JP2009521224A

JP2009521224A - 組み換え法によって生物活性ビタミンｋ依存性タンパク質を製造する方法

Info

Publication number: JP2009521224A
Application number: JP2008547588A
Authority: JP
Inventors: エヌ．ドロハン，ウィリアム; ジェイ．グリフィス，マイケル; アール．テイラー，ジョン; ダブリュー．スタッフォード，ダレル
Original assignee: インスピレーションバイオファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド; ユニバーシティオブノースカロライナアットチャペルヒル
Priority date: 2005-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2026-12-21
Also published as: CA2633661C; US20230287471A1; ES2503365T5; JP2017046717A; CA2633661A1; US20190032101A1; DK1969127T3; JP5526332B2; DK1969127T4; PT1969127E; WO2007075976A3; WO2007075976A2; US20160108449A1; JP2013223514A; PL1969127T5; SI1969127T1; EP1969127A2; EP2385125A3; US20210095323A1; AU2006331501A1

Abstract

本発明は、生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質、特に第ＩＸ因子を製造する商業的に実現可能な方法に関する。第ＩＸ因子は、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌのレベルで産生され、少なくとも２５％生物活性である。当該方法は、ビタミンＫ依存性タンパク質が、組み換え細胞によって効率的に産生及びプロセシングされるように、１つ又は複数の対になった塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）、ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）及びビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）を好ましい比率で同時発現させることに関する。

Description

本発明の実施の形態は一般的に、組み換えビタミンＫ依存性タンパク質、特に第ＩＸ因子の製造に関し、これはビタミンＫ依存性タンパク質のプロセシングに関連する１つ又は複数のタンパク質の同時発現によって完全に機能的である。これらのプロセシングタンパク質としては、対になった塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）、ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）及びビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）が挙げられる。さらに、ビタミンＫ依存性タンパク質のプロペプチドを修飾し、γ−カルボキシル化を改善することもできる。

［関連出願の相互参照］
本願は、２００５年１２月２１日に提出された米国仮特許出願第６０／７５２，６４２号（参照により本明細書中に援用される）に対する優先権を主張する。

出血性障害は、正常な止血、すなわち血液凝固に必要とされる、１つ又は複数の血液タンパク質（集合的に血液凝固因子として知られる）の機能レベルの欠損に起因し得る。所定の出血性障害の重症度は機能的な凝固因子の血液レベルに依存する。軽度の出血性障害は、所定の凝固因子の機能レベルが正常なものの約５％に達する場合に一般的に認められるが、機能レベルが１％未満まで落ちる場合、血管系に対する何らかの損傷によって重度の出血が起こる可能性が高い。

医療経験によって、本質的に正常な止血が１つ又は複数の血液凝固因子を含有する生物学的製剤の静脈内注入によって一次的に回復させることができることが示されている。出血が起こる場合（要求に応じて）、又は（予防的に）出血を防ぐために、欠損した血液凝固因子を含有する生物学的製剤が注入される、いわゆる補充療法が、多種多様な出血性障害の患者を管理するのに効果的であることが示されている。概して、効果的な補充療法のために、２〜３日間を超えて正常なものの５％を優に超えるレベルを達成するような欠損した（missing）凝固因子の静脈内注入を目的とする。

歴史的に、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）又は第ＩＸ因子（血友病Ｂ）のいずれかの欠損に起因する遺伝的に獲得した出血性障害である血友病を患う患者は、様々な純度の全血又は血漿分画の定期的な注入によって治療が成功した。

近年になって、バイオテクノロジーの出現により、合成（組み換え）血液凝固因子の生物活性製剤が血液凝固障害の治療のために市販されてきている。組み換え血液凝固タンパク質によって、ヒト血液由来の高純度の市販製剤であっても付きまとう懸念事項であり続けるヒト病原菌混入の危険性が本質的になくなる。

出血性障害の適切な治療は、主として世界の経済発展地域に限定される。血友病の場合、世界中で７５％を超える患者集団が、この疾患の治療が十分に受けられないか、又は粗悪な治療しか受けられないか、又は治療を受けることができないと推測される。世界の多くの地域では、凝固因子の安全で効果的な市販製剤のコストは、出血性障害の日常的な管理のために高すぎて、場合によっては、寄付された製品による応急処置しか利用することができない。

出血性障害の適切な治療が潜在的に利用可能である世界の地域では、コストが非常に高く、患者は、必要な市販製品を得るために、第三者の支払元（payors）、例えば健康保険
又は政府援助プログラムにほとんどの場合依存している。平均して、米国において血友病治療には、日常的に要望に応じたケアに必要な市販製品のために毎年１人の患者当たり約５００００ドルかかると推測される。しかし、米国血友病財団の医学科学諮問委員会によって、患者が、成人の血友病患者の場合、毎年２５００００ドルをはるかに超える年間コストがかかり得る予防的治療を受けることを勧められている限り、このコストはますます高くなる可能性がある。約１００万ドルという生命保険の上限額が一般的に米国のほとんどの政策に結び付いていると考えると、血友病患者がケアのために購入することができる市販製品の量は厳しく制約され、このことが少なくとも成人期の生活の質に影響し、最悪の場合生死にかかわる出血の危険性が増大する。

ここ２５年来、バイオテクノロジーによって低コストのバイオ医薬品を製造する見込みが出てきている。不運なことに、主に天然の生体分子の固有の複雑性、及び遺伝子操作した細胞におけるこれらの組み換えタンパク質相当物の合成に関する様々な制限のために、この見込みは果たされていない。合成に対して選択される細胞型、例えば動物、細菌、酵母、昆虫、植物等にかからわず、タンパク質は、安全で効果的な治療用途のために或る特定の最小限の構造的特性を達成する必要がある。幾つかの場合では、組み換えタンパク質は合成後に正しく単純に折り畳まれ、適切な機能に必要な三次元構造を達成する必要がある。他の場合では、コアタンパク質が細胞内で合成された後に、組み換えタンパク質は広範な酵素指向性の翻訳後修飾を受ける必要がある。多くの細胞内酵素活性のいずれか１つにおける活性の欠如によって、大部分の非機能的なタンパク質が形成され、商業的用途を目的とするバイオ医薬品の経済的製造のための遺伝子操作した細胞系の実用性が制限され得る。

正常な血液凝固に必要な幾つかのタンパク質は、止血の制御、及び／又は血栓症の予防におけるタンパク質の全体的な有効性に必須である非常に明確な機能特性にそれぞれが関連する複数の構造ドメインを有するという点で非常に複雑である。特に、いわゆる「ビタミンＫ依存性」血液凝固タンパク質、例えば第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ及びプロテインＳは非常に複雑なタンパク質であり、正常な機能のために広範な翻訳後修飾を受ける必要がある。組み換え技術によって高レベルの機能的ビタミンＫ依存性タンパク質を達成することが、これらのタンパク質の構造の複雑性、及び効率的で完全な翻訳後修飾が起こるのに必要な酵素活性の固有の欠如を克服する遺伝子操作した細胞系を作製することができないことによって制限されている。

市販された最初の合成ビタミンＫ依存性血液凝固タンパク質は、遺伝子操作したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＢｅｎｅＦｉｘ、凝固第ＩＸ因子（組み換え）指向性挿入、Weyth Pharmaceuticals, Inc. Philadelphia, PA 19101 CI 8020-3 WI0483C007, Rev 10/05）から今日もなお製造されている第ＩＸ因子である。組み換え第ＩＸ因子はＣＨＯ細胞を用いて産生することができるが、この因子は適切にプロセシングされておらず、その結果患者に対するバイオアベイラビリティが可変であるので、血友病Ｂの治療としては最適ではない。適度なレベルの組み換え第ＩＸ因子タンパク質、例えば最大１８８ｍｇ／Ｌを遺伝子操作したＣＨＯ細胞によって発現することができるが、ｇｌａドメインと称されるタンパク質のアミノ末端領域において、最初の１２個のグルタミン酸残基を完全にγ−カルボキシル化するというＣＨＯ細胞の能力が限定されるために、産生される完全に機能的な第ＩＸ因子のレベルはわずか０．５ｍｇ／Ｌ程度である。第ＩＸ因子の翻訳後修飾のこの欠損に加えて、その後の研究によって、タンパク質の効果的な細胞内γ−カルボキシル化に必要なプロペプチドドメインを含有する第ＩＸ因子の形態であるプロ第ＩＸ因子（pro-Factor IX）は、ＣＨＯ細胞からの分泌前では完全にプロセシングされないことが示された。結果として、遺伝子操作したＣＨＯ細胞から分泌された半分を優に超え
る第ＩＸ因子が依然としてプロペプチド領域を含有し、非機能的であることが見出された（Bond, M., Jankowski, M., Patel, H., Karnik, S., Strand, A., Xu, B.,他（1998）著「組み換え第ＩＸ因子の生化学的特徴（Biochemical characterization of recombinant factor IX）」. Semin. Hematol. 35 [2 Suppl.2], 11-17）。

本願は、ビタミンＫ依存性タンパク質が活性であり、市販製品に対して十分な収率であるように適切にプロセシングされている第ＩＸ因子等のビタミンＫ依存性タンパク質を産生する方法の必要性に取り組む。血友病Ｂ等の出血性障害の治療に対する世界規模の医学的必要性を満たす、ビタミンＫ依存性血液凝固タンパク質のアベイラビリティを増大させるために、遺伝子操作した細胞からの完全に機能的なタンパク質、この例では第ＩＸ因子の産生の改善が要求される。具体的に、本質的に完全な翻訳後修飾を得るのに必要な酵素活性の欠如の同定及び追加が必要である。

本発明の実施の形態は、組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を製造する方法であって、哺乳動物細胞を、プロモータと作用可能に連結するビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも１つのプロモータと作用可能に連結するプロセシング因子をコードする少なくとも１つの遺伝子とで、同時に又は連続してトランスフェクトすること、及びビタミンＫ依存性タンパク質産物を回収することを含む、組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を製造する方法に関する。好ましくは、この細胞が、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌの量の生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を産生する。

好ましい実施の形態において、ビタミンＫ依存性タンパク質産物は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ又はプロテインＳである。より好ましくは、ビタミンＫ依存性タンパク質は第ＩＸ因子又は第ＶＩＩ因子である。

好ましい実施の形態において、プロセシング因子は、１つ又は複数のプロモータと作用可能に連結する、対になった塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）、ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）、ビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）、及びそれらの組合せから選択される核酸である。好ましくは、１つ又は複数のプロセシング因子タンパク質は、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌの組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物の産生を容易にするのに十分な量で産生される。より好ましくは、プロセシング因子タンパク質はＶＫＯＲ及びＶＫＧＣを含む。好ましくは、この遺伝子の少なくとも１つが過剰発現する。より好ましくは、過剰発現した遺伝子は、チャイニーズハムスター伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）プロモータと作用可能に連結する。

より好ましい実施の形態において、生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物のｇｌａドメイン内の少なくとも約７５％のグルタミン酸残基がγ−カルボキシル化する。

幾つかの好ましい実施の形態において、ビタミンＫ依存性タンパク質産物はビタミンＫ依存性タンパク質産物のプロペプチドにおいて欠失を有する。

幾つかの好ましい実施の形態において、ビタミンＫ依存性タンパク質産物は、ビタミンＫ依存性タンパク質産物とは異なるビタミンＫ依存性タンパク質由来である異種プロペプチド領域を含む。

好ましくは、少なくとも１０％の組み換えビタミンＫ依存性タンパク質が生物活性である。より好ましくは、少なくとも２０％のビタミンＫ依存性タンパク質が生物活性である。さらに好ましくは、少なくとも５０％のビタミンＫ依存性タンパク質が生物活性である
。さらに好ましくは、少なくとも８０％のビタミンＫ依存性タンパク質が生物活性である。

好ましい実施の形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞である。

好ましい実施の形態において、生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質は、少なくとも約２０ｍｇ／Ｌの量で産生される。より好ましくは、生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質が、少なくとも約３０ｍｇ／Ｌの量で産生される。より好ましくは、生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質が、少なくとも約５０ｍｇ／Ｌの量で産生される。

幾つかの好ましい実施の形態において、トランスフェクションが連続的であり、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることが、高レベルのビタミンＫ依存性タンパク質産物又はプロセシング因子を発現する細胞を選択すること、選択された細胞をクローン化すること、及びクローン化した細胞を増幅することをさらに含む。幾つかの好ましい実施の形態では、プロセシング因子をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程が、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程の前に行なわれる。代替的に好ましい実施の形態では、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程が、プロセシング因子をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程の前に行なわれる。

好ましい実施の形態において、哺乳動物細胞は、トランスフェクション前に、内因性レベルの１つ又は複数のプロセシング因子の発現に対して選択される。

本発明の実施の形態は、プロモータと作用可能に連結するビタミンＫ依存性タンパク質に対する遺伝子と、少なくとも１つのプロモータと作用可能に連結する少なくとも１つのプロセシング因子に対する遺伝子とを含む組み換え哺乳動物細胞に関する。この細胞において、少なくとも１つのプロセシング因子に対する遺伝子によってコードされたタンパク質の発現が、好ましくは少なくとも約１５ｍｇ／Ｌの量の生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質の産生を容易にする。

好ましくは、ビタミンＫ依存性タンパク質は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ又はプロテインＳである。より好ましくは、ビタミンＫ依存性タンパク質は第ＩＸ因子又は第ＶＩＩ因子である。

好ましい実施の形態において、プロセシング因子は、上記細胞における発現に対する、１つ又は複数のプロモータと作用可能に連結する、ＰＡＣＥ、ＶＫＯＲ、ＶＫＧＣ及びそれらの組合せから選択されるプロセシング遺伝子産物を産生する遺伝子である。より好ましくは、プロセシング因子はＶＫＯＲ及びＶＫＧＣを含む。好ましくは、少なくとも１つのプロセシング遺伝子産物が、同じ系統のトランスフェクトしていない正常な細胞において見られたものよりも高いレベルで発現される。より好ましくは、過剰発現した遺伝子産物が、チャイニーズハムスター伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）プロモータと作用可能に連結する。

好ましい実施の形態において、非修飾ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子によってコードされるビタミンＫ依存性タンパク質を発現する細胞から産生されるビタミンＫ依存性タンパク質に存在するカルボキシル化グルタミン酸残基の割合と比較して、カルボキシル化されるグルタミン酸残基の割合が増大するように、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子を修飾する。

幾つかの好ましい実施の形態において、修飾は、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子のプロペプチド領域における欠失を含む。

幾つかの好ましい実施の形態において、修飾は、ビタミンＫ依存性タンパク質のプロペプチド領域の、異種ビタミンＫ依存性タンパク質由来の異種プロペプチド領域への置換を含む。

好ましくは、組み換え哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞である。

幾つかの好ましい実施の形態において、対応する血漿由来のビタミンＫ依存性タンパク質に存在する硫酸化レベルを少なくとも２５％、及びリン酸化レベルを少なくとも２５％含有するように翻訳後修飾されるアミノ酸から成るビタミンＫ依存性タンパク質を産生することができる天然の修飾酵素を含有する特異的組織培養細胞株の変異体を選択することによって、ビタミンＫ依存性タンパク質に対する遺伝子のトランスフェクションに用いる細胞を事前に選択する。好ましくは、ビタミンＫ依存性タンパク質は第ＩＸ因子である。

好ましい実施の形態において、組み換え第ＩＸ因子タンパク質は、本明細書中に記載される方法工程のうち１つ又は複数の工程によって産生される。より好ましくは、記載される方法によって産生される組み換え第ＩＸ因子タンパク質は薬学的組成物に含まれる。幾つかの好ましい実施の形態は、本明細書中に記載される方法に従って産生された組み換え第ＩＸ因子タンパク質を備えるキットに関する。好ましくは、効果的な量の組み換え第ＩＸ因子タンパク質を、それを必要とする患者に投与することによって、血友病を治療する方法で組み換え第ＩＸ因子タンパク質を用いる。

好ましい実施の形態は、組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を製造する方法であって、
（ａ）哺乳動物細胞を、プロモータと作用可能に連結するビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程、
（ｂ）高レベルのビタミンＫ依存性タンパク質産物を発現する細胞を選択する工程、
（ｃ）選択された細胞を、プロモータと作用可能に連結する１つ又は複数のプロセシング因子でトランスフェクトする工程、
（ｄ）工程（ｂ）を繰り返す工程、
（ｅ）任意で、工程（ａ）及び／又は工程（ｃ）の後に工程（ｂ）を繰り返す工程、
（ｆ）選択された細胞をクローン化する工程、
（ｇ）クローン化した細胞を増幅する工程、並びに
（ｈ）少なくとも１５ｍｇ／Ｌの量の組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質でクローン化した細胞から産物を回収する工程、
を含む、組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を製造する方法に関する。

本発明のさらなる態様、特徴及び利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになる。

次に本発明のこれら及び他の特徴が好ましい実施形態（本発明を例示することを意図し、限定することは意図しない）の図面を参照して説明される。

記載の実施形態が本発明の好ましい実施形態を表すが、本発明の精神を逸脱することなく、当業者には変更形態が思い浮かぶことが理解される。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ確定される。

本発明の好ましい実施形態は、世界規模の商業化に適切な量で高い割合の生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質を産生する遺伝子操作した細胞を作製する方法に関する。本発明の実施形態は、第ＩＸ因子の産生に関して記載されている。しかし、開示された方法は、全てのビタミンＫ依存性タンパク質に適用可能である。

世界規模の商業的使用のために低コストでビタミンＫ依存性タンパク質生物学的治療薬を製造するために、遺伝子操作した細胞は、（１）大量の所望の一次構造を有するポリペプチド鎖を産生し、（２）完全に機能的な合成バイオ医薬品を製造するのに必要な全ての必須の翻訳後修飾を効率的に行うことができる製造のために作製される必要がある。

本明細書中で用いられるような「商業的使用」という用語は、組織培養細胞から産生される場合に、少なくとも１０％が生物活性であり、少なくとも約３０ｍｇ／Ｌのレベルで産生することができる第ＩＸ因子又は他のビタミンＫ依存性タンパク質を意味する。

本明細書中で用いられるような「生物活性」は、ヒト血漿、例えばＭＯＮＯＮＩＮＥ（登録商標）（ZLB Behring）由来の第ＩＸ因子標準を参照して求められる。第ＩＸ因子標準の生物活性を１００％にとる。好ましくは、本発明の実施形態による第ＩＸ因子は、第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも２０％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも２５％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも３０％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも３５％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも４０％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも４５％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも５０％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも５５％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも６０％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも６５％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも７０％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも７５％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも８０％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも８５％、より好ましくは第ＩＸ因子標準の活性の少なくとも９０％を有する。

本発明によるビタミンＫ依存性タンパク質は、生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質の少なくとも約２０ｍｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約５０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約６０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約７０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約８０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約９０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１１０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１２０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１３０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１４０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１６０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１７０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１８０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１９０ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも約２１０ｍｇ／Ｌのレベルで産生することができる。

「プロセシング因子」という用語は、機能的なビタミンＫ依存性タンパク質の形成を促進する任意のタンパク質、ペプチド、非ペプチド補因子、基質又は核酸を含む広い用語である。このようなプロセシング因子の例としては、ＰＡＣＥ、ＶＫＯＲ及びＶＫＧＣが挙げられるが、これらに限定されない。

「限界希釈クローン化」は通常の従来的な意味を有し、ポリクローナル集団の細胞から始まってモノクローナル細胞集団を得るプロセスを表す。モノクローナル培養物が得られ
るまで、開始（ポリクローナル）培養物を段階希釈する。

Genetics Instituteによって、大量のビタミンＫ依存性タンパク質の産生が遺伝子操作したＣＨＯ細胞で可能であるが（米国特許第４，７７０，９９９号）、完全に機能的なタンパク質の割合は非常に低いことが示されている。本発明の目的は、完全に機能的なタンパク質の割合が世界規模での商業的使用のために、低コストでバイオ医薬品を製造するのに適切である、大量のビタミンＫ依存性タンパク質を産生する遺伝子操作したＣＨＯ細胞である。

Stafford（米国特許第５，２６８，２７５号）は、高い割合のγ−カルボキシル化ビタミンＫ依存性タンパク質の産生が、ビタミンＫ依存性タンパク質のカルボキシル化を高める酵素を同時に発現するように作製される遺伝子操作したＨＥＫ２９３細胞において可能であるが、産生されるγ−カルボキシル化タンパク質の全量が非常に低いことを示している。本発明の目的は、完全に機能的なタンパク質の割合が、世界規模の商業的使用のために低コストでバイオ医薬品を製造するのに適切である、遺伝子操作したＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞又は大量のビタミンＫ依存性タンパク質を産生する他の細胞である。

大量の組み換えタンパク質を発現する遺伝子操作した細胞を作製する多くのトランスフェクション法が既知である。例えば、モノクローナル抗体は、１０００ｍｇ／Ｌを超えるレベルでタンパク質を発現する遺伝子操作した細胞から日常的に製造される。本発明は、遺伝子操作した細胞を作製するのに用いられ得る任意の具体的なトランスフェクション法に依存しない。

多くの発現ベクターを用いて、遺伝子操作した細胞を作製することができる。選択され強く発現された細胞を好む様々な条件下で、トランスフェクトした細胞の増幅後に、大量の組み換えタンパク質を発現するように、幾つかの発現ベクターを設計する。選択圧下で増幅の必要なく、大量の組み換えタンパク質を発現するように、幾つかの発現ベクターを設計する。本発明は、任意の具体的な発現ベクターの使用に依存しない。

遺伝子操作した細胞を作製し、大量の所定のビタミンＫ依存性タンパク質を産生するために、タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有する発現ベクターで細胞をトランスフェクトする。本発明は、最適培養条件下で最低でも２０ｍｇ／Ｌの標的ビタミンＫ依存性タンパク質を産生することができる、トランスフェクトした細胞が作製されることを要求する。より高レベルの標的ビタミンＫ依存性タンパク質の産生が達成される可能性があり、本発明において有用であり得る。しかし、標的ビタミンＫ依存性タンパク質の最適な産生レベルは、標的タンパク質が、所定の細胞系で起こる標的タンパク質の適切な翻訳後修飾を引き起こす選択された同時トランスフェクト酵素によって発現される場合、有意に増大した機能的形態で得ることができる２０ｍｇ／Ｌ以上のレベルである。

完全に機能的な合成バイオ医薬品を製造するのに必要である全ての必須の翻訳後修飾を効率的に行うことができる遺伝子操作した細胞を作製するために、選択された酵素は、ビタミンＫ依存性タンパク質と同時にトランスフェクトされる。Genetics Instituteによって、大量のビタミンＫ依存性タンパク質（第ＩＸ因子）を産生する遺伝子操作したＣＨＯ細胞が、分泌前にはプロペプチド領域を取り除くように適切にプロセシングされていないことが示されている。この場合、Genetics Instituteによって、プロペプチド領域をビタミンＫ依存性タンパク質から取り除くことが知られている酵素（ＰＡＣＥ）の同時発現が内因性細胞レベルの酵素の欠損を実質的に排除することが見出されている。しかし、Genetics Instituteは、内因性レベルの他の酵素の欠損によって、ｇｌａドメインの翻訳後のγ−カルボキシル化の割合が低いために、大部分のビタミンＫ依存性タンパク質が非機能的な遺伝子操作したＣＨＯ細胞によって産生されることも示している（Bond, M., Jankow
ski, M., Patel, H., Karnik, S., Strand, A., Xu, B.,他（1998）著「組み換え第ＩＸ因子の生化学的特徴（Biochemical characterization of recombinant factor IX）」 Semin. Hematol. 35 [2 Suppl.2], 11- 17）。

本発明の方法は、大量のビタミンＫ依存性タンパク質、例えば第ＩＸ因子を産生するように遺伝子操作することができる細胞の一次選択に関する。

細胞は、様々な供給源から選択することができるが、もしそうでなければビタミンＫ依存性タンパク質の核酸、好ましくはｃＤＮＡを含有する発現ベクターでトランスフェクトすることができる細胞である。

トランスフェクトした細胞のプールから、市販製品の製造に最低限許容可能である最も高いレベルから最も低いレベルまで広がる範囲（標的範囲）で、大量のビタミンＫ依存性タンパク質を産生するクローンを選択する。標的範囲内で大量のビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞クローンを混合し、クローンを、標的範囲内の高、中、又は低レベルのビタミンＫ依存性タンパク質を産生するクローンの集団に分ける単一プール又は複数のサブプールを得てもよい。

標的範囲内のビタミンＫ依存性タンパク質を産生するトランスフェクトした細胞を分析し、完全に機能的なタンパク質が産生される範囲を求めることができることは、本発明の範囲内であると考えられる。このような分析によって、完全に機能的なタンパク質の産生を制限する特異的な酵素の欠損に対する見識が与えられる。さらに、標的範囲内の高、中、又は低レベルのビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞クローンから成るサブプールの分析は、様々なレベルのビタミンＫ依存性タンパク質の産生で完全に機能的なタンパク質の産生を限定する特異的な酵素の欠損に対する見識を与えることが予想される。細胞クローン単一プールで又はサブプールで行われるかにかかわらず、このような分析によって、完全に機能的なタンパク質を産生するために排除する必要がある特異的な酵素の欠損が示され得る。

標的範囲内の完全に機能的なビタミンＫ依存性タンパク質の産生を制限するトランスフェクトしたクローンのプール内における酵素の欠損を排除するために、本発明の実施形態は、細胞クローンによって発現される場合に全体で又は部分的に酵素の欠損を軽減させる核酸、好ましくはタンパク質に対するｃＤＮＡを含有する発現ベクターによる細胞プールのトランスフェクションを提供する。好ましい実施形態では、２つ以上の酵素の欠損が軽減され得るか、又はビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾における欠損の軽減には、所定のタンパク質に対するｃＤＮＡを含有するさらなる発現ベクターによる細胞クローンの同時又は後（連続）トランスフェクションによって本発明の方法で与えられ得る２つ以上の酵素又はタンパク質又は他のプロセシング因子の活性の存在を必要とすることがさらに考慮される。

幾つかの実施形態において、宿主細胞は１つ又は複数のプロセシング因子をコードする遺伝子で最初にトランスフェクトし、その後ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトし得る。幾つかの実施形態では、宿主細胞はビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子で最初にトランスフェクトし、その後１つ又は複数のプロセシング因子でトランスフェクトされる。任意で、宿主細胞はプロセシング因子に対する遺伝子で、又は初期導入遺伝子と同じ、若しくは実質的に同じであるビタミンＫ依存性タンパク質に対する遺伝子でトランスフェクトし得る。それぞれのトランスフェクション後に、最適レベルの導入遺伝子を発現するクローンが選択される。

幾つかの好ましい実施形態において、このようなタンパク質の１つがビタミンＫエポキ
シド還元酵素（ＶＫＯＲ）の酵素活性を有する。幾つかの好ましい実施形態では、このような酵素の別の１つがビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）の酵素活性を有する。幾つかの好ましい実施形態では、このような酵素の別の１つが対になったアミノ酸切断酵素、すなわちＰＡＣＥ又はフリンの酵素活性を有する。

本発明の目的は、標的範囲内の量でビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞クローンから高い割合の完全に機能的なビタミンＫ依存性タンパク質を得るためのタンパク質トランスフェクションの最低必要条件を同定する方法を提供することである。

本発明の好ましい実施形態において、その後標的範囲内のビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞クローンのプールをトランスフェクトし、様々な組合せで特異的なタンパク質又は複数のタンパク質を提供する。それから、トランスフェクトした細胞クローンのプールを分析し、様々なタンパク質を同時に発現するトランスフェクタントプールによってこれより産生される完全に機能的なビタミンＫ依存性タンパク質の相対的な割合を求める。最小数の同時発現したタンパク質で、最も高い割合の完全に機能的なビタミンＫ依存性タンパク質を産生するトランスフェクタントプールが、その後のクローン化に対して選択される。

本発明の好ましい実施形態において、選択されたトランスフェクタントプールをクローン化して、さらなるタンパク質の同時発現によって達成される完全に機能的なビタミンＫ依存性タンパク質の産生の最適レベルを求める。より高い割合の完全に機能的なビタミンＫ依存性タンパク質は、標的範囲内で全量がより少ないビタミンＫ依存性タンパク質を産生する細胞クローンによって産生されることが考慮される。幾つかの実施形態では、幾つかの細胞クローンは、翻訳後プロセシングでの有意な改善なしで、ビタミンＫ依存性タンパク質を過剰に産生するもの（superproducer）であり得る。それにもかかわらず、全体的な産生レベルが高いので、このような過剰に産生するものの系統は有効量の機能的なタンパク質を産生する。好ましい実施形態では、産生の最適レベルは機能的なビタミンＫ依存性タンパク質の最大レベルである。

本発明の実施は、他に示されない限り、当該技術分野の範囲内である、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を利用する。このような技法は文献で完全に説明される。例えば、Sambrook他著、「分子クローニング：研究室用マニュアル（Molecular Cloning; A Laboratory Manual）」第２版（1989）、「ＤＮＡクローニング（DNA Cloning）」, Vols. I and II（D. N Glover編（1985））、「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」（M. J. Gait編（1984））、「核酸ハイブリダイゼーション（Nucleic Acid Hybridization）」（B. D. Hames & S. J. Higgins編（1984））、「転写及び翻訳（Transcription and Translation）」（B. D. Hames & S. J. Higgins編（1984））、「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」（R. I. Freshney編（1986））、「固定化細胞及び酵素（Immobilized Cells and Enzymes）」（IRL Press, 1986）、B. Perbal著、「分子クローニングの実践ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）」（1984）、酵素学の方法（Methods in Enzymology）のシリーズ（Academic Press, Inc.）、特にVols. 154 and 155（それぞれWu及びGrossman並びにWu編）、「哺乳動物細胞に対する遺伝子導入ベクター（Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells）」（J. H. Miller and M. P. Calos編 1987, Cold Spring Harbor Laboratory）、「細胞及び分子生物学の免疫化学的方法（Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology）」、Mayer and Walker編（Academic Press, London, 1987）、Scopes著、「タンパク質精製：原理と実践（Protein Purification: Principles and Practice）」第２版（1987）（Springer-Verlag, N. Y.）、及び「実験免疫学便覧（Handbook of Experimental Immunology）」Vols I-IV（D. M. Weir and C. C. Blackwell編（1986））を参照されたい。背景技術及び本明細書に引用される（cited in the background and specification）全
ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照によって本明細書に援用される。

プロペプチドの修飾
幾つかの実施形態において、γ−カルボキシル化は、米国特許出願第２００３／０２２０２４７号（参照により本明細書中に援用される）に記載されるように、天然のプロペプチド配列をγ−カルボキシラーゼに対して低親和性であるプロペプチド配列で置き換えることによって増大される。有用なプロペプチド配列としては、異種ビタミンＫ依存性タンパク質に対する代替形態の野生型配列若しくはプロペプチド配列、又はその組合せが挙げられる。ビタミンＫ依存性タンパク質のプロペプチド配列はタンパク質のγ−カルボキシル化を導く酵素に対する認識因子である。ビタミンＫ依存性タンパク質が高い割合のγ−カルボキシル化部分を含まない場合、ビタミンＫ依存性タンパク質は完全に機能的ではない。したがって、これらのタンパク質の組み換え型が生じる際にその完全なγ−カルボキシル化を確実にするように機構が整備されることが重要である。

幾つかのプロペプチド配列の配列アライメントは米国特許出願第２００３／０２２０２４７号の図３に示されている。したがって、本発明に有用であるプロペプチドは図３で示される配列を有するものであり、幾つかの有用なプロペプチドの１８アミノ酸配列が、γ−カルボキシラーゼに対するこれらのプロペプチドの相対親和性と共に示される。低親和性のプロペプチドは、プロトロンビン又はプロテインＣの９位のアミノ酸又は１３位のアミノ酸のいずれか１つを修飾することによって生成することができる。好ましい修飾としては、９位のＡｒｇ残基又はＨｉｓ残基の置換、及び１３位のＰｒｏ残基又はＳｅｒ残基の置換が挙げられる。他の好ましいキメラタンパク質としては、修飾された第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、プロテインＳ、プロテインＣ及びプロトロンビン、又は選択されたプロペプチド配列由来ではない成熟したビタミンＫ依存性タンパク質と組合せた非修飾プロペプチドから成る群より選択されるプロペプチドが挙げられる。

「完全なγ−カルボキシル化タンパク質」という用語は、γ−カルボキシル化される必要があるアミノ酸の少なくとも約８０％がカルボキシル化されるタンパク質を表すのに本明細書中で用いられる。好ましくは、γ−カルボキシル化される必要があるアミノ酸の少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、及びさらに好ましくは少なくとも約９９％がγ−カルボキシル化される。

対になった塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）
本明細書中で用いられるように、「ＰＡＣＥ」という用語は対になった塩基性アミノ酸変換（又は切断）酵素の頭文字である。元々はヒト肝細胞株から単離されたＰＡＣＥはサブチリシン様エンドペプチダーゼ、すなわちポリペプチドの塩基性残基、例えば−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ、又は−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−での切断に対して特異性を示すプロペプチド切断酵素である。ＰＡＣＥはカルシウムイオンによって刺激され、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によって阻害される。ＰＡＣＥ（又はフリン）をコードするＤＮＡ配列が、米国特許第５，４６０，９５０号（参照により本明細書中に援用される）の図１（配列番号１）で表される。ＰＡＣＥと、成熟タンパク質の産生にプロセシングが必要な前駆タンパク質との同時発現によって、成熟タンパク質が高レベルで発現される。さらに、ＰＡＣＥと、生物活性にγ−カルボキシル化が必要なタンパク質との同時発現によって、真核生物、好ましくは哺乳動物の細胞において高収率の機能的な生物活性成熟タンパク質が発現される。

ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素
ビタミンＫが補因子である反応中に、ビタミンＫがビタミンＫエポキシドに変換されるので、ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）はビタミンＫ依存性タンパク質に重要である。ヒトの食事におけるビタミンＫの量は制限される。したがって、ビタミン
Ｋエポキシドは、枯渇を防ぐためにＶＫＯＲによってビタミンＫに戻し変換させる必要がある。結果として、ＶＫＯＲによる同時トランスフェクションによって、ビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＣＧ）等のビタミンＫ依存性酵素を適切に機能させるのに十分なビタミンＫが与えられる。ビタミンＫ依存性ＶＫＣＧの適切な機能は、ビタミンＫ依存性凝固因子のｇｌａドメインの適切なγ−カルボキシル化に不可欠である。

ビタミンＫ依存性γ−カルボキシラーゼ
ビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）は、ビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾に関与するＥＲ酵素である。ＶＫＧＣによって、ＣＯ₂がグルタミン酸に取り込まれ、プロペプチドの約４０残基内のビタミン依存性タンパク質内の複数の残基を修飾する。３つのカルボキシル化の喪失によって、ビタミンＫ依存性凝固因子等のビタミンＫ依存性タンパク質の活性が顕著に低減される。ヒトのビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼに対するｃＤＮＡ配列は、米国特許第５，２６８，２７５号（参照により本明細書中に援用される）に記載される。この配列は、米国特許第５，２６８，２７５号の配列番号１５で与えられる。

遺伝子操作技法
遺伝子操作によるクローン遺伝子、組み換えＤＮＡ、ベクター、形質転換宿主細胞、タンパク質、及びタンパク質断片の産生は既知である。たとえば、Bell他への米国特許第４，７６１，３７１号の第６欄３行目〜第９欄６５行目、Clark他への米国特許第４，８７７，７２９号の第４欄３８行目〜第７欄６行目、Schillingへの米国特許第４，９１２，０３８号の第３欄２６行目〜第１４欄１２行目、及びWallnerへの米国特許第４，８７９，２２４号の第６欄８行目〜第８欄５９行目を参照されたい。

ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物である。本明細書中では、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するのに、及び／又はビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡを発現するのにベクターを用いる。発現ベクターは、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡ配列が、好適な宿主においてビタミンＫ依存性タンパク質の発現をもたらすことができる好適な制御配列と操作可能に連結する、複製可能なＤＮＡ構築物である。このような制御配列に対する必要性は選択された宿主及び選ばれた形質転換法によって変わる。一般的に、制御配列には、転写プロモータ、制御転写に対する任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を制御する配列が含まれる。

増幅ベクターは発現制御ドメインを必要としない。通常、複製起点によって与えられる宿主における複製能、及び形質転換体の認識を容易にさせる選択遺伝子があれば十分である。

ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、及び統合可能なＤＮＡ断片（すなわち、組み換えによって宿主ゲノムに統合可能な断片）を含む。ベクターは、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能するか、又は場合によってはゲノム自身に統合されることもある。発現ベクターは、プロモータ及び発現される遺伝子と操作可能に連結され、宿主生物において操作可能なＲＮＡ結合部位を含有する必要がある。

ＤＮＡ領域は互いに機能的に関連する場合、操作可能に連結するか、又は操作可能に結び付く。例えば、プロモータが配列の転写を制御する場合、コード配列と操作可能に連結し、又はリボソーム結合部位が翻訳させるように位置付られている場合、コード配列と操作可能に連結している。

形質転換した宿主細胞は、組み換えＤＮＡ技法を用いて構築した１つ又は複数のビタミンＫ依存性タンパク質ベクターによって形質転換又はトランスフェクトしている細胞である。

複数のタンパク質の発現
本発明の実施形態は、より高収率の生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質が達成されるように、ビタミンＫ依存性タンパク質をプロセシングするのに必要な酵素及び補因子を細胞に与えることに関する。適切なレベルの完全に機能的なビタミンＫ依存性タンパク質が組み換え細胞によって産生される場合、所望の産物から不要の部分修飾、又は非修飾のビタミンＫ依存性タンパク質を取り除くように設計された長期にわたる精製工程が避けられる。このことによって製造コストが抑えられ、患者にとって望ましくない副作用を有し得る不活性材料が排除される。

好ましい実施形態において、ＰＡＣＥ、ＶＫＧＣ及び／又はＶＫＯＲによる同時発現によってビタミンＫ依存性タンパク質を産生する方法としては、以下の技法が挙げられ得る。最初に、ＰＡＣＥ及びビタミンＫ依存性タンパク質等の２つ以上のタンパク質に対するコード配列を含有する単一ベクターを選択された宿主細胞に挿入することができる。代替的に、ビタミンＫ依存性タンパク質と１つ又は複数の他のタンパク質とをコードする２つ以上の個々のベクターを宿主に挿入することができる。選択された宿主細胞に好適な条件下での培養の際に、２つ以上のポリペプチドが産生され相互作用して、前駆タンパク質の成熟タンパク質への切断及び修飾が提供される。

別の代替方法は２つの形質転換した宿主細胞の使用であり、この内の１つの宿主細胞はビタミンＫ依存性タンパク質を発現し、もう１つの宿主細胞は、培地に分泌される１つ又は複数のＰＡＣＥ、ＶＫＧＣ及び／又はＶＫＯＲを発現する。これらの宿主細胞は、組み換えビタミンＫ依存性タンパク質及び同時に発現した組み換えポリペプチドの発現、及び分泌又は放出、例えば細胞外ＰＡＣＥによる成熟形態への切断、及びＮ末端のグルタミン酸のγ−カルボキシル化を可能にする条件下で同時に培養することができる。この方法では、ＰＡＣＥポリペプチドが培地に分泌されるように膜貫通ドメインを欠失していることが好ましい。

場合によっては、複数のコピー、他の遺伝子に関してビタミンＫ依存性タンパク質を発現する２つ以上の遺伝子を有することが望ましい場合もあり、又はその逆も同様である（vice versa）。このことは様々な形で達成することができる。例えば、ポリヌクレオチドをコードするビタミンＫ依存性タンパク質を含有するベクターが、他のポリヌクレオチド配列を含有するベクターよりも高いコピー数を有する場合、個々のベクター又はプラスミドを用いてもよく、又はその逆も同様である。この状況では、宿主におけるプラスミドの連続維持を確実にするように、２つのプラスミドに対して異なる選択可能なマーカーを有することが望ましい。代替的に、１つ又は両方の遺伝子を宿主ゲノムに統合することができ、この遺伝子の１つを増幅遺伝子（例えば、ｄｈｆｒ又はメタロチオネイン遺伝子の１つ）と結び付けることができる。

代替的には、様々な転写開始速度を有する２つの転写調節領域を利用することができ、ビタミンＫ依存性タンパク質の発現の増大、又はビタミンＫ依存性タンパク質に対する任意の他のプロセシング因子ポリペプチドの発現のいずれかが提供される。別の代替方法として、１つのプロモータは構成的発現が低レベルなビタミンＫ依存性タンパク質を提供するが、第２のプロモータは他の産物の高レベルの誘導発現を提供する。多種多様のプロモータ、例えば既知の哺乳動物プロモータであるＣＭＶ、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０又はＳＲαプロモータが選択された宿主細胞に対して知られており、当業者によって本発明で容易に選
択及び利用することができる。

好ましい実施形態において、チャイニーズハムスター由来の伸長因子−１α（ＣＨＥＦ１）に対するプロモータを用いて、高レベル発現のビタミンＫ依存性凝固因子及び／又はプロセシング因子を提供する。ＣＨＥＦ１ベクターは、Deer他（2004）著「チャイニーズハムスターＥＦ−１α遺伝子由来の転写調節配列を用いた哺乳動物細胞におけるタンパク質の高レベルの発現（High-level expression of proteins in mammalian cells using transcription regulatory sequences from the Chinese Hamster EF-1α gene）」（Biotechnol. Prog. 20: 880-889）及び米国特許第５，８８８，８０９号（参照により本明細書中に援用される）に記載されるように用いられる。ＣＨＥＦ１ベクターはチャイニーズハムスターＥＦ−１α由来の５’及び３’のフランキング配列を利用する。ＣＨＥＦ１プロモータ配列には、ＥＦ−１αタンパク質のＳｐｅＩ制限部位から開始メチオニン（ＡＴＧ）コドンに広がる約３．７ｋｂのＤＮＡが含まれる。ＤＮＡ配列は米国特許第５，８８８，８０９号の配列番号１に記載される。

第ＩＸ因子等の生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質の産生は、１つ又は複数のＰＡＣＥ、ＶＫＯＲ、及び／若しくはＶＫＧＣの過剰発現によって、並びに／又はγ−カルボキシル化を最大にするｇｌａ領域の修飾によって最大になる。すなわち、律速成分は、商業的に実現可能な量のビタミンＫ依存性タンパク質を産生するようにシステム全体が働くのに十分な量で発現される。

宿主細胞
好適な宿主細胞としては、原核生物、酵母又はより高等な真核生物の細胞、例えば哺乳動物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。多細胞生物由来の細胞は、組み換えビタミンＫ依存性タンパク質の合成に特に好適な宿主であり、哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞培養下でのこのような細胞の増殖は決められた手順になっている（Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors （1973））。有用な宿主細胞株の例はＶＥＲＯ細胞及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、並びにＷＩ１３８、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＶ、及びＭＤＣＫ細胞株である。このような細胞に対する発現ベクターには通常、（必要であれば）複製起点、リボソーム結合部位と共に、発現するビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡの上流に位置し、操作可能に結び付くプロモータ、ＲＮＡスプライシング部位（イントロン含有ゲノムＤＮＡを用いる場合）、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列が含まれる。好ましい実施形態では、米国特許第５，８８８，８０９号（参照により本明細書中に援用される）の発現系を用いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現が行われる。

形質転換する脊椎動物細胞で用いられる発現ベクターにおける転写制御配列及び翻訳制御配列は、ウイルス源によって与えられることが多い。例えば、一般的に用いられるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス２、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。例えば、米国特許第４，５９９，３０８号を参照されたい。

複製起点は、ＳＶ４０又は他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、又はＢＰＶ）源に由来し得る、又は宿主細胞の染色体複製機構によって与えられ得るように、外因性の起点を含むベクターの構成によって与えられ得る。ベクターが宿主細胞の染色体に統合される場合、後者は十分条件であることが多い。

ウイルス複製起点を含有するベクターを用いることよりむしろ、選択可能なマーカー及びビタミンＫ依存性タンパク質に対するＤＮＡによる同時トランスフェクトの方法によって哺乳動物細胞を形質転換することができる。好適な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）又はチミジンキナーゼである。この方法は、米国特許第４，
３９９,２１６号（参照により援用される）にさらに記載される。

組み換え脊椎動物細胞の培養下でのビタミンＫ依存性タンパク質の合成に適用させるのに好適な他の方法としては、M-J. Gething他, Nature 293, 620 （1981）、N. Mantei他,
Nature 281, 40、A. Levinson他, 欧州特許出願第１１７，０６０Ａ号及び同第１１７，０５８Ａ号に記載されるものが挙げられる。

昆虫細胞（例えば、培養スポドブテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞）等の宿主細胞、及びバキュロウイルス発現ベクター（例えばオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）ＭＮＰＶ、キンウワバ（Trichoplusia ni）ＭＮＰＶ、ラキプルシア・オウ（Rachiplusia ou）ＭＮＰＶ、ガレリア・オウ（Galleria ou）ＭＮＰＶ）等の発現ベクターは、Smith他への米国特許第４，７４５，０５１号及び同第４，８７９，２３６号に記載されるように、本発明を行うのに利用され得る。概して、バキュロウイルス発現ベクターは、バキュロウイルスポリヘドリンプロモータの転写制御下で、ポリへドリン転写開始シグナルからＡＴＧ開始部位に及ぶ位置でポリへドリン遺伝子に挿入される発現遺伝子を含有するバキュロウイルスゲノムを含む。

原核生物宿主細胞としては、グラム陰性生物又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Escherichia coli）（Ｅ．コリ）又はバチルスが挙げられる。より高等な真核生物細胞としては、以下で記載されるような哺乳動物由来の樹立細胞株が挙げられる。例示的な宿主細胞は、Ｅ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、Ｅ．コリ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）である。広範の好適な原核生物及び微生物のベクターが利用可能である。Ｅ．コリは典型的にｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。組み換え微生物発現ベクターで最も一般的に用いられるプロモータとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモータ系（Chang 他, Nature 275, 615 （1978）、及びGoeddel他, Nature 281, 544 （1979））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ系（Goeddel他, Nucleic Acids Res. 8, 4057 （1980）及び欧州特許出願公開第３６，７７６号）並びにｔａｃプロモータ（H. De Boer他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21 （1983））が挙げられる。プロモータ及びシャイン−ダルガーノ配列（原核生物の宿主発現に対する）は、ビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡと操作可能に連結し、すなわちこれらはビタミンＫ依存性タンパク質のＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように位置付けされる。

酵母培養物等の真核微生物は、ビタミンＫ依存性タンパク質コード化ベクターで形質転換してもよい。例えば、米国特許第４，７４５，０５７号を参照されたい。他の多くの株が一般的に利用可能であるが、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、より下等な真核生物の宿主微生物の中で最も一般的に用いられる。酵母ベクターは、２ミクロンの酵母プラスミド又は自己複製配列（ＡＲＳ）由来の複製起点、プロモータ、１つ又は複数のビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化及び転写終結に対する配列、並びに選択遺伝子を含有し得る。例示的なプラスミドはＹＲｐ７である（Stinchcomb他, Nature 282, 39 （1979）、Kingsman他, Gene 7, 141 （1979）、Tschemper他, Gene 10, 157 （1980））。酵母ベクターにおける好適な促進配列としては、メタロチオネインに対するプロモータ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman他, J. Biol. Chem. 255, 2073 （1980））又は他の糖分解酵素（Hess他, J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 （1968）、及びHolland他, Biochemistry 17, 4900 （1978））が挙げられる。酵母の発現における使用に好適なベクター及びプロモータは、R. Hitzeman他の欧州特許出願公開第７３，６５７号にさらに記載される。

本発明のクローン化遺伝子は、任意の起源種、例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、ブタ、及びヒトをコードし得るが、好ましくはヒト由来のビタミンＫ依存性タンパク質を
コードし得る。本明細書中に開示されるタンパク質をコードするＤＮＡでハイブリダイズ可能なビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡも包含される。このような配列のハイブリダイゼーションは、低減したストリンジェント条件、又はストリンジェントな条件（例えば標準的なｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイにおける本明細書中で開示されるビタミンＫ依存性タンパク質をコードするＤＮＡに対する６０℃又はさらに７０℃での０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳの洗浄ストリンジェンシー（wash stringency）で表される条件）下であっても行うことができる。J. Sambrook他著「分子クローン化、研究所マニュアル）（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）（第２版）（1989）（Cold Spring Harbor Laboratory））。

上記のように、本発明の好ましい実施形態は、Ｎ末端のｇｌｕ残基のカルボキシル化を含む方法によって、機能的なビタミンＫ依存性タンパク質を与える方法を提供する。戦略には、単一の宿主細胞において、ＶＫＯＲ、ＶＫＧＣ及び／又はＰＡＣＥと共にビタミンＫ依存性タンパク質を同時発現することが含まれ得る。概して、この方法は、ビタミンＫ依存性タンパク質及び支持タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること、及びそれからタンパク質を培養物から回収することを含む。幾つかの宿主細胞は、基礎レベルで幾つかのビタミンＫ依存性タンパク質、ＶＫＯＲ、ＶＫＧＣ及び／又はＰＡＣＥを与えることができるが、好ましい実施形態では、カルボキシル化を高める、ＰＡＣＥ、ＶＫＧＣ及び／又はＶＫＯＲをコードするベクターＤＮＡが含まれる。培養は、培養培地を用いて、選択された特定の宿主細胞によるビタミンＫ依存性タンパク質の発現に適切な条件下で任意の好適な発酵容器中で行うことができる。培養物から回収したビタミンＫ依存性タンパク質は、宿主細胞における支持タンパク質の発現によってカルボキシル化されることが見出される。好ましい実施形態では、ビタミンＫ依存性タンパク質は、培養培地、又は溶解された宿主細胞及び宿主細胞から回収されたビタミンＫ依存性タンパク質から直接回収することができる。好ましい実施形態では、それから、ビタミンＫ依存性タンパク質を既知の技法に従ってさらに精製することができる。

一般命題として、本発明に従って産生した組み換えタンパク質の純度は好ましくは、タンパク質の最適な活性及び安定性を導く当業者に既知の適切な純度である。例えば、組み換えタンパク質が第ＩＸ因子である場合、第ＩＸ因子は非常に高い純度であることが好ましい。好ましくは、組み換えタンパク質は複数のクロマトグラフ精製工程、例えばアフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、並びに好ましくは製造、保存及び／又は使用中の組み換えタンパク質の断片化、活性化及び／又は分解を引き起こす物質を取り除くイムノアフィニティクロマトグラフィにかけられる。好ましくは精製によって取り除かれるこのような物質の例示的な例としては、トロンビン及び第ＩＸａ因子、他のタンパク質汚染物質、例えばＰＡＣＥ／フリン、ＶＫＯＲ及びＶＫＧＣ等の修飾酵素、タンパク質、例えば組み換えタンパク質産生中に産生細胞から組織培養培地に放出されるハムスタータンパク質、非タンパク質汚染物質、例えば脂質、タンパク質汚染物質と非タンパク質汚染物質との混合物、例えばリポタンパク質が挙げられる。ビタミンＫ依存性タンパク質の精製手順は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第５，７１４，５８３号（参照により本明細書中に援用される）を参照されたい。

第ＩＸ因子のＤＮＡコード配列は、それらの発現に関してベクター及び宿主細胞と共に、欧州特許出願第３７３０１２号、欧州特許出願第２５１８７４号、ＰＣＴ特許出願第８５０５３７６号、ＰＣＴ特許出願第８５０５１２５号、欧州特許出願第１６２７８２号、及びＰＣＴ特許出願第８４００５６０号に開示される。他の凝固因子に対する遺伝子も知られており、例えば第ＩＩ因子（アクセッション番号ＮＭ＿０００５０６）、第ＶＩＩ因子（アクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６）、及び第Ｘ因子（アクセッション番号ＮＭ＿０００５０４）が利用可能である。

（実施例１）
第ＩＸ因子の遺伝子によるＣＨＯ細胞の一次トランスフェクション
９６ウェルプレートへの限界希釈によって、野生型の第ＩＸ因子の遺伝子をＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。第ＩＸ因子の遺伝子はＣＨＥＦ−１プロモータの制御下であった。細胞を１４日間、５％の血清中で培養させた。細胞培養培地を回収し、第ＩＸ因子抗原の全量（μｇ／ｍＬ）を第ＩＸ因子のＥＬＩＳＡ法によって定量した。１５０個を超えるクローンを評価し、１つのクローン当たりに産生された第ＩＸ因子の全量を図１に示す。

第ＩＸ因子の遺伝子でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、第ＩＸ因子のＥＬＩＳＡによって検出される第ＩＸ因子抗原を産生した。この量はクローン間で有意に変化した。培養下での１４日後の全タンパク質産生の範囲は、０〜１．６μｇ／ｍＬを超える培養培地であった。本実験では求められなかったが、一次トランスフェクタントで産生した第ＩＸ因子は、第ＩＸ因子欠損血漿を用いたＡＰＴＴ凝固アッセイで求められるように、約２０％の生物活性であった（データ図示せず）。したがって、第ＩＸ因子抗原は、野生型の第ＩＸ因子による細胞トランスフェクション後にＣＨＯ細胞で産生することができる。

（実施例２）
ＶＫＧＣ遺伝子及びＶＫＯＲ遺伝子による第ＩＸ因子産生ＣＨＯ細胞のスーパートランスフェクション（Supertransfection）
第ＩＸ因子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で産生した活性第ＩＸ因子の割合を増大させるために、一次トランスフェクタントをプールし、組織培養下に広げて、一般的に第ＩＸ因子の効果的なビタミンＫ依存性γ−カルボキシル化に重要であると考えられる酵素に対するｃＤＮＡを含有するベクターでスーパートランスフェクトした。第ＩＸ因子産生クローンを振盪フラスコにプールし、ビタミンＫ依存性γ−カルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）及びビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）の両方に対するｃＤＮＡでスーパートランスフェクトした。個別にスーパートランスフェクトした細胞を５％血清の入った９６ウェルプレートで限界希釈によって、１４日間培養させた。１ｍＬ当たりに産生した第ＩＸ因子抗原の全量を第ＩＸ因子のＥＬＩＳＡによって求めた。活性第ＩＸ因子の量を、基質として第ＩＸ因子欠損血漿、及び標準として血漿由来第ＩＸ因子を用いて、ＡＰＴＴ凝固アッセイによって求めた。

表１に示されるように、１５個のクローンを個別に分析した。第ＩＸ因子抗原は、０．１２〜２．２μｇ／ｍＬの間で変化した。活性第ＩＸ因子の割合は、１５〜７２％に及んだ。結果として、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲによる第ＩＸ因子産生細胞のスーパートランスフェクションは特異的なＣＨＯ細胞クローンによって産生される活性第ＩＸ因子の割合を有意に増大させる。

産生が拡大されるのでより多くの抗原が産生されることに留意されたい。例えば、６ウェルプレートに対しては、９６ウェルプレートと比較すると、約２５倍多い抗原が産生される。結果として、６ウェルプレートでは、第ＩＸ因子抗原のレベルが３〜５５μｇ／ｍｌに及ぶことが予測される。

（実施例３）
大量の生物活性組み換え第ＩＸ因子の大規模産生
ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲによってスーパートランスフェクトした第ＩＸ因子産生ＣＨＯ細胞が大量の生物活性第ＩＸ因子を産生することができることを実証するために、２つの独立して単離したクローンをバイオリアクターで培養し、材料を精製した後に第ＩＸ因子産物の量及び質を評価した。血清無含有培地の入ったバイオリアクターを用いて、クローン１３０（１２Ｌ容のバイオリアクター）及びクローン４４（１０Ｌ容のバイオリアクター）を培養した。これらのクローンの両方がヒトの第ＩＸ因子、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲを発現した。バイオリアクターを培地を変えずに１２日間培養させた。組織培養液を細胞から分離し、第ＩＸ因子を標準セットのクロマトグラフィカラムによって精製して、９０％を超える純度の第ＩＸ因子タンパク質を得た。

表２で示されるように、大量の第ＩＸ因子抗原が両方のバイオリアクターで産生された。クローン１３０は培養培地１Ｌ当たり４４ｍｇの第ＩＸ因子を産生し、クローン４４は培養培地１Ｌ当たり２８ｍｇの第ＩＸ因子を産生した。上に示されたデータと一致して、活性第ＩＸ因子（％）は３５〜６１％であることが示された。結果として、翻訳後修飾酵素であるＶＫＧＣ及びＶＫＯＲでスーパートランスフェクトした場合の第ＩＸ因子産生ＣＨＯ細胞は、相当な量の生物活性第ＩＸ因子を含有する第ＩＸ因子抗原を大量に産生する。

（実施例４）
第ＩＸ因子、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲを産生するクローンのＶＫＯＲによる再トランスフェクション
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞で生物活性組み換え第ＩＸ因子を産生することができるか否かを求めるために、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲでスーパートランスフェクトした後に第ＩＸ因子を産生した２つのクローン、クローン１３０及びクローン４４をＶＫＯＲによって再びトランスフェクトさせた。クローン１３０及びクローン４４の個別の単離物を限界希釈によってクローン化し、ＶＫＯＲに対するｃＤＮＡで再びトランスフェクトさせた。クローンは６ウェルプレートで培養させ、細胞が密集するまで９日間培養した。第ＩＸ因子のＥＬＩＳＡによって全第ＩＸ因子抗原（μｇ／ｍＬ）を求め、第ＩＸ因子欠損血漿を用いたＡＰＴＴ凝固アッセイによって活性（Ｕ／ｍＬ）を求めた。

表３の結果によって、クローン１３０及びクローン４４の両方のサブクローンが０．９〜３．０μｇ／ｍＬに及ぶ相当な量の第ＩＸ因子抗原を産生したことが示される。さらに、ＶＫＯＲによる再トランスフェクションの結果として、両方のクローンは、生物活性タンパク質として第ＩＸ因子を１００％産生した少なくとも１つのサブクローン、及び９０％を超える活性第ＩＸ因子を有する幾つかのサブクローンをもたらした。これらのデータは、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲの適切な同時発現が、野生型の第ＩＸ因子のｃＤＮＡによってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において全体的に活性が高い、又はさらに全体的に活性のある第ＩＸ因子の産生を容易にすることができることを示唆する。

（実施例５）
翻訳後修飾酵素であるＶＫＯＲで再びトランスフェクトした遺伝子操作細胞における生物活性第ＩＸ因子の大規模産生
この実験は、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲによるトランスフェクション後に組み換え第ＩＸ因
子を産生し、ＶＫＯＲで再びトランスフェクトしたＣＨＯ細胞が生産規模で大量の第ＩＸ因子を産生することができることを実証するように設計された。ＶＫＯＲで再びトランスフェクトしたクローン１３０の個別の単離物を１．５Ｌ容の振盪フラスコで増殖させ（商業生産を表すため）、第ＩＸ因子抗原及び生物活性を求めた。上記の実施例４で記載されるクローン１３０の個別のサブクローン（第ＩＸ因子、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲでトランスフェクトし、その後ＶＫＯＲで再びトランスフェクトしたＣＨＯクローン）を６ウェルマイクロタイタープレートにおける限界希釈によって単離し、それから１．５Ｌ容の振盪フラスコに播種した。１．５Ｌ容の振盪フラスコ中の第ＩＸ因子の産生は、１５Ｌ容以上のバイオリアクターの産生条件を反映することが知られている（データ図示せず）。細胞を血清無含有培地で１８日間増殖させ、その時点のサンプルを採取し、第ＩＸ因子抗原に関しては第ＩＸ因子のＥＬＩＳＡによって、及び生物活性に関しては第ＩＸ因子欠損血漿を用いたＡＰＴＴ凝固アッセイによって評価した。

クローン１３０自体及び５つのサブクローンに関するデータを表４に示す。大量の第ＩＸ因子抗原が全てのクローンで産生され、培養液１Ｌ当たり３９．３〜５２．２ｍｇの第ＩＸ因子抗原に及んだ。活性第ＩＸ因子の割合も非常に高く、４６．４％〜６４．３％に及んだ。生物活性第ＩＸ因子の産生量も驚くほど高く、１９．４〜３１．０ｍｇ／Ｌに及んだ。結果として、商業レベルのバイオリアクターでの第ＩＸ因子の産生を反映する振盪フラスコシステムにおいて、第ＩＸ因子、ＶＫＧＣ及びＶＫＯＲでトランスフェクトし、その後ＶＫＯＲで再びトランスフェクトした細胞で大量の第ＩＸ因子抗原及び活性第ＩＸ因子を産生することができる。

本発明の精神を逸脱することなく、多くの様々な変更形態が為され得ることが、当業者によって理解される。したがって、本発明の形態は例示目的だけであり、本発明の範囲を限定することを意図しないことを明確に理解する必要がある。

野生型の第ＩＸ因子の遺伝子のＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後に１つのクローン当たりに産生される第ＩＸ因子の全量を示す図である。第ＩＸ因子の遺伝子はＣＨＥＦ−１プロモータの制御下であった。細胞は、１４日間５％の血清中で培養させた。細胞培養培地を回収し、第ＩＸ因子抗原の全量（μｇ／ｍＬ）を第ＩＸ因子のＥＬＩＳＡ法によって定量した。

Claims

哺乳動物細胞を、プロモータと作用可能に連結されたビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子と、少なくとも１つのプロモータと作用可能に連結されたプロセシング因子をコードする少なくとも１つの遺伝子とで、同時に又は逐次トランスフェクトする工程、及び
前記ビタミンＫ依存性タンパク質産物を回収する工程を含む、組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を製造する方法であって、前記細胞が、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌの量の生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を産生することを特徴とする方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質産物が、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ及びプロテインＳから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項２に記載の方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が第ＶＩＩ因子である、請求項２に記載の方法。
前記プロセシング因子が、１つ又は複数のプロモータと作用可能に連結された、対塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ）、ビタミンＫ依存性エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）、ビタミンＫ依存性γ−グルタミルカルボキシラーゼ（ＶＫＧＣ）、及びそれらの組合せから成る群より選択される核酸である、請求項１に記載の方法。
前記プロセシング因子タンパク質がＶＫＯＲ及びＶＫＧＣを含む、請求項５に記載の方法。
前記遺伝子の少なくとも１つが過剰発現する、請求項５に記載の方法。
前記過剰発現した遺伝子が、チャイニーズハムスター伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）プロモータと作用可能に連結された、請求項７に記載の方法。
前記生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物のｇｌａドメイン内の少なくとも約７５％のグルタミン酸残基がγ−カルボキシル化された、請求項１に記載の方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質の少なくとも２５％が生物的に活性である、請求項１に記載の方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質の少なくとも５０％が生物的に活性である、請求項１０に記載の方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質の少なくとも８０％が生物的に活性である、請求項１１に記載の方法。
前記哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
前記生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質が、少なくとも約２０ｍｇ／Ｌの量で産生される、請求項１に記載の方法。
前記生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質が、少なくとも約３０ｍｇ／Ｌの量で産生さ
れる、請求項１４に記載の方法。
前記生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質が、少なくとも約５０ｍｇ／Ｌの量で産生される、請求項１５に記載の方法。
トランスフェクションが逐次であり、前記哺乳動物細胞をトランスフェクトすることが、
高レベルの前記ビタミンＫ依存性タンパク質産物又は前記プロセシング因子を発現する細胞を選択すること、
前記選択された細胞をクローン化すること、及び
前記クローン化した細胞を増幅すること、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記プロセシング因子をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程が、前記ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程の前に行なわれる、請求項１７に記載の方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程が、前記プロセシング因子をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程の前に行なわれる、請求項１７に記載の方法。
前記哺乳動物細胞が、トランスフェクション前に、内因性レベルの１つ又は複数のプロセシング因子の発現に対して選択される、請求項１７に記載の方法。
プロモータと作用可能に連結されたビタミンＫ依存性タンパク質の遺伝子と、少なくとも１つのプロモータと作用可能に連結された少なくとも１つのプロセシング因子の遺伝子とを含む組み換え哺乳動物細胞であって、該細胞において、少なくとも１つのプロセシング因子の遺伝子によってコードされた前記タンパク質の発現が、少なくとも約１５ｍｇ／Ｌの量の生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質の製造を容易にする、組み換え哺乳動物細胞。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ及びプロテインＳから成る群より選択される、請求項２１に記載の組み換え哺乳動物細胞。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が第ＩＸ因子又は第ＶＩＩ因子である、請求項２２に記載の組み換え哺乳動物細胞。
前記プロセシング因子が、前記細胞における発現のための、１つ又は複数のプロモータと作用可能に連結された、ＰＡＣＥ、ＶＫＯＲ、ＶＫＧＣ及びそれらの組合せから成る群より選択されるプロセシング遺伝子産物を産生する遺伝子である、請求項２１に記載の組み換え哺乳動物細胞。
前記プロセシング因子がＶＫＯＲ及びＶＫＧＣを含む、請求項２１に記載の組み換え哺乳動物細胞。
前記プロセシング遺伝子産物の少なくとも１つが、同じ系統のトランスフェクトしていない正常な細胞において見られるものよりも高いレベルで発現される、請求項２４に記載の組み換え哺乳動物細胞。
前記過剰発現した遺伝子産物が、チャイニーズハムスター伸長因子１−α（ＣＨＥＦ１）プロモータと作用可能に連結された、請求項２６に記載の組み換え哺乳動物細胞。
ＣＨＯ細胞又はＨＥＫ２９３細胞である、請求項２１に記載の組み換え哺乳動物細胞。
請求項１に記載の方法によって産生される組み換え第ＩＸ因子タンパク質。
請求項２９に記載の第ＩＸ因子タンパク質を含む薬学的組成物。
請求項２９に記載の組み換え第ＩＸ因子タンパク質を含むキット。
血友病を治療する方法における、請求項３０に記載の薬学的組成物の使用。
請求項２１に記載の細胞を選択する方法であって、対応する血漿由来のビタミンＫ依存性タンパク質に存在する硫酸化レベルの少なくとも２５％、及びリン酸化レベルの少なくとも２５％含有するように翻訳後修飾されるアミノ酸から成るビタミンＫ依存性タンパク質を産生することができる天然の修飾酵素を含有する特異的組織培養細胞株の変異体を選択することを含む、請求項２１に記載の細胞を選択する方法。
前記ビタミンＫ依存性タンパク質が第ＩＸ因子である、請求項３３に記載の方法。
（ａ）哺乳動物細胞を、プロモータと作用可能に連結されたビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクトする工程、
（ｂ）高レベルの前記ビタミンＫ依存性タンパク質産物を発現する細胞を選択する工程、（ｃ）前記選択された細胞を、プロモータと作用可能に連結された１つ又は複数のプロセシング因子でトランスフェクトする工程、
（ｄ）工程（ｂ）を繰り返す工程、
（ｅ）任意で、工程（ａ）及び／又は工程（ｃ）の後に工程（ｂ）を繰り返す工程、
（ｆ）前記選択された細胞をクローン化する工程、
（ｇ）前記クローン化した細胞を増幅する工程、並びに
（ｈ）少なくとも１５ｍｇ／Ｌの組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質の量で前記クローン化した細胞から前記産物を回収する工程、
を含む、組み換え生物活性ビタミンＫ依存性タンパク質産物を製造する方法。