JP2009077703A - 形質転換植物 - Google Patents
形質転換植物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009077703A JP2009077703A JP2008055493A JP2008055493A JP2009077703A JP 2009077703 A JP2009077703 A JP 2009077703A JP 2008055493 A JP2008055493 A JP 2008055493A JP 2008055493 A JP2008055493 A JP 2008055493A JP 2009077703 A JP2009077703 A JP 2009077703A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- amino acid
- thermophilic
- endoglucanase activity
- transformed
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 158
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 144
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 143
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 107
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 43
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 138
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 58
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 33
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 33
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 33
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 32
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 claims description 22
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 20
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims description 12
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 11
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 49
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 31
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 14
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 107
- 239000002585 base Substances 0.000 description 57
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 35
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 21
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 17
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 17
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 8
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 5
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 5
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 5
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 5
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000219193 Brassicaceae Species 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 4
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 4
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000207892 Convolvulus Species 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 3
- 241000221017 Euphorbiaceae Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N meropenem Chemical compound C=1([C@H](C)[C@@H]2[C@H](C(N2C=1C(O)=O)=O)[C@H](O)C)S[C@@H]1CN[C@H](C(=O)N(C)C)C1 DMJNNHOOLUXYBV-PQTSNVLCSA-N 0.000 description 3
- 229960002260 meropenem Drugs 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 3
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000207782 Convolvulaceae Species 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 2
- 101800001707 Spacer peptide Proteins 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000018927 edible plant Nutrition 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 2
- AJBZENLMTKDAEK-UHFFFAOYSA-N 3a,5a,5b,8,8,11a-hexamethyl-1-prop-1-en-2-yl-1,2,3,4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a,13b-hexadecahydrocyclopenta[a]chrysene-4,9-diol Chemical compound CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC(C1(C)CC3O)(C)C2CCC1C1C3(C)CCC1C(=C)C AJBZENLMTKDAEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 244000296825 Amygdalus nana Species 0.000 description 1
- 235000003840 Amygdalus nana Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 240000005528 Arctium lappa Species 0.000 description 1
- 235000003130 Arctium lappa Nutrition 0.000 description 1
- 235000008078 Arctium minus Nutrition 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 240000006891 Artemisia vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- ZKQDCIXGCQPQNV-UHFFFAOYSA-N Calcium hypochlorite Chemical compound [Ca+2].Cl[O-].Cl[O-] ZKQDCIXGCQPQNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003880 Calendula Nutrition 0.000 description 1
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 1
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001033883 Cenchritis muricatus Protease inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 235000005940 Centaurea cyanus Nutrition 0.000 description 1
- 240000004385 Centaurea cyanus Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- 150000000782 D-glucoses Chemical class 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710111935 Endo-beta-1,4-glucanase Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000985694 Polypodiopsida Species 0.000 description 1
- 235000011432 Prunus Nutrition 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000204667 Thermoplasma Species 0.000 description 1
- 241000205204 Thermoproteus Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 244000195452 Wasabia japonica Species 0.000 description 1
- 235000000760 Wasabia japonica Nutrition 0.000 description 1
- 239000006661 aam medium Substances 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006743 cytoplasmic accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010091371 endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010092450 endoglucanase Z Proteins 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 235000021332 kidney beans Nutrition 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 235000014774 prunus Nutrition 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000005562 seed maturation Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
- C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
【課題】バイオマスエタノールの原料となる植物系資源として好適な、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼの発現量が多い植物の提供。
【解決手段】発現ベクターにより形質転換された植物であって、前記発現ベクターが、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含んでなり、宿主細胞において、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターであることを特徴とする形質転換植物。
【選択図】なし
【解決手段】発現ベクターにより形質転換された植物であって、前記発現ベクターが、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含んでなり、宿主細胞において、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターであることを特徴とする形質転換植物。
【選択図】なし
Description
本発明は、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターにより形質転換された形質転換植物に関する。
近年、バイオマスエタノール（バイオエタノール）を生産する方法の研究が、世界各国において盛んに行われている。バイオマスエタノールは、植物系資源を酵素処理等により単糖まで糖化した後、酵母等の微生物によるアルコール発酵により産生されるエタノールであり、再生可能な植物から得られる自然エネルギーであること、及び、燃焼させても地表の循環炭素量を増やさないことから、地球温暖化に対する関心が高まる中でエネルギー源としての将来性が期待されているためである。
バイオマスエタノールの原料となる植物系資源は、生産効率の面から、サトウキビやトウモロコシ等の、糖質あるいはデンプン質を多く含む植物資源が主に用いられている。しかしながら、このような植物は食料と競合するため、食料と直接競合しない植物資源を利用したバイオマスエタノールの製造方法の開発が求められている。例えば、雑草等の非食用植物や稲藁等の食用植物の非食用部分のような農業系廃棄物を原料とすることにより、より低コストで安定してバイオマスエタノールを生産し得ることが期待できる。
植物組織の主要な構成成分はセルロースであり、Ｄ−グルコースがβ−１，４結合により多数結合した鎖状高分子化合物である。つまり、セルロースを原料として効率よくバイオマスエタノールを製造することができれば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマスを原料とした場合であっても、サトウキビ等を原料とした場合と同等の生産効率でバイオマスエタノールを製造することが可能となる。
セルロース系バイオマスを原料とした場合に、バイオマスエタノールの生産効率が芳しくない主要な原因として、セルロース系バイオマスは、デンプン質を多く含む植物資源よりも、糖化が困難であることが挙げられる。このため、セルロース系バイオマスの糖化効率を改善することにより、バイオマスエタノールの生産効率を向上できることが期待される。通常、セルロース系バイオマスの糖化は、酵素や、酸又はアルカリ溶液、加圧熱水等を用いて加水分解することにより行われる。特に、セルラーゼ等の酵素を用いることにより、より穏やかな反応条件で糖化が可能である。
セルラーゼは、セルロースをセロビオースやグルコースにまで分解する酵素の総称であり、分解様式により、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼに大別される。なかでも、エンドグルカナーゼ（エンドβ−１，４グルカナーゼ；ＥＣ３．２．１．４）は、セルロース等のβ−１，４グルカンのグリコシド結合を加水分解する酵素であり、セルロースの分解に非常に重要な酵素である。ここで、通常、加水分解等の化学反応効率は、温度が高いほど高くなるため、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属等の超耐熱菌由来のエンドグルカナーゼを用いることにより、セルロース系バイオマスの糖化処理をより効率よく行うことが期待できる（例えば、引用文献１〜３参照。）。
特開２００３−２１０１８２号公報
特開２００４−１０５１３０号公報
特開２００５−２７５７２号公報
しかしながら、エンドグルカナーゼ等の酵素は通常高価であり、このような酵素類をセルロース系バイオマスの糖化処理に大量に用いることは、経済的に好ましくない。
また、元々セルロース系バイオマスは、酵素による分解処理を受け難い。このため、酵素反応を効率よく行うためには、酵素を添加する前に、粉砕や蒸煮等の物理化学的処理や、酸やアルカリによる化学的処理等の前処理が必要であり、これらの前処理にコストがかかるという問題もある。
また、元々セルロース系バイオマスは、酵素による分解処理を受け難い。このため、酵素反応を効率よく行うためには、酵素を添加する前に、粉砕や蒸煮等の物理化学的処理や、酸やアルカリによる化学的処理等の前処理が必要であり、これらの前処理にコストがかかるという問題もある。
本発明は、バイオマスエタノールの原料となる植物系資源として好適な、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼの発現量が高い植物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、形質転換により、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現した植物であれば、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼの発現量が高く、バイオマスエタノールの原料となるセルロースと、セルロースの加水分解に好適に用いられる好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼを同時に供給し得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、発現ベクターにより形質転換された植物であって、前記発現ベクターが、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含んでなり、宿主細胞において、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターであることを特徴とする形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらに、キチナーゼのキチン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記塩基配列が、配列番号７の塩基配列、又は、配列番号７の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列である形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらにアミノ末端にアポプラスト移行シグナルペプチドを有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらにカルボキシル末端に小胞体保留シグナルペプチドを有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、アブラナ科の植物である形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、シロイヌナズナである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、イネ科の植物である形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、イネである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらに、キチナーゼのキチン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記塩基配列が、配列番号７の塩基配列、又は、配列番号７の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列である形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらにアミノ末端にアポプラスト移行シグナルペプチドを有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらにカルボキシル末端に小胞体保留シグナルペプチドを有するポリペプチドである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、アブラナ科の植物である形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、シロイヌナズナである形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、イネ科の植物である形質転換植物を提供するものである。
また、本発明は、前記植物が、イネである形質転換植物を提供するものである。
本発明の形質転換植物は、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ（以下、好熱性エンドグルカナーゼという。）活性を有するポリペプチドを発現しているため、該植物の主要な構成成分であるセルロースが、高温条件下で容易に加水分解され得る。したがって、本発明の形質転換植物をバイオマスエタノールの原料となる植物系資源として用いることにより、糖化処理時に要される酵素量を顕著に低減することができる。さらに、糖化処理前の前処理も簡易化し得ることが期待できる。つまり、本発明の形質転換植物は、セルロースと、セルロースの加水分解に好適に用いられる好熱性エンドグルカナーゼを同時に供給し得るものであり、バイオマスエタノールの原料として特に好適な植物資源である。
本発明の形質転換植物は、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含んでなり、宿主細胞において好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得ることを特徴とする発現ベクターにより形質転換された植物である。本発明の形質転換植物中では、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが発現しているため、本発明の形質転換植物を例えば８５℃以上の高温処理することにより、該形質転換植物中のセルロースを分解することができる。また、該ポリペプチドは、５０℃以下の通常の生育温度では、非常に弱いエンドグルカナーゼ活性しか有さないため、本発明の形質転換植物は、形質転換されていない同種の植物と同様に問題なく生育することができる。
本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド」は、８５℃以上の環境下において、セルロース等のβ−１，４グルカンのグリコシド結合を加水分解することができる酵素活性を有するポリペプチドであれば、特に限定されるものではない。該ポリペプチドとして、例えば、高温環境下で生息する好熱性微生物由来のエンドグルカナーゼ等がある。該好熱性微生物として、例えば、パイロコッカス属、アエロアエロパイラム属、スフォロバス属、サーモプラズマ属、サーモプロテウス属、バチルス属、シネココッカス属、サーマス属等の好熱性菌がある。
また、本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド」は、好熱性エンドグルカナーゼを構成するアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドであってもよい。好熱性エンドグルカナーゼ活性を有しているかぎり、欠失等がなされるアミノ酸残基の位置や種類は特に限定されるものではない。
本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ」は、例えば、好熱性エンドグルカナーゼをコードする塩基配列情報に基づき作成したプライマーやプローブを用いて、該好熱性エンドグルカナーゼを有する微生物の培養液等から抽出した核酸溶液に対して、ＰＣＲやハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。
また、好熱性エンドグルカナーゼを構成するアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡは、好熱性エンドグルカナーゼをコードする核酸配列を有するＤＮＡを、周知の遺伝子組換え技術を用いて改変することにより得ることができる。
ここで、好熱性エンドグルカナーゼをコードする塩基配列情報は、例えば、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）等から入手することができる。その他、例えば、配列番号１の塩基配列等の公知の好熱性エンドグルカナーゼをコードする塩基配列情報を用いたＢＬＡＳＴ探索等の周知の手法により、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている可能性の高い塩基配列情報を入手することができる。なお、配列番号１の塩基配列は、パイロコッカス・ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来の天然型の好熱性エンドグルカナーゼをコードする塩基配列である。
このようにして得られたＤＮＡが、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡであるか否かは、該ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、大腸菌等の適当な宿主細胞に導入して発現させ、得られたポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性を、ソモギー−ネルソン法等の周知の手法を用いて測定することにより確認することができる。
本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド」としては、パイロコッカス属に属する微生物由来の好熱性エンドグルカナーゼであることが好ましく、パイロコッカス・ホリコシ由来の好熱性エンドグルカナーゼであることがより好ましく、配列番号２、４、６のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが特に好ましい。ここで、配列番号２、４、６のアミノ酸配列を有するポリペプチドには、それぞれ、各アミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドも含まれる。
ここで、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、パイロコッカス・ホリコシ由来の天然型の好熱性エンドグルカナーゼである。該好熱性エンドグルカナーゼは、酵素活性の至適温度が９７℃付近であり、至適ｐＨが５．４〜６．０であり、約９７℃で３時間の加熱処理に対しても安定なエンドグルカナーゼである。
また、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ＥＧＰｈという。）は、配列番号２のアミノ酸配列において、アミノ末端（以下、Ｎ末端という。）のシグナルペプチド（配列番号２の２〜２８位のアミノ酸配列）を欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
さらに、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ＥＧＰｆという。）は、配列番号４のアミノ酸配列において、カルボキシル末端（以下、Ｃ末端という。）の４２アミノ酸を欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドである。配列番号２のアミノ酸配列を有する好熱性エンドグルカナーゼのＣ末端のアミノ酸を欠失させることにより、形質転換植物内での該好熱性エンドグルカナーゼの発現量を増大させることができる（例えば、引用文献２参照。）。
ＥＧＰｈやＥＧＰｆをコードする核酸配列は、配列番号１の核酸配列において相当する領域の塩基配列と相同的な塩基配列であってもよく、配列番号１の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であり、かつ好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列であってもよい。例えば、ＥＧＰｆをコードする塩基配列は、配列番号１の塩基配列の８２２〜８２５位の核酸配列ａｇｇａをｔｇｇｔに改変した配列番号７の塩基配列であることが好ましい。ＥＧＰｆのアミノ酸配列を変更することなく、形質転換植物内でのＥＧＰｆの発現量を増大させることができるためである。該核酸配列ａｇｇａは、Ｎ末端から２番目のＳＤ様配列であり、該ＳＤ様配列を改変することにより、翻訳効率が改善されるためと推察される。
本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド」は、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド（以下、第一ペプチドということもある。）と、好熱性エンドグルカナーゼ活性以外の機能を有するポリペプチド（以下、第二ペプチドということもある。）とが、ペプチド結合したポリペプチドであってもよい。第二ペプチドは、第一ペプチドが有する好熱性エンドグルカナーゼ活性を阻害しない限り、特に限定されるものではなく、好熱性である必要もない。また、第一ペプチドと第二ペプチドのいずれがＮ末端にあってもよいが、Ｎ末端が第一ペプチドであることが好ましい。さらに、第一ペプチドと第二ペプチドの間にスペーサーペプチドを有していてもよい。
該第二ペプチドとして、キチナーゼのキチン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。好熱性エンドグルカナーゼにキチン結合領域を付加することにより、該好熱性エンドグルカナーゼの酵素活性を改善することができるためである。該キチナーゼは、好熱性であってもよく、好耐熱性であってもよいが、好熱性であることが好ましい。キチナーゼのキチン結合領域は、通常、５０〜１５０アミノ酸残基からなるポリペプチドであるが、好熱性エンドグルカナーゼに付加するポリペプチドは、一のキチン結合領域の全域を有していることが好ましいが、一部の領域が欠損しているものであってもよい。また、同種又は異種の複数のキチン結合領域からなるポリペプチドであってもよい。該第二ペプチドとして、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のキチナーゼのキチン結合領域であることがより好ましい。なお、配列番号８は、パイロコッカス・フリオサス由来のキチナーゼのアミノ酸配列であり、キチン結合領域は、７０〜１４０位のアミノ酸配列の領域と、６００〜７２０位のアミノ酸配列の領域と考えられている。
キチナーゼのキチン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドのうち、本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド」としては、ＥＧＰｆのＣ末端にパイロコッカス・フリオサス由来のキチナーゼのキチン結合領域を付加した配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭという。）、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであることが好ましい。具体的には、配列番号１０のアミノ酸配列において、１〜３８９位が配列番号６のアミノ酸配列であり、３９０〜３９２位がスペーサーペプチドのアミノ酸配列であり、３９３〜５００位が配列番号８の６１３〜７２０位のアミノ酸配列である。
また、本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド」は、発現したポリペプチドを、植物細胞において特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドを有していても良い。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。本発明における「好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド」としては、Ｎ末端にアポプラスト移行シグナルペプチドを有するポリペプチドや、Ｃ末端に小胞体保留シグナルペプチドを有するポリペプチドであることが好ましく、Ｎ末端にアポプラスト移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端に小胞体保留シグナルペプチドを有するポリペプチドであってもよい。該シグナルペプチドを付加することにより、形質転換植物中で発現したポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性をより高くすることができる。このような効果が得られる理由は明らかではないが、例えば、発現させたポリペプチドを、アポプラストや細胞中の小胞体に局在させることにより、該ポリペプチドが、内在性のタンパク質分解酵素等による分解等から保護されるためと推察される。その他、アポプラスト移行シグナルペプチドの付加により、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをセルロース含有量の多い細胞壁に近在させることができるため、本発明の形質転換植物をバイオマスエタノールの原料として用いた場合に、糖化処理がより効果的に行われることも期待できる。
該アポプラスト移行シグナルペプチドは、ポリペプチドをアポプラストに移行させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知のアポプラスト移行シグナルペプチドを適宜用いることができる。該アポプラスト移行シグナルペプチドとして、例えば、ＭＤＶＨＫＥＶＮＦＶＡＹＬＬＩＶＬＧＬＬＶＬＶＳＡＭＥＨＶＤＡＫＡＣのアミノ酸配列からなるジャガイモのプロテアーゼインヒビターIIのシグナルペプチド（例えば、Wang et al. ２００５年、Transgenic Research、第１４巻、１６７〜１７８ページ参照。）等がある。
該小胞体保留シグナルペプチドは、ポリペプチドを小胞体に保留させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知の小胞体保留シグナルペプチドを適宜用いることができる。該小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。
本発明における「発現ベクター」は、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含んでなり、宿主細胞において、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターである。すなわち、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る状態で、該ポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡが組み込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現用カセットとして発現ベクターに組み込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ＤＮＡを発現ベクターに組み込むことができる。
本発明における「発現ベクター」としては、植物細胞において転写が可能なプロモーター配列と、ポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を有する発現ベクターであれば、特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物の作製のために通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。該発現ベクターとして、例えば、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等のバイナリーベクター等がある。使用可能なプロモーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等がある。また、使用可能なターミネーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター等がある。その他、組織や器官に特異的なプロモーターを用いてもよい。このような組織又は器官特異的プロモーターを用いることにより、植物全体ではなく、特定の組織や器官にのみ、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現させることができるため、例えば、食用植物の非食用部分にのみ該ポリペプチドを発現させ得ることが期待できる。
該発現ベクターは、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組み込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
例えば、図１に示すような発現ベクターを用いて形質転換を行うことにより、本発明の形質転換植物を得ることができる。図１（ａ）は、バイナリーベクターｐＩＧ１２１Ｈｍのハイグロマイシン耐性遺伝子領域にビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）を組み込んだバイナリーベクターｐＩＧ１２１Ｂａｒを用いて作製されたものであり、ｐＩＧ１２１ＢａｒのイントロンＧＵＳ領域に、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（ＥＧｓ）を組み込んだコンストラクトの概略図である。該コンストラクトは、上流から、カナマイシン耐性遺伝子発現用カセット、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド発現用カセット、ビアラホス耐性遺伝子発現用カセットを有する発現用ベクターである。
カナマイシン耐性遺伝子発現用カセットは、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（ＰＮＯＳ）の下流にカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ II）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ＴＮＯＳ）をつないだものである。好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチド発現用カセットは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５Ｓ）の下流に好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（ＥＧｓ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターをつないだものである。ビアラホス耐性遺伝子発現用カセットは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流にビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）をつなぎ、さらにノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターをつないだものである。
図１（ｂ）は、（ａ）に示されるコンストラクトの、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡの５’末端に、アポプラスト移行シグナルペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（ａｐ）を挿入したコンストラクトの概略図である。また、図１（ｃ）は、（ｂ）に示されるコンストラクトの、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡの３’末端に、小胞体保留シグナルペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（ｅｒ）を挿入したコンストラクトの概略図である。
本発明において、発現ベクターを用いて形質転換植物を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、アグロバクテリウム法で行うことが好ましい。なお、形質転換植物細胞や形質転換植物は、薬剤耐性等を指標として選抜することができる。また、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。
周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
また、本発明の形質転換植物には、形質転換により直接得られた植物に加え、該植物と同様に好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現している該植物の子孫である植物も含まれる。ここで、植物の子孫とは、植物から得られた種子を発芽して得られる植物や、挿し木により得られた植物等を意味する。
本発明の形質転換植物の種類は、特に限定されるものではなく、被子植物であってもよく、裸子植物であってもよく、シダ類やコケ類であってもよい。本発明の形質転換植物として、例えば、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、キク科、ヒルガオ科、トウダイグサ科等に属する植物が挙げられるが、アブラナ科又はイネ科の植物であることが好ましく、アグロバクテリウムを介した形質転換に好適な植物であるためである。アブラナ科の植物として、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、ワサビ等がある。また、イネ科の植物として、例えば、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ等がある。その他、ナス科の植物として、例えば、ナス、ジャガイモ、トマト、ピーマン、タバコ等がある。マメ科の植物として、例えば、ラッカセイ、ヒヨコマメ、ダイズ、インゲンマメ等がある。キク科の植物として、例えば、ゴボウ、ヨモギ、キンセンカ、ヤグルマギク、ヒマワリ等がある。ヒルガオ科の植物として、例えば、ヒルガオ、ハマヒルガオ、ネナシカズラ、セイヨウヒルガオ等がある。トウダイグサ科の植物として、例えば、トウダイグサ、ナツトウダイ、タカトウダイ等がある。
本発明の形質転換植物としては、シロイヌナズナであることが好ましい。シロイヌナズナは、いわゆる雑草であり、栽培が簡便であるため、及び、ライフサイクルが短い一年草であるためである。例えば、シロイヌナズナ植物体の蕾に、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターにより形質転換されたアグロバクテリウムの溶液を塗布して感染させた後、抗生物質等を用いて感染した種子を選抜するフローラルディップ法を用いることにより、本発明の形質転換植物であるシロイヌナズナを得ることができる。
本発明の形質転換植物としては、イネであることも好ましい。イネは我が国の主要な農作物であり、イネ藁等の非可食部が、農業系廃棄物として毎年大量に排出されている。食用として栽培されるイネを、本発明の形質転換植物とすることにより、産生されるイネ藁等をバイオマスエタノールの原料とすることができるため、農業系廃棄物量を顕著に削減することが可能となる。本発明の形質転換イネは、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターを、Nishimuraらの方法（Nishimura et al.、２００６年、Nature Protocols、第１巻、２７９６〜２８０２ページ参照。）等の常法により形質転換することにより作成することができる。 具体的には、例えば、外皮を除去した後表面殺菌した完熟種子を培養して得られたカルスを、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターにより形質転換されたアグロバクテリウムの溶液に浸漬して感染させた後、抗生物質等を用いて形質転換されたカルスを選抜することにより、本発明の形質転換植物であるイネを得ることができる。
本発明の形質転換植物から抽出することにより、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを得ることもできる。本発明の形質転換植物から該ポリペプチドを抽出する方法は、該ポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、該ポリペプチドは、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。該方法として、例えば、Kawazuらの方法（Kawazu et al.、１９９９年、Journal of bioscience and bioengineering、第８８巻、４２１〜４２５ページ参照。）や、Kimuraらの方法（Kimura et al.、２００３年、Applied microbiology and biotechnology、第６２巻、３７４〜３７９ページ参照。）等がある。
本発明の形質転換植物は、バイオマスエタノール生成の原料として特に好適であり、例えば、以下のようにして、バイオマスエタノールを生成することができる。まず、前処理を行った本発明の形質転換植物を、適当なバッファーに混合した後、８５℃以上に加温する。加温処理により、該形質転換植物中に発現している好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが機能し、該形質転換植物中のセルロースが分解され、糖化液を得ることができる。このようにして得られた糖化液に酵母等を接種し、アルコール発酵を行うことにより、バイオマスエタノールを得ることができる。
該前処理は、該ポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性を失活させない処理方法で行うことが好ましい。例えば、粉砕処理等の物理的処理や加熱処理であることが好ましい。強酸処理や強アルカリ処理は、該ポリペプチドを失活させるおそれがある。また、該バッファーは、該ポリペプチドによるセルロース加水分解反応に適した組成のバッファーであれば、特に限定されるものではなく、界面活性剤や酵素等の該形質転換植物の分解を促進し得る化合物を含有するものであってもよい。例えば、該ポリペプチドがパイロコッカス・ホリコシ由来の好熱性エンドグルカナーゼである場合には、ｐＨ５〜６のバッファーであることが好ましい。該好熱性エンドグルカナーゼの酵素活性の至適ｐＨが５〜６であるためである。
その他、本発明の形質転換植物から抽出した好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを用いてバイオマスエタノールを生成してもよい。例えば、前処理を行った本発明の形質転換植物を、適当な抽出バッファーに浸して、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを抽出した後、ポリペプチド抽出液と植物残渣に分離する。分離された植物残渣にさらに前処理を施した後、再び該ポリペプチド抽出液と混合して、８５℃以上に加温することにより、該植物残渣に存在するセルロースを分解し糖化液を得ることができる。
ポリペプチドの抽出に用いる抽出バッファーは、好熱性エンドグルカナーゼ活性を損なうことなく該ポリペプチドを抽出し得るバッファーであれば、特に限定されるものではないが、界面活性剤等の可溶化剤を含有することが好ましい。形質転換植物の分解が促進される等により、ポリペプチドの抽出効率が改善されるためである。例えば、該ポリペプチドがパイロコッカス・ホリコシ由来の好熱性エンドグルカナーゼである場合には、該抽出バッファーは、ｐＨ５〜６でありかつＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤を含有するバッファーであることが好ましい。
また、ポリペプチド抽出液と植物残渣の分離方法は、特に限定されるものではなく、植物等の生体固形物から特定の化合物を抽出する場合に通常用いられる分離方法により行うことができる。例えば、抽出バッファーに浸漬させた形質転換植物を搾ってもよく、目の粗いフィルター等を用いて濾過してもよく、遠心分離を行っても良い。量が多い場合には、圧縮濾過を行うことも好ましい。
植物残渣の前処理は、糖化処理を促進し得る処理であれば、特に限定されるものではなく、通常、バイオマスになされる任意の前処理を行うことができる。例えば、加熱処理であってもよく、酸やアルカリ処理等の化学処理であってもよい。特にアルカリ処理であることが好ましい。予め、形質転換植物から好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを抽出してしまうため、酵素活性を損なうおそれがなく、様々な前処理を行うことができる。
次に、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１） 形質転換シロイヌナズナの作製
好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換されたシロイヌナズナを得た。
発現ベクターとして、図１（ｂ）に記載のアポプラスト蓄積型コンストラクトと、図１（ｃ）に記載の小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いた。アポプラスト蓄積型コンストラクトとして、図１（ｂ）中の「ＥＧｓ」にＥＧＰｈをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｈベクター）、「ＥＧｓ」にＥＧＰｆをコードする塩基配列であって、Ｎ末端から２番目のＳＤ様配列を改変したＤＮＡ（配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＳＤ２Ｍベクター）、Ｎ末端にＥＧＰｆをコードする塩基配列を有し、Ｃ末端にパイロコッカス・フリオサス由来のキチナーゼのキチン結合領域をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭベクター）をそれぞれ用いた。また、小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトとして、図１（ｃ）中の「ＥＧｓ」にＥＧＰｈをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈベクター）、「ＥＧｓ」にＥＧＰｆをコードする塩基配列であって、Ｎ末端から２番目のＳＤ様配列を改変したＤＮＡ（配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＳＤ２Ｍ−Ｈベクター）、Ｎ末端にＥＧＰｆをコードする塩基配列を有し、Ｃ末端にパイロコッカス・フリオサス由来のキチナーゼのキチン結合領域をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ−Ｈベクター）をそれぞれ用いた。なお、アポプラスト移行シグナルペプチドをコードする塩基配列として、Schaewenらのアポプラスト移行シグナルペプチド（Schaewen Av et al.、１９９０年、 The European Molecular Biology Organization Journal、第９巻第１０号、３０３３〜３０４４ページ参照。）を参考にして、配列番号１１の塩基配列を用いた。また、小胞体保留シグナルペプチドをコードする塩基配列として配列番号１２の塩基配列を用いた。
好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換されたシロイヌナズナを得た。
発現ベクターとして、図１（ｂ）に記載のアポプラスト蓄積型コンストラクトと、図１（ｃ）に記載の小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いた。アポプラスト蓄積型コンストラクトとして、図１（ｂ）中の「ＥＧｓ」にＥＧＰｈをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｈベクター）、「ＥＧｓ」にＥＧＰｆをコードする塩基配列であって、Ｎ末端から２番目のＳＤ様配列を改変したＤＮＡ（配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＳＤ２Ｍベクター）、Ｎ末端にＥＧＰｆをコードする塩基配列を有し、Ｃ末端にパイロコッカス・フリオサス由来のキチナーゼのキチン結合領域をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭベクター）をそれぞれ用いた。また、小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトとして、図１（ｃ）中の「ＥＧｓ」にＥＧＰｈをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈベクター）、「ＥＧｓ」にＥＧＰｆをコードする塩基配列であって、Ｎ末端から２番目のＳＤ様配列を改変したＤＮＡ（配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＳＤ２Ｍ−Ｈベクター）、Ｎ末端にＥＧＰｆをコードする塩基配列を有し、Ｃ末端にパイロコッカス・フリオサス由来のキチナーゼのキチン結合領域をコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ−Ｈベクター）をそれぞれ用いた。なお、アポプラスト移行シグナルペプチドをコードする塩基配列として、Schaewenらのアポプラスト移行シグナルペプチド（Schaewen Av et al.、１９９０年、 The European Molecular Biology Organization Journal、第９巻第１０号、３０３３〜３０４４ページ参照。）を参考にして、配列番号１１の塩基配列を用いた。また、小胞体保留シグナルペプチドをコードする塩基配列として配列番号１２の塩基配列を用いた。
まず、発現ベクターを、凍結融解法を用いてアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入した。具体的には、氷中で融解したアグロバクテリウムＥＨＡ１０５株のコンピテントセルに、約１μｇのプラスミド（発現ベクター）を加え、軽く混合した後、液体窒素を用いて瞬時に凍結させた。その後、３７℃で４分間温めて融解し、０．５ｍＬのＳＯＣ培地を加えて、２８℃で１〜３時間培養した。得られた培養液を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１０ｍｇ／ＬのＰＰＴ（ホスフィノトリシン）を含有させたＬＢ寒天培地に塗布し、２８℃のインキュベーターで２日間静置培養することにより形質転換アグロバクテリウムを得た。該形質転換アグロバクテリウムを液体培養後、プラスミドを抽出・精製した。得られたプラスミドは、ＰＣＲ及び制限酵素処理により、形質転換に用いた発現ベクターであることを確認した。
次に、２２℃、２４時間明期で約２ヶ月間生育させたシロイヌナズナ植物体と、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含有させたＬＢ培地を用いて培養した形質転換アグロバクテリウムを用いて、形質転換シロイヌナズナを作製した。
まず、ＯＤ600＝１程度のアグロバクテリウム培養液を集菌後、５％シュークロース、０．０５％シルウェット溶液に懸濁した。その後、シロイヌナズナ植物体をアグロバクテリウム懸濁液に数秒浸け、種子への感染を行った。種子成熟後、回収し５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含有させた１/２ＭＳ培地を用いて形質転換体の選抜を行い、形質転換シロイヌナズナを得た。より詳細には、ａｐ−ＥＧＰｈベクターを用いた形質転換植物を３３種（ａｐ−ＥＧＰｈ１〜３３）、ａｐ−ＳＤ２Ｍベクターを用いた形質転換植物を６種（ａｐ−ＳＤ２Ｍ１〜６）、ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭベクターを用いた形質転換植物を１６種（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ１〜１６）、ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈベクターを用いた形質転換植物を４種（ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈ１〜４）、ａｐ−ＳＤ２Ｍ−Ｈベクターを用いた形質転換植物を２３種（ａｐ−ＳＤ２Ｍ−Ｈ１〜２３）、ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ−Ｈベクターを用いた形質転換植物を４種（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ−Ｈ１〜４）、それぞれ得た。
まず、ＯＤ600＝１程度のアグロバクテリウム培養液を集菌後、５％シュークロース、０．０５％シルウェット溶液に懸濁した。その後、シロイヌナズナ植物体をアグロバクテリウム懸濁液に数秒浸け、種子への感染を行った。種子成熟後、回収し５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンと１０ｍｇ／ＬのＰＰＴを含有させた１/２ＭＳ培地を用いて形質転換体の選抜を行い、形質転換シロイヌナズナを得た。より詳細には、ａｐ−ＥＧＰｈベクターを用いた形質転換植物を３３種（ａｐ−ＥＧＰｈ１〜３３）、ａｐ−ＳＤ２Ｍベクターを用いた形質転換植物を６種（ａｐ−ＳＤ２Ｍ１〜６）、ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭベクターを用いた形質転換植物を１６種（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ１〜１６）、ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈベクターを用いた形質転換植物を４種（ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈ１〜４）、ａｐ−ＳＤ２Ｍ−Ｈベクターを用いた形質転換植物を２３種（ａｐ−ＳＤ２Ｍ−Ｈ１〜２３）、ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ−Ｈベクターを用いた形質転換植物を４種（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ−Ｈ１〜４）、それぞれ得た。
（実施例２） 形質転換シロイヌナズナからの好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの抽出
実施例１で得られた形質転換シロイヌナズナから、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを抽出し、該ポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性を測定した。
該ポリペプチドの抽出は、Kawazuらの方法やKimuraらの方法に基づいて行った。具体的には、１００ｍｇの形質転換シロイヌナズナの葉を液体窒素下で乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した後、１ｍＬの冷抽出バッファー（１００ｍＭ 酢酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．６）を加え、よく混合した。得られた混合物を、２ｍＬマイクロチューブに移して１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離を行って、上清を回収し、粗酵素溶液とした。得られた粗酵素溶液のタンパク質濃度は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を標準タンパク質とし、界面活性剤を含むサンプルでも測定可能であるＤＣプロテインアッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。なお、形質転換されていない天然のシロイヌナズナの葉を用いて、同様にして調製した粗酵素溶液をコントロールとした。
実施例１で得られた形質転換シロイヌナズナから、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを抽出し、該ポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性を測定した。
該ポリペプチドの抽出は、Kawazuらの方法やKimuraらの方法に基づいて行った。具体的には、１００ｍｇの形質転換シロイヌナズナの葉を液体窒素下で乳鉢及び乳棒を用いて粉砕した後、１ｍＬの冷抽出バッファー（１００ｍＭ 酢酸、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ５．６）を加え、よく混合した。得られた混合物を、２ｍＬマイクロチューブに移して１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離を行って、上清を回収し、粗酵素溶液とした。得られた粗酵素溶液のタンパク質濃度は、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を標準タンパク質とし、界面活性剤を含むサンプルでも測定可能であるＤＣプロテインアッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて測定した。なお、形質転換されていない天然のシロイヌナズナの葉を用いて、同様にして調製した粗酵素溶液をコントロールとした。
得られた粗酵素溶液のエンドグルカナーゼ活性を、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を基質とし、ＤＮＳＡ法により測定した。
まず、０．４ｍＬの１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）に、０．２ｍｇのタンパク質を含む粗酵素溶液と、最終濃度が０．５％となるようにＣＭＣを添加して反応溶液を調製した。その後、該反応溶液を８５℃で１６時間反応させた。反応前後の反応溶液中の還元糖量を定量し、該粗酵素溶液による加水分解反応により増加した還元糖量から、粗酵素溶液の好熱性エンドグルカナーゼ活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。ここで、１ｕｎｉｔは、８５℃、１分間で１μｇのグルコースを生産するために要する酵素量である。なお、反応溶液中の還元糖は、ＤＮＳＡ（３，５−ｄｉｎｉｔｏｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて定量し、該定量に用いた検量線は、グルコースを用いて作成したものを用いた。
まず、０．４ｍＬの１００ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）に、０．２ｍｇのタンパク質を含む粗酵素溶液と、最終濃度が０．５％となるようにＣＭＣを添加して反応溶液を調製した。その後、該反応溶液を８５℃で１６時間反応させた。反応前後の反応溶液中の還元糖量を定量し、該粗酵素溶液による加水分解反応により増加した還元糖量から、粗酵素溶液の好熱性エンドグルカナーゼ活性（ｕｎｉｔ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した。ここで、１ｕｎｉｔは、８５℃、１分間で１μｇのグルコースを生産するために要する酵素量である。なお、反応溶液中の還元糖は、ＤＮＳＡ（３，５−ｄｉｎｉｔｏｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ）を用いて定量し、該定量に用いた検量線は、グルコースを用いて作成したものを用いた。
図２は、アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いて得られた形質転換シロイヌナズナ由来の粗酵素溶液の好熱性エンドグルカナーゼ活性を示した図であり、図３は、小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いて得られた形質転換シロイヌナズナ由来の粗酵素溶液の好熱性エンドグルカナーゼ活性を示した図である。アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いて得られた形質転換シロイヌナズナ由来の粗酵素溶液は、コントロールに比べて非常に高い好熱性エンドグルカナーゼ活性を有していた。一方、小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いて得られた形質転換シロイヌナズナでは、好熱性エンドグルカナーゼ活性が観察されなかった個体もあったが、非常に高い好熱性エンドグルカナーゼ活性が観察された個体も多かった。なお、アポプラスト蓄積型コンストラクトでも、小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトでも、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの種類による違いは特に観察されなかった。
つまり、これらの結果から、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む発現ベクターを用いて形質転換を行うことにより、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが高発現している形質転換植物を作製し得ることが明らかである。
つまり、これらの結果から、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む発現ベクターを用いて形質転換を行うことにより、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが高発現している形質転換植物を作製し得ることが明らかである。
（実施例３） 形質転換イネの作成１
実施例１で作製した形質転換アグロバクテリウムを用いて、Nishimuraらの方法に基づき、形質転換イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．品種名：日本晴）を作成した。
具体的には、外皮を除去した完熟種子を、７０％エタノールで３０秒間、その後２％（有効塩素濃度）次亜塩素酸カルシウム溶液で３０分間処理することにより表面殺菌し、さらに滅菌蒸留水で５〜７回水洗した後に、Ｎ６Ｄ培地に置床した。３０℃、明所（約１２０μｍｏｌｍ−２ ｓ−１）で３〜４週間培養し、形成したカルスをＮ６Ｄ培地に移植してさらに３日間前培養した。前培養したカルスを、実施例１で作製した形質転換アグロバクテリウムを抗生物質含有ＡＢ培地上で３日間培養した後にＡＡＭ培地に懸濁して得られた形質転換アグロバクテリウム菌液に９０秒間浸漬し、ペーパータオルで過剰な菌液を拭き取った後、２Ｎ６−ＡＳ培地に置床した。さらに、２８℃、暗黒下で２日間共存培養することにより得られたカルスを、滅菌蒸留水で３〜５回洗浄した後に、２５ｍｇ／Ｌメロペネムと２０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有させたＮ６Ｄ培地に移植し、３０℃、明所で４週間培養してＰＰＴ耐性カルスを得た。得られたＰＰＴ耐性カルスを、２５ｍｇ／Ｌメロペネムと２０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有させたＭＳ−ＮＫ培地に移植し、さらに４週間培養して分化したシュートを得た。得られたシュートを、２５ｍｇ／Ｌメロペネムと２０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有させたＭＳ−ＨＦ培地に移植して発根させることにより、目的の形質転換イネを得た。得られた形質転換イネは、培養土を充填したビニールポットに鉢上げし、グロースチャンバー内で２週間の馴化を行った後、プラスチックポットに移植して閉鎖温室内でさらに育成した。
実施例１で作製した形質転換アグロバクテリウムを用いて、Nishimuraらの方法に基づき、形質転換イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．品種名：日本晴）を作成した。
具体的には、外皮を除去した完熟種子を、７０％エタノールで３０秒間、その後２％（有効塩素濃度）次亜塩素酸カルシウム溶液で３０分間処理することにより表面殺菌し、さらに滅菌蒸留水で５〜７回水洗した後に、Ｎ６Ｄ培地に置床した。３０℃、明所（約１２０μｍｏｌｍ−２ ｓ−１）で３〜４週間培養し、形成したカルスをＮ６Ｄ培地に移植してさらに３日間前培養した。前培養したカルスを、実施例１で作製した形質転換アグロバクテリウムを抗生物質含有ＡＢ培地上で３日間培養した後にＡＡＭ培地に懸濁して得られた形質転換アグロバクテリウム菌液に９０秒間浸漬し、ペーパータオルで過剰な菌液を拭き取った後、２Ｎ６−ＡＳ培地に置床した。さらに、２８℃、暗黒下で２日間共存培養することにより得られたカルスを、滅菌蒸留水で３〜５回洗浄した後に、２５ｍｇ／Ｌメロペネムと２０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有させたＮ６Ｄ培地に移植し、３０℃、明所で４週間培養してＰＰＴ耐性カルスを得た。得られたＰＰＴ耐性カルスを、２５ｍｇ／Ｌメロペネムと２０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有させたＭＳ−ＮＫ培地に移植し、さらに４週間培養して分化したシュートを得た。得られたシュートを、２５ｍｇ／Ｌメロペネムと２０ｍｇ／Ｌ ＰＰＴを含有させたＭＳ−ＨＦ培地に移植して発根させることにより、目的の形質転換イネを得た。得られた形質転換イネは、培養土を充填したビニールポットに鉢上げし、グロースチャンバー内で２週間の馴化を行った後、プラスチックポットに移植して閉鎖温室内でさらに育成した。
（実施例４） 形質転換イネの作成２
発現ベクターとして、ａｐ−ＥＧＰｈベクターに代えて、図１（ａ）中の「ＥＧｓ」にＥＧＰｈをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ｃｙｔ−ＥＧＰｈベクター）を用いた以外は、実施例１と同様にして、形質転換アグロバクテリウムを作製した。なお、ｃｙｔ−ＥＧＰｈベクターは、
Ｎ末端にアポプラスト移行シグナルペプチドを有さないため、細胞質に蓄積されると推察される。
さらに、この形質転換アグロバクテリウムを用いて、実施例３と同様にして形質転換イネを得た。
発現ベクターとして、ａｐ−ＥＧＰｈベクターに代えて、図１（ａ）中の「ＥＧｓ」にＥＧＰｈをコードする塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡ）を挿入した発現ベクター（ｃｙｔ−ＥＧＰｈベクター）を用いた以外は、実施例１と同様にして、形質転換アグロバクテリウムを作製した。なお、ｃｙｔ−ＥＧＰｈベクターは、
Ｎ末端にアポプラスト移行シグナルペプチドを有さないため、細胞質に蓄積されると推察される。
さらに、この形質転換アグロバクテリウムを用いて、実施例３と同様にして形質転換イネを得た。
（実施例５） 形質転換イネからの好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの抽出
実施例３及び４で得られた形質転換イネから、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを抽出し、該ポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性を測定した。
具体的には、形質転換シロイヌナズナの葉に代えて、形質転換イネの葉を用いた以外は、実施例２と同様にして、粗酵素溶液を調製した後、該粗酵素溶液のエンドグルカナーゼ活性を、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を基質とし、ＤＮＳＡ法により測定した。
なお、形質転換イネとしては、実施例３で得られたａｐ−ＥＧＰｈベクターを用いた形質転換イネを３種（ａｐ−ＥＧＰｈ１、２、５）、ａｐ−ＳＤ２Ｍベクターを用いた形質転換イネを６種（ａｐ−ＳＤ２Ｍ１、２、４、５、８、９）、ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭベクターを用いた形質転換イネを４種（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ１、３〜５）、ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈベクターを用いた形質転換イネを９種（ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈ３、４、６〜１２）、及び実施例４で得られたｃｙｔ−ＥＧＰｈベクターを用いた形質転換イネを３種（ｃｙｔ−ＥＧＰｈ４、６、７）を、それぞれ用いた。また、形質転換されていない天然のイネの葉を用いて、同様にして調製した粗酵素溶液をコントロールとした。
実施例３及び４で得られた形質転換イネから、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを抽出し、該ポリペプチドの好熱性エンドグルカナーゼ活性を測定した。
具体的には、形質転換シロイヌナズナの葉に代えて、形質転換イネの葉を用いた以外は、実施例２と同様にして、粗酵素溶液を調製した後、該粗酵素溶液のエンドグルカナーゼ活性を、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を基質とし、ＤＮＳＡ法により測定した。
なお、形質転換イネとしては、実施例３で得られたａｐ−ＥＧＰｈベクターを用いた形質転換イネを３種（ａｐ−ＥＧＰｈ１、２、５）、ａｐ−ＳＤ２Ｍベクターを用いた形質転換イネを６種（ａｐ−ＳＤ２Ｍ１、２、４、５、８、９）、ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭベクターを用いた形質転換イネを４種（ａｐ−ＥＧＰｆＣｈｉＣＢＭ１、３〜５）、ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈベクターを用いた形質転換イネを９種（ａｐ−ＥＧＰｈ−Ｈ３、４、６〜１２）、及び実施例４で得られたｃｙｔ−ＥＧＰｈベクターを用いた形質転換イネを３種（ｃｙｔ−ＥＧＰｈ４、６、７）を、それぞれ用いた。また、形質転換されていない天然のイネの葉を用いて、同様にして調製した粗酵素溶液をコントロールとした。
図４は、得られた形質転換イネ由来の粗酵素溶液の好熱性エンドグルカナーゼ活性を示した図である。アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いて得られた形質転換イネ由来の粗酵素溶液は、いずれのコンストラクトであっても、コントロールに比べて非常に高い好熱性エンドグルカナーゼ活性を有していた。また、小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトを用いて得られた形質転換イネ由来の粗酵素溶液も、コントロールに比べて非常に高い好熱性エンドグルカナーゼ活性を有していた。一方、細胞質蓄積型コンストラクトを用いて得られた形質転換イネでは、好熱性エンドグルカナーゼ活性が観察されなかった。なお、アポプラスト蓄積型コンストラクトでも、小胞体保留シグナル付アポプラスト蓄積型コンストラクトでも、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドの種類による違いは特に観察されなかった。
つまり、これらの結果からも、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む発現ベクターを用いて形質転換を行うことにより、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが高発現している形質転換植物を作製し得ることが明らかである。
つまり、これらの結果からも、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含む発現ベクターを用いて形質転換を行うことにより、好熱性エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが高発現している形質転換植物を作製し得ることが明らかである。
本発明の形質転換植物は、バイオマスエタノールの原料となるセルロースと、セルロースの加水分解に好適に用いられる好熱性エンドグルカナーゼを同時に供給し得るため、バイオマスエタノールの製造分野で利用が可能である。
Claims (13)
- 発現ベクターにより形質転換された植物であって、
前記発現ベクターが、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含んでなり、宿主細胞において、好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る発現ベクターであることを特徴とする形質転換植物。 - 前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらに、キチナーゼのキチン結合領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載の形質転換植物。
- 前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１又は２記載の形質転換植物。
- 前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１又は２記載の形質転換植物。
- 前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１又は２記載の形質転換植物。
- 前記塩基配列が、配列番号７の塩基配列、又は、配列番号７の塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列である請求項１又は２記載の形質転換植物。
- 前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項２記載の形質転換植物。
- 前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらにアミノ末端にアポプラスト移行シグナルペプチドを有するポリペプチドである請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換植物。
- 前記好熱性β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドが、さらにカルボキシル末端に小胞体保留シグナルペプチドを有するポリペプチドである請求項１〜８のいずれかに記載の形質転換植物。
- 前記植物が、アブラナ科の植物である請求項１〜９のいずれかに記載の形質転換植物。
- 前記植物が、シロイヌナズナである請求項１０記載の形質転換植物。
- 前記植物が、イネ科の植物である請求項１〜９のいずれかに記載の形質転換植物。
- 前記植物が、イネである請求項１２記載の形質転換植物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008055493A JP2009077703A (ja) | 2007-09-04 | 2008-03-05 | 形質転換植物 |
| US12/203,772 US20090158472A1 (en) | 2007-09-04 | 2008-09-03 | Transformant plant |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007229270 | 2007-09-04 | ||
| JP2008055493A JP2009077703A (ja) | 2007-09-04 | 2008-03-05 | 形質転換植物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009077703A true JP2009077703A (ja) | 2009-04-16 |
Family
ID=40652947
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008055493A Withdrawn JP2009077703A (ja) | 2007-09-04 | 2008-03-05 | 形質転換植物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090158472A1 (ja) |
| JP (1) | JP2009077703A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014507945A (ja) * | 2011-02-14 | 2014-04-03 | ザイレコ，インコーポレイテッド | バイオマス処理 |
| JP2020150856A (ja) * | 2019-03-20 | 2020-09-24 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 接木改善剤 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105087687A (zh) * | 2014-05-04 | 2015-11-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种利用亚铵法纸浆为原料制备微生物油脂的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU1685600A (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-31 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Polypeptides |
| US8558058B2 (en) * | 2001-12-06 | 2013-10-15 | Applied Biotechnology Institute | Monocotyledonous seed expressing exo-1,4B-glucanase |
| US7314974B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-01-01 | Monsanto Technology, Llc | Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties |
-
2008
- 2008-03-05 JP JP2008055493A patent/JP2009077703A/ja not_active Withdrawn
- 2008-09-03 US US12/203,772 patent/US20090158472A1/en not_active Abandoned
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014507945A (ja) * | 2011-02-14 | 2014-04-03 | ザイレコ，インコーポレイテッド | バイオマス処理 |
| JP2017018112A (ja) * | 2011-02-14 | 2017-01-26 | ザイレコ，インコーポレイテッド | バイオマス処理 |
| JP2020150856A (ja) * | 2019-03-20 | 2020-09-24 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 接木改善剤 |
| JP7399375B2 (ja) | 2019-03-20 | 2023-12-19 | 国立大学法人東海国立大学機構 | 接木改善剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090158472A1 (en) | 2009-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7786345B2 (en) | Transgenic plants expressing cellulase for autohydrolysis of cellulose components and methods for production of soluble sugar | |
| US7049485B2 (en) | Transgenic plants containing ligninase and cellulase which degrade lignin and cellulose to fermentable sugars | |
| CN1930293B (zh) | 具有降低的饱和脂肪酸水平的转基因植物及其制备方法 | |
| CN105073987B (zh) | 耐热性纤维二糖水解酶 | |
| MX2010012952A (es) | Composiciones y metodos para producir carbohidratos fermentables en plantas. | |
| CA2704016A1 (en) | Methods for increasing starch content in plants | |
| Ziegelhoffer et al. | Expression of Acidothermus cellulolyticus E1 endo‐β‐1, 4‐glucanase catalytic domain in transplastomic tobacco | |
| US8350123B2 (en) | Transgenic cover plants containing hemicellulase and cellulase which degrade lignin and cellulose to fermentable sugars | |
| ES2272333T3 (es) | Procedimiento para aumentar el nivel de una sustancia de fermentacion. | |
| JP2009077703A (ja) | 形質転換植物 | |
| CN101508980B (zh) | 小麦肉桂醇脱氢酶及其编码基因与应用 | |
| WO2001016338A2 (en) | Production of cellulase in plastids of transgenic plants | |
| JP4410318B2 (ja) | ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物 | |
| BRPI0719038A2 (pt) | Beta-mananase da broca da baga do café, hypothenemus hampei, e usos da mesma | |
| CN117430679B (zh) | 来源于小麦的广谱抗病相关蛋白及其相关生物材料与应用 | |
| TWI726287B (zh) | 促進木質纖維素水解之重組核酸分子、表現載體以及方法 | |
| JP3861370B2 (ja) | ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物 | |
| CN117088954A (zh) | 来源于谷子的蛋白质及其调控其表达的物质的应用 | |
| CN117088953A (zh) | 来源于谷子的蛋白质相关的生物材料及其应用 | |
| JP4238909B2 (ja) | ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物 | |
| WO2012115102A1 (ja) | タンパク質の植物細胞内への蓄積方法 | |
| CA2731866A1 (en) | Production of cellulase enzymes in plant hosts using transient agroinfiltration | |
| JP2009039075A (ja) | 耐熱性酵素を葉緑体内で発現するトランスジェニック植物 | |
| JP2012147712A (ja) | 糖化酵素を大量発現する植物及びそれを用いたバイオマス糖化法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20101215 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20120120 |