイズさせる工程であり得る。本明細書中で使用される場合、「核酸プローブ」は、目的の核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定されず、いわゆるハイブリダイゼーションプローブであってもＰＣＲプライマーであってもよい。ハイブリダイゼーション技術およびＰＣＲ技術は、当該分野において周知であり、当業者は、容易に実行し得る。
　核酸プローブは、目的遺伝子（またはその相補鎖）の部分配列を含むオリゴヌクレオチドであれば特に限定されない。ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの場合、核酸プローブは、配列表に記載のヌクレオチド配列またはその相補配列の、１５～５０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、より好ましくは２０～５０個、さらに好ましくは２０～４５個、最も好ましくは２５～４０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである。また、ＰＣＲ（ｉｎ　ｓｉｔｕ　ＰＣＲを含む。）の場合、核酸プローブは、配列表に記載のヌクレオチド配列またはその相補配列の、１５～５０個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましく、より好ましくは１５～４０個、さらに好ましくは１５～３５個、最も好ましくは２５～３５個連続する塩基からなるオリゴヌクレオチドである。もちろん、後述する実施例にて用いられたオリゴヌクレオチドであってもよい。
　本発明にかかるポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、所望のタンパク質が発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
　このような植物体の作製方法が、植物体にＥＲボディを生成させる方法でもあり得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、本発明はまた、植物体にＥＲボディを生成させる方法を提供する。
　上述したＤＮＡ構築物が、貯蔵を目的とするタンパク質をコードする遺伝子を含んでいる場合は、本発明を用いれば、ＥＲボディに目的タンパク質を貯蔵した植物体を作製することができる。すなわち、本発明は、ＥＲボディに目的タンパク質を貯蔵した植物体およびその作製方法を提供する。また同様に、本発明は、目的タンパク質を植物体内に貯蔵する方法を提供する。
　なお、貯蔵した目的タンパク質を精製する際には、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、目的のタンパク質に対する抗体を用いたアフィニティー精製、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
　非特許文献２に記載の手順に従って、表１に記載のプライマーおよびテンプレートとしてのＥＳＴクローン（ＭＥＢ１についてはU21078、ＭＥＢ２についてはU23495、ＮＡＩ２についてはU16255）またはｍＲＮＡを用いて、目的の遺伝子を含むｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、それぞれ発現ベクターｐＵＧＷ２に挿入した。用いたＥＳＴクローンは、the Arabidopsis Biological Resource Centerから得たSalk/Stanford/PGEC Consortium full-length cDNA/ORFクローンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　得られた発現ベクターを、非特許文献２に記載の手順に従って、粒子ボンバードメントによって、タマネギ上皮細胞またはタバコカルスへ導入した。小胞体とＥＲボディを緑色蛍光タンパク質で可視化するために、発現ベクター、ｐＢＩ２２１・ＳＰ－ＧＦＰ－ＨＤＥＬを同時に導入した。遺伝子導入の６～１２時間後に、非特許文献２に記載の手順に従って、共焦点レーザ顕微鏡にて観察を行った。
　内因性のＥＲボディはアブラナ目植物においてのみ観察される。アブラナ目植物に独特なオルガネラを非アブラナ目植物にて形成させることは、非常に興味深いことである。ＮＡＩ２は、内因性のＥＲボディの形成に必須な、ＥＲボディ形成能を有するタンパク質である。このようなＮＡＩ２を用いれば非アブラナ目植物においてＥＲボディ形成を誘導することが可能であるのかどうかを確認した。しかし、タマネギ上皮細胞にＮＡＩ２を導入しても、ＥＲボディは観察されなかった（図１右上）。同様に、ＥＲボディ集積能を有するＰＹＫ１０をタマネギ上皮細胞に導入しても、ＥＲボディは観察されなかった（図１左上）。
　ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０の発現を制御する転写因子ＮＡＩ１によって発現が制御される膜タンパク質ＭＥＢ１およびＭＥＢ２を用いて、タマネギ上皮細胞においてＥＲボディ形成を誘導することが可能であるのかどうかを確認した。しかし、ＭＥＢ１およびＭＥＢ２を導入しても、ＥＲボディは誘導されなかった（図１左中）。ＥＲボディの膜タンパク質であるＭＥＢ１およびＭＥＢ２と、可溶性のＥＲボディタンパク質であるＰＹＫ１０との相互作用に基づいてＥＲボディ形成が誘導される可能性を検討したが、これらの組合せによっても、ＥＲボディ形成は誘導されなかった（図１右中）。さらに、膜タンパク質であるＭＥＢ１およびＭＥＢ２と、ＥＲボディ形成能を有するＮＡＩ２との相互作用に基づいてＥＲボディ形成が誘導される可能性を検討したが、これらの組合せによっても、ＥＲボディ形成は誘導されなかった（図１左下）。
　遺伝子導入の手順や観察時期についても種々の条件を検討したが、好ましい結果を得ることはできなかった。このことは、アブラナ目植物におけるＥＲボディ形成機構が非常に複雑であること、アブラナ目植物に独特なオルガネラを非アブラナ目植物にて形成させることは非常に困難であることを示唆した。
　そこで、ＭＥＢ１、ＭＥＢ２およびＰＹＫ１０の局在がＮＡＩ２の有無に伴ってどのように変化するのかをさらに詳細に検討する目的で、これらの遺伝子を組み合わせてタマネギ上皮細胞に導入した。すると、ＮＡＩ２とＰＹＫ１０とを同時に発現させた際に、タマネギ上皮細胞には通常観察されない細長い形状の構造物が観察された（図１右下）。その形状がＥＲボディと似ているものの、非膜タンパク質であるＮＡＩ２およびＰＹＫ１０の２つのタンパク質を発現させるだけで、ＥＲボディという独特なオルガネラが構築され得るとは全く予想し得なかったので、このタマネギ上皮細胞に形成された細長い構造物を、シロイヌナズナにおける内因性のＥＲボディと、形態面で比較した。図２に示すように、この人工的に誘導した構造物は、シロイヌナズナにおける内因性のＥＲボディと同一のサイズおよび形状であった（図２）。タマネギ上皮細胞のみならず、タバコ培養細胞でもＮＡＩ２およびＰＹＫ１０タンパク質を発現させるだけでＥＲボディが形成された（図４）。
　この人工的に誘導した構造物がＥＲボディであるのか否かをさらに検討するために、ＥＲボディの膜タンパク質であるＭＥＢ２の局在が、ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０の有無によって変化するかどうかを調べた。ＧＦＰとＭＥＢ２との融合遺伝子を作製する目的で、ＭＥＢ２遺伝子を含むｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し、ＧＦＰ遺伝子を含む発現ベクターｐＵＧＷ６に挿入した。得られたベクターをＮＡＩ２遺伝子またはＰＹＫ１０遺伝子を含むベクターとともにタマネギ上皮細胞に導入した。小胞体およびＥＲボディを赤色蛍光タンパク質で可視化するために、発現ベクターｐＢＩ２２１・ＳＰ－ｔｄＴＯＭ－ＫＤＥＬを同時に導入した。その結果、ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０が存在しない（すなわち、構造物が誘導されていない）状態では、ＭＥＢ２はＥＲ全体に分散し、そのシグナルは非常に低かった（図３上）。しかし、ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０が存在する（すなわち、構造物が誘導されている）状態では、ＭＥＢ２はその構造物へ引き寄せられて、その構造物の膜状に局在した（図３下）。
　これらの結果より、アブラナ目植物に独特なオルガネラであるＥＲボディを非アブラナ目植物にて形成させるには、ＮＡＩ２およびＰＹＫ１０の両方を発現させることが必要でありかつ十分であることがわかった。
　シロイヌナズナにおいて、ＮＡＩ２は、ＥＲボディ形成のためのＥＲボディ成分である。本発明者らは、主要なＥＲボディ成分であるＰＹＫ１０における変異がＥＲボディの形態を変化させることを見出した（示さず）。このことは、ＰＹＫ１０もまたＥＲボディ形成を調節することを示唆するが、上記結果とも一致している。また、シロイヌナズナにおいて、ＣＢＢ染色によってＰＹＫ１０タンパク質は容易に検出されるがＮＡＩ２タンパク質は検出されない。このことは、ＰＹＫ１０がＮＡＩ２よりも豊富に存在することを示す。ＮＡＩ２がＰＹＫ１０のシャペロンとして機能し、ＰＹＫ１０の集積および濃縮化を容易にしている可能性が示唆される。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　本発明を用いれば、タンパク質生産工場として用いた植物にて目的タンパク質の備蓄を省資源かつ省エネルギーにて行うことができる。

Claims (16)

  1. 　第１ポリペプチドをコードする第１遺伝子と、第２ポリペプチドをコードする第２遺伝子とを含んでいるＤＮＡ構築物であって、
    　第１ポリペプチドが、
    　（i）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（ii）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質
    であり、
    　第２ポリペプチドが、
    　（iii）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（iv）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質
    である、ＤＮＡ構築物、あるいは
    　第１遺伝子が、
    　（Ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    　（Ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（Ｃ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは
    　（Ｄ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    を含んでおり、
    　第２遺伝子が、
    　（ａ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    　（ｂ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（ｃ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは
    　（ｄ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    を含んでいる、ＤＮＡ構築物。
  2. 　第３ポリペプチドをコードする第３遺伝子をさらに含んでおり、
    　第３ポリペプチドが、
    　（i）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（ii）配列番号９に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質
    であり、
    　第３遺伝子が、
    　（ａ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    　（ｂ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（ｃ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは
    　（ｄ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    を含んでいる、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  3. 　目的タンパク質をコードする目的遺伝子をさらに含んでおり、第２ポリペプチドまたは第３ポリペプチドと該目的タンパク質との融合タンパク質を生成するように第２遺伝子または第３遺伝子と目的遺伝子とがインフレームにて連結されている、請求項１または２に記載のＤＮＡ構築物。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含有している、植物体にＥＲボディを生成させるための組成物。
  5. 　請求項３に記載のＤＮＡ構築物を含有している、目的タンパク質を植物体に貯蔵するための組成物。
  6. 　第１ポリペプチドをコードする第１遺伝子を含んでいる第１ＤＮＡ構築物と、第２ポリペプチドをコードする第２遺伝子を含んでいる第２ＤＮＡ構築物とを含有している、植物体にＥＲボディを生成させるための組成物であって、
    　第１ポリペプチドが、
    　（i）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（ii）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質
    であり、
    　第２ポリペプチドが、
    　（iii）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（iv）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質
    である、組成物、あるいは
    　第１遺伝子が、
    　（Ａ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    　（Ｂ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（Ｃ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは
    　（Ｄ）配列番号２、４、６もしくは８に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    を含んでおり、
    　第２遺伝子が、
    　（ａ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    　（ｂ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（ｃ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは
    　（ｄ）配列番号１２、１４もしくは１６に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    を含んでいる、組成物。
  7. 　第３ポリペプチドをコードする第３遺伝子を含んでいる第３ＤＮＡ構築物をさらに含有している、請求項５に記載の組成物であって、
    　第３ポリペプチドが、
    　（i）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（ii）配列番号９に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質
    であり、
    　第３遺伝子が、
    　（ａ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡ、
    　（ｂ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の、１もしくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加されているポリヌクレオチド配列からなるＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
    　（ｃ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは
    　（ｄ）配列番号１０に示されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    を含んでいる、組成物。
  8. 　第２ＤＮＡ構築物が、目的タンパク質をコードする目的遺伝子をさらに含んでおり、第２ポリペプチドまたは第３ポリペプチドと該目的タンパク質との融合タンパク質を生成するように第２遺伝子または第３遺伝子と目的遺伝子とがインフレームにて連結されている、請求項６または７に記載の組成物。
  9. 　目的タンパク質を植物体に貯蔵するために用いられる、請求項８に記載の組成物。
  10. 　前記植物体が単子葉植物である、請求項４～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物、あるいは請求項４～１０のいずれか１項に記載の組成物を植物体に導入する工程を包含する、ＥＲボディを有する植物体の作製方法。
  12. 　第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを発現しており、
    　第１ポリペプチドが、
    　（i）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（ii）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質
    であり、
    　第２ポリペプチドが、
    　（iii）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（iv）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質
    である、植物体。
  13. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物、あるいは請求項４～１０のいずれか１項に記載の組成物を植物体に導入する工程を包含する、植物体にＥＲボディを生成させる方法。
  14. 　請求項３に記載のＤＮＡ構築物、あるいは請求項８または９に記載の組成物を植物体に導入する工程を包含する、ＥＲボディに目的タンパク質を貯蔵した植物体の作製方法。
  15. 　第１ポリペプチド、第２ポリペプチドおよび第３ポリペプチドを発現しており、かつ第２ポリペプチドまたは第３ポリペプチドが目的タンパク質との融合タンパク質として発現しており、
    　第１ポリペプチドが、
    　（i）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（ii）配列番号１、３、５もしくは７に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ形成能を有するタンパク質
    であり、
    　第２ポリペプチドが、
    　（iii）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（iv）配列番号１１、１３もしくは１５に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質
    であり、
    　第３ポリペプチドが、
    　（v）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または
    　（vi）配列番号９に示されるアミノ酸配列の、１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失しているアミノ酸配列からなり、かつＥＲボディ集積能を有するタンパク質
    である、植物体。
  16. 　請求項３に記載のＤＮＡ構築物、あるいは請求項８または９に記載の組成物を植物体に導入する工程を包含する、目的タンパク質を植物体内に貯蔵する方法。
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