WO2021090888A1 - タンパク質の製造方法 - Google Patents

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WO2021090888A1
WO2021090888A1 PCT/JP2020/041377 JP2020041377W WO2021090888A1 WO 2021090888 A1 WO2021090888 A1 WO 2021090888A1 JP 2020041377 W JP2020041377 W JP 2020041377W WO 2021090888 A1 WO2021090888 A1 WO 2021090888A1
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靖道 古関
貴裕 片山
裕介 大矢
文 緒方
聖 平川
拓哉 樋口
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味の素株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing animal cells.
  • One aspect of the present invention relates to a method for producing a target substance such as a protein by an animal cell.
  • Animal cells are used as an expression host for recombinant proteins.
  • Patent Document 1 As a method for producing a recombinant protein as an expression host of a Chinese hamster ovary-derived cell line (CHO), a fed-batch medium containing phosphoric acid is flowed so that the phosphoric acid concentration in the medium is 1.5 to 3.5 mM. A method of adding has been reported (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 a method of culturing cells using a medium containing a high concentration of choline
  • Patent Document 3 a method of culturing cells using a medium containing a high concentration of serine
  • Patent Document 4 A method of culturing cells using a medium containing an amine (Patent Document 4) is known.
  • An object of the present invention is to provide a novel technique for improving the culture performance of animal cells (for example, proliferation of animal cells and production of target substance by animal cells).
  • the present inventors increase the concentration of specific components such as phosphate and potassium in the medium when culturing animal cells to increase the culture results of animal cells (for example, proliferation of animal cells and target substances by animal cells).
  • the present invention has been completed by finding that the production) is improved.
  • the present invention can be exemplified as follows.
  • the method the culture is carried out under the conditions (A) and / or (B) below.
  • the method, wherein the target substance is a protein.
  • a method of culturing animal cells Including culturing animal cells in medium The method: the culture is carried out under the conditions (A) and / or (B) below.
  • the method of the present invention is a method for culturing animal cells, which comprises culturing the animal cells in a medium, and the culture enhances the phosphoric acid concentration and / or the potassium concentration in the medium. It is a method that is carried out under the above conditions.
  • the target substance may be produced by culturing animal cells. That is, when an animal cell has a target substance-producing ability, the target substance can be produced by culturing the cell. That is, one aspect of the method of the present invention is a method for producing a target substance, which comprises culturing an animal cell capable of producing the target substance in a medium and recovering the target substance, and the culture is the medium. The method may be carried out under conditions in which the concentration of phosphoric acid and / or the concentration of potassium in the medium is increased.
  • the target substance is not particularly limited as long as it can be produced by animal cells.
  • examples of the target substance include proteins.
  • a protein produced as a target substance is also referred to as a "target protein”.
  • Animal cells are not particularly limited. The animal cell can be appropriately selected depending on various conditions such as the use of the animal cell. For example, when an animal cell is used for producing a target protein, the animal cell is not particularly limited as long as it can express the target protein.
  • Animal cells are also referred to as "hosts," "expression hosts,” or "host cells.” Animals include mammals, birds and amphibians. Animals include mammals in particular. Mammals include rodents and primates. Rodents include hamsters, mice, rats and guinea pigs. Examples of hamsters include Chinese hamsters. Primates include humans, monkeys and chimpanzees. Examples of monkeys include African green monkeys. Examples of birds include chickens. Amphibians include Xenopus laevis.
  • tissue or cell from which the animal cell is derived is not particularly limited.
  • Tissues or cells from which animal cells are derived include ovaries, kidneys, adrenal glands, tongue epithelium, olfactory epithelium, pineal gland, thyroid gland, and melanocytes.
  • Examples of Chinese hamster cells include Chinese hamster ovary-derived cell lines (CHO). Specific examples of CHO include CHO-DG44 and CHO-K1. Examples of human cells include human fetal kidney cell-derived cell lines (HEK). Specific examples of HEK include HEK293 and HEK293T. Examples of African green monkey cells include African green monkey renal cell-derived cell lines (COS). Specific examples of COS include COS-1.
  • Specific examples of Xenopus cells include Xenopus oocytes.
  • Animal cell capable of producing a target substance means an animal cell capable of producing a target substance.
  • animal cells capable of producing a target substance means an ability to produce a target substance (for example, express a target protein) and accumulate it in a culture to a extent that it can be recovered when cultured in a medium. It may mean an animal cell having.
  • "Accumulation in culture” may specifically mean accumulation in medium, cell surface, intracellular, or a combination thereof. The case where the target substance accumulates extracellularly (for example, in the medium or on the cell surface) is also referred to as "secretion" or "secretory production” of the target substance.
  • the animal cell may have a secretory production ability (the ability to secrete and produce the target substance) of the target substance.
  • the accumulated amount of the target substance may be, for example, 10 ⁇ g / L or more, 1 mg / L or more, 100 mg / L or more, or 1 g / L or more as the accumulated amount in the culture.
  • the animal cell may have the ability to produce one kind of target substance, or may have the ability to produce two or more kinds of target substances.
  • the animal cell may be one that originally has the ability to produce the target substance, or may be one that has been modified to have the ability to produce the target substance.
  • the animal cells may be modified so as to enhance the inherent ability to produce the target substance.
  • the animal cell having the target substance-producing ability can be obtained, for example, by imparting the target substance-producing ability to the animal cell as described above, or by enhancing the target substance-producing ability of the animal cell as described above. ..
  • the target protein-producing ability can be imparted or enhanced by introducing a gene encoding the target protein.
  • the gene encoding the target protein is also referred to as the "target protein gene".
  • the target protein is not particularly limited as long as it can be expressed using animal cells as a host.
  • the protein may be a host-derived protein or a heterologous protein.
  • the "heterologous protein” refers to a protein that is exogenous to a host that produces the protein (ie, an animal cell capable of producing the protein of interest).
  • the target protein may be, for example, a naturally occurring protein, a modified protein thereof, or an artificially designed amino acid sequence protein.
  • the target protein may be, for example, a protein derived from a microorganism, a protein derived from a plant, a protein derived from an animal, or a protein derived from a virus.
  • the protein of interest may be, in particular, a protein of human origin.
  • the target protein may be a monomeric protein or a multimeric protein.
  • the target protein may be a secretory protein or a non-secretory protein.
  • the "protein” also includes what is called a peptide, such as an oligopeptide or a polypeptide.
  • target protein examples include enzymes, bioactive proteins, receptor proteins, antigen proteins, and other proteins.
  • Enzymes include cellulase, transglutaminase, protein glutaminase, isomaltodextranase, protease, endopeptidase, exopeptidase, aminopeptidase, carboxypeptidase, collagenase, and chitinase.
  • bioactive proteins include growth factors (growth factors), hormones, cytokines, and antibody-related molecules.
  • Growth factors include epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), and transforming growth factor (TGF). ), Nerve growth factor (NGF), Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Vascular endothelial growth factor (VEGF), Granulocyte- colony stimulating factor (G-CSF), granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), platelet-derived growth factor (PDGF), erythropoietin (EPO), Thrombopoietin (TPO), acidic fibroblast growth factor (aFGF or FGF1), basic fibroblast growth factor (bFGF or FGF2), keratinocyte growth factor ; KGF-1 or FGF7, KGF-2 or FGF10), hepatocellular growth factor (HGF), stem cell factor (SCF), activin (Activin). Examples of activin include activin A, C, and E.
  • hormones include insulin, glucagon, somatostatin, human growth hormone (hGH), parathyroid hormone (PTH), calcitonin, and exenatide.
  • Cytokines include interleukin, interferon, and tumor necrosis factor (TNF).
  • the bioactive protein may be the whole protein or a part thereof.
  • a portion having a physiological activity can be mentioned.
  • Specific examples of the portion having physiological activity include the physiologically active peptide Teriparatide consisting of 34 amino acid residues at the N-terminal of a mature parathyroid hormone (PTH).
  • Antibody-related molecule may mean a protein comprising a molecular species consisting of a single domain selected from the domains constituting a complete antibody or a combination of two or more domains. Domains that make up a complete antibody include the heavy chain domains VH, CH1, CH2, and CH3, and the light chain domains VL and CL.
  • the antibody-related molecule may be a monomeric protein or a multimeric protein as long as it contains the above-mentioned molecular species. When the antibody-related molecule is a multimeric protein, it may be a homomultimer composed of a single type of subunit, or a heteromultimer composed of two or more types of subunits. May be good.
  • antibody-related molecules include complete antibodies, Fab, F (ab'), F (ab') 2 , Fc, dimers consisting of heavy chain (H chain) and light chain (L chain), and Fc. Fusion protein, heavy chain (H chain), light chain (L chain), single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2 , disulfide bond Fv (sdFv), diabody, VHH fragment (nanobody®) Be done. More specific examples of antibody-related molecules include Trastuzumab, Adalimumab, and Nivolumab.
  • the receptor protein examples include a physiologically active protein and a receptor protein for other physiologically active substances.
  • Other bioactive substances include neurotransmitters such as dopamine.
  • the receptor protein may be an orphan receptor whose corresponding ligand is unknown.
  • the antigen protein is not particularly limited as long as it can elicit an immune response.
  • the antigen protein can be appropriately selected, for example, according to the target of the assumed immune response.
  • the antigen protein can be used, for example, as a vaccine.
  • LFABP Liver-type fatty acid-binding protein
  • fluorescent protein include Green Fluorescent Protein (GFP).
  • immunoglobulin binding protein include Protein A, Protein G, and Protein L.
  • albumin include human serum albumin.
  • fibroin-like protein include those disclosed in WO2017 / 090665 and WO2017 / 171001.
  • Laminin is a protein having a heterotrimeric structure consisting of ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain.
  • laminin include mammalian laminin.
  • the laminin subunit chains ie, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain
  • the laminin subunit chains include 5 types of ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 5), 3 types of ⁇ chain ( ⁇ 1 to ⁇ 3), and 3 types of ⁇ chain ( ⁇ 1). ⁇ ⁇ 3) can be mentioned.
  • Laminin constitutes various isoforms by combining these subunit chains.
  • laminin specifically, for example, laminin 111, laminin 121, laminin 211, laminin 213, laminin 221, laminin 311, laminin 321, laminin 332, laminin 411, laminin 421, laminin 423, laminin 511, laminin 521, laminin. 523 can be mentioned.
  • a partial sequence of laminin includes laminin E8, which is an E8 fragment of laminin.
  • laminin E8 has a heterotrimeric structure consisting of an ⁇ chain E8 fragment ( ⁇ chain E8), a ⁇ chain E8 fragment ( ⁇ chain E8), and a ⁇ chain E8 fragment ( ⁇ chain E8). It is a protein that has.
  • the subunit chains of laminin E8 are collectively referred to as “E8 subunit chains”.
  • Examples of the E8 subunit chain include the E8 fragment of the laminin subunit chain exemplified above.
  • Laminin E8 constitutes various isoforms by combining these E8 subunit chains.
  • Specific examples of the laminin E8 include laminin 111E8, laminin 121E8, laminin 211E8, laminin 221E8, laminin 332E8, laminin 421E8, laminin 411E8, laminin 511E8, and laminin 521E8.
  • the target protein may be, for example, a protein having a known or natural amino acid sequence of the above-mentioned protein. Further, the target protein may be, for example, a variant of a protein having a known or natural amino acid sequence of the above-mentioned protein. Variants include proteins having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added at one or several positions in a known or natural amino acid sequence. Specifically, "1 or several" means, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1. It may mean up to 5, particularly preferably 1 to 3.
  • Variants include, for example, 50% or more, 65% or more, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 97% or more, particularly with respect to the entire known or natural amino acid sequence.
  • a protein having an amino acid sequence having 99% or more identity is also mentioned.
  • the protein specified by the species of origin is not limited to the protein itself found in the species, but includes proteins having the amino acid sequence of the protein found in the species and variants thereof.
  • Variants may or may not be found in the species. That is, for example, "human-derived protein” is not limited to the protein itself found in humans, but includes proteins having an amino acid sequence of proteins found in humans and variants thereof.
  • the target protein gene is not particularly limited as long as it encodes the target protein as described above.
  • the target protein gene may be, for example, a gene having a known or natural base sequence of a gene encoding a protein as described above. Further, the target protein gene may be, for example, a variant of a gene having a known or natural base sequence of a gene encoding a protein as described above.
  • the protein gene of interest may be modified, for example, to encode a protein having a variant sequence as exemplified above.
  • the target protein gene may be one in which any codon is replaced with an equivalent codon.
  • the target protein gene may be modified to have an optimum codon, for example, depending on the codon usage frequency of the host cell.
  • the term "gene” is not limited to DNA as long as it encodes the corresponding expression product, and may include any polynucleotide. That is, the "target protein gene” may mean any polynucleotide encoding the target protein.
  • the target protein gene may be DNA, RNA, or a combination thereof.
  • the target protein gene may be single-stranded or double-stranded.
  • the target protein gene may be single-stranded DNA or single-stranded RNA.
  • the target protein gene may be double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a hybrid strand consisting of a DNA strand and an RNA strand.
  • the protein gene of interest may contain both DNA and RNA residues in a single polynucleotide strand.
  • the protein gene of interest may or may not contain an intron.
  • the mode of the target protein gene can be appropriately selected according to various conditions such as the means for expressing the target protein.
  • the expression “having a (amino acid or base) sequence” means “including the (amino acid or base) sequence” and includes the case of “consisting of the (amino acid or base) sequence”.
  • the target protein is expressed from the target protein gene. That is, an animal cell capable of producing a target protein has a target protein gene. Specifically, an animal cell having a target protein-producing ability has a target protein gene capable of expressing it. It is sufficient that the animal cell having the target protein-producing ability has the target protein gene until the target protein is expressed to a desired degree. That is, the animal cell capable of producing the target protein may or may not have the target protein gene after the expression of the target protein.
  • "expression of target protein gene” and "expression of target protein” may be used synonymously.
  • the target protein gene can be obtained by cloning from an organism having the target protein gene. Nucleic acids such as genomic DNA and cDNA containing the same gene can be used for cloning. The target protein gene can also be obtained by chemical synthesis (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
  • the acquired target protein gene can be used as it is or after being appropriately modified. That is, the variant can be obtained by modifying the target protein gene.
  • the gene can be modified by a known method.
  • a site-specific mutation method can be used to introduce a desired mutation into a target site of DNA.
  • a site-specific mutation method a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. In Enzymol., 154, 382 (1987)) and methods using phage (Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth . In Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • the variant of the target protein gene may be directly obtained by chemical synthesis.
  • the form of introducing the target protein gene into the host cell is not particularly limited.
  • the target protein gene may be retained in the host cell so that it can be expressed. Specifically, for example, when a target protein gene is introduced in a form that requires transcription of DNA or the like, the target protein gene is retained in a host cell so as to be expressible under the control of a promoter functioning in the host cell. Just do it.
  • the protein gene of interest may be extrachromosomally present or introduced onto the chromosome. When introducing two or more genes, each gene need only be retained in the host cell so that it can be expressed.
  • the promoter for expressing the target protein gene is not particularly limited as long as it functions in the host cell.
  • "Promoter functioning in a host cell” means a promoter having promoter activity in a host cell.
  • the promoter may be a host cell-derived promoter or a heterologous promoter.
  • the promoter may be a promoter unique to the target protein gene or a promoter of another gene.
  • the promoter may be a stronger promoter than the unique promoter of the target protein gene.
  • Promoters that function in animal cells include the SV40 promoter, EF1a promoter, RSV promoter, CMV promoter, and SRalpha promoter. Further, as the promoter, a highly active form of a conventional promoter may be obtained and used by using various reporter genes. Methods for assessing promoter strength and examples of potent promoters are described in Goldstein et al.'S paper (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128
  • the target protein gene can be introduced into a host cell using, for example, a vector containing the same gene.
  • a vector containing a target protein gene is also referred to as an "expression vector of the target protein gene".
  • the expression vector of the target protein gene can be constructed, for example, by ligating a DNA fragment containing the target protein gene with the vector.
  • the gene By introducing the expression vector of the target protein gene into the host cell, the gene can be introduced into the host cell.
  • the vector may comprise a marker such as a drug resistance gene.
  • the vector may include an expression regulatory sequence such as a promoter for expressing the inserted gene.
  • the vector can be appropriately selected according to various conditions such as the type of host cell and the form of introduction of the target protein gene.
  • Examples of vectors that can be used for gene transfer into animal cells include plasmid vectors and viral vectors.
  • the viral vector include a retrovirus vector and an adenovirus vector.
  • Examples of the plasmid vector include a pcDNA series vector (pcDNA3.1 and the like; Thermo Fisher Scientific), a pBApo-CMV series vector (Takara Bio), and pCI-neo (Promega).
  • the vector can be integrated into the chromosome of the host cell, can autonomously replicate outside the chromosome of the host cell, or can be temporarily retained outside the chromosome of the host cell.
  • a vector having a viral origin of replication can replicate autonomously outside the chromosomes of animal cells.
  • the pcDNA series vector has an SV40 origin of replication and can autonomously replicate extrachromosomally in host cells expressing the SV40 large T antigen (COS-1, HEK293T, etc.).
  • the target protein gene can also be introduced into a host cell by, for example, introducing a nucleic acid fragment containing the gene into the host cell.
  • nucleic acid fragments include linear DNA and linear RNA.
  • linear RNA include mRNA and cRNA.
  • the method for introducing nucleic acids such as vectors and nucleic acid fragments into host cells can be appropriately selected according to various conditions such as the type of host cells.
  • Examples of the method for introducing a nucleic acid such as a vector or a nucleic acid fragment into an animal cell include a DEAE dextran method, a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, and a microinjection method.
  • the vector is a viral vector
  • the vector can be introduced into the host cell by infecting the host cell with the vector (virus).
  • a cell that originally has the target protein gene may be modified and used so that the expression of the target protein gene is increased.
  • Increased gene expression means that the per-cell expression level of the gene is increased as compared to unmodified cells.
  • unmodified cell as used herein means a control cell that has not been modified to increase the expression of the target gene. Examples of unmodified cells include wild-type cells and cells from which they are modified.
  • Methods for increasing the expression of the target protein gene include increasing the number of copies of the target protein gene and improving the transcription efficiency and translation efficiency of the target protein gene. An increase in the number of copies of the target protein gene can be achieved by introducing the target protein gene into a host cell. The introduction of the target protein gene can be carried out as described above.
  • the target protein gene to be introduced may be derived from a host cell or a heterologous gene. Improvements in transcription efficiency and translation efficiency of the target protein gene can be achieved by modifying the expression regulatory sequences of genes such as promoters. For example, improvement in transcription efficiency of a target protein gene can be achieved by replacing the promoter of the target protein gene with a stronger promoter.
  • Animal cell culture is carried out under conditions in which the phosphate concentration and / or potassium concentration in the medium is increased. Culturing of animal cells may be carried out, for example, under conditions in which at least the concentration of phosphoric acid in the medium is increased. "Conditions in which the phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium is enhanced” are also referred to as “phosphoric acid / potassium enhancing conditions”. The “condition for enhancing the phosphoric acid concentration in the medium” is also particularly referred to as the “phosphoric acid enhancing condition”. "Conditions in which the potassium concentration in the medium is enhanced” are also particularly referred to as “potassium-enhanced conditions".
  • Control conditions include general conditions used for culturing animal cells. Specific examples of the control condition include conditions that do not satisfy the phosphoric acid / potassium enhancement conditions exemplified below.
  • the culture results of animal cells can be improved. Specifically, by culturing the animal cells under the phosphate / potassium enhancing condition, the culture performance of the animal cells can be improved as compared with the case where the animal cells are cultured under the control condition. Further, for example, by culturing the animal cells under the condition that both the phosphate concentration and the potassium concentration in the medium are enhanced, the animal cells are cultured under the condition that only one of the phosphate concentration and the potassium concentration in the medium is enhanced. The culture performance of animal cells may be improved as compared with the case. Improvements in the culture results of animal cells include improvement of animal cell proliferation, improvement of animal cell viability, improvement of target substance production by animal cells, and extension of animal cell culture period.
  • culturing animal cells under phosphate / potassium-enhanced conditions may, for example, improve the proliferation and / or viability of the animal cells.
  • culturing animal cells under phosphate / potassium-enhanced conditions may improve the proliferation and / or viability of the animal cells as compared to culturing the animal cells under control conditions.
  • the viable cell density of the animal cells is increased during culturing, for example, 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more the viable cell density at the start of culturing.
  • the density may reach times or more, 80 times or more, 90 times or more, 100 times or more, 200 times or more, 500 times or more, or 1000 times or more.
  • the viable cell density of the animal cells can be increased, for example, 1.5 ⁇ 10 7 cells / mL or more and 1.6 ⁇ 10 7 cells / mL or more during the culture.
  • the density may reach 5 ⁇ 10 7 cells / mL or more, 7 ⁇ 10 7 cells / mL or more, 1 ⁇ 10 8 cells / mL or more, or 1 ⁇ 10 9 cells / mL or more.
  • the viable cell count of animal cells can be measured, for example, using a live-and-dead cell autoanalyzer Vi-CELL TM XR (Beckman Coulter) or a flow cytometer guava easy Cyte (Luminex).
  • the animal cell has a target substance-producing ability such as a target protein-producing ability
  • culturing the animal cell under the phosphate / potassium-enhanced condition improves, for example, the production of the target substance such as the target protein by the animal cell.
  • the animal cell has a target substance-producing ability such as a target protein-producing ability
  • the animal cell is cultured under the phosphate / potassium-enhanced condition as compared with the case where the animal cell is cultured under the control condition.
  • the production of target substances such as target proteins by animal cells may be improved.
  • the culture period of animal cells may be extended by culturing animal cells under phosphate / potassium enhancing conditions. Specifically, by culturing the animal cells under the phosphate / potassium-enhanced condition, the culture period of the animal cells may be extended as compared with the case where the animal cells are cultured under the control condition.
  • the extension of the culture period of the animal cells includes the extension of the period during which the growth of the animal cells continues, the extension of the period during which the animal cells are maintained (that is, the survival of the animal cells), and the extension of the target substance such as the target protein by the animal cells. There is an extension of the period during which production continues.
  • one aspect of the method of the present invention may be a method of improving the proliferation of animal cells.
  • one aspect of the method of the present invention may be a method for improving the survival rate of animal cells.
  • one aspect of the method of the present invention may be a method for improving the production of a target substance by an animal cell.
  • one aspect of the method of the present invention may be a method of extending the culture period of animal cells.
  • “Culture of animal cells” is not limited to those intended for the proliferation of animal cells, but also includes those not intended for the proliferation of animal cells, such as maintenance of animal cells and production of target substances by animal cells. Good.
  • the medium composition and culture conditions are not particularly limited as long as the purpose of culturing animal cells can be achieved, except that the phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium is enhanced.
  • the medium composition and culture conditions can be configured so that animal cells proliferate.
  • the purpose is to maintain animal cells
  • the medium composition and culture conditions can be configured so that the animal cells are maintained (that is, the animal cells survive).
  • the purpose is to produce a target substance such as a target protein
  • the medium composition and culture conditions can be configured so that the target substance is produced (for example, the target protein is expressed). If not intended for the growth of animal cells, the animal cells may or may not grow during culturing.
  • the animal cells may proliferate during culturing, even if they are not intended for the growth of the animal cells.
  • the medium composition and culture conditions can be appropriately set according to various conditions such as the type of animal cells.
  • the culture is carried out using, for example, the normal medium and normal conditions used for culturing animal cells as they are or with appropriate modifications, except that the phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium is enhanced. can do.
  • Culturing can be carried out using, for example, a liquid medium.
  • Specific media that can be used for culturing animal cells include D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), CELLiST Basal Media BASAL4P (Ajinomoto Co., Ltd.), Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific), and RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific).
  • the medium contains various medium components such as carbon source, amino acid, vitamin, inorganic salt, phosphoric acid, choline, amine, pH buffer, growth factor, serum, serum albumin, selective drug, gene expression inducer and the like. You can. Glucose is mentioned as a carbon source.
  • amino acids examples include 20 types of amino acids constituting proteins and their derivatives.
  • the amino acid may be, for example, L-form.
  • Specific examples of amino acids include glutamine and serine.
  • glutamine examples include L-glutamine.
  • Examples of serine include L-serine.
  • Amines include 1,4-butanediamine (also called "putresin"), agmatin, methylamine, dimethylamine, trimethylamine, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethylenediamine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, N, N-diisopropyl.
  • Examples thereof include ethylamine, tetramethylethylenediamine, hexamethylenediamine, spermidine, spermin and amantazine.
  • aromatic amines include aniline, phenethylamine, toluidine, catecholamines, and 1,8-bis (dimethylamino) naphthalene.
  • Heterocyclic amines include pyrrolidine, piperidine, piperidine, morpholin, quinuclidine, 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octane, pyrrole, pyrazole, imidazole, pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, oxazole, thiazole, 4-dimethyl.
  • Aminopyridine can be mentioned.
  • Amines include, among others, 1,4-butanediamine, ethanolamine, spermidine, spermine. Amines include, more particularly, 1,4-butanediamine.
  • any component that can form a salt may be used as a free form, as a salt, or as a combination thereof. That is, for example, the term “amino acid” may mean a free amino acid, a salt thereof, or a combination thereof, unless otherwise specified. Further, for example, the term “phosphoric acid” may mean free phosphoric acid, or a salt thereof, or a combination thereof, unless otherwise specified. Also, for example, the term “choline” may mean free choline, or a salt thereof, or a combination thereof, unless otherwise specified. Further, for example, the term “amine” may mean a free amine, a salt thereof, or a combination thereof, unless otherwise specified.
  • the salt is not particularly limited as long as it can be used for culturing animal cells.
  • a salt for an acidic group such as a phosphoric acid group or a carboxyl group
  • a salt with an alkali metal such as ammonium salt, sodium and potassium
  • a salt with an alkaline earth metal such as calcium and magnesium
  • an amine as exemplified above.
  • salts with basic amino acids such as arginine and lysine.
  • a salt for a basic group such as an amino group
  • a salt with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid and fumaric acid.
  • Salts with organic carboxylic acids such as tartaric acid, succinic acid, tannic acid, butyric acid, hibenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, theocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid, malic acid, methanesulfonic acid , Benzylsulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and other salts with organic sulfonic acids.
  • examples of the salt of phosphoric acid include sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and dipotassium hydrogen phosphate.
  • choline salt includes choline bitartrate.
  • the seeding amount of animal cells at the start of culture is, for example, 1 ⁇ 10 3 cells / mL or more, 1 ⁇ 10 4 cells / mL or more, 1 ⁇ 10 5 cells / mL or more, 1 ⁇ 10 6 cells / mL or more, or It may be 1 ⁇ 10 7 cells / mL or more, 1 ⁇ 10 10 cells / mL or less, 1 ⁇ 10 9 cells / mL or less, 1 ⁇ 10 8 cells / mL or less, 1 ⁇ 10 7 cells / mL or less, It may be 1 ⁇ 10 6 cells / mL or less, 1 ⁇ 10 5 cells / mL or less, or 1 ⁇ 10 4 cells / mL or less.
  • the culture may be divided into a seed culture and a main culture.
  • the culture conditions of the seed culture and the main culture may or may not be the same.
  • the target substance may be produced at least during the main culture period.
  • animal cells may be sufficiently proliferated by seed culture, and then a target substance such as a target protein may be produced by main culture.
  • Culturing can be carried out by batch culture, fed-batch culture, continuous culture, or a combination thereof.
  • fed-batch culture or continuous culture include perfusion culture.
  • the medium at the start of culturing is also referred to as "initial medium” or “basal medium”.
  • the medium supplied to the culture system (for example, the initial medium) in the fed-batch culture or the continuous culture is also referred to as "fed-batch medium”.
  • supplying a fed-batch medium to a culture system in fed-batch culture or continuous culture is also referred to as "fed-batch".
  • Fed-batch may be carried out throughout the period of the culture or only for a part of the period of the culture. Fed-batch may be carried out continuously or intermittently.
  • withdrawal of the culture broth may be carried out.
  • the withdrawal of the culture solution may be, for example, withdrawal of the culture solution containing animal cells or withdrawal of the culture supernatant.
  • animal cells may be collected from the extracted culture medium and returned to the culture system.
  • Withdrawal of the culture medium may be carried out throughout the whole period of the culture, or may be carried out only during a part of the culture.
  • the withdrawal of the culture solution may be carried out continuously or intermittently.
  • the withdrawal and feeding of the culture medium may or may not be performed at the same time.
  • the amount of the culture solution to be withdrawn is preferably the same as the amount of the fed-batch medium to be fed.
  • the “equivalent amount” may mean, for example, an amount of 93 to 107% (v / v) with respect to the amount of fed-batch medium to be fed.
  • the culture forms of the seed culture and the main culture may or may not be the same.
  • Various components such as phosphoric acid may be contained in the initial medium, the fed-batch medium, or both. That is, in the process of culturing, various components such as phosphoric acid may be supplied to the medium alone or in any combination. All of these components may be supplied once or multiple times, or may be supplied continuously.
  • the composition of the initial medium and the fed-batch medium eg, the type and / or concentration of the components contained
  • the composition of the initial medium and the fed-batch medium may or may not be the same. That is, the type of the component contained in the initial medium may or may not be the same as the type of the component contained in the fed-batch medium. Further, the concentration of each component contained in the initial medium may or may not be the same as the concentration of each component contained in the fed-batch medium.
  • the composition of the initial medium and the fed-batch medium may be the same.
  • two or more fed-batch media having different compositions may be used.
  • the composition of each fed-batch medium may or may not be the same.
  • various components such as phosphoric acid may be supplied to the medium in a form such as powder that is not contained in the fed-batch medium.
  • the culture may be carried out in a CO 2 containing atmosphere such as 5% CO 2.
  • the pH of the medium may be, for example, near neutral. "Near neutral” may mean, for example, pH 6-8, pH 6.5-7.5, or pH 6.8-7.2.
  • the pH of the medium can be adjusted as needed.
  • the pH of the medium is various alkaline or acidic substances such as ammonia gas, aqueous ammonia, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, potassium bicarbonate, magnesium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, etc. Can be adjusted using.
  • the culture temperature may be, for example, 36-38 ° C.
  • the culture period is, for example, 0.5 days or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more, 9 days or more, 10 days. More than 12 days, more than 15 days, or more than 20 days, 50 days or less, 40 days or less, 30 days or less, 25 days or less, 20 days or less, 15 days or less, 12 days or less, 10 days Hereinafter, it may be 9 days or less, 8 days or less, or 7 days or less, and may be a consistent combination thereof. Specifically, the culture period may be, for example, 1 to 30 days, 3 to 25 days, or 5 to 20 days. At the time of culturing, gene expression such as expression of the target protein may be induced as appropriate.
  • Various components such as phosphoric acid may be present in the medium in any form.
  • a component is a component that can be ionized, the component may or may not be ionized in the medium.
  • Concentration of a certain component may mean the total concentration of the dissolved component when the component can be present in a liquid in a plurality of forms. That is, for example, "concentration of a certain component” may mean the sum of the concentration of the molecule and the concentration of ions of the component when the component can be present in the liquid in the form of molecules and ions.
  • concentration of a component in a medium may mean the total concentration of the component dissolved in the medium when the component can be present in the medium in multiple forms. That is, for example, "concentration of a certain component in the medium” means the sum of the concentration of the molecule of the component and the concentration of ions in the medium when the component can be present in the medium in the form of molecules and ions. May mean.
  • phosphoric acid concentration may mean the total concentration of dissolved phosphoric acid molecular species. That is, the “phosphoric acid concentration", specifically, the concentration of molecular phosphoric acid (H 3 PO 4) and phosphoric acid ions (PO 4 3-, HPO 4 2- , and H 2 PO 4 -) concentration May mean the sum of.
  • phosphoric acid concentration in the medium may mean the total concentration of phosphoric acid molecular species dissolved in the medium. That is, for example, the "phosphoric acid concentration in the medium”, specifically, phosphoric acid ions in the concentration and medium phosphate molecules in the medium (H 3 PO 4) (PO 4 3-, HPO 4 2 -, and H 2 PO 4 -) may refer to the total concentration of.
  • the degree of enhancement of the phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium is not particularly limited as long as the culture performance of the animal cells (for example, the proliferation of the animal cells or the production of the target substance by the animal cells) is improved.
  • the degree of enhancement of the phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium can be appropriately set according to various conditions such as the type of animal cells, the length of the culture period, and the desired production amount of the target substance.
  • “Culturing is carried out under conditions of enhanced phosphate and / or potassium concentration in the medium” means, for example, that the phosphate and / or potassium concentration in the medium is within a predetermined range. Good.
  • the phosphoric acid concentration in the medium is, for example, 0.2 mM or more, 0.5 mM or more, 1 mM or more, 1.5 mM or more, 2 mM or more, 2.5 mM or more, 3 mM or more, 3.5 mM or more, 4 mM or more, 4.5 mM.
  • the phosphoric acid concentration in the medium may be 4 mM or more, in particular.
  • the phosphoric acid concentration in the medium may be 11 mM or more, more particularly.
  • the phosphoric acid concentration in the medium may be, for example, 0.2 to 100 mM, 4 to 70 mM, 11 to 50 mM, 11 to 40 mM, 11 to 30 mM, 11 to 27 mM, or 10 to 25 mM. ..
  • the potassium concentration in the medium is, for example, 0.2 mM or more, 0.5 mM or more, 1 mM or more, 2 mM or more, 3 mM or more, 4 mM or more, 5 mM or more, 6 mM or more, 7 mM or more, 8 mM or more, 9 mM or more, or 10 mM or more. It may be 50 mM or less, 40 mM or less, 30 mM or less, 20 mM or less, 15 mM or less, 12 mM or less, 10 mM or less, 9 mM or less, 8 mM or less, 7 mM or less, 6 mM or less, or 5 mM or less, and their contradictions.
  • the potassium concentration in the medium may be, in particular, 1 mM or higher. Specifically, the potassium concentration in the medium may be, for example, 0.2 to 50 mM, 0.5 to 30 mM, or 1 to 10 mM.
  • Phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium may be enhanced during the entire period of the culture, or may be enhanced only during a part of the culture. That is, "the culture is carried out under the condition that the phosphoric acid concentration and / or the potassium concentration in the medium is enhanced” means that the phosphoric acid concentration and / or the potassium concentration in the medium is enhanced during at least a part of the culture. It is sufficient, and it is not necessary that the phosphate concentration and / or potassium concentration in the medium is enhanced during the entire period of the culture.
  • the phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium may be increased to the above-exemplified concentration during the entire period of the culture, or may be increased to the above-exemplified concentration only during a part of the culture.
  • Phosphoric acid and / or potassium may be contained in the medium at the above-exemplified concentration at the start of culturing, or may be supplied to the medium at the above-exemplified concentration after the start of culturing. Further, phosphoric acid and / or potassium is contained in the medium at the above-exemplified concentration at the start of culturing, and is further supplied to the medium at the above-exemplified concentration after the start of culturing (for example, after consumption). You may. When the culture is divided into seed culture and main culture, the phosphate concentration and / or potassium concentration in the medium should be at least during the main culture, that is, during the entire main culture or a part of the main culture.
  • the phosphate concentration and / or potassium concentration in the medium may or may not be enhanced during the seed culture period.
  • the description about the culture for example, “culture period (culture period)” or “culture start" can be read as that for the main culture.
  • the “partial period” is not particularly limited as long as the culture performance of the animal cells (for example, the proliferation of the animal cells and the production of the target substance by the animal cells) is improved.
  • the “partial period” can be appropriately set according to various conditions such as the type of animal cells, the length of the culture period, and the desired production amount of the target substance.
  • “Partial period” is, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more of the entire culture period. It may be there.
  • the "partial period” is, for example, 0.5 days or more, 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more, The period may be 9 days or more, 10 days or more, 12 days or more, or 15 days or more.
  • the phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium may be enhanced to the above-exemplified concentration, for example, as an average value over the entire culture period. That is, "culture is carried out under the condition that the phosphate concentration and / or potassium concentration in the medium is increased to a certain concentration” or "culture is carried out in a medium having a certain phosphoric acid concentration and / or potassium concentration”. By may mean that the average value of phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium throughout the whole period of the culture is within the range of the concentration.
  • the "average value of phosphoric acid concentration and / or potassium concentration in the medium throughout the entire culture period” is not particularly limited as long as the fluctuation of phosphoric acid concentration and / or potassium concentration during the entire culture period can be grasped. May mean, for example, the average value of phosphate and / or potassium concentration in the medium measured every 60 minutes, every 30 minutes, every 20 minutes, or every 10 minutes throughout the culture.
  • the culture is carried out under the condition that the concentration of phosphoric acid and / or the concentration of potassium in the medium is increased” means that, for example, the amount of phosphoric acid and / or potassium supplied to the medium is within a predetermined range. It may mean.
  • the amount of phosphoric acid supplied to the medium is, for example, 0.05 mM or more, 0.1 mM or more, 0.15 mM or more, 0.2 mM or more, 0.25 mM or more, 0.3 mM or more per day throughout the culture.
  • 0.35 mM or more 0.35 mM or more, 0.4 mM or more, 0.45 mM or more, 0.5 mM or more, 0.55 mM or more, 0.6 mM or more, 0.65 mM or more, 0.7 mM or more, 0.75 mM or more, 0.8 mM or more , 0.85 mM or more, 0.9 mM or more, 0.95 mM or more, or 1 mM or more, 5 mM or less, 4 mM or less, 3 mM or less, 2 mM or less, or 1 mM or less, and there is no contradiction between them. It may be a combination.
  • the amount of phosphoric acid supplied to the medium may be 0.05 mM or more per day, especially throughout the culture.
  • the amount of phosphoric acid supplied to the medium may be 0.5 mM or more per day, more particularly throughout the entire culture.
  • the amount of phosphoric acid supplied to the medium is, for example, 0.05 to 5 mM, 0.1 to 4 mM, 0.4 to 3 mM, or 0.7 to 2 mM per day throughout the culture. It may be.
  • the amount of potassium supplied to the medium is, for example, 0.05 mM or more, 0.1 mM or more, 0.15 mM or more, 0.2 mM or more, 0.25 mM or more, 0.3 mM or more per day throughout the culture.
  • the amount of potassium supplied to the medium may be 0.2 mM or more per day, especially throughout the culture. Specifically, the amount of potassium supplied to the medium may be, for example, 0.05 to 5 mM, 0.1 to 3 mM, or 0.2 to 1 mM per day throughout the culture.
  • Phosphoric acid and / or potassium may be continuously supplied to the medium or intermittently supplied to the medium, for example. Phosphoric acid and / or potassium may be supplied to the medium daily or every few days, for example.
  • Supply of phosphoric acid and / or potassium to the medium for example, viable cell density of the animal cells 1.5 ⁇ 10 6 cells / mL or more, 1.6 ⁇ 10 6 cells / mL or more, 1.7 ⁇ 10 6 cells / mL or more, 1.8 ⁇ 10 6 cells / mL or more, 1.9 ⁇ 10 6 cells / mL or more, 2 ⁇ 10 6 cells / mL or more, 3 ⁇ 10 6 cells / mL or more, 5 ⁇ 10 6 cells It may be carried out at a density of / mL or higher, 7 ⁇ 10 6 cells / mL or higher, 1 ⁇ 10 7 cells / mL or higher, or 1 ⁇ 10 8 cells / mL or higher.
  • Culturing may be carried out in the presence of amines, choline, and / or serins. Culturing may be carried out, for example, in the presence of amines, choline, and / or serins, at least when the phosphate concentration in the medium is enhanced. Culturing may be carried out, for example, in the presence of at least amine. Culturing may be carried out, for example, in the presence of at least choline and / or serin.
  • “Culture is performed in the presence of amines, choline, and / or serin” may mean, for example, that the medium contains amines, choline, and / or serine.
  • the amine concentration in the medium is, for example, 0.001 mM or more, 0.002 mM or more, 0.005 mM or more, 0.01 mM or more, 0.02 mM or more, 0.03 mM or more, 0.04 mM or more, 0.05 mM or more, 0.
  • the amine concentration in the medium may be, in particular, 0.002 mM or more.
  • the amine concentration in the medium may be, more particularly, 0.007 mM or more.
  • the amine concentration in the medium may be, for example, 0.002-0.5 mM, 0.005-0.2 mM, or 0.007-0.1 mM.
  • the choline concentration in the medium is, for example, 0.1 mM or more, 0.2 mM or more, 0.5 mM or more, 1 mM or more, 2 mM or more, 3 mM or more, 4 mM or more, 5 mM or more, 6 mM or more, 7 mM or more, 8 mM or more, 9 mM or more.
  • the choline concentration in the medium may be 0.2 mM or more, in particular.
  • the choline concentration in the medium may be, more particularly, 1 mM or more.
  • the choline concentration in the medium may be, for example, 0.2 to 50 mM, 0.5 to 20 mM, or 1 to 10 mM.
  • the serine concentration in the medium is, for example, 0.5 mM or more, 1 mM or more, 2 mM or more, 3 mM or more, 4 mM or more, 5 mM or more, 6 mM or more, 7 mM or more, 8 mM or more, 9 mM or more, 10 mM or more, 12 mM or more, 15 mM or more, It may be 20 mM or more, 25 mM or more, 30 mM or more, 35 mM or more, 40 mM or more, 50 mM or more, 60 mM or more, 70 mM or more, 80 mM or more, 90 mM or more, or 100 mM or more, 500 mM or less, 400 mM or less, 300 mM or less, 200 mM.
  • the serine concentration in the medium may be particularly 2 mM or more.
  • the serine concentration in the medium may be more than 10 mM, more particularly.
  • the serine concentration in the medium may be, for example, 1 to 200 mM, 2 to 100 mM, 4 to 50 mM, 2 to 500 mM, 5 to 200 mM, or 10 to 100 mM.
  • Amine, choline, and / or serine may be contained in the medium for the entire period of the culture, or may be contained in the medium only for a part of the period of the culture. That is, "culture is performed in the presence of amines, choline, and / or serine" or "culture is performed in a medium containing amine, choline, and / or serine” means that amine, choline, and It is sufficient that / or serine is contained in the medium for at least a part of the culture, and it is not necessary that amine, choline, and / or serine be contained in the medium for the entire duration of the culture.
  • Amine, choline, and / or serine may be contained in the medium at the above-exemplified concentrations, for example, during the entire period of the culture, and may be contained in the medium at the above-exemplified concentrations only during a part of the culture. May be good. That is, "culture is carried out in the presence of certain amine, choline and / or serine" or "culture is carried out in medium of certain amine, choline and / or serine concentration".
  • the amine concentration, choline concentration, and / or serine concentration in the medium is within the range of the concentration during at least a part of the culture, and the amine concentration, choline concentration, and / or serine concentration in the medium is It does not have to be within the concentration range for the entire duration of the culture.
  • the amine concentration, choline concentration, and / or serine concentration in the medium may be set to the above-exemplified concentration, for example, as an average value over the entire culture period. That is, "culture is carried out in the presence of certain amine, choline, and / or serine” or "culture is carried out in medium of certain amine, choline, and / or serine concentrations.” May mean that the average value of amine, choline, and / or serine concentrations in the medium throughout the culture is within that concentration range.
  • the "average value of amine concentration, choline concentration, and / or serine concentration in the medium throughout the entire culture period” means that the fluctuation of amine concentration, choline concentration, and / or serine concentration during the entire culture period can be grasped. This is not particularly limited, but for example, the amine concentration, choline concentration, and / or serine concentration in the medium measured every 60 minutes, 30 minutes, 20 minutes, or 10 minutes throughout the culture period. It may mean an average value.
  • culture is carried out in the presence of amines, choline, and / or serin may mean, for example, that the medium is supplied with amine, choline, and / or serine.
  • the amount of amine supplied to the medium is, for example, 0.0002 mM or more, 0.0005 mM or more, 0.001 mM or more, 0.0015 mM or more, 0.002 mM or more, 0.0025 mM or more, per day throughout the culture. It may be 0.003 mM or more, 0.0035 mM or more, 0.004 mM or more, 0.0045 mM or more, or 0.005 mM or more, 0.025 mM or less, 0.02 mM or less, 0.015 mM or less, 0.01 mM or less.
  • the supply of amine to the medium may be 0.0005 mM or more per day, especially throughout the culture.
  • the amount of amine supplied to the medium is, for example, 0.0005 to 0.025 mM mM, 0.001 to 0.015 mM, 0.002 to 0.007 mM, or 0.003 to 0 per day throughout the culture. It may be .004 mM.
  • the amount of choline supplied to the medium is, for example, 0.02 mM or more, 0.05 mM or more, 0.1 mM or more, 0.15 mM or more, 0.2 mM or more, 0.25 mM or more per day throughout the culture. It may be 0.3 mM or more, 0.35 mM or more, 0.4 mM or more, 0.45 mM or more, or 0.5 mM or more, 2.5 mM or less, 2 mM or less, 1.5 mM or less, 1 mM or less, 0.7 mM. Hereinafter, it may be 0.5 mM or less, 0.2 mM or less, or 0.1 mM or less, and may be a consistent combination thereof.
  • the supply of choline to the medium may be 0.05 mM or more per day, especially throughout the culture.
  • the supply of choline to the medium is, for example, 0.05-2.5 mM, 0.1-1.5 mM, 0.2-0.7 mM, or 0.3-0 per day throughout the culture. It may be .5 mM.
  • the amount of serin supplied to the medium is, for example, 0.1 mM or more, 0.2 mM or more, 0.3 mM or more, 0.4 mM or more, 0.5 mM or more, 0.6 mM or more, per day throughout the culture.
  • the supply of serin to the medium may be 0.5 mM or more per day, especially throughout the culture.
  • the amount of serin supplied to the medium is, for example, 0.2 to 10 mM, 0.4 to 5 mM, 0.8 to 3 mM, 0.5 to 25 mM, 1 to 15 mM, 2 to per day throughout the culture. It may be 7 mM, or 3.5-5 mM.
  • Amine, choline, and / or serine may be supplied to the medium continuously or intermittently, for example. Amines, choline, and / or serine may be supplied to the medium daily or every few days, for example.
  • the phosphoric acid concentration in the fed-batch medium is not particularly limited as long as the desired amount of phosphoric acid can be supplied.
  • the phosphoric acid concentration in the fed-batch medium may be, for example, the phosphoric acid concentration in the above-exemplified medium.
  • the phosphoric acid concentration in the fed-batch medium may be the phosphoric acid concentration in the above-exemplified medium.
  • the phosphoric acid concentration in the fed-batch medium is, for example, more than 1 times, 1.1 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more the phosphoric acid concentration in the above-exemplified medium.
  • the concentration may be 3 times or more, 5 times or more, 7 times or more, 10 times or more, 15 times or more, or 20 times or more, and 100 times or less, 70 times or less, 50 times or less, 30 times or less, 20 times or more.
  • the concentration may be 10 times or less, or 5 times or less, and may be a consistent combination thereof.
  • the phosphoric acid concentration in the fed-batch medium may be, for example, 10 mM or more, 20 mM or more, 30 mM or more, 50 mM or more, 70 mM or more, 100 mM or more, 150 mM or more, or 200 mM or more, 1000 mM or less, 700 mM or less, It may be 500 mM or less, 300 mM or less, 200 mM or less, 100 mM or less, 70 mM or less, or 50 mM or less, and may be a consistent combination thereof. Specifically, the phosphoric acid concentration in the fed-batch medium may be, for example, 10 to 1000 mM, 30 to 500 mM, or 50 to 200 mM.
  • the amine concentration in the fed-batch medium is not particularly limited as long as the desired amount of amine can be supplied.
  • the amine concentration in the fed-batch medium may be, for example, the amine concentration in the above-exemplified medium.
  • the amine concentration in the fed-batch medium may be the amine concentration in the above-exemplified medium.
  • the amine concentration in the fed-batch medium is, for example, more than 1 times, 1.1 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, or 3 times the amine concentration in the above-exemplified medium.
  • the concentration may be 5 times or more, 7 times or more, 10 times or more, 15 times or more, or 20 times or more, 100 times or less, 70 times or less, 50 times or less, 30 times or less, 20 times or less,
  • the concentration may be 10 times or less, or 5 times or less, and may be a consistent combination thereof.
  • the amine concentration in the fed-batch medium is, for example, 0.05 mM or more, 0.1 mM or more, 0.2 mM or more, 0.3 mM or more, 0.5 mM or more, 0.7 mM or more, 1 mM or more, or 1 mM or more.
  • the amine concentration in the fed-batch medium may be, for example, 0.05 to 5 mM, 0.1 to 3 mM, or 0.2 to 1 mM.
  • the choline concentration in the fed-batch medium is not particularly limited as long as the desired amount of choline can be supplied.
  • the choline concentration in the fed-batch medium may be, for example, the choline concentration in the above-exemplified medium.
  • the choline concentration in the fed-batch medium may be the choline concentration in the above-exemplified medium.
  • the choline concentration in the fed-batch medium is, for example, more than 1 times, 1.1 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, and 3 times the choline concentration in the above-exemplified medium.
  • the concentration may be 5 times or more, 7 times or more, 10 times or more, 15 times or more, or 20 times or more, 100 times or less, 70 times or less, 50 times or less, 30 times or less, 20 times or less,
  • the concentration may be 10 times or less, or 5 times or less, and may be a consistent combination thereof.
  • the choline concentration in the fed-batch medium may be, for example, 5 mM or more, 10 mM or more, 20 mM or more, 30 mM or more, 50 mM or more, 70 mM or more, or 100 mM or more, and 500 mM or less, 300 mM or less, 200 mM or less, 100 mM.
  • the choline concentration in the fed-batch medium may be, for example, 5 to 500 mM, 10 to 300 mM, or 20 to 100 mM.
  • the serine concentration in the fed-batch medium is not particularly limited as long as the desired amount of serine to be supplied can be obtained.
  • the serine concentration in the fed-batch medium may be, for example, the serine concentration in the above-exemplified medium.
  • the serine concentration in the fed-batch medium may be the serine concentration in the above-exemplified medium.
  • the serine concentration in the fed-batch medium is, for example, more than 1 times, 1.1 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more and 3 times the serine concentration in the above-exemplified medium.
  • the concentration may be 5 times or more, 7 times or more, 10 times or more, 15 times or more, or 20 times or more, 100 times or less, 70 times or less, 50 times or less, 30 times or less, 20 times or less, The concentration may be 10 times or less, or 5 times or less, and may be a consistent combination thereof.
  • the serine concentration in the fed-batch medium may be, for example, 20 mM or more, 30 mM or more, 50 mM or more, 70 mM or more, 100 mM or more, 200 mM or more, 300 mM or more, 500 mM or more, 700 mM or more, or 1000 mM or more, and 5000 mM.
  • the serine concentration in the fed-batch medium may be, for example, 30 to 2000 mM, 50 to 1000 mM, 70 to 500 mM, 50 to 5000 mM, 100 to 3000 mM, or 200 to 1000 mM.
  • the concentration of various components can be measured, for example, by a known method used for detecting or identifying a compound. Such methods include, for example, HPLC, UPLC, LC / MS, GC / MS, NMR. These methods can also be used to confirm that the target substance has been produced. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in combination as appropriate.
  • Animal cells can be cultured as described above.
  • the target substance is produced (for example, the target protein is expressed) by culturing the animal cell as described above, and thus the target substance is contained.
  • the culture to be used is obtained.
  • the target substance such as the target protein may be accumulated in the medium, the cell surface, the cell, or a combination thereof.
  • the production of the target protein can be confirmed by a known method used for protein detection or identification.
  • a known method used for protein detection or identification examples include SDS-PAGE, Western blotting, mass spectrometry, N-terminal amino acid sequence analysis, and enzyme activity measurement.
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • Western blotting Western blotting
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • N-terminal amino acid sequence analysis N-terminal amino acid sequence analysis
  • enzyme activity measurement One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in combination as appropriate.
  • the target protein can be recovered as appropriate. Specifically, the target protein can be recovered as an appropriate fraction containing the target protein. Examples of such a fraction include cultures, culture supernatants, cultured cells, and processed products of cultured cells (crushed products, lysates, extracts (cell-free extracts). Cultured cells include, for example, It may be obtained in the form of immobilized cells immobilized with a carrier such as acrylamide or carrageenan.
  • the target protein may be further purified to the desired degree.
  • the target protein When the target protein accumulates in the medium, the target protein can be purified from the supernatant after removing the solid content of cells or the like from the culture by centrifugation or the like.
  • the target protein When the target protein accumulates in the cell, the target protein can be purified from the processed product after being subjected to a treatment such as crushing, lysing, or extracting the cell, for example.
  • the cells can be recovered from the culture by centrifugation or the like.
  • Treatments such as cell disruption, lysis, and extraction can be performed by known methods. Examples of such a method include an ultrasonic crushing method, a dynomill method, a bead crushing method, a French press crushing method, and a lysozyme treatment. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in combination as appropriate.
  • the target protein When the target protein accumulates on the cell surface, the target protein can be purified from the solubilized product after being solubilized, for example.
  • Solubilization can be performed by a known method. Such methods include, for example, increasing the salt concentration and using a surfactant. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in combination as appropriate.
  • Purification of the target protein can be performed by a known method used for protein purification.
  • a known method used for protein purification include sulfur fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and isoelectric point precipitation.
  • sulfur fractionation ion exchange chromatography
  • hydrophobic chromatography affinity chromatography
  • gel filtration chromatography gel filtration chromatography
  • isoelectric point precipitation One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in combination as appropriate.
  • the target protein may be obtained in a free state or in a state of an immobilized enzyme immobilized on a solid phase such as a resin.
  • the recovered target protein may be appropriately formulated.
  • the dosage form is not particularly limited and can be appropriately set according to various conditions such as the intended use of the target protein. Dosage forms include, for example, liquids, suspensions, powders, tablets, pills and capsules. In formulation, pharmacologically acceptable additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, odorants, fragrances, diluents, surfactants, etc. Can be used.
  • the medium of the present invention is a medium for culturing animal cells in which the phosphoric acid concentration and / or the potassium concentration is enhanced.
  • the medium of the present invention can be used, for example, in the method of the present invention.
  • the description of the medium used in the method of the present invention can be applied mutatis mutandis.
  • the medium of the present invention contains phosphoric acid and / or potassium.
  • the medium of the present invention may further contain amines, choline, and / or serine.
  • the medium of the present invention may contain amines, choline, and / or serine, for example, if it contains at least phosphoric acid.
  • the medium of the present invention may contain, for example, at least an amine.
  • the medium of the present invention may contain, for example, at least choline and / or serine.
  • the medium of the present invention may be, for example, a basal medium (initial medium) or a fed-batch medium.
  • the fed-batch medium may be used for, for example, fed-batch culture or continuous culture.
  • the fed-batch medium may be, for example, one used for perfusion culture.
  • the description of the phosphoric acid concentration in the medium (including the description of the phosphoric acid concentration in the feed medium) in the method of the present invention exemplified above can be applied mutatis mutandis.
  • the description of the potassium concentration in the medium (including the description of the potassium concentration in the fed-batch medium) in the method of the present invention exemplified above can be applied mutatis mutandis.
  • the description of the amine concentration in the medium (including the description of the amine concentration in the fed-batch medium) in the method of the present invention exemplified above can be applied mutatis mutandis.
  • the description of the choline concentration in the medium (including the description of the choline concentration in the fed-batch medium) in the method of the present invention exemplified above can be applied mutatis mutandis.
  • the description of the serine concentration in the medium (including the description of the serine concentration in the feed medium) in the method of the present invention exemplified above can be applied mutatis mutandis.
  • Example 1 Evaluation of the effect of improving CHO cell proliferation and antibody production by adding phosphoric acid to the feeding medium
  • the effect of improving CHO cell proliferation and antibody production by adding phosphoric acid to the feeding medium was evaluated. evaluated.
  • CHO cells cells of the CHO DG-44 lineage modified to produce the antibody Adalimumab were used.
  • Basal medium CELLiST registered trademark
  • Basal media (Ajinomoto Co., Ltd .: BASAL4P; containing phosphoric acid with a final concentration of 1.9 mM), LR3-IGF-1 (final concentration 10 ⁇ g / mL), sodium dextran sulfate (Final concentration 400 mg / L) and L-Glutamine (final concentration 6 mM) were added to prepare a basal medium.
  • Feed media (Ajinomoto Co., Ltd .: FEED2)
  • glucose final concentration 75 g / L
  • sodium dihydrogen phosphate final concentration 0, 125, 250, 500, 1000
  • 4000 or 7000 mg / L (ie, 0.0, 1.0, 2.1, 4.2, 8.3, 33.3, or 58.3 mM) was added to prepare seven fed-batch media with different phosphate concentrations.
  • Cell culture medium was sampled on days 4, 7, 9, 11, and 14 of the start of culture, and the number of viable cells was measured using a living-and-dead cell autoanalyzer Vi-CELL TM XR (Beckman Coulter), and the amount of antibody produced. was measured using Octet QK (FORTEBIO).
  • Example 2 Evaluation of the effect of improving CHO cell proliferation and antibody production by adding phosphoric acid to the feed medium
  • the effect of improving CHO cell proliferation and antibody production by adding phosphoric acid to the feed medium was evaluated. evaluated.
  • CHO cells cells of the CHO DG-44 lineage modified to produce the antibody Adalimumab were used.
  • Basal medium CELLiST registered trademark
  • Basal media (Ajinomoto Co., Ltd .: BASAL4P; containing phosphoric acid with a final concentration of 1.9 mM), LR3-IGF-1 (final concentration 10 ⁇ g / mL), diphosphate Sodium hydrogen hydrogen (115 mg / L (ie, final concentration 2.9 mM)), sodium dextran sulfate (final concentration 400 mg / L) and L-Glutamine (final concentration 6 mM) were added to prepare a basal medium.
  • Basal media (Ajinomoto Co., Ltd .: BASAL4P; containing phosphoric acid with a final concentration of 1.9 mM
  • LR3-IGF-1 final concentration 10 ⁇ g / mL
  • diphosphate Sodium hydrogen hydrogen 115 mg / L (ie, final concentration 2.9 mM)
  • sodium dextran sulfate final concentration 400 mg / L
  • L-Glutamine final concentration
  • Feed media (Ajinomoto Co., Ltd .: FEED2)
  • glucose final concentration 75 g / L
  • sodium dihydrogen phosphate final concentration 0, 1000, 2000, 3000, 4000
  • 5000 mg / L ie 0.0, 8.3, 16.7, 25, 33.3, or 41.7 mM
  • Cell culture medium was sampled on days 4, 7, 9, 11, and 14 of the start of culture, and the number of viable cells was measured using a living-and-dead cell autoanalyzer Vi-CELL TM XR (Beckman Coulter), and the amount of antibody produced. was measured using CEDEX Bio HT (Roche Diagnostics).
  • Example 3 Evaluation of the effect of adding phosphoric acid and serine, choline, or amine to the feed medium to improve CHO cell proliferation and antibody production
  • phosphoric acid and serine, choline, etc. to the feed medium
  • the effect of adding amine on improving CHO cell proliferation and antibody production was evaluated.
  • CHO cells cells of the CHO S lineage modified to produce the antibody Adalimumab were used.
  • Basal medium CELLiST registered trademark
  • Basal media (Ajinomoto Co., Ltd .: BASAL4P; containing phosphoric acid with a final concentration of 1.9 mM), LR3-IGF-1 (final concentration 10 ⁇ g / mL), diphosphate Sodium hydrogen hydrogen (115 mg / L (ie, total final concentration 2.9 mM with phosphate contained in Basal media)), sodium dextran sulfate (final concentration 400 mg / L), and L-Glutamine (final concentration 6 mM) ) was added to prepare a basal medium.
  • Basal media Ajinomoto Co., Ltd .: BASAL4P
  • LR3-IGF-1 final concentration 10 ⁇ g / mL
  • diphosphate Sodium hydrogen hydrogen 115 mg / L (ie, total final concentration 2.9 mM with phosphate contained in Basal media)
  • sodium dextran sulfate final concentration 400 mg / L
  • Feed media (Ajinomoto Co., Ltd .: FEED2), glucose (final concentration 75 g / L), sodium dihydrogen phosphate (final concentration 0 or 2500 mg / L (ie, that is) 0.0 or 20.8 mM)), and if necessary, the following components (A), (B), (C), or (D) were added to prepare 10 types of fed-batch media: (A) 1,4-Butanediamine (final concentration 12.8 mg / L (ie 0.145 mM)); (B) Serine (final concentration 20,000 mg / L (ie 190 mM)), choline bitartrate (final concentration 4,400 mg / L (ie 17.4 mM)), and 1,4-butanediamine (final concentration 12.8 mg /).
  • Cell culture medium was sampled on days 4, 7, 9, 11 and 14 of the start of culture, the number of viable cells was measured using a flow cytometer guava easyCyte (Luminex), and the amount of antibody produced was measured by CEDEX Bio HT (Roche. It was measured using Diagnostics).
  • Luminex flow cytometer guava easyCyte
  • CEDEX Bio HT Roche. It was measured using Diagnostics.
  • Example 4 Evaluation of CHO cell proliferation and antibody production improving effect by addition of phosphoric acid or potassium to the feed medium
  • CHO cell proliferation and CHO cell proliferation by addition of phosphoric acid or potassium to the feed medium The effect of improving antibody production was evaluated.
  • CHO cells cells of the CHO S lineage modified to produce the antibody Herceptin were used.
  • Cell culture medium was sampled on days 4, 7, 9, 11, and 14 of the start of culture, and the number of viable cells was measured using a living-and-dead cell autoanalyzer Vi-CELL TM XR (Beckman Coulter), and the amount of antibody produced. was measured using CEDEX Bio HT (Roche Diagnostics).
  • cell culture medium was sampled on the 4th, 7th, 9th, and 11th days after the start of culture, and the glucose concentration was measured using CEDEX Bio HT (Roche Diagnostics), and the final glucose concentration was 11 g / A 500 g / L glucose aqueous solution was added so as to have L.
  • Example 5 Evaluation of the effect of improving antibody production by phosphate-enriched medium in Perfusion culture
  • the effect of improving CHO cell proliferation and antibody production by adding phosphate to the basal medium and flow medium was applied to Perfusion culture. Evaluated.
  • CHO cells cells of the CHO S lineage modified to produce the antibody Adalimumab were used.
  • the medium exchange was carried out by centrifuging the culture medium, removing it so that 3.68 mL of the centrifugal supernatant remained, adding 6.32 mL of the same fresh fed-batch medium as the basal medium, and stirring. After changing the medium, the culture was restarted. The number of living cells was measured using a living-and-dead cell autoanalyzer Vi-CELL TM XR (Beckman Coulter), and the amount of antibody produced was measured using CEDEX Bio HT (Roche Diagnostics).
  • Example 6 Evaluation of the effect of improving antibody production by the phosphate-enriched medium in Perfusion culture
  • the effect of improving CHO cell proliferation and antibody production by adding phosphate to the flow medium was evaluated in Perfusion culture. ..
  • CHO cells cells of the CHO S lineage modified to produce the antibody Adalimumab were used.
  • the medium exchange was carried out by centrifuging the culture medium, removing it so that 3.68 mL of the centrifugal supernatant remained, and adding 6.32 mL of fresh fed-batch medium. After changing the medium, the culture was restarted.
  • the number of living cells was measured using a living-and-dead cell autoanalyzer Vi-CELL TM XR (Beckman Coulter), and the amount of antibody produced was measured using CEDEX Bio HT (Roche Diagnostics).
  • animal cells for example, proliferation of animal cells and production of target substance by animal cells.

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Abstract

動物細胞を発現宿主とした目的タンパク質の製造方法を提供する。目的タンパク質生産能を有する動物細胞を培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件で培養することにより目的タンパク質を製造する。

Description

タンパク質の製造方法
　本発明は、動物細胞の培養方法に関するものである。本発明の一態様は、動物細胞によるタンパク質等の目的物質の製造方法に関するものである。
　動物細胞は、組み換えタンパク質の発現宿主として利用されている。
　チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO）の発現宿主とする組み換えタンパク質の製造方法としては、培地中のリン酸濃度が１．５～３．５ｍＭとなるようにリン酸を含有する流加培地を流加する方法が報告されている（特許文献１）。
　また、高濃度のコリンを含有する培地を用いて細胞を培養する方法（特許文献２）、高濃度のセリンを含有する培地を用いて細胞を培養する方法（特許文献３）、および高濃度のアミンを含有する培地を用いて細胞を培養する方法（特許文献４）が知られている。
US6,924,124 WO2011/134921A1 WO2008/136398A1 WO2007/077217A2
　本発明は、動物細胞の培養成績（例えば、動物細胞の増殖や動物細胞による目的物質生産）を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。
　本発明者らは、動物細胞の培養の際の培地中のリン酸やカリウム等の特定の成分の濃度を増強することにより動物細胞の培養成績（例えば、動物細胞の増殖や動物細胞による目的物質生産）が向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
　目的物質の製造方法であって、
　目的物質生産能を有する動物細胞を培地で培養すること；および
　目的物質を回収すること
　を含み、
　前記培養が、下記（Ａ）および／または（Ｂ）の条件で実施される、方法：
（Ａ）前記培地中のリン酸濃度を４ｍＭ以上に増強した条件；
（Ｂ）前記培地中のカリウム濃度を１ｍＭ以上に増強した条件。
［２］
　前記目的物質が、タンパク質である、前記方法。
［３］
　動物細胞の培養方法であって、
　動物細胞を培地で培養すること
　を含み、
　前記培養が、下記（Ａ）および／または（Ｂ）の条件で実施される、方法：
（Ａ）前記培地中のリン酸濃度を４ｍＭ以上に増強した条件；
（Ｂ）前記培地中のカリウム濃度を１ｍＭ以上に増強した条件。
［４］
　前記培養が、少なくとも、前記培地中のリン酸濃度を増強した条件で実施される、前記方法。
［５］
　前記培養の際の前記培地中のリン酸濃度が、１１ｍＭ以上である、前記方法。
［６］
　リン酸および／またはカリウムが、培養開始時に前記濃度で前記培地に含有される、前記方法。
［７］
　リン酸および／またはカリウムが、培養開始後に前記濃度で前記培地に含有されるように該培地に供給される、前記方法。
［８］
　リン酸および／またはカリウムが、培養の全期間を通じての平均値として、前記濃度で前記培地に含有される、前記方法。
［９］
　リン酸が、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、前記方法。
［１０］
　リン酸が、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、前記方法。
［１１］
　カリウムが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．２ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、前記方法。
［１２］
　前記培養が、リン酸濃度が４ｍＭ以上の流加培地を用いた灌流培養により実施される、前記方法。
［１３］
　前記培養が、リン酸濃度が１１ｍＭ以上の流加培地を用いた灌流培養により実施される、前記方法。
［１４］
　前記培養が、アミンの存在下で実施される、前記方法。
［１５］
　前記アミンが、1,4-ブタンジアミンである、前記方法。
［１６］
　前記培養が、コリンおよび／またはセリンの存在下で実施される、前記方法。
［１７］
　前記培養の際の前記培地中のアミン濃度が、０．００２ｍＭ以上である、前記方法。
［１８］
　前記培養の際の前記培地中のコリン濃度が、０．２ｍＭ以上である、前記方法。
［１９］
　前記培養の際の前記培地中のセリン濃度が、２ｍＭ以上である、前記方法。
［２０］
　前記アミン、コリン、および／またはセリンが、培養開始時に前記濃度で前記培地に含有される、前記方法。
［２１］
　前記アミン、コリン、および／またはセリンが、培養開始後に前記濃度で前記培地に含有されるように該培地に供給される、前記方法。
［２２］
　前記アミン、コリン、および／またはセリンが、培養の全期間を通じての平均値として、前記濃度で前記培地に含有される、前記方法。
［２３］
　前記アミンが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０００５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、前記方法。
［２４］
　コリンが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、前記方法。
［２５］
　セリンが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、前記方法。
［２６］
　リン酸濃度および／またはカリウム濃度が増強された、動物細胞培養用の培地。
［２７］
　少なくとも、リン酸濃度が増強された、前記培地。
［２８］
　さらに、アミンを含有する、前記培地。
［２９］
　前記アミンが、1,4-ブタンジアミンである、前記培地。
［３０］
　さらに、コリンおよび／またはセリンを含有する、前記培地。
［３１］
　初発培地である、前記培地。
［３２］
　流加培地である、前記培地。
流加培地中のリン酸濃度がCHO細胞の増殖に与える影響を示す図。 流加培地中のリン酸濃度がCHO細胞による抗体生産に与える影響を示す図。 培養液中のリン酸濃度の推移を示す図。 流加培地中のリン酸濃度がCHO細胞による抗体生産に与える影響を示す図。 流加培地中のリン酸、アミン、コリン、およびセリンの濃度がCHO細胞による抗体生産に与える影響を示す図。 流加培地中のリン酸およびカリウムの濃度がCHO細胞による抗体生産に与える影響を示す図。 基礎培地および流加培地中のリン酸濃度が灌流培養（Perfusion培養）におけるCHO細胞による抗体生産に与える影響を示す図。 流加培地中のリン酸濃度が灌流培養（Perfusion培養）におけるCHO細胞による抗体生産に与える影響を示す図。
＜１＞本発明の方法
　本発明の方法は、動物細胞の培養方法であって、動物細胞を培地で培養することを含み、前記培養が前記培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件で実施される方法である。
　一態様においては、動物細胞の培養により目的物質が製造されてもよい。すなわち、動物細胞が目的物質生産能を有する場合、同細胞の培養により目的物質を製造することができる。すなわち、本発明の方法の一態様は、目的物質の製造方法であって、目的物質生産能を有する動物細胞を培地で培養すること、および目的物質を回収することを含み、前記培養が前記培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件で実施される方法であってもよい。
　目的物質は、動物細胞により製造できるものであれば、特に制限されない。目的物質としては、タンパク質が挙げられる。目的物質として製造されるタンパク質を、「目的タンパク質」ともいう。
　動物細胞は、特に制限されない。動物細胞は、例えば、動物細胞の用途等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、動物細胞を目的タンパク質の製造に利用する場合、動物細胞は、目的タンパク質を発現できるものであれば、特に制限されない。動物細胞を、「宿主」、「発現宿主」、または「宿主細胞」ともいう。動物としては、哺乳類、鳥類、両生類が挙げられる。動物としては、特に、哺乳類が挙げられる。哺乳類としては、げっ歯類や霊長類が挙げられる。げっ歯類としては、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。ハムスターとしては、チャイニーズハムスターが挙げられる。霊長類としては、ヒト、サル、チンパンジーが挙げられる。サルとしては、アフリカミドリザルが挙げられる。鳥類としては、ニワトリが挙げられる。両生類としては、アフリカツメガエルが挙げられる。また、動物細胞が由来する組織または細胞は、特に制限されない。動物細胞が由来する組織または細胞としては、卵巣、腎臓、副腎、舌上皮、嗅上皮、松果体、甲状腺、メラノサイトが挙げられる。チャイニーズハムスターの細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO）が挙げられる。CHOとして、具体的には、CHO-DG44やCHO-K1が挙げられる。ヒトの細胞としては、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（HEK）が挙げられる。HEKとして、具体的には、HEK293やHEK293Tが挙げられる。アフリカミドリザルの細胞としては、アフリカミドリザル腎細胞由来細胞株（COS）が挙げられる。COSとして、具体的には、COS-1が挙げられる。アフリカツメガエルの細胞として、具体的には、アフリカツメガエル卵母細胞が挙げられる。
　「目的物質生産能を有する動物細胞」とは、目的物質を生産する能力を有する動物細胞を意味する。「目的物質生産能を有する動物細胞」とは、具体的には、培地で培養した際に、目的物質を生成（例えば、目的タンパク質を発現）し、回収できる程度に培養物中に蓄積する能力を有する動物細胞を意味してよい。「培養物中への蓄積」とは、具体的には、培地中、細胞表層、細胞内、またはそれらの組み合わせへの蓄積を意味してよい。なお、目的物質が細胞外（例えば、培地中または細胞表層）に蓄積する場合を、目的物質の「分泌」または「分泌生産」ともいう。すなわち、動物細胞は、目的物質の分泌生産能（目的物質を分泌生産する能力）を有していてもよい。目的物質の蓄積量は、例えば、培養物中への蓄積量として、10 μg/L以上、1 mg/L以上、100 mg/L以上、または1 g/L以上であってよい。動物細胞は、１種の目的物質の生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上の目的物質の生産能を有していてもよい。
　動物細胞は、本来的に目的物質生産能を有するものであってもよく、目的物質生産能を有するように改変されたものであってもよい。また、動物細胞は、本来的に有する目的物質生産能が増強されるように改変されたものであってもよい。目的物質生産能を有する動物細胞は、例えば、上記のような動物細胞に目的物質生産能を付与することにより、または、上記のような動物細胞の目的物質生産能を増強することにより、取得できる。例えば、目的タンパク質生産能は、目的タンパク質をコードする遺伝子の導入により、付与または増強できる。目的タンパク質をコードする遺伝子を、「目的タンパク質遺伝子」ともいう。
　目的タンパク質は、動物細胞を宿主として発現可能なものであれば、特に制限されない。タンパク質は、宿主由来のタンパク質であってもよく、異種タンパク質（heterologous protein）であってもよい。「異種タンパク質（heterologous protein）」とは、同タンパク質を生産する宿主（すなわち、目的タンパク質生産能を有する動物細胞）にとって外来性（exogenous）であるタンパク質をいう。目的タンパク質は、例えば、天然に存在するタンパク質であってもよく、それらを改変したタンパク質であってもよく、人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。目的タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウイルス由来のタンパク質であってもよい。目的タンパク質は、特に、ヒト由来のタンパク質であってもよい。目的タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。目的タンパク質は、分泌性タンパク質であってもよく、非分泌性タンパク質であってもよい。なお、「タンパク質」には、オリゴペプチドやポリペプチド等の、ペプチドと呼ばれるものも包含される。
　目的タンパク質として、具体的には、酵素、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、抗原タンパク質、その他のタンパク質が挙げられる。
　酵素としては、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼ、およびキチナーゼが挙げられる。
　生理活性タンパク質としては、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカイン、抗体関連分子が挙げられる。
　成長因子（増殖因子）としては、上皮成長因子（Epidermal growth factor；EGF）、インスリン様成長因子-1（Insulin-like growth factor-1；IGF-1）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor；TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor；NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor；BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor；VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin；EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin；TPO）、酸性線維芽細胞増殖因子（Acidic fibroblast growth factor；aFGFまたはFGF1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（Basic fibroblast growth factor；bFGFまたはFGF2）、角質細胞増殖因子（Keratinocyte growth factor；KGF-1またはFGF7や、KGF-2またはFGF10）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；HGF）、幹細胞因子（Stem Cell Factor；SCF）、アクチビン（Activin）が挙げられる。アクチビンとしては、アクチビンA, C, Eが挙げられる。
　ホルモンとしては、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（somatostatin）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）、カルシトニン（calcitonin）、エキセナチド（exenatide）が挙げられる。
　サイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。
　また、生理活性タンパク質は、タンパク質全体であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生理活性を有する部分が挙げられる。生理活性を有する部分として、具体的には、例えば、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）の成熟体のN末端３４アミノ酸残基からなる生理活性ペプチドTeriparatideが挙げられる。
　「抗体関連分子」とは、完全抗体を構成するドメインから選択される単一のドメインまたは２もしくはそれ以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質を意味してよい。完全抗体を構成するドメインとしては、重鎖のドメインであるVH、CH1、CH2、およびCH3、ならびに軽鎖のドメインであるVLおよびCLが挙げられる。抗体関連分子は、上述の分子種を含む限り、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。なお、抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。抗体関連分子として、具体的には、完全抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fc、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Fc融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Fv（scFv）、sc(Fv)2、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、diabody、VHHフラグメント（nanobody（登録商標））が挙げられる。抗体関連分子として、より具体的には、トラスツズマブ（Trastuzumab）、アダリムマブ（Adalimumab）、ニボルマブ（Nivolumab）が挙げられる。
　レセプタータンパク質としては、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質が挙げられる。その他の生理活性物質としては、ドーパミン等の神経伝達物質が挙げられる。なお、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。
　抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されない。抗原タンパク質は、例えば、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択できる。抗原タンパク質は、例えば、ワクチンとして使用することができる。
　その他のタンパク質としては、Liver-type fatty acid-binding protein（LFABP）、蛍光タンパク質、イムノグロブリン結合タンパク質、アルブミン、フィブロイン様タンパク質、細胞外タンパク質が挙げられる。蛍光タンパク質としては、Green Fluorescent Protein（GFP）が挙げられる。イムノグロブリン結合タンパク質としては、Protein A、Protein G、Protein Lが挙げられる。アルブミンとしては、ヒト血清アルブミンが挙げられる。フィブロイン様タンパク質としては、WO2017/090665やWO2017/171001に開示されたものが挙げられる。
　細胞外タンパク質としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、ラミニン、それらの部分配列が挙げられる。ラミニンは、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンとしては、哺乳類のラミニンが挙げられる。ラミニンのサブユニット鎖（すなわち、α鎖、β鎖、およびγ鎖）としては、５種のα鎖（α１～α５）、３種のβ鎖（β１～β３）、３種のγ鎖（γ１～γ３）が挙げられる。ラミニンは、これらサブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンとして、具体的には、例えば、ラミニン111、ラミニン121、ラミニン211、ラミニン213、ラミニン221、ラミニン311、ラミニン321、ラミニン332、ラミニン411、ラミニン421、ラミニン423、ラミニン511、ラミニン521、ラミニン523が挙げられる。ラミニンの部分配列としては、ラミニンのE8断片であるラミニンE8が挙げられる。ラミニンE8は、具体的には、α鎖のE8断片（α鎖E8）、β鎖のE8断片（β鎖E8）、およびγ鎖のE8断片（γ鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンE8のサブユニット鎖（すなわち、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）を総称して、「E8サブユニット鎖」ともいう。E8サブユニット鎖としては、上記例示したラミニンサブユニット鎖のE8断片が挙げられる。ラミニンE8は、これらE8サブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンE8として、具体的には、例えば、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、ラミニン521E8が挙げられる。
　目的タンパク質は、例えば、上記のようなタンパク質の公知または天然のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、目的タンパク質は、例えば、上記のようなタンパク質の公知または天然のアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。バリアントとしては、公知または天然のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。「１又は数個」とは、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味してよい。バリアントとしては、公知または天然のアミノ酸配列全体に対して、例えば、５０％以上、６５％以上、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質も挙げられる。なお、由来する生物種で特定されるタンパク質は、当該生物種において見出されるタンパク質そのものに限られず、当該生物種において見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。バリアントは、当該生物種において見出されてもよく、見出されなくてもよい。すなわち、例えば、「ヒト由来タンパク質」とは、ヒトにおいて見出されるタンパク質そのものに限られず、ヒトにおいて見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。
　なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味する。
　目的タンパク質遺伝子は、上記のような目的タンパク質をコードするものであれば、特に制限されない。目的タンパク質遺伝子は、例えば、上記のようなタンパク質をコードする遺伝子の公知または天然の塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、目的タンパク質遺伝子は、例えば、上記のようなタンパク質をコードする遺伝子の公知または天然の塩基配列を有する遺伝子のバリアントであってもよい。目的タンパク質遺伝子は、例えば、上記例示したようなバリアント配列を有するタンパク質をコードするよう改変されてもよい。目的タンパク質遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。目的タンパク質遺伝子は、例えば、宿主細胞のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されていてもよい。
　なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、対応する発現産物をコードする限り、DNAに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「目的タンパク質遺伝子」とは、目的タンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。目的タンパク質遺伝子は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、その組み合わせであってもよい。目的タンパク質遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。目的タンパク質遺伝子は、一本鎖DNAであってもよく、一本鎖RNAであってもよい。目的タンパク質遺伝子は、二本鎖DNAであってもよく、二本鎖RNAであってもよく、DNA鎖とRNA鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。目的タンパク質遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、DNA残基とRNA残基の両方を含んでいてもよい。目的タンパク質遺伝子は、イントロンを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。目的タンパク質遺伝子の態様は、目的タンパク質の発現手段等の諸条件に応じて適宜選択できる。
　「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
　目的タンパク質は、目的タンパク質遺伝子から発現する。すなわち、目的タンパク質生産能を有する動物細胞は、目的タンパク質遺伝子を有する。目的タンパク質生産能を有する動物細胞は、具体的には、目的タンパク質遺伝子を発現可能に有する。なお、目的タンパク質生産能を有する動物細胞は、所望の程度に目的タンパク質を発現するまで目的タンパク質遺伝子を有していれば足りる。すなわち、目的タンパク質生産能を有する動物細胞は、目的タンパク質の発現後には、目的タンパク質遺伝子を有していてもよく、いなくてもよい。なお、「目的タンパク質遺伝子の発現」と「目的タンパク質の発現」とは同義に用いられてよい。
　目的タンパク質遺伝子は、目的タンパク質遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。また、目的タンパク質遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
　取得した目的タンパク質遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、目的タンパク質遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、目的タンパク質遺伝子のバリアントを化学合成によって直接取得してもよい。
　目的タンパク質遺伝子を宿主細胞に導入する形態は特に制限されない。目的タンパク質遺伝子は、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。具体的には、例えば、目的タンパク質遺伝子をDNA等の転写を要する形態で導入する場合、宿主細胞において、目的タンパク質遺伝子は、当該宿主細胞で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主細胞において、目的タンパク質遺伝子は、染色体外に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。２つまたはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主細胞に保持されていればよい。
　目的タンパク質遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主細胞において機能するものであれば特に制限されない。「宿主細胞において機能するプロモーター」とは、宿主細胞においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主細胞由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、目的タンパク質遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、目的タンパク質遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。動物細胞において機能するプロモーターとしては、SV40プロモーター、EF1aプロモーター、RSVプロモーター、CMVプロモーター、SRalphaプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　目的タンパク質遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主細胞に導入することができる。目的タンパク質遺伝子を含むベクターを、「目的タンパク質遺伝子の発現ベクター」ともいう。目的タンパク質遺伝子の発現ベクターは、例えば、目的タンパク質遺伝子を含むDNA断片をベクターと連結することにより、構築することができる。目的タンパク質遺伝子の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、同遺伝子を宿主細胞に導入することができる。ベクターは、薬剤耐性遺伝子などのマーカーを備えていてもよい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーター等の発現調節配列を備えていてもよい。ベクターは、宿主細胞の種類や目的タンパク質遺伝子の導入形態等の諸条件に応じて適宜選択できる。動物細胞への遺伝子導入に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、pcDNAシリーズベクター（pcDNA3.1等；Thermo Fisher Scientific）、pBApo-CMVシリーズベクター（タカラバイオ）、pCI-neo（Promega）が挙げられる。なお、ベクターの種類や構成によっては、ベクターは、宿主細胞の染色体に組み込まれ得るし、宿主細胞の染色体外で自律複製し得るし、あるいは宿主細胞の染色体外に一時的に保持され得る。例えば、SV40複製起点等のウイルスの複製起点を有するベクターは、動物細胞の染色体外で自律複製し得る。具体的には、例えば、pcDNAシリーズベクターはSV40複製起点を有しており、SV40のラージＴ抗原を発現する宿主細胞（COS-1やHEK293T等）において染色体外で自律複製し得る。
　また、目的タンパク質遺伝子は、例えば、同遺伝子を含む核酸断片を宿主細胞に導入することによっても、宿主細胞に導入することができる。そのような核酸断片としては、直鎖状DNAや直鎖状RNAが挙げられる。直鎖状RNAとしては、例えば、mRNAやcRNAが挙げられる。
　ベクターや核酸断片等の核酸を宿主細胞に導入する方法は、宿主細胞の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。動物細胞にベクターや核酸断片等の核酸を導入する方法としては、DEAEデキストラン法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法が挙げられる。また、ベクターがウイルスベクターである場合は、同ベクター（ウイルス）を宿主細胞に感染させることにより、宿主細胞に同ベクターを導入することができる。
　また、本来的に目的タンパク質遺伝子を有する細胞を、目的タンパク質遺伝子の発現が増大するよう改変して用いてもよい。「遺伝子の発現が増大する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変細胞と比較して増大することを意味する。ここでいう「非改変細胞」とは、標的の遺伝子の発現が増大するように改変されていない対照細胞を意味する。非改変細胞としては、野生型の細胞や改変元の細胞が挙げられる。目的タンパク質遺伝子の発現を増大させる手法としては、目的タンパク質遺伝子のコピー数を増加させることや目的タンパク質遺伝子の転写効率や翻訳効率を向上させることが挙げられる。目的タンパク質遺伝子のコピー数の増加は、目的タンパク質遺伝子を宿主細胞に導入することにより達成できる。目的タンパク質遺伝子の導入は、上述したように実施できる。なお、導入される目的タンパク質遺伝子は、宿主細胞由来であってもよく、異種由来であってもよい。目的タンパク質遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、プロモーター等の遺伝子の発現調節配列の改変により達成できる。例えば、目的タンパク質遺伝子の転写効率の向上は、目的タンパク質遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。
　動物細胞の培養は、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件で実施される。動物細胞の培養は、例えば、少なくとも、培地中のリン酸濃度を増強した条件で実施されてよい。「培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件」を「リン酸／カリウム増強条件」ともいう。「培地中のリン酸濃度を増強した条件」を特に「リン酸増強条件」ともいう。「培地中のカリウム濃度を増強した条件」を特に「カリウム増強条件」ともいう。「培地中のリン酸濃度およびカリウム濃度のいずれも増強していない条件」を「対照条件」ともいう。対照条件としては、動物細胞の培養に利用される一般的な条件が挙げられる。対照条件として、具体的には、以下に例示するリン酸／カリウム増強条件を満たさない条件が挙げられる。
　リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、動物細胞の培養成績を向上させることができる。具体的には、リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、対照条件で動物細胞を培養する場合と比較して、動物細胞の培養成績を向上させることができる。また、例えば、培地中のリン酸濃度およびカリウム濃度の両方を増強した条件で動物細胞を培養することにより、培地中のリン酸濃度およびカリウム濃度の一方のみを増強した条件で動物細胞を培養する場合と比較して、動物細胞の培養成績が向上してもよい。動物細胞の培養成績の向上としては、動物細胞の増殖の向上、動物細胞の生存率の向上、動物細胞による目的物質生産の向上、動物細胞の培養期間の延長が挙げられる。
　すなわち、リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、例えば、動物細胞の増殖および／または生存率が向上してよい。具体的には、リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、対照条件で動物細胞を培養する場合と比較して、動物細胞の増殖および／または生存率が向上してよい。リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、動物細胞の生細胞密度は、培養中に、例えば、培養開始時の生細胞密度の１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、５００倍以上、または１０００倍以上の密度に到達してよい。リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、動物細胞の生細胞密度は、培養中に、例えば、１．５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．７×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．９×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、７×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、または１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の密度に到達してよい。動物細胞の生細胞数は、例えば、生死細胞オートアナライザーVi-CELLTM XR（ベックマン・コールター社）またはフローサイトメーターguava easy Cyte（Luminex社）を用いて測定することができる。
　また、動物細胞が目的タンパク質生産能等の目的物質生産能を有する場合、リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、例えば、動物細胞による目的タンパク質等の目的物質の生産が向上してよい。具体的には、動物細胞が目的タンパク質生産能等の目的物質生産能を有する場合、リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、対照条件で動物細胞を培養する場合と比較して、動物細胞による目的タンパク質等の目的物質の生産が向上してよい。
　また、リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、例えば、動物細胞の培養期間が延長されてもよい。具体的には、リン酸／カリウム増強条件で動物細胞を培養することにより、対照条件で動物細胞を培養する場合と比較して、動物細胞の培養期間が延長されてもよい。動物細胞の培養期間の延長としては、動物細胞の増殖が継続する期間の延長、動物細胞が維持される（すなわち、動物細胞が生存する）期間の延長、動物細胞による目的タンパク質等の目的物質の生産が継続する期間の延長が挙げられる。
　言い換えると、本発明の方法の一態様は、動物細胞の増殖を向上させる方法であってもよい。また、本発明の方法の一態様は、動物細胞の生存率を向上させる方法であってもよい。また、本発明の方法の一態様は、動物細胞による目的物質生産を向上させる方法であってもよい。また、本発明の方法の一態様は、動物細胞の培養期間を延長する方法であってもよい。
　「動物細胞の培養」には、動物細胞の増殖を目的とするものに限られず、動物細胞の維持や動物細胞による目的物質の製造等の、動物細胞の増殖を目的としないものも包含されてよい。
　培地組成や培養条件は、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度が増強されること以外は、動物細胞の培養の目的を達成できる限り、特に制限されない。例えば、動物細胞の増殖を目的とする場合、培地組成や培養条件は、動物細胞が増殖するように構成することができる。また、例えば、動物細胞の維持を目的とする場合、培地組成や培養条件は、動物細胞が維持される（すなわち、動物細胞が生存する）ように構成することができる。また、例えば、目的タンパク質等の目的物質の生産を目的とする場合、培地組成や培養条件は、目的物質が生産される（例えば、目的タンパク質が発現する）ように構成することができる。動物細胞の増殖を目的としない場合、培養の際に、動物細胞は、増殖してもよく、しなくてもよい。動物細胞の増殖を目的としない場合でも、典型的には、培養の際に、動物細胞は、増殖してよい。培地組成や培養条件は、例えば、動物細胞の種類等の諸条件に応じて、適宜設定することができる。培養は、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度が増強されること以外は、例えば、動物細胞の培養に利用される通常の培地および通常の条件をそのまま、あるいは適宜改変して用いて実施することができる。
　培養は、例えば、液体培地を用いて実施することができる。動物細胞の培養に利用できる培地として、具体的には、D-MEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）、CELLiST Basal Media BASAL4P（味の素株式会社）、Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific）、RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific）、CD293（Thermo Fisher Scientific）、CHO-S-SFMII（Thermo Fisher Scientific）、CHO-SF（Sigma-Aldrich）、EX-CELL CD CHO（Sigma-Aldrich）、EX-CELLTM302（Sigma-Aldrich）、IS CHO-CD（Irvine Scientific）、IS CHO-CDXP（Irvine Scientific）が挙げられる。培地は、例えば、炭素源、アミノ酸、ビタミン、無機塩、リン酸、コリン、アミン、ｐＨ緩衝剤、成長因子、血清、血清アルブミン、選択薬剤、遺伝子発現誘導剤等の各種培地成分を含有していてよい。炭素源としては、グルコースが挙げられる。アミノ酸としては、タンパク質を構成する20種類のアミノ酸やそれらの誘導体が挙げられる。アミノ酸は、例えば、Ｌ体であってよい。アミノ酸として、具体的には、グルタミンやセリンが挙げられる。グルタミンとしては、Ｌ－グルタミンが挙げられる。セリンとしては、Ｌ－セリンが挙げられる。アミンとしては、1,4-ブタンジアミン（「プトレシン」ともいう）、アグマチン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、スペルミジン、スペルミン、アマンタジンが挙げられる。芳香族アミンとしては、アニリン、フェネチルアミン、トルイジン、カテコールアミン、1,8-ビス（ジメチルアミノ）ナフタレンが挙げられる。複素環式アミンとしては、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、キヌクリジン、1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、オキサゾール、チアゾール、4-ジメチルアミノピリジンが挙げられる。アミンとしては、特に、1,4-ブタンジアミン、エタノールアミン、スペルミジン、スペルミンが挙げられる。アミンとして、さらに特には、1,4-ブタンジアミンが挙げられる。
　塩を形成し得る成分は、いずれも、フリー体として使用されてもよく、塩として使用されてもよく、それらの組み合わせとして使用されてもよい。すなわち、例えば、「アミノ酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のアミノ酸、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせを意味してよい。また、例えば、「リン酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のリン酸、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせを意味してよい。また、例えば、「コリン」という用語は、特記しない限り、フリー体のコリン、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせを意味してよい。また、例えば、「アミン」という用語は、特記しない限り、フリー体のアミン、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせを意味してよい。塩は、動物細胞の培養に利用できるものであれば、特に制限されない。例えば、リン酸基やカルボキシル基等の酸性基に対する塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、上記例示したようなアミンとの塩、アルギニンやリジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、例えば、アミノ基等の塩基性基に対する塩としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。具体的には、例えば、リン酸の塩としては、特に、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウムが挙げられる。また、具体的には、例えば、コリンの塩としては、特に、重酒石酸コリンが挙げられる。
　培養開始時の動物細胞の播種量は、例えば、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、または１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であってもよく、１×１０１０ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下、または１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下であってもよい。
　培養は、種培養と本培養とに分けて実施してもよい。種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。目的タンパク質等の目的物質の生産を目的とする場合、目的物質は、少なくとも本培養の期間に生産されればよい。例えば、種培養により動物細胞を十分に増殖させてから、本培養により目的タンパク質等の目的物質を製造してもよい。
　培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。流加培養または連続培養としては、灌流培養（perfusion culture）が挙げられる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」または「基礎培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（例えば、初発培地）に供給される培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。流加は、培養の全期間を通じて実施されてもよく、培養の一部の期間においてのみ実施されてもよい。また、流加は、連続的に実施されてもよく、間欠的に実施されてもよい。培養（特に、灌流培養等の流加培養または連続培養）の際には、培養液の引き抜きが実施されてもよい。培養液の引き抜きは、例えば、動物細胞を含む培養液の引き抜きであってもよく、培養上清の引き抜きであってもよい。また、引き抜いた培養液から動物細胞を回収して培養系に戻してもよい。培養液の引き抜きは、培養の全期間を通じて実施されてもよく、培養の一部の期間においてのみ実施されてもよい。培養液の引き抜きは、連続的に実施されてもよく、間欠的に実施されてもよい。培養液の引き抜きと流加は、同時に行われてもよく、そうでなくてもよい。引き抜く培養液の量は、流加する流加培地の量と同等量であるのが好ましい。「同等量」とは、例えば、流加する流加培地の量に対して９３～１０７％（ｖ／ｖ）の量を意味してよい。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、種培養と本培養の培養形態は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
　リン酸等の各種成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。すなわち、培養の過程において、リン酸等の各種成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、培地に供給してもよい。これらの成分は、いずれも、１回または複数回供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。初発培地と流加培地の組成（例えば、含有する成分の種類および／または濃度）は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、流加培地が灌流培養に用いられる場合に、初発培地と流加培地の組成は同一であってもよい。また、組成（例えば、含有する成分の種類および／または濃度）の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地の組成は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、リン酸等の各種成分は、粉末等の、流加培地に含有されない形態で、培地に供給してもよい。
　培養は、例えば、５％ＣＯ２等のＣＯ２含有雰囲気下で実施してよい。培地のｐＨは、例えば、中性付近であってよい。「中性付近」とは、例えば、ｐＨ６～８、ｐＨ６．５～７．５、またはｐＨ６．８～７．２を意味してよい。培養中、必要に応じて培地のｐＨを調整することができる。培地のｐＨは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、３６～３８℃であってよい。培養期間は、例えば、０．５日以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１２日以上、１５日以上、または２０日以上であってもよく、５０日以下、４０日以下、３０日以下、２５日以下、２０日以下、１５日以下、１２日以下、１０日以下、９日以下、８日以下、または７日以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培養期間は、具体的には、例えば、１～３０日、３～２５日、または５～２０日であってもよい。培養の際には、適宜、目的タンパク質の発現等の遺伝子発現を誘導してよい。
　リン酸等の各種成分は、いずれの形態で培地中に存在していてもよい。例えば、或る成分がイオン化し得る成分である場合、当該成分は培地中でイオン化していてもよく、いなくてもよい。
　「或る成分の濃度」とは、当該成分が複数の形態で液体中に存在し得る場合、溶解している当該成分の総濃度を意味してよい。すなわち、例えば、「或る成分の濃度」とは、当該成分が分子およびイオンの形態で液体中に存在し得る場合、当該成分の分子の濃度およびイオンの濃度の合計を意味してよい。例えば、「培地中の或る成分の濃度」とは、当該成分が複数の形態で培地中に存在し得る場合、培地中に溶解している当該成分の総濃度を意味してよい。すなわち、例えば、「培地中の或る成分の濃度」とは、当該成分が分子およびイオンの形態で培地中に存在し得る場合、培地中の当該成分の分子の濃度およびイオンの濃度の合計を意味してよい。
　例えば、「リン酸濃度」とは、溶解しているリン酸分子種の総濃度を意味してよい。すなわち、「リン酸濃度」とは、具体的には、リン酸分子（Ｈ３ＰＯ４）の濃度およびリン酸イオン（ＰＯ４ ３－，ＨＰＯ４ ２－，およびＨ２ＰＯ４ －）の濃度の合計を意味してよい。例えば、「培地中のリン酸濃度」とは、培地中に溶解しているリン酸分子種の総濃度を意味してよい。すなわち、例えば、「培地中のリン酸濃度」とは、具体的には、培地中のリン酸分子（Ｈ３ＰＯ４）の濃度および培地中のリン酸イオン（ＰＯ４ ３－，ＨＰＯ４ ２－，およびＨ２ＰＯ４ －）の濃度の合計を意味してよい。
　培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度の増強の程度は、動物細胞の培養成績（例えば、動物細胞の増殖や動物細胞による目的物質生産）が向上する限り、特に制限されない。培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度の増強の程度は、動物細胞の種類、培養期間の長さ、所望の目的物質生産量等の諸条件に応じて適宜設定できる。
　「培養が培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件で実施される」とは、例えば、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度が所定の範囲であることを意味してよい。
　培地中のリン酸濃度は、例えば、０．２ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１．５ｍＭ以上、２ｍＭ以上、２．５ｍＭ以上、３ｍＭ以上、３．５ｍＭ以上、４ｍＭ以上、４．５ｍＭ以上、５ｍＭ以上、５．５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、６．５ｍＭ以上、７ｍＭ以上、７．５ｍＭ以上、８ｍＭ以上、８．５ｍＭ以上、９ｍＭ以上、９．５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１１ｍＭ以上、１２ｍＭ以上、１３ｍＭ以上、１４ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、１６ｍＭ以上、１７ｍＭ以上、１８ｍＭ以上、１９ｍＭ以上、または２０ｍＭ以上であってもよく、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２９ｍＭ以下、２８ｍＭ以下、２７ｍＭ以下、２６ｍＭ以下、２５ｍＭ以下、２４ｍＭ以下、２３ｍＭ以下、２２ｍＭ以下、２１ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１９ｍＭ以下、１８ｍＭ以下、１７ｍＭ以下、１６ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１４ｍＭ以下、１３ｍＭ以下、１２ｍＭ以下、１１ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、または５ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地中のリン酸濃度は、特に、４ｍＭ以上であってよい。培地中のリン酸濃度は、さらに特には、１１ｍＭ以上であってよい。培地中のリン酸濃度は、具体的には、例えば、０．２～１００ｍＭ、４～７０ｍＭ、１１～５０ｍＭ、１１～４０ｍＭ、１１～３０ｍＭ、１１～２７ｍＭ、または１０～２５ｍＭであってもよい。
　培地中のカリウム濃度は、例えば、０．２ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、または１０ｍＭ以上であってもよく、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１２ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、または５ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地中のカリウム濃度は、特に、１ｍＭ以上であってよい。培地中のカリウム濃度は、具体的には、例えば、０．２～５０ｍＭ、０．５～３０ｍＭ、または１～１０ｍＭであってもよい。
　培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度は、培養の全期間において増強されていてもよく、培養の一部の期間にのみ増強されていてもよい。すなわち、「培養が培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件で実施される」とは、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度が培養の少なくとも一部の期間において増強されていれば足り、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度が培養の全期間において増強されていることを要しない。
　培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度は、例えば、培養の全期間において上記例示した濃度に増強されていてもよく、培養の一部の期間にのみ上記例示した濃度に増強されていてもよい。すなわち、「培養が培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を或る濃度に増強した条件で実施される」または「培養が或るリン酸濃度および／またはカリウム濃度の培地で実施される」とは、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度が培養の少なくとも一部の期間において当該濃度の範囲内にあれば足り、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度が培養の全期間において当該濃度の範囲内にあることを要しない。リン酸および／またはカリウムは、例えば、培養開始時に上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、培養開始後に上記例示した濃度となるように培地に供給されてもよい。また、リン酸および／またはカリウムは、例えば、培養開始時に上記例示した濃度で培地に含有され、且つ、培養開始後（例えば、消費後）に上記例示した濃度となるように培地にさらに供給されてもよい。培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度は、少なくとも本培養の期間に、すなわち本培養の全期間または本培養の一部の期間に、増強されていればよい。すなわち、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度は、種培養の期間には、増強されていてもよく、いなくてもよい。このような場合、培養についての記載（例えば、「培養期間（培養の期間）」や「培養開始」）は、本培養についてのものとして読み替えることができる。
　「一部の期間」は、動物細胞の培養成績（例えば、動物細胞の増殖や動物細胞による目的物質生産）が向上する限り、特に制限されない。「一部の期間」は、動物細胞の種類、培養期間の長さ、所望の目的物質生産量等の諸条件に応じて適宜設定できる。「一部の期間」は、例えば、培養の全期間の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、または９９％以上の期間であってよい。また、「一部の期間」は、例えば、０．５日以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１２日以上、または１５日以上の期間であってもよい。
　また、培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度は、例えば、培養の全期間を通じての平均値として、上記例示した濃度に増強されていてもよい。すなわち、「培養が培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を或る濃度に増強した条件で実施される」または「培養が或るリン酸濃度および／またはカリウム濃度の培地で実施される」とは、培養の全期間を通じての培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度の平均値が当該濃度の範囲内にあることを意味してもよい。「培養の全期間を通じての培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度の平均値」とは、培養の全期間におけるリン酸濃度および／またはカリウム濃度の変動を把握できるものであれば特に制限されないが、例えば、培養の全期間を通じて６０分ごと、３０分ごと、２０分ごと、または１０分ごとに測定された培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度の平均値を意味してよい。
　また、「培養が培地中のリン酸濃度および／またはカリウム濃度を増強した条件で実施される」とは、例えば、培地へのリン酸および／またはカリウムの供給量が所定の範囲であることを意味してもよい。
　培地へのリン酸の供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上、０．１ｍＭ以上、０．１５ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．２５ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．３５ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．４５ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、０．５５ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．６５ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、０．７５ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、０．８５ｍＭ以上、０．９ｍＭ以上、０．９５ｍＭ以上、または１ｍＭ以上であってもよく、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、または１ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地へのリン酸の供給量は、特に、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上であってもよい。培地へのリン酸の供給量は、さらに特には、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．５ｍＭ以上であってもよい。培地へのリン酸の供給量は、具体的には、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５～５ｍＭ、０．１～４ｍＭ、０．４～３ｍＭ、または０．７～２ｍＭであってもよい。
　培地へのカリウムの供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上、０．１ｍＭ以上、０．１５ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．２５ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．３５ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．４５ｍＭ以上、または０．５ｍＭ以上であってもよく、５ｍＭ以下、４．５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３．５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２．５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．７ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、または０．２ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地へのカリウムの供給量は、特に、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．２ｍＭ以上であってもよい。培地へのカリウムの供給量は、具体的には、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５～５ｍＭ、０．１～３ｍＭ、または０．２～１ｍＭであってもよい。
　リン酸および／またはカリウムは、例えば、連続的に培地へ供給されてもよく、間欠的に培地へ供給されてもよい。リン酸および／またはカリウムは、例えば、毎日培地へ供給されてもよく、数日おきに培地へ供給されてもよい。
　培地へのリン酸および／またはカリウムの供給は、例えば、動物細胞の生細胞密度が１．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１．９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、７×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、または１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の密度である時点で実施してよい。
　培養は、アミン、コリン、および／またはセリンの存在下で実施されてもよい。培養は、例えば、少なくとも培地中のリン酸濃度が増強されている場合に、アミン、コリン、および／またはセリンの存在下で実施されてもよい。培養は、例えば、少なくとも、アミンの存在下で実施されてもよい。培養は、例えば、少なくとも、コリンおよび／またはセリンの存在下で実施されてもよい。
　「培養がアミン、コリン、および／またはセリンの存在下で実施される」とは、例えば、培地がアミン、コリン、および／またはセリンを含有することを意味してよい。
　培地中のアミン濃度は、例えば、０．００１ｍＭ以上、０．００２ｍＭ以上、０．００５ｍＭ以上、０．０１ｍＭ以上、０．０２ｍＭ以上、０．０３ｍＭ以上、０．０４ｍＭ以上、０．０５ｍＭ以上、０．０６ｍＭ以上、０．０７ｍＭ以上、０．０８ｍＭ以上、０．０９ｍＭ以上、または０．１ｍＭ以上であってもよく、０．５ｍＭ以下、０．４ｍＭ以下、０．３ｍＭ以下、０．２ｍＭ以下、０．１５ｍＭ以下、０．１２ｍＭ以下、０．１ｍＭ以下、０．０９ｍＭ以下、０．０８ｍＭ以下、０．０７ｍＭ以下、０．０６ｍＭ以下、０．０５ｍＭ以下、０．０４ｍＭ以下、０．０３ｍＭ以下、０．０２ｍＭ以下、または０．０１ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地中のアミン濃度は、特に、０．００２ｍＭ以上であってもよい。培地中のアミン濃度は、さらに特には、０．００７ｍＭ以上であってもよい。培地中のアミン濃度は、具体的には、例えば、０．００２～０．５ｍＭ、０．００５～０．２ｍＭ、または０．００７～０．１ｍＭであってもよい。
　培地中のコリン濃度は、例えば、０．１ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、または１０ｍＭ以上であってもよく、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１２ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、または１ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地中のコリン濃度は、特に、０．２ｍＭ以上であってもよい。培地中のコリン濃度は、さらに特には、１ｍＭ以上であってもよい。培地中のコリン濃度は、具体的には、例えば、０．２～５０ｍＭ、０．５～２０ｍＭ、または１～１０ｍＭであってもよい。
　培地中のセリン濃度は、例えば、０．５ｍＭ以上、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、３ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、７ｍＭ以上、８ｍＭ以上、９ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１２ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、２５ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、３５ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上、であってもよく、５００ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１２ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、９ｍＭ以下、８ｍＭ以下、７ｍＭ以下、６ｍＭ以下、または５ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地中のセリン濃度は、特に、２ｍＭ以上であってもよい。培地中のセリン濃度は、さらに特には、１０ｍＭ以上であってもよい。培地中のセリン濃度は、具体的には、例えば、１～２００ｍＭ、２～１００ｍＭ、４～５０ｍＭ、２～５００ｍＭ、５～２００ｍＭ、または１０～１００ｍＭであってもよい。
　アミン、コリン、および／またはセリンは、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間にのみ培地に含有されていてもよい。すなわち、「培養がアミン、コリン、および／またはセリンの存在下で実施される」または「培養がアミン、コリン、および／またはセリンを含有する培地で実施される」とは、アミン、コリン、および／またはセリンが培養の少なくとも一部の期間において培地に含有されていれば足り、アミン、コリン、および／またはセリンが培養の全期間において培地に含有されていることを要しない。
　アミン、コリン、および／またはセリンは、例えば、培養の全期間において上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間にのみ上記例示した濃度で培地に含有されていてもよい。すなわち、「培養が或る濃度のアミン、コリン、および／またはセリンの存在下で実施される」または「培養が或るアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度の培地で実施される」とは、培地中のアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度が培養の少なくとも一部の期間において当該濃度の範囲内にあれば足り、培地中のアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度が培養の全期間において当該濃度の範囲内にあることを要しない。
　「一部の期間」については、リン酸／カリウム増強条件における「一部の期間」についての記載を準用できる。
　また、培地中のアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度は、例えば、培養の全期間を通じての平均値として、上記例示した濃度に設定されていてもよい。すなわち、「培養が或る濃度のアミン、コリン、および／またはセリンの存在下で実施される」または「培養が或るアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度の培地で実施される」とは、培養の全期間を通じての培地中のアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度の平均値が当該濃度の範囲内にあることを意味してもよい。「培養の全期間を通じての培地中のアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度の平均値」とは、培養の全期間におけるアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度の変動を把握できるものであれば特に制限されないが、例えば、培養の全期間を通じて６０分ごと、３０分ごと、２０分ごと、または１０分ごとに測定された培地中のアミン濃度、コリン濃度、および／またはセリン濃度の平均値を意味してよい。
　また、「培養がアミン、コリン、および／またはセリンの存在下で実施される」とは、例えば、培地にアミン、コリン、および／またはセリンが供給されることを意味してもよい。
　培地へのアミンの供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０００２ｍＭ以上、０．０００５ｍＭ以上、０．００１ｍＭ以上、０．００１５ｍＭ以上、０．００２ｍＭ以上、０．００２５ｍＭ以上、０．００３ｍＭ以上、０．００３５ｍＭ以上、０．００４ｍＭ以上、０．００４５ｍＭ以上、または０．００５ｍＭ以上であってもよく、０．０２５ｍＭ以下、０．０２ｍＭ以下、０．０１５ｍＭ以下、０．０１ｍＭ以下、０．００７ｍＭ以下、０．００５ｍＭ以下、０．００２ｍＭ以下、または０．００１ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地へのアミンの供給量は、特に、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０００５ｍＭ以上であってもよい。培地へのアミンの供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０００５～０．０２５ｍＭｍＭ、０．００１～０．０１５ｍＭ、０．００２～０．００７ｍＭ、または０．００３～０．００４ｍＭであってもよい。
　培地へのコリンの供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０２ｍＭ以上、０．０５ｍＭ以上、０．１ｍＭ以上、０．１５ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．２５ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．３５ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．４５ｍＭ以上、または０．５ｍＭ以上であってもよく、２．５ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．７ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、０．２ｍＭ以下、または０．１ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地へのコリンの供給量は、特に、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上であってもよい。培地へのコリンの供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５～２．５ｍＭ、０．１～１．５ｍＭ、０．２～０．７ｍＭ、または０．３～０．５ｍＭであってもよい。
　培地へのセリンの供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．１ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．４ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、０．９ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１．２ｍＭ以上、１．５ｍＭ以上、２ｍＭ以上、２．５ｍＭ以上、３ｍＭ以上、３．５ｍＭ以上、４ｍＭ以上、４．５ｍＭ以上、または５ｍＭ以上、であってもよく、２５ｍＭ以下、２０ｍＭ以下、１５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、７ｍＭ以下、５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．７ｍＭ以下、または０．５ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培地へのセリンの供給量は、特に、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．５ｍＭ以上であってもよい。培地へのセリンの供給量は、例えば、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．２～１０ｍＭ、０．４～５ｍＭ、０．８～３ｍＭ、０．５～２５ｍＭ、１～１５ｍＭ、２～７ｍＭ、または３．５～５ｍＭであってもよい。
　アミン、コリン、および／またはセリンは、例えば、連続的に培地へ供給されてもよく、間欠的に培地へ供給されてもよい。アミン、コリン、および／またはセリンは、例えば、毎日培地へ供給されてもよく、数日おきに培地へ供給されてもよい。
　流加培地の流加によりリン酸を培地へ供給する場合、流加培地中のリン酸濃度は、所望のリン酸の供給量が得られる限り、特に制限されない。流加培地中のリン酸濃度は、例えば、上記例示した培地中のリン酸濃度であってよい。例えば、流加培地が灌流培養に用いられる場合に、流加培地中のリン酸濃度は、上記例示した培地中のリン酸濃度であってよい。また、流加培地中のリン酸濃度は、例えば、上記例示した培地中のリン酸濃度の１倍超、１．１倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、１５倍以上、または２０倍以上の濃度であってもよく、１００倍以下、７０倍以下、５０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１０倍以下、または５倍以下の濃度であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。また、流加培地中のリン酸濃度は、例えば、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、または２００ｍＭ以上であってもよく、１０００ｍＭ以下、７００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。流加培地中のリン酸濃度は、具体的には、例えば、１０～１０００ｍＭ、３０～５００ｍＭ、または５０～２００ｍＭであってもよい。
　流加培地の流加によりアミンを培地へ供給する場合、流加培地中のアミン濃度は、所望のアミンの供給量が得られる限り、特に制限されない。流加培地中のアミン濃度は、例えば、上記例示した培地中のアミン濃度であってよい。例えば、流加培地が灌流培養に用いられる場合に、流加培地中のアミン濃度は、上記例示した培地中のアミン濃度であってよい。また、流加培地中のアミン濃度は、例えば、上記例示した培地中のアミン濃度の１倍超、１．１倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、１５倍以上、または２０倍以上の濃度であってもよく、１００倍以下、７０倍以下、５０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１０倍以下、または５倍以下の濃度であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。また、流加培地中のアミン濃度は、例えば、０．０５ｍＭ以上、０．１ｍＭ以上、０．２ｍＭ以上、０．３ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、１ｍＭ以上、または１ｍＭ以上であってもよく、５ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１ｍＭ以下、０．７ｍＭ以下、０．５ｍＭ以下、０．３ｍＭ以下、または０．２ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。流加培地中のアミン濃度は、具体的には、例えば、０．０５～５ｍＭ、０．１～３ｍＭ、または０．２～１ｍＭであってもよい。
　流加培地の流加によりコリンを培地へ供給する場合、流加培地中のコリン濃度は、所望のコリンの供給量が得られる限り、特に制限されない。流加培地中のコリン濃度は、例えば、上記例示した培地中のコリン濃度であってよい。例えば、流加培地が灌流培養に用いられる場合に、流加培地中のコリン濃度は、上記例示した培地中のコリン濃度であってよい。また、流加培地中のコリン濃度は、例えば、上記例示した培地中のコリン濃度の１倍超、１．１倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、１５倍以上、または２０倍以上の濃度であってもよく、１００倍以下、７０倍以下、５０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１０倍以下、または５倍以下の濃度であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。また、流加培地中のコリン濃度は、例えば、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上であってもよく、５００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、５０ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、または２０ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。流加培地中のコリン濃度は、具体的には、例えば、５～５００ｍＭ、１０～３００ｍＭ、または２０～１００ｍＭであってもよい。
　流加培地の流加によりセリンを培地へ供給する場合、流加培地中のセリン濃度は、所望のセリンの供給量が得られる限り、特に制限されない。流加培地中のセリン濃度は、例えば、上記例示した培地中のセリン濃度であってよい。例えば、流加培地が灌流培養に用いられる場合に、流加培地中のセリン濃度は、上記例示した培地中のセリン濃度であってよい。また、流加培地中のセリン濃度は、例えば、上記例示した培地中のセリン濃度の１倍超、１．１倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上、５倍以上、７倍以上、１０倍以上、１５倍以上、または２０倍以上の濃度であってもよく、１００倍以下、７０倍以下、５０倍以下、３０倍以下、２０倍以下、１０倍以下、または５倍以下の濃度であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。また、流加培地中のセリン濃度は、例えば、２０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、７００ｍＭ以上、または１０００ｍＭ以上であってもよく、５０００ｍＭ以下、３０００ｍＭ以下、２０００ｍＭ以下、１０００ｍＭ以下、７００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、または７０ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。流加培地中のセリン濃度は、具体的には、例えば、３０～２０００ｍＭ、５０～１０００ｍＭ、７０～５００ｍＭ、５０～５０００ｍＭ、１００～３０００ｍＭ、または２００～１０００ｍＭであってもよい。
　各種成分の濃度は、例えば、化合物の検出または同定に用いられる公知の方法により測定することができる。そのような方法としては、例えば、HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの方法は、目的物質が生成したことの確認にも利用できる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
　上記のようにして動物細胞を培養することができる。動物細胞が目的タンパク質生産能等の目的物質生産能を有する場合、上記のようにして動物細胞を培養することにより、目的物質が生成（例えば、目的タンパク質が発現）し、以て目的物質を含有する培養物が得られる。目的タンパク質等の目的物質は、具体的には、培地中、細胞表層、細胞内、またはそれらの組み合わせへ蓄積してよい。
　以下、特に、目的タンパク質を製造する場合を参照して目的タンパク質の生成の確認、回収、精製等の操作について説明するが、目的タンパク質以外の目的物質についても、適宜、そのような操作を実施することができる。
　目的タンパク質が生成したことは、タンパク質の検出または同定に用いられる公知の方法により確認することができる。そのような方法としては、例えば、SDS-PAGE、Western blotting、質量分析、Ｎ末アミノ酸配列解析、酵素活性測定が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
　目的タンパク質は、適宜回収することができる。目的タンパク質は、具体的には、目的タンパク質を含有する適当な画分として回収することができる。そのような画分としては、例えば、培養物、培養上清、培養細胞、培養細胞の処理物（破砕物、溶解物、抽出物（無細胞抽出液）が挙げられる。培養細胞は、例えば、アクリルアミドやカラギーナン等の担体で固定化した固定化細胞の形態で取得されてもよい。
　目的タンパク質は、さらに、所望の程度に精製されてもよい。
　培地中に目的タンパク質が蓄積する場合、目的タンパク質は、例えば、細胞等の固形分を遠心分離等により培養物から除去した後、上清から精製することができる。
　細胞内に目的タンパク質が蓄積する場合、目的タンパク質は、例えば、細胞を破砕、溶解、または抽出等の処理に供した後、処理物から精製することができる。細胞は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等の処理は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
　細胞表層に目的タンパク質が蓄積する場合、目的タンパク質は、例えば、可溶化した後、可溶化物から精製することができる。可溶化は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、塩濃度の上昇や界面活性剤の使用が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
　目的タンパク質の精製（例えば、上記のような上清、処理物、または可溶化物からの精製）は、タンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。
　目的タンパク質は、遊離の状態で取得されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で取得されてもよい。
　回収した目的タンパク質は、適宜、製剤化してもよい。剤形は特に制限されず、目的タンパク質の使用用途等の諸条件に応じて適宜設定することができる。剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。
＜２＞本発明の培地
　本発明の培地は、リン酸濃度および／またはカリウム濃度が増強された、動物細胞培養用の培地である。本発明の培地は、例えば、本発明の方法に用いることができる。
　本発明の培地については、例えば、本発明の方法に用いられる培地の記載（流加培地の記載も含む）を準用できる。
　本発明の培地は、リン酸および／またはカリウムを含有する。本発明の培地は、さらに、アミン、コリン、および／またはセリンを含有していてよい。本発明の培地は、例えば、少なくともリン酸を含有する場合に、アミン、コリン、および／またはセリンを含有していてよい。本発明の培地は、例えば、少なくとも、アミンを含有していてよい。本発明の培地は、例えば、少なくとも、コリンおよび／またはセリンを含有していてよい。
　本発明の培地は、例えば、基礎培地（初発培地）であってもよく、流加培地であってもよい。流加培地は、例えば、流加培養または連続培養に用いるものであってよい。流加培地は、例えば、特に、灌流培養に用いるものであってもよい。
　本発明の培地におけるリン酸濃度については、例えば、上記例示した本発明の方法における培地中のリン酸濃度の記載（流加培地中のリン酸濃度の記載も含む）を準用できる。
　本発明の培地におけるカリウム濃度については、例えば、上記例示した本発明の方法における培地中のカリウム濃度の記載（流加培地中のカリウム濃度の記載も含む）を準用できる。
　本発明の培地におけるアミン濃度については、例えば、上記例示した本発明の方法における培地中のアミン濃度の記載（流加培地中のアミン濃度の記載も含む）を準用できる。
　本発明の培地におけるコリン濃度については、例えば、上記例示した本発明の方法における培地中のコリン濃度の記載（流加培地中のコリン濃度の記載も含む）を準用できる。
　本発明の培地におけるセリン濃度については、例えば、上記例示した本発明の方法における培地中のセリン濃度の記載（流加培地中のセリン濃度の記載も含む）を準用できる。
　以下、非限定的な実施例を参照して、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：流加培地へのリン酸添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果の評価
　本実施例では、流加培地へのリン酸添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果を評価した。CHO細胞としては、抗体Adalimumabを生産するよう改変されたCHO DG-44系統の細胞を用いた。
（１）基礎培地の調製
　CELLiST（登録商標） Basal media（味の素株式会社：BASAL4P；終濃度1.9 mMのリン酸を含有する）にLR3-IGF-1（終濃度10 μg/mL）、デキストラン硫酸ナトリウム（終濃度400 mg/L）、およびL-Glutamine（終濃度 6 mM）を添加し、基礎培地を調製した。
（２）流加培地の調製
　CELLiST（登録商標） Feed media（味の素株式会社：FEED2）にグルコース（終濃度75 g/L）とリン酸二水素ナトリウム（終濃度0、125、250、500、1000、4000、または7000 mg/L（すなわち、0.0、1.0、2.1、4.2、8.3、33.3、または58.3 mM））を添加し、リン酸濃度の異なる7種類の流加培地を調製した。
（３）培養実験
　調製した基礎培地を用いて3×105 cells/mLに調整したCHO細胞懸濁液30 mLを125 mLフラスコ（CORNING：431143）へ播種し、14日間培養を行った。培養は、全ての実験群についてn=2で実施した。培養温度は37℃、撹拌速度は110 rpmとした。調製した流加培地を、培養開始4、7、9、11日目にそれぞれ2.1 mL添加した。培養開始4、7、9、11、および14日目に細胞培養液をサンプリングし、生細胞数を生死細胞オートアナライザーVi-CELLTM XR（ベックマン・コールター社）を用いて測定し、抗体産生量をOctet QK（FORTEBIO社）を用いて測定した。
（４）培養結果
　生細胞数の推移および培養14日目の抗体産生量を図１および２に示す。流加培地中のリン酸濃度の増大に伴い、生細胞数と抗体産生量が向上することが明らかとなった。
実施例２：流加培地へのリン酸添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果の評価
　本実施例では、流加培地へのリン酸添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果を評価した。CHO細胞としては、抗体Adalimumabを生産するよう改変されたCHO DG-44系統の細胞を用いた。
（１）基礎培地の調製
　CELLiST（登録商標） Basal media（味の素株式会社：BASAL4P；終濃度1.9 mMのリン酸を含有する）にLR3-IGF-1（終濃度10 μg/mL）、リン酸二水素ナトリウム（115 mg/L（すなわち、終濃度2.9 mM））、デキストラン硫酸ナトリウム（終濃度400 mg/L）とL-Glutamine（終濃度 6 mM）を添加し、基礎培地を調製した。
（２）流加培地の調製
　CELLiST（登録商標） Feed media（味の素株式会社：FEED2）にグルコース（終濃度75 g/L）とリン酸二水素ナトリウム（終濃度0、1000、2000、3000、4000、または5000 mg/L（すなわち、0.0、8.3、16.7、25、33.3、または41.7 mM））を添加し、リン酸濃度の異なる6種類の流加培地を調製した。
（３）培養実験
　調製した基礎培地を用いて3×105 cells/mLに調整したCHO細胞懸濁液30 mLを125 mLフラスコ（CORNING：431143）へ播種し、14日間培養を行った。培養は、全ての実験群についてn=2で実施した。培養温度は37℃、撹拌速度は110 rpmとした。調製した流加培地を、培養開始4、7、9、11日目にそれぞれ2.1 mL添加した。培養開始4、7、9、11、および14日目に細胞培養液をサンプリングし、生細胞数を生死細胞オートアナライザーVi-CELLTM XR（ベックマン・コールター社）を用いて測定し、抗体産生量をCEDEX Bio HT（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて測定した。
（４）培養結果
　培養液中のリン酸濃度の推移および培養14日目の抗体産生量を図３および４に示す。終濃度2000 mg/Lリン酸二水素ナトリウムを含有する流加培地を添加することにより、先行特許（US6,924,124）に記載のリン酸濃度（培養液中のリン酸濃度1.5～3.5 mM）を再現した。先行特許の条件より高濃度のリン酸を含有する流加培地を添加することで、先行特許の条件と比較して抗体の生産性が向上することが明らかとなった。
実施例３：流加培地へのリン酸及びセリン、コリン、またはアミンの添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果の評価
　本実施例では、流加培地へのリン酸ならびにセリン、コリン、またはアミンの添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果を評価した。CHO細胞としては、抗体Adalimumabを生産するよう改変されたCHO S系統の細胞を用いた。
（１）基礎培地の調製
　CELLiST（登録商標） Basal media（味の素株式会社：BASAL4P；終濃度1.9 mMのリン酸を含有する）にLR3-IGF-1（終濃度10 μg/mL）、リン酸二水素ナトリウム（115 mg/L（すなわち、Basal mediaに含有されるリン酸との合計で終濃度2.9 mM））、デキストラン硫酸ナトリウム（終濃度400 mg/L）、およびL-Glutamine（終濃度 6 mM）を添加し、基礎培地を調製した。
（２）流加培地の調製
　CELLiST（登録商標） Feed media（味の素株式会社：FEED2）にグルコース（終濃度75 g/L）、リン酸二水素ナトリウム（終濃度0または2500 mg/L（すなわち、0.0または20.8 mM））、および必要により以下の成分（A）、（B）、（C）、または（D）を添加し、10種類の流加培地を調製した：
（A）1,4-ブタンジアミン（終濃度12.8 mg/L（すなわち、0.145 mM））；
（B）セリン（終濃度20,000 mg/L（すなわち、190 mM））、重酒石酸コリン（終濃度4,400 mg/L（すなわち、17.4 mM））、および1,4-ブタンジアミン（終濃度12.8 mg/L（すなわち、0.145 mM））；
（C）1.5倍濃度の成分（B）（すなわち、セリン：30,000 mg/L , 重酒石酸コリン：6,600 mg/L, および1,4-ブタンジアミン：19.2 mg/L）；
（D）2倍濃度の成分（B）（すなわち、セリン：40,000 mg/L , 重酒石酸コリン：8,800 mg/L, および1,4-ブタンジアミン：25.6 mg/L）。
（３）培養実験
　調製した基礎培地を用いて3×105 cells/mLに調整したCHO細胞懸濁液を4 mLを6wellフラスコ（CORNING：3471）へ播種し、14日間培養を行った。培養は、全ての実験群についてn=2で実施した。培養温度は37℃、撹拌速度は110 rpmとした。調製した流加培地を、培養開始4、7、9、11日目にそれぞれ280 μL添加した。培養開始4、7、9、11、14日目に細胞培養液をサンプリングし、生細胞数をフローサイトメーターguava easyCyte（Luminex社）を用いて測定し、抗体産生量をCEDEX Bio HT（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて測定した。
（４）培養結果
　培養14日目の抗体産生量を図５に示す。流加培地中へリン酸二水素ナトリウムを添加しない条件では、セリン、重酒石酸コリン、または1,4-ブタンジアミンの添加効果は認められなかった。一方、流加培地へリン酸二水素ナトリウムを添加した条件では、1,4-ブタンジアミンを添加することで抗体の生産性が向上し、セリン、重酒石酸コリン、および1,4-ブタンジアミンを添加することで抗体の生産性がさらに向上することが明らかとなった。特に、セリン、重酒石酸コリン、および1,4-ブタンジアミンを1.5倍濃度で添加した場合に最大の抗体濃度を示した。
実施例４：流加培地へのリン酸またはカリウムの添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果の評価
　本実施例では、流加培地へのリン酸またはカリウムの添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果を評価した。CHO細胞としては、抗体Herceptinを生産するよう改変されたCHO S系統の細胞を用いた。
（１）基礎培地の調製
　CELLiST（登録商標） Basal media（味の素株式会社：BASAL3；終濃度1.9 mMのリン酸を含有する）にLR3-IGF-1（終濃度10 μg/mL）とL-Glutamine（終濃度 6 mM）を添加し、基礎培地を調製した。
（２）流加培地の調製
　CELLiST（登録商標） Feed media（味の素：FEED2）にリン酸水素二ナトリウム（終濃度0または4,510 mg/L（すなわち、0.0または20.8 mM））と塩化カリウム（終濃度0または2,850 mg/L（すなわち、0.0または38.2 mM））を添加し、4種類の流加培地を調製した。
（３）培養実験
　調製した基礎培地を用いて3×105 cells/mLに調整したCHO細胞懸濁液30 mLを125 mLフラスコ（CORNING：431143）へ播種し、14日間培養を行った。培養は、全ての実験群についてn=2で実施した。培養温度は37℃、撹拌速度は110 rpmとした。調製した流加培地を、培養開始4、6、8、10、12日目にそれぞれ1.2 mL添加した。培養開始4、7、9、11、および14日目に細胞培養液をサンプリングし、生細胞数を生死細胞オートアナライザーVi-CELLTM XR（ベックマン・コールター社）を用いて測定し、抗体産生量をCEDEX Bio HT（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて測定した。また、培養開始4、7、9、11日目に細胞培養液をサンプリングし、グルコース濃度をCEDEX Bio HT（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて測定し、グルコースの終濃度が11 g/Lとなるように500 g/Lグルコース水溶液を添加した。
（４）培養結果
　培養14日目の抗体産生量を図６に示す。流加培地中へリン酸および／またはカリウムを添加した群では、無添加群と比較して抗体生産量は高値を示した。また、リン酸およびカリウムを添加した群では、リン酸単独添加群およびカリウム単独添加群と比較して抗体産生量は高値を示した。
実施例５：Perfusion培養におけるリン酸強化培地による抗体生産の向上効果の評価
　本実施例では、基礎培地および流加培地へのリン酸添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果をPerfusion培養にて評価した。CHO細胞としては、抗体Adalimumabを生産するよう改変されたCHO S系統の細胞を用いた。
（１）基礎培地および流加培地の調製
　CELLiST（登録商標） Basal media（味の素株式会社：BASAL4P；終濃度1.9 mMのリン酸を含有する）にLR3-IGF-1（終濃度10 μg/mL）、リン酸二水素ナトリウム（添加量0, 1450, または1690 mg/L（すなわち、Basal mediaに含有されるリン酸との合計で終濃度1.9, 14, または16 mM））、およびL-Glutamine（終濃度 6 mM）を添加し、基礎培地および流加培地を調製した。
（２）培養実験
　調製した基礎培地を用いて25×105 cells/mLに調整した10 mLのCHO細胞懸濁液をマイクロバイオリアクターambr15（sartorius:001-0881）を用いて8日間培養を行った。培養中は、pH 7.2±0.1、DOを飽和濃度に対して50%、培養温度37℃、攪拌速度＝1000 rpmとなるように管理した。また、細胞数が200×105cells/mLに到達した後、毎日細胞数を測定し、培地交換後の培養液中の細胞濃度が200×105 cells/mLとなるように過剰な細胞培養液を除いた後、培地交換を実施した。培地交換は、培養液を遠心分離し、遠心上清が3.68 mL残るように取り除き、基礎培地と同一の新鮮な流加培地を6.32 mL添加し、撹拌することで実施した。培地交換後に、培養を再開した。生細胞数を生死細胞オートアナライザーVi-CELLTM XR（ベックマン・コールター社）を用いて測定し、抗体産生量をCEDEX Bio HT（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて測定した。
（３）培養結果
　培養8日目の抗体産生量を図７に示す。基礎培地および流加培地のリン酸濃度を14 mM以上に増強した場合には、基礎培地および流加培地のリン酸濃度を増強しない場合と比較して、抗体濃度が増加することが明らかとなった。
実施例６：Perfusion培養におけるリン酸強化培地による抗体生産の向上効果の評価
　本実施例では、流加培地へのリン酸添加によるCHO細胞の増殖及び抗体生産の向上効果をPerfusion培養にて評価した。CHO細胞としては、抗体Adalimumabを生産するよう改変されたCHO S系統の細胞を用いた。
（１）基礎培地の調製
　CELLiST（登録商標） Basal media（味の素株式会社：BASAL4P；終濃度1.9 mMのリン酸を含有する）にLR3-IGF-1（終濃度10 μg/mL）とL-Glutamine（終濃度 6 mM）を添加し、基礎培地を調製した。
（２）流加培地の調製
　CELLiST（登録商標） Basal media（味の素株式会社：BASAL4P；終濃度1.9 mMのリン酸を含有する）にLR3-IGF-1（終濃度10 μg/mL）、リン酸二水素ナトリウム（添加量0, 490, または730 mg/L（すなわち、Basal mediaに含有されるリン酸との合計で終濃度1.9, 6, または8 mM））、およびL-Glutamine（終濃度6 mM）を添加し、流加培地を調製した。
（３）培養実験
　調製した基礎培地を用いて25×105 cells/mLに調整した10 mLのCHO細胞懸濁液をマイクロバイオリアクターambr15（sartorius:001-0881）を用いて12日間培養を行った。培養中は、pH 7.2±0.1、DOを飽和濃度に対して50%、培養温度37℃、攪拌速度＝1000 rpmとなるように管理した。また、細胞数が150×105 cells/mLに到達した後、毎日細胞数を測定し、培地交換後の培養液中の細胞濃度が150×105 cells/mLとなるように、過剰な細胞培養液を除いた後、培地交換を実施した。培地交換は、培養液を遠心分離し、遠心上清が3.68 mL残るように取り除き、新鮮な流加培地を6.32 mL添加することで実施した。培地交換後に、培養を再開した。生細胞数を生死細胞オートアナライザーVi-CELLTM XR（ベックマン・コールター社）を用いて測定し、抗体産生量をCEDEX Bio HT（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて測定した。
（４）培養結果
　培養8日目の抗体産生量を図８に示す。流加培地のリン酸濃度を6 mM以上に増強した場合には、流加培地のリン酸濃度を増強しない場合と比較して、抗体濃度が増加することが明らかとなった。
　本発明によれば、動物細胞の培養成績（例えば、動物細胞の増殖や動物細胞による目的物質生産）を向上させることができる。

Claims (32)

  1. 　目的物質の製造方法であって、
    　目的物質生産能を有する動物細胞を培地で培養すること；および
    　目的物質を回収すること
    　を含み、
    　前記培養が、下記（Ａ）および／または（Ｂ）の条件で実施される、方法：
    （Ａ）前記培地中のリン酸濃度を４ｍＭ以上に増強した条件；
    （Ｂ）前記培地中のカリウム濃度を１ｍＭ以上に増強した条件。
  2. 　前記目的物質が、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
  3. 　動物細胞の培養方法であって、
    　動物細胞を培地で培養すること
    　を含み、
    　前記培養が、下記（Ａ）および／または（Ｂ）の条件で実施される、方法：
    （Ａ）前記培地中のリン酸濃度を４ｍＭ以上に増強した条件；
    （Ｂ）前記培地中のカリウム濃度を１ｍＭ以上に増強した条件。
  4. 　前記培養が、少なくとも、前記培地中のリン酸濃度を増強した条件で実施される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記培養の際の前記培地中のリン酸濃度が、１１ｍＭ以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　リン酸および／またはカリウムが、培養開始時に前記濃度で前記培地に含有される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　リン酸および／またはカリウムが、培養開始後に前記濃度で前記培地に含有されるように該培地に供給される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　リン酸および／またはカリウムが、培養の全期間を通じての平均値として、前記濃度で前記培地に含有される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　リン酸が、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　リン酸が、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　カリウムが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．２ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記培養が、リン酸濃度が４ｍＭ以上の流加培地を用いた灌流培養により実施される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記培養が、リン酸濃度が１１ｍＭ以上の流加培地を用いた灌流培養により実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　前記培養が、アミンの存在下で実施される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　前記アミンが、1,4-ブタンジアミンである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記培養が、コリンおよび／またはセリンの存在下で実施される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　前記培養の際の前記培地中のアミン濃度が、０．００２ｍＭ以上である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　前記培養の際の前記培地中のコリン濃度が、０．２ｍＭ以上である、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 　前記培養の際の前記培地中のセリン濃度が、２ｍＭ以上である、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　前記アミン、コリン、および／またはセリンが、培養開始時に前記濃度で前記培地に含有される、請求項１４～１９に記載の方法。
  21. 　前記アミン、コリン、および／またはセリンが、培養開始後に前記濃度で前記培地に含有されるように該培地に供給される、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　前記アミン、コリン、および／またはセリンが、培養の全期間を通じての平均値として、前記濃度で前記培地に含有される、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　前記アミンが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０００５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、請求項１４～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 　コリンが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．０５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 　セリンが、培養の全期間を通じて、一日当たり、０．５ｍＭ以上の供給量で前記培地に供給される、請求項１６～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 　リン酸濃度および／またはカリウム濃度が増強された、動物細胞培養用の培地。
  27. 　少なくとも、リン酸濃度が増強された、請求項２６に記載の培地。
  28. 　さらに、アミンを含有する、請求項２６または２７に記載の培地。
  29. 　前記アミンが、1,4-ブタンジアミンである、請求項２８に記載の培地。
  30. 　さらに、コリンおよび／またはセリンを含有する、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の培地。
  31. 　初発培地である、請求項２６～３０のいずれか１項に記載の培地。
  32. 　流加培地である、請求項２６～３０のいずれか１項に記載の培地。
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