JP2012170400A - タンパク質の植物細胞内への蓄積方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、ERボディ形成機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子と、N末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつC末端にER保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、当該植物細胞内に形成されたERボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のN末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
【選択図】なし
Description
(1) タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
ERボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、N末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつC末端にER保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、当該植物細胞内に形成されたERボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質から前記細胞内膜系移行シグナルペプチドが欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
(2) 前記ERボディ形成機能を有するタンパク質が、下記(a)〜(d)のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする前記(1)に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法;
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド、
(d)配列番号1で表されるアミノ酸配列中の473番目から772番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド、
(3) 前記標的タンパク質が、Pyk10タンパク質のC末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする前記(1)又は(2)に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
(4) 前記植物細胞が、植物個体中の細胞であることを特徴とする前記(1)〜(3)のいずれか一つに記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
(5) ERボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター、又は、ERボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターが導入されており、
前記標的タンパク質は、N末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつC末端にER保留シグナルペプチドを有しており、
植物体中の少なくとも1の細胞において、当該細胞内に形成されたERボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のN末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されていることを特徴とする形質転換植物、
(6) 前記ERボディ形成機能を有するタンパク質が、下記(a)〜(d)のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする前記(5)に記載の形質転換植物;
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド、
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド、
(d)配列番号1で表されるアミノ酸配列中の473番目から772番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド、
(7) 前記標的タンパク質が、Pyk10タンパク質のC末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする前記(5)又は(6)に記載の形質転換植物、
(8) 単子葉植物であることを特徴とする前記(5)〜(7)のいずれか一つに記載の形質転換植物、
(9) ユリ科植物又はイネ科植物であることを特徴とする前記(5)〜(7)のいずれか一つに記載の形質転換植物、
(10) イネであることを特徴とする前記(5)〜(7)のいずれか一つに記載の形質転換植物、
(11) 前記(5)〜(10)のいずれか一つに記載の形質転換植物の後代個体又はクローン個体であることを特徴とする植物、
を、提供するものである。
また、本発明の形質転換植物は、外来タンパク質をERボディに比較的安定して蓄積させることができる。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。
なお、配列番号1で表されるアミノ酸配列とのアミノ酸配列上の相同性は、Blast等の公知のプログラムを用いて求めることができる。
(d)配列番号1で表されるアミノ酸配列中の473番目から772番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。
タマネギ表皮細胞に、nai2遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子を一過性に共発現させることにより、新たに形成されたERボディに標的タンパク質を蓄積させた。
<遺伝子発現ベクターの作製>
レポーターであるオワンクラゲ蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を、単独、若しくは糖化酵素であるAcidothermus cellulolyticus由来エンドグルカナーゼE1遺伝子触媒領域(E1−cat)(非特許文献15参照。)又はPyrococcus furiosus由来β−グルコシダーゼCelB遺伝子(非特許文献16参照。)との融合タンパク質として、トウモロコシubi1プロモーター及びアグロバクテリムnosターミネーターとPCR法により連結し、遺伝子発現カセットを作製した。各遺伝子のコード領域5’末端にはタバコモザイクウイルスPr1aタンパク質シグナルペプチド(非特許文献10参照。)を付加し、コード領域3’末端にはER保留シグナルペプチドであるアミノ酸4残基(HDEL)を付加した。また、トウモロコシubi1プロモーター、GFP遺伝子、及びアグロバクテリムnosターミネーターをPCR法により連結し、細胞内膜系移行シグナルペプチドとER保留シグナルペプチドのいずれも含まない遺伝子発現カセット(GFP発現カセット)を作製した。さらに、シロイヌナズナERボディ形成関連遺伝子であるnai2遺伝子の発現カセット(nai2発現カセット)を同様に作製した。
作製した発現ベクターを、遺伝子組み換え装置(パーティクルガン)(製品名:PDS−1000/He、Bio−Rad社製)を用いて、インストラクションマニュアルに従ってタマネギ鱗茎に導入した。
発現ベクターを導入した細胞は、蛍光実体顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡により観察した。具体的には、GFPの蛍光を検出することにより、細胞中に発現しているGFP又はGFP融合タンパク質の局在を観察した。蛍光実体顕微鏡画像を図2に示す。図2中、上段(nai2共発現なし)は、nai2発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった細胞の画像であり、下段(nai2共発現あり)は、nai2発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞の画像である。
Pyk10タンパク質のC末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質を標的タンパク質として、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、タマネギ表皮細胞に、ERボディを形成させて標的タンパク質を蓄積させた。
<遺伝子発現ベクターの作製>
Pyk10のC末端にGFPを連結させた融合タンパク質として、トウモロコシubi1プロモーター及びアグロバクテリムnosターミネーターとPCR法により連結し、遺伝子発現カセットを作製した。当該遺伝子のコード領域3’末端にはER保留シグナルペプチドであるアミノ酸4残基(HDEL)を付加した。作製された発現カセット(Pyk10::GFP−HDEL融合発現カセット)の模式図を図1に示す。
Pyk10::GFP−HDEL融合発現カセットを、In−Fusion Advantage PCRクローニングキット(クロンテック社製)を用いてMultiRound Gateway(非特許文献11参照。)エントリーベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。
実施例1と同様にして、Pyk10::GFP−HDEL融合発現カセットを含む発現ベクター、実施例1で用いたSP−GFP−HDEL発現カセットを含む発現ベクター、又は、細胞内膜系移行シグナルペプチドとER保留シグナルペプチドのいずれも含まないGFP発現カセットを含む発現ベクター、並びにnai2発現カセットを含む発現ベクターを、それぞれタマネギ鱗茎に導入した。さらに、実施例1と同様にして、発現ベクターを導入した細胞は、蛍光実体顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡により観察した。蛍光実体顕微鏡画像を図3に示す。図3中、上段(nai2共発現なし)は、nai2発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった細胞の画像であり、下段(nai2共発現あり)は、nai2発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞の画像である。
Claims (11)
- タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
ERボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、N末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつC末端にER保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、当該植物細胞内に形成されたERボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のN末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法。 - 前記ERボディ形成機能を有するタンパク質が、下記(a)〜(d)のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。
(d)配列番号1で表されるアミノ酸配列中の473番目から772番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。 - 前記標的タンパク質が、Pyk10タンパク質のC末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする請求項1又は2に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
- 前記植物細胞が、植物個体中の細胞であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
- ERボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター、又は、ERボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターが導入されており、
前記標的タンパク質は、N末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつC末端にER保留シグナルペプチドを有しており、
植物体中の少なくとも1の細胞において、当該細胞内に形成されたERボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のN末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されていることを特徴とする形質転換植物。 - 前記ERボディ形成機能を有するタンパク質が、下記(a)〜(d)のいずれかから選択されるポリペプチドであることを特徴とする請求項5に記載の形質転換植物。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。
(d)配列番号1で表されるアミノ酸配列中の473番目から772番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有し、かつ、ERボディ形成機能を有するポリペプチド。 - 前記標的タンパク質が、Pyk10タンパク質のC末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質であることを特徴とする請求項5又は6に記載の形質転換植物。
- 単子葉植物であることを特徴とする請求項5〜7のいずれか一項に記載の形質転換植物。
- ユリ科植物又はイネ科植物であることを特徴とする請求項5〜7のいずれか一項に記載の形質転換植物。
- イネであることを特徴とする請求項5〜7のいずれか一項に記載の形質転換植物。
- 請求項5〜10のいずれか一項に記載の形質転換植物の後代個体又はクローン個体であることを特徴とする植物。
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