KR20200111198A - 양방향성 chef1 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 차이니즈 햄스터 난소 신장 인자 1-α(CHEF1) 전사 조절 DNA 요소, 관심 유전자(GOI), 최소 사이토메갈로바이러스(minCMV; minimal cytomegalovirus) 및 선별 마커(SM) 및/또는 인간 아데노바이러스 3부 리더(AdTPL; adenovirus tripartite leader) 서열을 포함하는 양방향성 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한, 숙주 세포에서 이종성 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 양방향성 발현 벡터(들)를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
Description
본 출원은 컴퓨터-판독 가능 형태(파일명: 52530_Seqlisting.txt; 크기: 129,138 바이트; 생성일자: 2019년 1월 8일)의 서열 목록을 본 개시내용의 개별 일부로서 포함하며, 상기 목록은 그 전문이 참조에 의해 포함된다.
기술분야
본 발명은 이종성 단백질 발현을 증가시키는 신규 프로모터-인핸서 조합을 포함하는 양방향성 발현 벡터에 관한 것이고, 재조합 단백질 생성 분야에서 실용적인 적용을 가진다.
전사, 번역, 단백질 접힘(folding) 및/또는 분비의 향상을 통해 재조합 단백질 발현을 증가시키는 것은 세포주 개발 동안 수율을 최적화하기 위한 근본적인 우선사항이다. 차이니즈 햄스터 난소 신장 인자 1-α(CHEF1) 발현 시스템은 재조합 단백질을 생성하는 임상 세포주를 제조하기 위해 광범위하게 사용되어 왔다. 신장 인자 1-α(EF-1α) 유전자는 대부분의 조직 유형에서 고도로 발현되고, EF-1은 인간 세포에서 가장 풍부한 단백질 중 하나이다(문헌[Beck et al., Molecular Systems Biology 7: 549; 2011]). CHEF1 발현 벡터는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서, 뿐만 아니라 비-햄스터 세포에서 높은-수준의 재조합 단백질 발현을 달성한다.
CHEF1 발현은, 증가된 부피 생산성(volumetric productivity)에 의해 역가 증가가 구동(driven)되도록 성장과 조정된다. 전형적으로, 단백질 발현은 지수적 성장기(exponential phase of growth)에서 초기에 개시되고, 정지기(stationary phase) 동안 하락하고 저하된다. 단백질 발현과 세포 성장 사이의 연관성은 리보솜 단백질 복합체에서 작용하도록 구성적으로 발현되는 본래의(native) EF-1α 유전자의 조절과 일관된다. EF-1α의 발현은, 활성적으로 성장중인 세포에서 EF-1α의 구성적 발현과 일관되게 형질전환된 세포(Sanders et al., Nucleic Acids Research 20: 5907; 1992) 및 미토겐-자극된 세포(Thomas and Thomas, Journal of Cell Biology 103: 2137; 1986)에서 증가하는 것으로 문서화되었다. 성장중인 세포에서의 전사 제어 외에도, 성장 인자 인슐린은 mRNA 5' 비번역 영역(5'UTR)을 통해 EF-1α의 번역을 조절한다(문헌[Hammond and Bowman, Journal of Biological Chemistry 25: 17785; 1988; Proud and Denton, Biochemical Journal 328: 329; 1997]). 이러한 번역 제어는 5'UTR에서 확인되는 폴리피리미딘 트랙(TOP; Tract of Polypyrimidine) 서열을 통해 달성된다(문헌[Mariottini and Amaldi, Molecular and Cellular Biology 10: 816; 1990]).
CHEF1 발현 시스템은 다른 흔히 사용되는 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV; cytomegalovirus), 인간 EF-1α, 및 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터를 이용하는 벡터보다 더 높은 수준의 단백질 발현을 달성할 수 있는 것으로 나타났다(문헌[Running Deer and Allison, Biotechnology Progress 20: 880; 2004]). CMV 프로모터는 재조합 단백질 발현에 가장 광범위하게 사용되는 프로모터 중 하나이다. 예를 들어, 글루타민 신서타제(GS; glutamine synthetase) 시스템은 뮤린 또는 인간 CMV 프로모터를 사용한다(문헌[Kalwy, S., "Towards stronger gene expression - a promoter's tale," 19th European Society for Animal Cell Technology (ESACT) meeting, 2005]). 상업적인 발현 플라스미드 pcDNATM3(Life Technologies Corp., 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)는 이전에 기재된(문헌[Boshart et al., Cell 1985; 4:521]) 주요 즉각-초기(IE; immediate-early) 유전자로부터 유래되는 CMV 프로모터를 운반한다(GenBank Accession # K03104.1). 또 다른 흔히 사용되는 CMV 프로모터는 인간 헤르페스바이러스 5로도 알려진 인간 CMV 균주(strain) AD169(GenBank Accession # X17403.1)로부터 유래된다.
CHEF1 제어 DNA를 함유하는 벡터는 CMV-제어 플라스미드로부터 280-배까지 더 큰 재조합 단백질의 향상된 발현을 초래한다(Running Deer 및 Allison, 2004). 분비 단백질 및 막-결합 단백질을 비롯하여 여러 가지 관심 단백질의 증가된 발현은 비-햄스터 세포를 비롯하여 상이한 진핵 세포주에서 CHEF1-구동 벡터를 사용하여 달성되어 왔다. CHEF1과 CMV 벡터 사이의 형질감염 효율은 유사하지만, CHEF1 벡터로 형질 감염된 클론에서의 발현 수준이 일반적으로 균일하게 더 높다.
재조합 단백질의 높은-수준의 발현을 구동하는 데 있어서 CHEF1 벡터의 실증된 성공에도 불구하고, 향상된 발현 시스템을 개발하기 위한 지속적인 필요성이 존재한다.
본 개시내용은 하나 이상의 재조합 단백질 및/또는 선별 마커(SM; selectable marker)의 높은-수준의 발현을 위한 양방향성 발현 벡터를 제공한다. 다양한 양태에서, 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 요소, 관심 유전자(GOI), 및 선별 마커(SM)를 포함한다. 일부 양태에서, 양방향성 발현 벡터는 CMV 프로모터 및/또는 인간 아데노바이러스 3부 리더(AdTPL; adenovirus tripartite leader) 서열을 추가로 포함한다. 관련 양태에서, 양방향성 발현 벡터는 최소 사이토메갈로바이러스 프로모터(minCMV)를 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 이종성 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 양방향성 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI를 포함한다. 다양한 구현예에서, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI의 배향은 5':3'이다(즉, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI는 동일한 배향으로 존재함). 다양한 양태에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함하며, 여기서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 5' CHEF1 전사 조절 DNA와 동일한 배향으로 존재한다. 다양한 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5, 또는 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 최소 CMV(minCMV) 및 선별 마커(SM)를 포함한다. 다양한 구현예에서, minCMV 및 SM의 배향은 3':5'이다(즉, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI는 minCMV 및 SM에 비해 역(reverse) 배향으로 존재함). 다양한 구현예에서, SM은 코돈 탈최적화된다(deoptimized).
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA, GOI 및 SM을 포함한다. 관련 양태에서, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI의 배향은 5':3'이다(즉, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI는 동일한 배향으로 존재함). 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 관련 구현예에서, 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함하며, 여기서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 5' CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI와 동일한 배향으로 존재한다. 관련 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 관련 구현예에서, SM의 배향은 3':5'이다(즉, 5' CHEF1 전사 조절 DNA, 3' CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI에 비해 역 배향으로 존재함). 관련 구현예에서, SM은 CHEF1 전사 조절 DNA의 업스트림이다. 관련 구현예에서, SM은 코돈 탈최적화된다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 CMV 프로모터 및/또는 인간 아데노바이러스 3부 리더(AdTPL) 서열, GOI, minCMV 및 SM을 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 CMV 프로모터, GOI 및 SM을 포함한다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 선별 마커 유전자를 추가로 포함한다. 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 다양한 양태에서, SM은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(npt II), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt), 디하이드로포에이트 리덕타제(dhfr), 제오신(zeocin), 플레오마이신(phleomycin), 블레오마이신 내성 유전자 ble(알려져 있지 않은 효소), 겐타마이신 아세틸트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제, 아세토락테이트 신타제(als)의 돌연변이체 형태, 브로목시닐 니트릴라제, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(bar), 에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트(EPSP; enolpyruvylshikimate-3-phosphate) 신타제(aro A), 근육 특이적 티로신 키나제 수용체 분자(MuSK-R), 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sod1), 메탈로티오네인(cup1, MT1), 베타-락타마제(BLA), 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제(pac), 블라스티시딘 아세틸 트랜스퍼라제(bls), 블라스티시딘 데아미나제(bsr), 히스티디놀 데하이드로게나제(HDH), N-숙시닐-5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 리보타이드(SAICAR) 신서타제(ade1), 아르기노숙시네이트 리아제(arg4), 베타-이소프로필말레이트 데하이드로게나제(leu2), 인버타제(suc2) 및 오로티딘-5'-포스페이트(OMP) 데카르복실라제(ura3)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다양한 구현예에서, 본 개시내용은 숙주 세포에서 이종성 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이)이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 효모 세포(예를 들어 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris))이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 곤충 세포(예를 들어 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda))이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 식물 세포이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 원생동물 세포이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 다양한 양태에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 인간 세포이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 세포이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 혈청-무함유, 현탁액-적응(suspension-adapted) CHO 세포주(SFSA DG44)이다.
도 1a 내지 도 1c는 양방향성 발현 벡터 pDEF90(도 1a), pDEF90 -(마이너스) CMV(도 1b), 및 pDEF90 -(마이너스) CHEF(도 1c)의 맵(map)을 보여준다. 도 1a는 5' 및 3' CHEF1 전사 조절 DNA 및 최소 CMV(minCMV) 프로모터를 포함하는 pDEF90을 보여준다. minCMV 프로모터는 CHEF 프로모터의 역 배향 업스트림에 존재한다. DHFR 유전자는 CHEF 프로모터에 관하여 역 배향에서 최소 CMV 요소의 다운스트림에 존재한다. 도 1b는 5' 및 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 포함하는 pDEF90 -(마이너스) CMV를 보여준다. minCMV 프로모터는 pDEF90 벡터로부터 제거되었다. DHFR 유전자는 CHEF 프로모터의 역 배향 업스트림에 존재한다. 도 1c는 pDEF90 -(마이너스) CHEF를 보여주며, 여기서 4 kb의 5' CHEF1 전사 조절 DNA가 제거되었다. pDEF90은 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 포함하고, DHFR 유전자는 최소 CMV 프로모터의 다운스트림에 존재한다.
도 2a 내지 도 2d는 pDEF90 벡터의 형질감염, 및 21 일에 걸쳐 회수 및 선별 동안 세포 성장, 생존력, 배가 시간(doubling time) 및 형질감염 풀의 세대(generation)에 미치는 이들의 효과를 보여준다. pDEF38; pDEF90; pDEF90 -(마이너스) CHEF; pDEF90 -(마이너스) CMV 및 모의 대조군(mock control)에 대한 생존 세포 밀도(도 2a), 생존력(도 2b), 세포 배가 시간(도 2c), 세대 수(도 2d)이다.
도 3a 내지 도 3c는 pDEF90이 혈청-무함유, 현탁액-적응 (SFSA) 세포에서 이종성 단백질의 발현을 구동함을 보여준다. 생존 세포 밀도(도 3a) 및 생존력(도 3b)은 SFSA 세포를 pDEF90-GFP-1 및 pDEF90-GFP-2로 형질감염-후 0 일 내지 21 일 후에 나타난다(SFSA 세포에서 선형화된 플라스미드를 이용한 2벌 중복 형질감염). 형질감염체는 CDCIM1 배지에서 회수되었고, GFP는 Guava 유세포분석기를 사용하여 측정되었다. 도 3c는 녹색 형광(GRN-HLog)의 측정을 이용한 2 개의 pDEF90-GFP 형질감염 풀의 카운트를 보여준다. pDEF90-GFP 풀 및 pDEF90(GFP 없음) 형질감염된 풀이다.
도 4는 pEF90-GFP 클론의 GFP 발현을 보여준다. 12 개의 클론은 유세포분석에 의해 GFP 발현에 대해 분석되었다. 좌측 피크: 비형질감염된 세포; 우측 피크: pDEF90-GFP 클론이다.
도 2a 내지 도 2d는 pDEF90 벡터의 형질감염, 및 21 일에 걸쳐 회수 및 선별 동안 세포 성장, 생존력, 배가 시간(doubling time) 및 형질감염 풀의 세대(generation)에 미치는 이들의 효과를 보여준다. pDEF38; pDEF90; pDEF90 -(마이너스) CHEF; pDEF90 -(마이너스) CMV 및 모의 대조군(mock control)에 대한 생존 세포 밀도(도 2a), 생존력(도 2b), 세포 배가 시간(도 2c), 세대 수(도 2d)이다.
도 3a 내지 도 3c는 pDEF90이 혈청-무함유, 현탁액-적응 (SFSA) 세포에서 이종성 단백질의 발현을 구동함을 보여준다. 생존 세포 밀도(도 3a) 및 생존력(도 3b)은 SFSA 세포를 pDEF90-GFP-1 및 pDEF90-GFP-2로 형질감염-후 0 일 내지 21 일 후에 나타난다(SFSA 세포에서 선형화된 플라스미드를 이용한 2벌 중복 형질감염). 형질감염체는 CDCIM1 배지에서 회수되었고, GFP는 Guava 유세포분석기를 사용하여 측정되었다. 도 3c는 녹색 형광(GRN-HLog)의 측정을 이용한 2 개의 pDEF90-GFP 형질감염 풀의 카운트를 보여준다. pDEF90-GFP 풀 및 pDEF90(GFP 없음) 형질감염된 풀이다.
도 4는 pEF90-GFP 클론의 GFP 발현을 보여준다. 12 개의 클론은 유세포분석에 의해 GFP 발현에 대해 분석되었다. 좌측 피크: 비형질감염된 세포; 우측 피크: pDEF90-GFP 클론이다.
본 개시내용은 다양한 양태에서, 차이니즈 햄스터 신장 인자-1α(CHEF1) 전사 조절 DNA, 관심 유전자(GOI) 및 선별 마커(SM)를 포함하는 다양한 양방향성 발현 벡터를 제공한다. 관련 양태에서, 양방향성 발현 벡터는 또한, 최소 사이토메갈로바이러스(minCMV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및/또는 인간 아데노바이러스 3부 리더(AdTPL) 서열을 포함할 수 있다.
재조합 단백질의 높은-수준의 발현을 달성하기 위한 발현 벡터(일방향성 발현 벡터)에서 CHEF1 전사 조절 DNA 요소의 용도는 이전에 기재되었다(미국 특허 5,888,809; 9,212,367; 9,297,024(이들은 각각 그 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함됨); Running Deer and Allison, 2004). CHEF1-구동 벡터로부터의 단백질 발현은 다수의 상이한 단백질 및 숙주 세포 유형에 대한 CMV 프로모터-제어 벡터로부터 보다 유의하게 더 높은 것으로 나타났고, 이러한 증가는 250-배 초과일 수 있다(Running Deer and Allison, 2004). AdTPL 서열은 후기(late) 바이러스 mRNA 상에서 이들 mRNA의 번역을 증강시키는 것으로 확인되는 200-뉴클레오타이드 5' 비코딩 서열이다(문헌[Logan, PNAS 81: 3655; 1984]).
정의
본원에 사용된 바와 같이, 하기 정의는 당업자가 본 개시내용을 이해하는 데 일조하는 데 유용할 수 있다:
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "양방향성"은 5' -> 3'(전사 방향) 및 3' -> 5'(각각의 반대 전사 방향) 둘 모두에서의 관심 유전자 또는 선별 마커의 발현을 지칭한다. 용어 "양방향성 발현 벡터"는, 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트가 반대 방향으로 배열되도록, 즉, 관심 유전자(GOI)에 대한 발현 카세트가 하나의 전사 방향으로 존재하고 선별 마커(SM)에 대한 발현 카세트가 각각의 반대 전사 방향으로 존재하도록 발현 카세트가 구조화되는 발현 벡터를 지칭한다.
용어 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 코딩 정보를 숙주 세포에 이전시키는 데 사용되는 임의의 분자를 지칭한다. 다양한 양태에서, 발현 벡터는 핵산, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 인공 염색체이다. 본 개시내용에 따른 "발현 플라스미드" 또는 "플라스미드"는 실시예에서 추가로 기재된다.
폴리뉴클레오타이드에 관하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "탈최적화된(deoptimized)"은, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 단백질의 번역이 이러한 폴리뉴클레오타이드가 도입된 숙주 세포에 대해 최적화되는 것보다 덜하도록 상기 폴리뉴클레오타이드가 변형되었음을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 다양한 방식으로 탈최적화되고, 본 발명은 본원에 예시된 방법에 의해 제한되지 않는다.
용어 "숙주 세포"는, GOI를 갖는 양방향성 발현 벡터에 의해 형질전환되거나, 형질감염되거나 형질도입된 다음 세포에 의해 발현되는 세포를 지칭한다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 원생생물 세포, 진균류 세포, 식물 세포 또는 동물 세포이다. 상기 용어는 또한, 자손이 부모와 유전자형 또는 표현형에서 동일하든지 상관 없이, 관심 유전자가 존재하는 한, 부모 숙주 세포의 자손을 지칭한다.
용어 "사이토메갈로바이러스 프로모터" 또는 "CMV 프로모터"는 당업계에 알려진 CMV 프로모터 서열을 지칭한다. 다양한 양태에서, CMV 프로모터는 뮤린(mCMV) 또는 인간(hCMV)을 비롯한 임의의 기원의 것이다. 다양한 양태에서, hCMV는 임의의 CMV 균주로부터 유래된다. 다양한 양태에서, CMV 균주는 AD169, Davis, Toledo 또는 Towne이다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서, CMV 프로모터는 서열번호 1에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 함유한다.
용어 "최소 CMV" 또는 "minCMV" 프로모터는 TATA 박스 및 전사 개시 부위를 포함하여 CMV 프로모터의 최소 요소를 지칭하며, 이는 프로모터 활성을 증강시키는 조절 요소가 업스트림에 놓이지 않는 한 불활성이다(또는 매우 낮은 기저 활성을 가짐). 본 개시내용에 사용하기 위한 minCMV 프로모터의 일례는 서열번호 6에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
용어 "AdTPL 서열"은 당업계에 알려진 인간 아데노바이러스 후기 바이러스 mRNA에 존재하는 대략 200개의 뉴클레오타이드, 5' 비코딩 서열을 지칭한다. 다양한 구현예에서, AdTPL 서열은 서열번호 2에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 함유한다.
용어 "전사 조절 DNA"는 유전자의 전사를 제어할 수 있는 cis-작용성 조절 요소, 예컨대 프로모터 영역 및 요소, 예컨대 인핸서, 인설레이터(insulator) 및 스캐폴드/매트릭스 부착 영역을 함유하는 비코딩 서열을 지칭한다.
용어 "CHEF1 전사 조절 DNA"는 CHEF1 유전자의 전사를 제어할 수 있는 cis-작용성 조절 요소, 예컨대 프로모터 영역 및 요소, 예컨대 인핸서, 인설레이터 및 스캐폴드/매트릭스 부착 영역을 함유하는 비코딩 서열을 지칭한다.
용어 "5' CHEF1 전사 조절 DNA"는 자연상에서, 차이니즈 햄스터 게놈의 CHEF1 유전자에서 출발 코돈의 5', 즉, 업스트림에 위치한 DNA를 지칭한다.
용어 "3' CHEF1 전사 조절 DNA"는 자연상에서, 차이니즈 햄스터 게놈의 CHEF1 유전자에서 정지 코돈의 3', 즉, 다운스트림에 위치한 DNA를 지칭한다.
용어 "대략" 및 "약"은 기준 양의 닫힌 범위 내에 있는 양을 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드에 관하여, 대략/약 명시된 길이인 서열은 언급된 길이의 5% 이내에 있다.
양방향성 발현 벡터
양방향성 발현 벡터는 하나 이상의 관심 유전자 및 선택적으로 선별 마커를 구성적으로 발현하도록 설계된다. 다양한 양태에서, 양방향성 벡터는 하나 이상의 프로모터를 인코딩할 수 있다. 다양한 양태에서, 발현 벡터는 1, 2, 3 또는 4 개의 관심 유전자를 포함한다. 관련 양태에서, 1, 2, 3 또는 4 개의 관심 유전자는 하나의 또는 선택적으로 2 개의 프로모터의 제어 하에 있다.
본 발명의 양방향성 발현 벡터는, 선별 마커(DHFR) 및 GOI가 동일한 CHEF1 프로모터로부터 발현되므로, 관심 유전자(GOI)의 증강된 안정성을 가능하게 한다.
pDEF90
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA, minCMV, GOI 및 SM을 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI를 5':3' 배향으로 포함한다(즉, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI는 동일한 배향으로 존재함). 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 3에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다. 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 minCMV 및 SM을 3':5' 배향으로 포함한다(즉, minCMV 및 SM은 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI에 비해 역 배향으로 존재함). 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서, minCMV 프로모터는 서열번호 6에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 함유한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 5에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
pDEF90 -(마이너스) CMV
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA, GOI 및 SM을 포함한다. 다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI를 5':3' 배향으로 포함한다(즉, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI는 동일한 배향으로 존재함). 관련 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 3에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다. 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
관련 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 5에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
관련 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 SM을 3':5' 배향으로 포함한다(즉, SM은 5' CHEF1 전사 조절 DNA, 3' CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI에 비해 역 배향으로 존재함). 다양한 양태에서, SM은 CHEF1 전사 조절 DNA의 업스트림이다. 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 관련 양태에서, 상기 언급된 CHEF1 전사 조절 DNA 서열은 SM과 GOI 둘 모두의 발현을 촉진한다.
pDEF90 CHEF CMV
AdTPL 하이브리드
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 CMV 프로모터 및/또는 인간 아데노바이러스 3부 리더(AdTPL) 서열, GOI, minCMV 및 SM을 포함한다. 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서, AdTPL은 서열번호 2에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 함유한다.
관련 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함한다. 관련 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 5에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
CHEF 및 CMV를 갖는 pDEF90
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 CMV 프로모터, GOI 및 SM을 포함한다. 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 본 개시내용의 다양한 양태에서, CMV 프로모터는 서열번호 1에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 함유한다.
다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 3에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다. 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 5에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
pDEF93CMV
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA, minCMV, GOI 및 SM을 효율적인 mRNA 가공을 위해 5' UTR 및 SM의 3' 말단에 SV40 폴리아데닐화 서열과 함께 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI를 5':3' 배향으로 포함한다(즉, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI는 동일한 배향으로 존재함). 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 3에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다. 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 minCMV 및 SM을 3':5' 배향으로 포함한다(즉, minCMV 및 SM은 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI에 비해 역 배향으로 존재함). 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서, minCMV 프로모터는 서열번호 6에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 함유한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 5에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
pDEF94CMV
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA, minCMV, GOI 및 SM을 효율적인 mRNA 가공을 위해 SM의 3' 말단에 SV40 폴리아데닐화 서열과 함께 포함한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI를 5':3' 배향으로 포함한다(즉, CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI는 동일한 배향으로 존재함). 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 3에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다. 다양한 구현예에서, 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 4에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 5' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 minCMV 및 SM을 3':5' 배향으로 포함한다(즉, minCMV 및 SM은 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI에 비해 역 배향으로 존재함). 다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 본 개시내용의 다양한 구현예에서, minCMV 프로모터는 서열번호 6에 제시된 폴리뉴클레오타이드를 함유한다.
다양한 양태에서, 본 개시내용에 따른 양방향성 발현 벡터는 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함한다. 다양한 구현예에서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5를 포함한다. 본 개시내용은 또한, 서열번호 5에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 96%, 적어도 95%, 적어도 94%, 적어도 93%, 적어도 92%, 적어도 91%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75% 또는 적어도 70% 동일한 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 제공한다.
선별 마커
선별 마커는 숙주 세포 단백질 결핍을 보완하거나 다르게는 독성제에 대해 내성을 부여하고 이로써 공동-형질전환된 관심 유전자의 존재(발현)에 대해 선별하기 위해 형질감염 실험에 사용된다.
다양한 양태에서, 양방향성 발현 벡터는 형질전환된 세포의 식별을 위해 선별 마커(SM) 유전자를 추가로 포함한다. 적합한 SM 유전자의 예는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(npt II), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt), 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr), 제오신, 플레오마이신, 블레오마이신 내성 유전자(ble), 겐타마이신 아세틸트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제, 아세토락테이트 신타제(als)의 돌연변이체 형태, 브로목시닐 니트릴라제, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(bar), 에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트(EPSP) 신타제(aro A), 근육 특이적 티로신 키나제 수용체 분자(MuSK-R), 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sod1), 메탈로티오네인(cup1, MT1), 베타-락타마제(BLA), 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제(pac), 블라스티시딘 아세틸 트랜스퍼라제(bls), 블라스티시딘 데아미나제(bsr), 히스티디놀 데하이드로게나제(HDH), N-숙시닐-5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 리보타이드(SAICAR) 신서타제(ade1), 아르기노숙시네이트 리아제(arg4), 베타-이소프로필말레이트 데하이드로게나제(leu2), 인버타제(suc2), 오로티딘-5'-포스페이트(OMP) 데카르복실라제(ura3) 및 이들 중 임의의 이종상동체(ortholog)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 개시내용은 또한, CHEF1 전사 조절 DNA 및 CMV 프로모터 및/또는 AdTPL 서열을 포함하는 양방향성 발현 벡터로 형질전환되거나, 형질도입되거나 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. 다양한 양태에서, 숙주 세포는 햄스터 세포이다. 다양한 양태에서, 햄스터 세포는 CHO 세포이다. 다양한 구현예에서, 숙주 세포는 비-햄스터 포유류 세포이고, 다양한 양태에서, 세포는 인간 세포이다.
코돈 탈최적화
다양한 양태에서, SM은 코돈 탈최적화된다. 코돈 최적화 방법은 다른 이들이 언급하였다(Itakura 1987, Kotula 1991, Holler 1993, Seed 1998). 그러나, 코돈 탈최적화 이용성의 제한된 예가 존재한다. 하나의 이러한 예는 최소의 바람직한 코돈 또는 비무작위화된 코돈 쌍을 혼입함으로써 복제 적합도(replicative fitness)를 감소시키기 위한 바이러스 유전자의 탈최적화이다(Burns2006, Mueller 2006, Coleman 2008, Kew 2008). 코돈 탈최적화 방법은 미국 특허 번호 9,212,367에 추가로 기재되어 있으며, 이는 참조에 의해 포함되고, 이때 예에 대한 특정 참조는 코돈 탈최적화된 DHFR-인코딩 폴리뉴클레오타이드 서열이 CHEF1 발현 벡터 pDEF38(컬럼 14 내지 16) 내로 도입되었음을 기재하였다. 제시된 예는 일반적으로, 임의의 선별 마커를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에서 코돈을 이의 종 특이적 숙주에 대해 탈최적화하기 위해 적용 가능하다.
관심 유전자
다양한 양태에서, 양방향성 발현 벡터는 하나 이상의 관심 유전자(GOI)를 추가로 포함한다. 적합한 GOI의 예는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 및 다른 당단백질, 바이오시밀러(biosimilar), Fc-융합 유전자, 효소, 백신, 펩타이드 호르몬, 또는 성장 인자를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 항체에 대한 관련 양태에서, 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)는 단일 벡터에서 단일 프로모터로부터 발현될 수 있다.
벡터 및 숙주 세포
선택된 숙주 세포에 유용한 포유류, 효모, 진균류, 곤충, 식물 또는 바이러스 벡터를 비롯하여 임의의 진핵 및 원핵 벡터는 본 방법에 사용하기 위한 것으로 고려된다. 용어 "벡터"는 코딩 정보를 숙주 세포에 이전하는 데 사용되는 임의의 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 지칭하기 위해 당업계에서 인식된 바와 같이 사용된다. 용어 "숙주 세포"는 이후에 세포에 의해 발현되는 선택된 관심 유전자를 갖는 벡터에 의해 형질전환되었거나 형질전환될 수 있는 세포를 지칭하는 데 사용된다. 상기 용어는 포유류, 효모, 진균류, 곤충, 식물 및 원생동물 세포, 및 자손이 원래의 부모와 형태 또는 유전적 구성 면에서 동일하든지 상관 없이, 선택된 유전자가 존재하는 한 부모 세포의 자손을 포함한다. 일반적으로, 임의의 벡터는 본 발명의 방법에 사용될 수 있고, 일 양태에서, 적절한 벡터의 선택은 GOI의 발현을 위해 선택된 숙주 세포를 기반으로 한다.
예는 포유류 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)(ATCC No. CCL61); CHO DHFR-세포; CMC ICOS에서 생성된 혈청-무함유, 현탁액-적응 CHO DHFR 세포주(SFSA DG44 세포); 인간 배아 신장(HEK) 293 또는 293T 세포(ATCC No. CRL1573); 또는 3T3 세포(ATCC No. CCL92)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 다른 적합한 포유류 세포주는 원숭이 COS-1(ATCC No. CRL1650) 및 COS-7(ATCC No. CRL1651) 세포주, 및 CV-1 세포주(ATCC No. CCL70)이다. 보다 다른 적합한 포유류 세포주는 Sp2/0, NS1 및 NS0 마우스 하이브리도마 세포, 마우스 신경아세포종 N2A 세포, HeLa, 마우스 L-929 세포, Swiss로부터 유래되는 3T3 세포주, Balb-c 또는 NIH 마우스, BHK 또는 HaK 햄스터 세포주를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니며, 이들은 또한 ATCC로부터 입수 가능하다.
추가의 예시적인 포유류 숙주 세포는 형질전환된 세포주를 비롯하여 영장류 세포주 및 설치류 세포주를 포함한다. 정상적인 2배체 세포, 1차 조직의 시험관내 배양물로부터 유래되는 세포 균주, 뿐만 아니라 1차 외식편 또한, 적합하다.
유사하게 유용한 숙주 세포는 예를 들어, 이. 콜라이의 다양한 균주(예를 들어, HB101(ATCC No. 33694) DH5, DH10, 및 MC1061(ATCC No. 53338)), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium)의 다양한 균주 등을 포함한다.
당업자에게 알려진 효모 세포의 많은 균주는 또한, GOI의 발현을 위한 숙주 세포로서 입수 가능하고, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 균주, 칸디다(Candida), 피치아 시페리이(Pichia ciferrii) 및 피치아 파스토리스를 포함한다.
부가적으로, 요망된다면, 곤충 세포 시스템은 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어 비제한적으로, Sf-9 및 Hi5(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 포함한다.
예시적인 진균류 세포는 테르모아스쿠스 아우란티아쿠스(Thermoascus aurantiacus), 비제한적으로 아스페르길루스 오리자엠(Aspergillus oryzaem), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus) 및 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)를 포함하여 아스페르길루스(Aspergillus)(사상균(filamentous fungus)), 비제한적으로 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum)을 포함하여 푸사리움(Fusarium)(사상균), 페니실리움 크라이소게눔(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum), 아크레모니움 크라이소게눔(Acremonium chrysogenum), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei), 노르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 및 크라이소스포리움 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
예시적인 원생동물 세포는 비제한적으로 테트라하이메나(Tetrahymena) 균주 및 트리파노소마(Trypanosoma) 균주를 포함한다.
본 개시내용에 따른 발현 플라스미드는 하기 실시예에 추가로 기재된다. 실시예는 본 발명을 예시하는 역할을 할 뿐이고, 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한하려는 것이 아니다.
실시예
유전자 서열 및 발현 벡터 - 최소 CMV 요소(서열번호 6)의 DNA 단편(61 bp)을 CHEF 프로모터의 -(마이너스) 가닥 업스트림에서 클로닝하였고(minCMV 요소의 마이너스가닥 다운스트림에서 재-클로닝된 SV40 프로모터의 다운스트림의 DHFR 유전자 카세트와 함께), 화학적으로 합성하고, pDEF38 내로 클로닝하였고, CHEF1 발현 벡터는 미국 특허 US Patent 9,297,024에서 이전에 기재된 서열이고, 본 출원에서 서열번호 7로서 본 출원에 제공되며, pDEF90으로 지정된 양방향성 CHEF1-minCMV-프로모터 벡터를 생성하였다(도 1a). pDEF90 벡터의 2 가지 추가의 변이가 또한, 발생되었다. 양방향성 CHEF1-프로모터 벡터(최소 CMV 요소는 제거되었고, DHFR 유전자는 CHEF 프로모터의 역 배향 업스트림에 존재함)는 pDEF90 -(마이너스) CMV(도 1b) 및 pDEF90 -(마이너스) CHEF(4 kb의 5' CHEF 영역이 제거되었고, DHFR 유전자는 최소 CMV 요소의 다운스트림에 존재함)(도 1c)로 지정되었다.
모든 플라스미드를 표준 분자생물학 기법을 사용하여 제조하였다(문헌[Maniatis et al., J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. 545, 1982]). 각각의 플라스미드의 DNA 서열은 서열 목록에 제공된다. pDEF90(서열번호 8); pDEF90 -(마이너스) CMV(서열번호 9); pDEF90 minus CHEF(서열번호 10); pDEF93CMV(서열번호 11); pDEF94CMV(서열번호 12).
CHO 세포 배양물 및 배지 - 이 프로젝트에 사용된 세포주는 SFSA로 지정된 혈청-무함유, 현탁액-적응 CHO 세포주였다. SFSA 세포주는 DG44 세포주, dhfr 돌연변이체 CHO 세포주로부터 유래되었다. DG44 세포의 기원은 문헌[Urlaub, G. et al., Effect of Gamma Rays at the Dihydrofolate Reductase Locus: Deletions and Inversion. Somatic Cell and Molecular Genetics, 12:555-566, 1986)]에 기재되어 있다.
CD-CIM1 및 BM18 배지를 세포주 발달 전기간에 걸쳐 사용하였다. SFSA 세포를 CD-CIM1:BM18(75:25) 배합 배지에서 1/100 부피의 200 mM L-글루타민(Gibco, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 및 1/100 부피의 HT 보충제(Gibco, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 첨가하면서 계대배양한 후, 형질감염시켰다. 후속하여, 형질감염된 풀 또는 클론을 하이폭산틴 및 티미딘이 결여된 CD-CIM1 선별 배지에서 전적으로 계대배양하였다.
다르게 주지되지 않는 한, SFSA 세포 배양물을 3-일 스케쥴에서 37℃ 및 5% CO2에서 125 rpm에서 진탕시키면서 계대배양하였다. 성장 배양물을 전형적으로 0.3 또는 0.4 x 106 c/ml로 접종하였다. 배양물 분할이 1:3보다 크다면, 계대배양을 희석에 의해 수행하였으나, 분할이 1:3보다 작다면, 계대배양을 원심분리에 의해, 뒤이어 새로운 배지에서의 세포의 현탁에 의해 수행하였다. 전기 천공 전 1 일째에, 세포를 1 x 106 c/ml로 접종하였다.
실시예 1: 다양한 벡터 백본 플라스미드를 이용한 세포의 형질감염
SFSA DG44 세포 Biorad 전기 천공기를 사용하여 다양한 플라스미드(pDEF38, pDEF90, pDEF90 -(마이너스) CMV 및 pDEF90 -(마이너스) CHEF)로 형질감염시켰다. 간략하게는, 대수적으로 성장중인(logarithmically growing) 세포를 DNA/HEBS 완충제 믹스(mix)에 재현탁시키고, 4 cm 갭 큐벳에 이전시켰다. 2,000만 개의 세포를 100 μg의 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 표준 CHO 설정을 사용하여 전기 천공시켰다. 전기 천공 후, 세포를 비-선별 배지에서 3 일 동안 회수시킨 후, 하이폭산틴 및 티미딘이 결여된 선별 배지에 완전 배지 교환에 의해 이전시켰다. 세포를 선별 배지에서 정기적으로(2 일 내지 4 일 사이에) 계대배양하였다. 배양물 생존력이 90% 초과에 도달하였을 때, 형질감염된 세포는 선별로부터 완전히 "회수된" 것으로 여겨졌다.
형질감염 후, 배양물 생존력은 하락하였고, 세포 성장은 선별 배지에서 초기 계대배양 동안 예상된 바와 같이 느려졌다. 선별 후 대략 2 주째에, pDEF38(pDEF38-1), pDEF90(pDEF90-1) 및 pDEF90 -(마이너스) CMV(pDEF90 -(마이너스) CMV-1)로 형질감염된 배양물 세포 성장, 생존력, 배가 시간 및 세대는 도 2a 내지 도 2d에 제시된 바와 같이 90% 초과까지 회수되었고, pDEF90 -(마이너스) CHEF로 형질감염된 세포(pDEF90 -(마이너스) CHEF-1) 및 모의 형질감염된 세포는 선별 배지에서 회수되지 않았다.
이들 결과는, pDEF90 플라스미드를 갖는 모의 대조군과 비교한 경우, pDEF90 플라스미드가 선별 배지에서 세포가 성장하기에 충분한 DHFR을 생성할 수 있었음을 실증하였다. 선별 배지에서 세포에 대한 회수 시간은 pDEF38 플라스미드와 유사하였다. CHEF 프로모터가 결여된 플라스미드(pDEF90 -(마이너스) CHEF)는 선별 배지에서 성장을 지지할 수 없었으므로, pDEF90 플라스미드의 CHEF 영역은 pDEF90 백본으로부터의 DHFR 발현에 필요하였다. CHEF 프로모터 단독은 선별 배지에서의 성장을 지지하기 위해 역 배향에서 업스트림에서 클로닝된 DHFR 카세트로부터 유전자 발현을 구동할 수 있긴 하였지만(pDEF90 -(마이너스) CMV), 회수 기간은 pDEF90 및 pDEF38 플라스미드보다 약간 더 길었다.
실시예 2: pDEF90 GFP 플라스미드를 이용한 세포의 형질감염
SFSA DG44 세포를 pDEF90-GFP 플라스미드(2벌 중복 형질 감염)로 형질 감염시켰다. 전기 천공 전, pDEF90 플라스미드를 Pvu1 효소를 사용하여 선형화시켰다. DNA를 에탄올 침전에 의해 정제하고, 고압 멸균된 주사용수(WFI)에 재현탁시켰다. 대수적으로 성장중인 세포를 DNA/HEBS 완충제 믹스에 재현탁시키고, 4 cm 갭 큐벳에 이전시켰다. 2,000만 개의 세포를 100 μg의 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 후속하여, 세포를 표준 CHO 설정을 사용하여 전기 천공시켰다. 전기 천공 후, 세포를 비-선별 배지에서 3 일 동안 회수시킨 후, 하이폭산틴 및 티미딘이 결여된 선별 배지에 완전 배지 교환에 의해 이전시켰다. 세포를 선별 배지에서 정기적으로(2 일 내지 4 일 사이에) 계대배양하였다. 배양물 생존력이 90% 초과에 도달하였을 때, 형질감염된 세포는 선별로부터 완전히 "회수된" 것으로 여겨졌다(도 3a 및 도 3b). 회수된 풀로부터의 세포를 사용하여, Guava 유세포분석기 및 연관된 Express Pro 소프트웨어를 사용하여 GFP 발현에 대해 분석하였다. 엠티(empty) 벡터 pDEF90으로 형질감염된 세포는 GFP 발현에 대한 음성 대조군으로서 역할을 하였다(도 3c).
이들 결과는, pDEF90 플라스미드 백본이 선별 배지에서 CHO 세포 성장을 지속시키고 이종성 단백질의 발현을 구동할 수 있음을 보여준다.
실시예 3: 세포주 클로닝 및 클론 증식(expansion)
하나의 pDEF90-GFP 형질감염 풀로부터의 세포를 제한 희석 클로닝 방법에 의해 클로닝하였다. 풀로부터의 세포를 클로닝 배지에서 격렬한 피펫팅에 의해 재현탁시켜, 임의의 다중-세포 무리(clump)를 해리시키고, 96-웰 플레이트 내로 이론적 0.5 개 세포/웰로 접종하였다. 총 5 개 플레이트를 접종하였다. 클로닝 배지는 하기 구성성분의 배합물로 구성되었다: 6.2% BM18, 34.4% DMEM/F12, 34.4% CD-CIM1 및 3 일의 성장 후 풀로부터 단리된 25% 조건화된 배지. 조건화된 배지를 수합하기 위해, 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 상층액을 0.2 미크론 PES 필터를 통해 여과하였다. 모노클로날 세포주는 14-일 기간을 통해 Solentim로부터의 Cell Metric Imager를 사용하여 일련의 이미징에 의해 단일 세포로부터 유래되는 것으로 확증되었다. 단일 콜로니를 함유하는 웰이 식별되었고, 각각의 클론의 모노클론성은 0 일째 이미지에서 콜로니 기원점에서 단일 세포의 식별에 의해 입증되거나 입증되지 않았다.
96-웰 플레이트로부터의 콜로니는 CMC Biologics 클로닝 플랫폼을 통해 진행된 과거 항체 및 재조합 단백질 프로젝트와 일관된 형태 및 성장 속도를 나타내었다. 12 가지의 선별된 모노클로날 콜로니를 6웰 플레이트 내로 증식시켰다. 이들 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 125 rpm에서 진탕하면서 인큐베이션하였다. 일단 충분한 세포 밀도가 달성되면, 각각의 클론을 Guava 유세포분석기 및 연관된 Express Pro 소프트웨어를 사용하여 GFP 발현에 대해 분석하였다. 비형질감염된 세포는 GFP 발현에 대한 음성 대조군으로서 역할을 하였다.
6웰 플레이트로 스케일링된(scaled) 12 가지 클론 중 11 가지는 형광의 수준을 다양하게 하면서 GFP 발현에 대해 양성이었다(도 4).
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물은 본 개시내용의 측면에서 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 개시내용의 조성물이 구체적인 구현예의 측면에서 기재되긴 하였지만, 당업자는 조성물의 변이가 본 개시내용의 개념 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 명백히 알 것이다. 더 구체적으로, 화학적 그리고 생물학적 둘 모두로 관련된 소정의 폴리뉴클레오타이드가, 달성되는 동일한 또는 유사한 결과를 갖는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 대해 치환될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이러한 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같은 본 발명의 범위 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
본원에서 전반적으로 인용된 참조문헌은 이들 참조문헌이 본원에 제시된 것들에 대한 예시적인 절차적 또는 다른 상세한 보충을 제공하는 정도에서 모두 본원에서 참조에 의해 구체적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> CMC ICOS Biologics
<120> BIDIRECTIONAL CHEF1 VECTORS
<130> 31351/52530
<150> US 62/615574
<151> 2018-01-10
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 676
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> CMV
<400> 1
gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
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atggaaacaa cttgaccaaa aatctgtcac agaattttga gacccattaa aatacaagtt 7320
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tatgtggatg cccatttgtg ttccaaggga ttggactgtt catcaggacc cagagctgag 7440
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aaattaggaa tgtttttggc agacatggtg actacccttc atctgggtga gttcagttga 7560
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caggaattta aaaggccatc tggggcacaa agattaagca gaaaaggtag aaggtgagat 7860
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<211> 13539
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> pDEF90
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tcaggaattt aaaaggccat ctggggcaca aagattaagc agaaaaggta gaaggtgaga 7920
ttgggggact ttgagtactt cacacacttt aatgtgtgag tgctttagtg catatagtac 7980
aactgccaga taagggcatc cacatctgat tgtttggaag gcaccttgtg gtttctggga 8040
attcagaatt gggagaaaaa gtgctcccaa ccgctgaagc ccttggtaat ctgcagggtg 8100
tttatttagc aggagataag gacaaaaagt tatagtgtgg agttggttga gttggtagat 8160
gtcattacaa caggtggtct taaattgggt taggagtcac tttgaaatac ctgggccata 8220
agcaaagtgg cattttcacc tttcaggaga aactggtaca cttatccatt ctatagtgca 8280
tgcttgttca attgggctga tgactaaacc ggtgactaaa ggtttgtcag tataaatgga 8340
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ataaaagccc tttaccaaat taactacata ccagcataca tcagtccttt agtgttgaaa 8640
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ctataaacta cacaaaacga aggaatttac aggaattagg aaggtattct taacattaaa 8880
acattatggg cattttaaaa aaagctttga caggatttct ttgtcatggc tgtcctggag 8940
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<211> 13478
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> pDEF90 minus CMV
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gggttgtagg cagacggtga ggaattacta tacctgcaag gagtcattgc ctgatctgcc 8340
tggaaagggg caggattgag tctcagaagg tgtacaccat aggatatgga aaaatttgtc 8400
acgcctagca ttcaacttag tggtgtagcg ccacctactg gcactttaaa agcttagcat 8460
agaggagcat gtgtgttagg agctcggatg ggatccaggg cctcaaggtt tgcatgtaaa 8520
taaaagccct ttaccaaatt aactacatac cagcatacat cagtccttta gtgttgaaaa 8580
acagaagtga aagctaatat atatagtgct tgctttattt aagtctagct gattacgtgt 8640
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tataaactac acaaaacgaa ggaatttaca ggaattagga aggtattctt aacattaaaa 8820
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<211> 9457
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> pDEF90 minus CHEF
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<223> pDEF94CMV
<400> 12
cgatccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 60
aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag 120
ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga 180
ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatgg ctgattatga 240
tctctagtca aggcactata catcaaatat tccttattaa cccctttaca aattaaaaag 300
ctaaaggtac acaatttttg agcatagtta ttaatagcag acactctatg cctgtgtgga 360
gtaagaaaaa acagtatgtt atgattataa ctgttatgcc tacttataaa ggttacagaa 420
tatttttcca taattttctt gtatagcagt gcagcttttt cctttgtggt gtaaatagca 480
aagcaagcaa gagttctatt actaaacaca gcatgactca aaaaacttag caattctgaa 540
ggaaagtcct tggggtcttc tacctttctc ttcttttttg gaggagtaga atgttgagag 600
tcagcagtag cctcatcatc actagatggc atttcttctg agcaaaacag gttttcctca 660
ttaaaggcat tccaccactg ctcccattca tcagttccat aggttggaat ctaaaataca 720
caaacaatta gaatcagtag tttaacacat tatacactta aaaattttat atttacctta 780
gagctttaaa tctctgtagg tagtttgtcc aattatgtca caccacagaa gtaaggttcc 840
ttcacaaaga tcgatctaaa gccagcaaaa gtcccatggt cttataaaaa tgcatagctt 900
taggagggga gcagagaact tgaaagcatc ttcctgttag tctttcttct cgtagacttc 960
aaacttatac ttgatgcctt tttcctcctg gacctcagag aggacgcctg ggtattctgg 1020
gagaagttta tatttcccca aatcaatttc tgggaaaaac gtgtcacttt caaattcctg 1080
catgatcctt gtcacaaaga gtctgaggtg gcctggttga ttcatggctt cctggtaaac 1140
agaactgcct ccgactatcc aaaccatgtc tactttactt gccaattccg gttgttcaat 1200
aagtcttaag gcatcatcca aacttttggc aagaaaatga gctcctcgtg gtggttcttt 1260
gagttctcta ctgagaacta tattaattct gtcctttaaa ggtcgattct tctcaggaat 1320
ggagaaccag gttttcctac ccataatcac cagattctgt ttaccttcca ctgaagaggt 1380
tgtggtcatt ctttggaagt acttgaactc gttcctgagc ggaggccagg gtaggtctcc 1440
gttcttgcca atccccatat tttgggacac ggcgacgatg cagttcaatg gtcgaaccat 1500
gatctgacgg ttcactaaac cagctctgct tatatagacc tcccaccgta cacgcctacc 1560
ttcgacggcg cggtgcatag aaacagatgc aggcaaaaca tccacacata taaaacaaaa 1620
aattaaaacc aataaaactc ctaaactttt ggtctttctt gaatcttcaa tccctcaggt 1680
tatgaaataa tcatttatgc agtcaaaaat ttgccattct tgttgccagg tgtggtgatg 1740
attcggggaa gcagaagcag gcagatctct gtgaatgagg ccagcctggt ctacaaagtg 1800
agtcccagga cagtcaggcc tgttacacag agaaaccttg aaaaaaaaaa gataatatgt 1860
actgttgtat taccccaata tataaggcta aaccattaga agcacaacac tgttaagtac 1920
ggaaaataat atctagtgtg gtacagttac tactactata atacactaat atagctgtgg 1980
gaaactagtt ccaaagatga attactaacc agtgtttcca aggaaataaa tgaaagcaga 2040
gagattagtt ctattgctag tgtttcattt tcgtatattt cttacaattt ctcttgttac 2100
aaataggcac tagggtatca agataatttt aacgactggc tgagaaccct agaaaatctc 2160
tgtgaaaaag ggatttgtga aatgagagag ggtaatgtgg ccattataga aaaggctttt 2220
gtgtgccttg catgcataga ccctgtgttt gatctcttaa caccctcctt gaccagaaaa 2280
agcttctgtg gatagaaaat gattagttat atatactttt agggaaacgt agttctggat 2340
tctttggtta caattaacag aattaagtgc aaacaaagcc agaaacctcc tgataaatga 2400
gaaaacctgc ttgtagaagg ttgtaaggct ctgtaatata ggaattagga gaaaagaaac 2460
ctgtgtggtg gggcacgtct gtaatcccag cattgggaag tagaggtaga agattagaaa 2520
tcaaaggcca gcctcagcaa cacagtgagt ttgaggccac cctgaactac atcaggttct 2580
gtctcctttc tttttttttt ttttttcttt tctttttttg gtttctctgt gtagttttgg 2640
agcctatcct ggcactagct ctgaagagca ggctggcctc gaactcagag atcagccagc 2700
ctctgctggg attaaaggta tgcaccacca acgccccagg ttttgtctca aacaaacaaa 2760
aataacatca ggaggtggtg agagggctca gtggtcacag gcattctctg caaagcctga 2820
ctctgagttg gatcctttag agctacatgg ttgagggaag agaactgact cctggaaggt 2880
gtcctctggt ccccacacat agctatacac agcatgtgca ttcacacaca ctaaataatg 2940
ctatttttaa aaaaattaaa aacaacaaca gtttgggttg tgaaaactag aactagataa 3000
taggtaagaa tcaagtatca tgtaaatttg ctttcaactc atcccaaaat ttgttttata 3060
tttcagtttt tttccttcct agcttgactg tggagtcttg tccggaagca aatagttcct 3120
ttgcagatcc cacatgtgga caccggacag taggtcctca aatgctcctt attaggttgg 3180
ttcaataata tcaattgttt gttactaggc agtgatgttg tacatctgga ggagatctct 3240
tgagcccata atcaggttat taggaataaa tactctaagg ctaaaaatgt agcttagtga 3300
taagagtgct tgcctggtgt gctgagaccc tcggttccat ctccacaacc ccatattcca 3360
ttacaaaata ccttttcacc gtccctagca ttaagaaaca aaacaacaaa gaagtttttc 3420
tttcttctga gatcctgccc ggagaggcat ttaaaactgg ccagggccaa aaaaaaaaaa 3480
aaaaaaagaa aaaaaagaaa agaaaacagg ctagggccgg catggtggcg cacgccttta 3540
atcccagcac gcaggaggca gaggcagggc ggatctctgt gagtttgagg tcagcctggt 3600
ctacctagtg agtttcaggg cacccagggc taaagagact gtctcaaaaa caaaacagcc 3660
acacaatcag aaccacagca aaacgcagtt atgatccttg gaactgtagg aatgacaagc 3720
atttaaataa taggacgagc catttttgag aagctctgat ttcacaagtg tcagggatgg 3780
gctctgggcg agtaagattg ctaatgctgg cctctaaatg agaccacgtg gagttgatta 3840
gattcttttc atgttcctcg tgctctatca aataactgta cccaaataca cacacacaca 3900
cacacacaca caatgcgcgc acacacaaaa tcctttttta gcttaagaag cccagaatca 3960
gaagtaaagc taactgtggg acttaagtat tattctgaac ggaactccca gggcgtgaag 4020
cgcgcttcag gcttccagag aagcagctgg cgctggatgg aatgaaccaa gaggccagca 4080
caggggcaga tccgtcgagc tctcggccac cgagctgagc ccttaggttc tggggctggg 4140
aagggtccct aggattgtgc acctctcccg cgggggacaa gcagggggat ggcggggctg 4200
acgtcgggag gtggcctcca cgggaaggga cacccggatc tcgacacagc cttggcagtg 4260
gagtcaggaa gggtagggac agattctgga cgccctcttg gccagctcct caccgcccca 4320
cccccgactg gagccgagag taattcatac aaaaggaggg atcgccttcg cccctgggaa 4380
tcccagggac cgtcgctaaa ttctggccgg cctcccagcc cggaaccgct gtgcccgccc 4440
agcgcggcgg gaggagcctg cgcctagggc ggatcgcggg tcggcgggag agcacaagcc 4500
cacagtcccc ggcggtgggg gaggggcgcg ctgagcgggg gcccgggagc cagcgcgggg 4560
caaactggga aagtggtgtc gtgtgctggc tccgccctct tcccgagggt gggggagaac 4620
ggtataaaag tgcggtagtc gcgttggacg ttctttttcg caacgggttt gccgtcagaa 4680
cgcaggtgag tggcgggtgt ggcctccgcg ggcccgggct ccctcctttg agcggggtcg 4740
ggccgccgtg cgggtgtcgt cggccgggct tctctgcgag cgttcccgcc ctggatggcg 4800
ggctgtgcgg gagggcgagg gggggaggcc tggcggcggc cccggagcct cgcctcgtgt 4860
cgggcgtgag gcctagcgtg gcttccgccc cgccgcgtgc caccgcggcc gcgctttgct 4920
gtctgcccgg ctgccctcga ttgcctgccc gcggcccggg ccaacaaagg gagggcgtgg 4980
agctggctgg tagggagccc cgtagtccgc atgtcgggca gggagagcgg cagcagtcgg 5040
gggggggacc gggcccgccc gtcccgcagc acatgtccga cgccgcctgg acgggtagcg 5100
gcctgtgtcc tgataaggcg gccgggcggt gggttttaga tgccgggttc aggtggcccc 5160
gggtcccggc ccggtctggc cagtaccccg tagtggctta gctccgagga gggcgaggcc 5220
cgcccgcccg gcaccagttg cgtgcgcgga aagatggccg ctcccgggcc ctgtagcaag 5280
gagctcaaaa tggaggacgc ggcagcccgg cggagcgggg cgggtgagtc acccacacaa 5340
aggaagaggg ccttgcccct cgccggccgc tgcttcctgt gaccccgtgg tgtaccggcc 5400
gcacttcagt caccccgggc gctctttcgg agcaccgctg gcctccgctg ggggagggga 5460
tctgtctaat ggcgttggag tttgctcaca tttggtgggt ggagactgta gccaggccag 5520
cctggccatg gaagtaattc ttggaatttg cccattttga gtttggagcg aagctgattg 5580
acaaagctgc ttagccgttc aaaggtattc ttcgaacttt ttttttaagg tgttgtgaaa 5640
accaagcttc tcgagcgtac gtattaatta actcacgcgt attggcgcgc ctctagaata 5700
ttacccctaa cacctgccac cccagtctta atcagtggtg gaagaacggt ctcagaactg 5760
tttgtctcaa ttggccattt aagtttaata gtgaaagact ggttaatgat aacaatgcat 5820
cggaaaacct tcaggaggaa aggagaatgt tttgtggaac atttttgtgt gtgtggcagt 5880
tttaagttat tagttttcaa aatcagtact ttttaatgga aacaacttga ccaaaaatct 5940
gtcacagaat tttgagaccc attaaaatac aagtttaatg agaagtctgt ctctgttaat 6000
gctgaagtca ttactaagtg cttagcttag caaggtatgt ggatgcccat ttgtgttcca 6060
agggattgga ctgttcatca ggacccagag ctgagtttca agggctcaag agatggctta 6120
ttacctgtgg gtgtcttgaa ggttctggtt gggacaaatt aggaatgttt ttggcagaca 6180
tggtgactac ccttcatctg ggtgagttca gttgatttgt cttgagcctt tggggtttac 6240
acaagtaaat gacatcatac agttagtgta ttgttagtga atattaatat atgaggcagg 6300
ctttgctcta gcaattttag agtcgagggg ggatccccac gcgccctgta gcggcgcatt 6360
aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc 6420
gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca 6480
agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc 6540
caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt 6600
tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac 6660
aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc 6720
ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt 6780
aacgcttaca atttaaatat ttgcttatac aatcttcctg tttttggggc ttttctgatt 6840
atcaaccggg gtgggtacct ctagcatcgg ccggccgcgt ttccatttaa gtttaatagt 6900
gaaagactgg ttaatgataa caatgcatcg gaaaaccttc aggaggaaag gagaatgttt 6960
tgtggaacat ttttgtgtgt gtggcagttt taagttatta gttttcaaaa tcagtacttt 7020
ttaatggaaa caacttgacc aaaaatctgt cacagaattt tgagacccat taaaatacaa 7080
gtttaatgag aagtctgtct ctgttaatgc tgaagtcatt actaagtgct tagcttagca 7140
aggtatgtgg atgcccattt gtgttccaag ggattggact gttcatcagg acccagagct 7200
gagtttcaag ggctcaagag atggcttatt acctgtgggt gtcttgaagg ttctggttgg 7260
gacaaattag gaatgttttt ggcagacatg gtgactaccc ttcatctggg tgagttcagt 7320
tgatttgtct tgagcctttg gggtttacac aagtaaatga catcatacag ttagtgtatt 7380
gttagtgaat attaatatat gaggcaggct ttgctctagc aattttagaa ctagttttca 7440
ggaaagggtt catcttgtgc attggatgtt tgattctatc acttagagtt taaactgaaa 7500
gtgctcaaga ggttttattt aggctgggat ataaataagc ctttctgtag cttgtaatgg 7560
tatcaggaat ttaaaaggcc atctggggca caaagattaa gcagaaaagg tagaaggtga 7620
gattggggga ctttgagtac ttcacacact ttaatgtgtg agtgctttag tgcatatagt 7680
acaactgcca gataagggca tccacatctg attgtttgga aggcaccttg tggtttctgg 7740
gaattcagaa ttgggagaaa aagtgctccc aaccgctgaa gcccttggta atctgcaggg 7800
tgtttattta gcaggagata aggacaaaaa gttatagtgt ggagttggtt gagttggtag 7860
atgtcattac aacaggtggt cttaaattgg gttaggagtc actttgaaat acctgggcca 7920
taagcaaagt ggcattttca cctttcagga gaaactggta cacttatcca ttctatagtg 7980
catgcttgtt caattgggct gatgactaaa ccggtgacta aaggtttgtc agtataaatg 8040
gatgggttgt aggcagacgg tgaggaatta ctatacctgc aaggagtcat tgcctgatct 8100
gcctggaaag gggcaggatt gagtctcaga aggtgtacac cataggatat ggaaaaattt 8160
gtcacgccta gcattcaact tagtggtgta gcgccaccta ctggcacttt aaaagcttag 8220
catagaggag catgtgtgtt aggagctcgg atgggatcca gggcctcaag gtttgcatgt 8280
aaataaaagc cctttaccaa attaactaca taccagcata catcagtcct ttagtgttga 8340
aaaacagaag tgaaagctaa tatatatagt gcttgcttta tttaagtcta gctgattacg 8400
tgtttggttg ccagtgtgac tagtctggag ttgaatttgt cctcagacac gtaaaatgga 8460
atttgggatt cacaacactc tagtatgagg gacctaatgg cctgtaccag gcacaaacgt 8520
gtctataaac tacacaaaac gaaggaattt acaggaatta ggaaggtatt cttaacatta 8580
aaacattatg ggcattttaa aaaaagcttt gacaggattt ctttgtcatg gctgtcctgg 8640
agctagttgt gtagaccagg ctgggctgaa atcttgtctg cctgcctggc ttggacactt 8700
ttttattatg tatacaacat tctgcttcca tgtatatctg cacattagaa gacggcacca 8760
gatctcctaa tggatggttg tgagccacca tgtggttgct gggaattgaa ctcaggacct 8820
ctggaagagc agtgctctta acctctgagc catctccagc cccagcttgg gcacattttt 8880
aatggctggg aaatcaaacc ccctaggcct tctgtcagta atgaagggct tttggctacc 8940
gagagtagga tttaaggtta ttcggagctg caggtctgcc tcagtgcagg tttgggagtc 9000
cagcatctta gaaaatgcag tgaagccaag ctgagctata ttttgtttaa aaaaaaaata 9060
agtgggtaaa gtgctgctga gcctgatgac caagctggga cacaagtaga agaacatagg 9120
ccaatgctct atattaaaag catgggtcat ttttaatgct cttgagaagg ctatgcctac 9180
actactctca gccaccgcag cgtgtttaaa ttaaactagt ttggaaattt tctttggggg 9240
taagctattt aacctagtgc cttggcaggt atactactga actctcctcc tcattccttt 9300
ttgtttttta agaatttcag tcaggctcag gcagccctta aacttgtgat taagcctgag 9360
aacagttacg attatgagcc tattagtata ccgatcaata tgtgaatttt tttgggatgg 9420
gggtcaggcc tccctgcctc ccaaatactg ggactaaagg ctgcaccacc acaacctggc 9480
tcttgaaata cttttctaca ttttttgggg ggcatgggtg ggagagcagg gtttctctgt 9540
attagccctg gctctcctgg aactctgtag accaggctat tcttgagctc agattagcct 9600
gtctctgcct cctaaattct gggattaaag gtgtgtgcta ctgctgcctg gctacaaaga 9660
catttttttt tttcttaaat ttaaaaacaa aagtggttct tttagaaggg tggttggtgt 9720
tggcacatac tccaagcact caggttttga gtttgtccca ggaatgaaga ctgcattact 9780
gccgcccctc cctggtaagg gctacacaga gaaatcctat ttggagccta tcctggtaac 9840
tcgctctgta gaccaggctg gcctcgaact caagagaacc acctgcctct gaatgctggt 9900
attaagggca ggcaccacca acacccagcc taaaaaatgt ctttttttta aagatttttt 9960
tttttttttt tacagaataa acattctgtt tacaatattc tgcttctatg tatatctgca 10020
cactagaaga gggcacccga tctcataatg gatggttgtg agccaccaag tggttgctgg 10080
gaattgaact cagaacctct ggaagagcag tcagtgctct taacctctga gccatctctc 10140
cagcccctaa aaatggctct tgagataggg tctcaagtag tttgagactg agttggctat 10200
ataaacaagg ctggcacata gcaccatgta cagctgggtt tagtttacat ggggtgtttt 10260
tgtctctgga ggcaggagga tcatttgagc atagggagtt aatagtgagg tcatgtttta 10320
tctactcttc tgaattgaga actaagctga tgcaaagcaa gtttgactga agaagtccag 10380
tttatgagaa caagggtgga aactaatgtg tcaaagatgg ccttgcatgt gttttagatg 10440
atgacccagt cacttgggaa ttactggatg tgtaagacct atatcttgac aggagtgaac 10500
agtgtcttat aggtcctata tgaaagaaat gagacatacc cattttgttt cccctaagaa 10560
ttcacttttc ctaacctggt tcatgctatt taggttattt tacttgcaaa tcctagggtg 10620
ctcccttacc cagtattgct tatgtggcac caaagtcact cactcccatg atttgcaagt 10680
ctctgggaac ttccatgaca acctagaata gcaactcaaa tacattttct cagtaccaat 10740
tttgaagaaa aaatattttg caaaatagct gtatggatgg gtactaaata gtgaggttat 10800
ctccagaagg cctatgaaga attaaggttg agttcagttg agttcagcag caagtttaag 10860
gttcatccat ttttgtacag tgttttccta ttacggtaag tgttttgcct gcaggaatat 10920
ctgtaccaca tgcttgcctg gtacctatat cggccagaag agggctttgg atcctctgga 10980
cttgaattac agatgggtat tagccaccat ttaggtgctg ggaattgaaa ccaagtcctc 11040
tggaagaaca gcaagtgatc gagtcgacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 11100
gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 11160
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 11220
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 11280
cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 11340
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 11400
tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 11460
agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 11520
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 11580
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 11640
ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 11700
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 11760
cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 11820
actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 11880
ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 11940
tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 12000
ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 12060
aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 12120
ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 12180
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 12240
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 12300
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 12360
cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 12420
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 12480
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 12540
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 12600
aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 12660
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 12720
ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 12780
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 12840
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 12900
ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 12960
gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac 13020
cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact 13080
ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc 13140
aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat 13200
ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct c 13241
Claims (37)
- 차이니즈 햄스터 신장 인자-1α(CHEF1) 전사 조절 DNA, 관심 유전자(GOI), 최소 사이토메갈로바이러스 프로모터(minCMV; minimal cytomegalovirus promoter) 및 선별 마커(SM)를 포함하는 양방향성 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI의 배향은 5':3'인, 양방향성 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 4, 또는 서열번호 4와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함하며, 상기 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 상기 5' CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI와 동일한 배향으로 존재하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제5항에 있어서, 상기 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5, 또는 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 minCMV 및 SM의 배향은 3':5'인, 양방향성 발현 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 SM은 코돈 탈최적화되는(deoptimized), 양방향성 발현 벡터.
- CHEF1 전사 조절 DNA, GOI 및 SM을 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 CHEF1 전사 조절 DNA 및 GOI의 배향은 5':3'인, 양방향성 발현 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 5' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 3, 또는 서열번호 3과 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 3' CHEF1 전사 조절 DNA를 추가로 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제12항에 있어서, 상기 3' CHEF1 전사 조절 DNA는 서열번호 5, 또는 서열번호 5와 적어도 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 SM의 배향은 3':5'인, 양방향성 발현 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 SM은 CHEF1 전사 조절 DNA의 업스트림인, 양방향성 발현 벡터.
- 제9항에 있어서, 상기 SM은 코돈 탈최적화되는, 양방향성 발현 벡터.
- CHEF1 전사 조절 DNA 및 CMV 프로모터 및/또는 인간 아데노바이러스 3부 리더(AdTPL; adenovirus tripartite leader) 서열, GOI, minCMV 및 SM을 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- CHEF1 전사 조절 DNA 및 CMV 프로모터, GOI 및 SM을 포함하는, 양방향성 발현 벡터.
- 제17항에 있어서, 상기 SM은 코돈 탈최적화되는, 양방향성 발현 벡터.
- 제18항에 있어서, 상기 SM은 코돈 탈최적화되는, 양방향성 발현 벡터.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SM은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(npt II), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt), 디하이드로포에이트 리덕타제(dhfr), 제오신(zeocin), 플레오마이신(phleomycin), 블레오마이신 내성 유전자 ble(알려져 있지 않은 효소), 겐타마이신 아세틸트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제, 아세토락테이트 신타제(als)의 돌연변이체 형태, 브로목시닐 니트릴라제, 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(bar), 에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트(EPSP; enolpyruvylshikimate-3-phosphate) 신타제(aro A), 근육 특이적 티로신 키나제 수용체 분자(MuSK-R), 구리-아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(sod1), 메탈로티오네인(cup1, MT1), 베타-락타마제(BLA), 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제(pac), 블라스티시딘 아세틸 트랜스퍼라제(bls), 블라스티시딘 데아미나제(bsr), 히스티디놀 데하이드로게나제(HDH), N-숙시닐-5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 리보타이드(SAICAR) 신서타제(ade1), 아르기노숙시네이트 리아제(arg4), 베타-이소프로필말레이트 데하이드로게나제(leu2), 인버타제(suc2) 및 오로티딘-5'-포스페이트(OMP) 데카르복실라제(ura3)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 양방향성 발현 벡터.
- 숙주 세포에서 이종성 단백질 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 양방향성 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포는 진핵 세포인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포는 원핵 세포인, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포는 효모 세포인, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인, 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 숙주 세포는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포는 식물 세포인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 숙주 세포는 원생동물 세포인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포는 인간 세포인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 세포의 것인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)인, 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 숙주 세포는 혈청-무함유, 현탁액-적응(suspension-adapted) CHO 세포주(SFSA DG44)인, 방법.
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