KR20220097421A - 단백질의 제조 방법 - Google Patents

단백질의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220097421A
KR20220097421A KR1020227017195A KR20227017195A KR20220097421A KR 20220097421 A KR20220097421 A KR 20220097421A KR 1020227017195 A KR1020227017195 A KR 1020227017195A KR 20227017195 A KR20227017195 A KR 20227017195A KR 20220097421 A KR20220097421 A KR 20220097421A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
medium
concentration
culture
less
phosphoric acid
Prior art date
Application number
KR1020227017195A
Other languages
English (en)
Inventor
야스미치 고세키
다카히로 가타야마
유스케 오야
후미 오가타
기요시 히라카와
다쿠야 히구치
Original Assignee
아지노모토 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아지노모토 가부시키가이샤 filed Critical 아지노모토 가부시키가이샤
Publication of KR20220097421A publication Critical patent/KR20220097421A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/42—Organic phosphate, e.g. beta glycerophosphate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

동물 세포를 발현 숙주로 한 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다. 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포를 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건에서 배양함으로써 목적 단백질을 제조한다.

Description

단백질의 제조 방법
본 발명은 동물 세포의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 양태는, 동물 세포에 의한 단백질 등의 목적 물질의 제조 방법에 관한 것이다.
동물 세포는 재조합 단백질의 발현 숙주로서 이용되고 있다.
차이니즈 햄스터 난소 유래 세포주(CHO)의 발현 숙주로 하는 재조합 단백질의 제조 방법으로서는, 배지 중의 인산 농도가 1.5 내지 3.5mM로 되도록 인산을 함유하는 유가 배지를 유가하는 방법이 보고되어 있다(특허문헌 1).
또한, 고농도의 콜린을 함유하는 배지를 사용하여 세포를 배양하는 방법(특허문헌 2), 고농도의 세린을 함유하는 배지를 사용하여 세포를 배양하는 방법(특허문헌 3), 및 고농도의 아민을 함유하는 배지를 사용하여 세포를 배양하는 방법(특허문헌 4)이 알려져 있다.
US6,924,124 WO2011/134921A1 WO2008/136398A1 WO2007/077217A2
본 발명은 동물 세포의 배양 성적(예를 들어, 동물 세포의 증식이나 동물 세포에 의한 목적 물질 생산)을 향상시키는 신규의 기술을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 동물 세포의 배양 시의 배지 중의 인산이나 칼륨 등의 특정의 성분의 농도를 증강함으로써 동물 세포의 배양 성적(예를 들어, 동물 세포의 증식이나 동물 세포에 의한 목적 물질 생산)이 향상되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하와 같이 예시할 수 있다.
[1]
목적 물질의 제조 방법으로서,
목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포를 배지에서 배양하는 것; 및
목적 물질을 회수하는 것
을 포함하고,
상기 배양이, 하기 (A) 및/또는 (B)의 조건에서 실시되는 방법:
(A) 상기 배지 중의 인산 농도를 4mM 이상으로 증강한 조건;
(B) 상기 배지 중의 칼륨 농도를 1mM 이상으로 증강한 조건.
[2]
상기 목적 물질이 단백질인, 상기 방법.
[3]
동물 세포의 배양 방법으로서,
동물 세포를 배지에서 배양하는 것
을 포함하고,
상기 배양이, 하기 (A) 및/또는 (B)의 조건에서 실시되는 방법:
(A) 상기 배지 중의 인산 농도를 4mM 이상으로 증강한 조건;
(B) 상기 배지 중의 칼륨 농도를 1mM 이상으로 증강한 조건.
[4]
상기 배양이, 적어도 상기 배지 중의 인산 농도를 증강한 조건에서 실시되는, 상기 방법.
[5]
상기 배양 시의 상기 배지 중의 인산 농도가 11mM 이상인, 상기 방법.
[6]
인산 및/또는 칼륨이, 배양 개시 시에 상기 농도로 상기 배지에 함유되는, 상기 방법.
[7]
인산 및/또는 칼륨이, 배양 개시 후에 상기 농도로 상기 배지에 함유되도록 해당 배지에 공급되는, 상기 방법.
[8]
인산 및/또는 칼륨이, 배양의 전기간을 통한 평균값으로서, 상기 농도로 상기 배지에 함유되는, 상기 방법.
[9]
인산이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는, 상기 방법.
[10]
인산이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.5mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는, 상기 방법.
[11]
칼륨이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.2mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는, 상기 방법.
[12]
상기 배양이, 인산 농도가 4mM 이상인 유가 배지를 사용한 관류 배양에 의해 실시되는, 상기 방법.
[13]
상기 배양이, 인산 농도가 11mM 이상인 유가 배지를 사용한 관류 배양에 의해 실시되는, 상기 방법.
[14]
상기 배양이 아민의 존재 하에서 실시되는, 상기 방법.
[15]
상기 아민이 1,4-부탄디아민인, 상기 방법.
[16]
상기 배양이 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시되는, 상기 방법.
[17]
상기 배양 시의 상기 배지 중의 아민 농도가 0.002mM 이상인, 상기 방법.
[18]
상기 배양 시의 상기 배지 중의 콜린 농도가 0.2mM 이상인, 상기 방법.
[19]
상기 배양 시의 상기 배지 중의 세린 농도가 2mM 이상인, 상기 방법.
[20]
상기 아민, 콜린 및/또는 세린이, 배양 개시 시에 상기 농도로 상기 배지에 함유되는, 상기 방법.
[21]
상기 아민, 콜린 및/또는 세린이, 배양 개시 후에 상기 농도로 상기 배지에 함유되도록 해당 배지에 공급되는, 상기 방법.
[22]
상기 아민, 콜린 및/또는 세린이, 배양의 전기간을 통한 평균값으로서, 상기 농도로 상기 배지에 함유되는, 상기 방법.
[23]
상기 아민이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.0005mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는, 상기 방법.
[24]
콜린이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는, 상기 방법.
[25]
세린이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.5mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는, 상기 방법.
[26]
인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 증강된, 동물 세포 배양용 배지.
[27]
적어도 인산 농도가 증강된, 상기 배지.
[28]
아민을 더 함유하는, 상기 배지.
[29]
상기 아민이 1,4-부탄디아민인, 상기 배지.
[30]
콜린 및/또는 세린을 더 함유하는, 상기 배지.
[31]
초발 배지인, 상기 배지.
[32]
유가 배지인, 상기 배지.
도 1은 유가 배지 중의 인산 농도가 CHO 세포의 증식에 미치는 영향을 도시하는 도면.
도 2는 유가 배지 중의 인산 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 미치는 영향을 도시하는 도면.
도 3은 배양액 중의 인산 농도의 추이를 도시하는 도면.
도 4는 유가 배지 중의 인산 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 미치는 영향을 도시하는 도면.
도 5는 유가 배지 중의 인산, 아민, 콜린 및 세린의 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 미치는 영향을 도시하는 도면.
도 6은 유가 배지 중의 인산 및 칼륨의 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 미치는 영향을 도시하는 도면.
도 7은 기초 배지 및 유가 배지 중의 인산 농도가 관류 배양(Perfusion 배양)에 있어서의 CHO 세포에 의한 항체 생산에 미치는 영향을 도시하는 도면.
도 8은 유가 배지 중의 인산 농도가 관류 배양(Perfusion 배양)에 있어서의 CHO 세포에 의한 항체 생산에 미치는 영향을 도시하는 도면.
<1> 본 발명의 방법
본 발명의 방법은, 동물 세포의 배양 방법으로서, 동물 세포를 배지에서 배양하는 것을 포함하고, 상기 배양이 상기 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건에서 실시되는 방법이다.
일 양태에 있어서는, 동물 세포의 배양에 의해 목적 물질이 제조되어도 된다. 즉, 동물 세포가 목적 물질 생산능을 갖는 경우, 동 세포의 배양에 의해 목적 물질을 제조할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법의 일 양태는, 목적 물질의 제조 방법으로서, 목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포를 배지에서 배양하는 것, 및 목적 물질을 회수하는 것을 포함하고, 상기 배양이 상기 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건에서 실시되는 방법이어도 된다.
목적 물질은, 동물 세포에 의해 제조할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 목적 물질로서는 단백질을 들 수 있다. 목적 물질로서 제조되는 단백질을, 「목적 단백질」이라고도 한다.
동물 세포는, 특별히 제한되지 않는다. 동물 세포는, 예를 들어 동물 세포의 용도 등의 여러 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 동물 세포를 목적 단백질의 제조에 이용하는 경우, 동물 세포는, 목적 단백질을 발현할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 동물 세포를 「숙주」, 「발현 숙주」또는 「숙주 세포」라고도 한다. 동물로서는 포유류, 조류, 양서류를 들 수 있다. 동물로서는, 특히 포유류를 들 수 있다. 포유류로서는 설치류나 영장류를 들 수 있다. 설치류로서는 햄스터, 마우스, 래트, 모르모트를 들 수 있다. 햄스터로서는 차이니즈 햄스터를 들 수 있다. 영장류로서는 인간, 원숭이, 침팬지를 들 수 있다. 원숭이로서는 아프리카 녹색 원숭이를 들 수 있다. 조류로서는 닭을 들 수 있다. 양서류로서는 아프리카 발톱 개구리를 들 수 있다. 또한, 동물 세포가 유래하는 조직 또는 세포는, 특별히 제한되지 않는다. 동물 세포가 유래하는 조직 또는 세포로서는 난소, 신장, 부신, 혀상피, 후상피, 송과체, 갑상선, 멜라노사이트를 들 수 있다. 차이니즈 햄스터의 세포로서는 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포주(CHO)를 들 수 있다. CHO로서, 구체적으로는 CHO-DG44나 CHO-K1을 들 수 있다. 인간의 세포로서는 인간 태아 신장 세포 유래 세포주(HEK)를 들 수 있다. HEK로서, 구체적으로는 HEK293이나 HEK293T를 들 수 있다. 아프리카 녹색 원숭이의 세포로서는 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 유래 세포주(COS)를 들 수 있다. COS로서, 구체적으로는 COS-1을 들 수 있다. 아프리카 발톱 개구리의 세포로서, 구체적으로는 아프리카 발톱 개구리 난모 세포를 들 수 있다.
「목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포」란, 목적 물질을 생산하는 능력을 갖는 동물 세포를 의미한다. 「목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포」란, 구체적으로는 배지에서 배양하였을 때, 목적 물질을 생성(예를 들어, 목적 단백질을 발현)하고, 회수할 수 있을 정도로 배양물 중에 축적하는 능력을 갖는 동물 세포를 의미해도 된다. 「배양물 중으로의 축적」이란, 구체적으로는 배지 중, 세포 표층, 세포 내, 또는 그것들의 조합으로의 축적을 의미해도 된다. 또한, 목적 물질이 세포 외(예를 들어, 배지 중 또는 세포 표층)에 축적되는 경우를, 목적 물질의 「분비」또는 「분비 생산」이라고도 한다. 즉, 동물 세포는, 목적 물질의 분비 생산능(목적 물질을 분비 생산하는 능력)을 가져도 된다. 목적 물질의 축적량은, 예를 들어 배양물 중으로의 축적량으로서, 10㎍/L 이상, 1mg/L 이상, 100mg/L 이상 또는 1g/L 이상이어도 된다. 동물 세포는, 1종의 목적 물질의 생산능을 가져도 되고, 2종 또는 그 이상의 목적 물질의 생산능을 가져도 된다.
동물 세포는, 본래적으로 목적 물질 생산능을 갖는 것이어도 되고, 목적 물질 생산능을 갖도록 개변된 것이어도 된다. 또한, 동물 세포는, 본래적으로 갖는 목적 물질 생산능이 증강되도록 개변된 것이어도 된다. 목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포는, 예를 들어 상기와 같은 동물 세포에 목적 물질 생산능을 부여함으로써, 또는 상기와 같은 동물 세포의 목적 물질 생산능을 증강함으로써 취득할 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질 생산능은, 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 도입에 의해 부여 또는 증강할 수 있다. 목적 단백질을 코딩하는 유전자를, 「목적 단백질 유전자」라고도 한다.
목적 단백질은, 동물 세포를 숙주로 하여 발현 가능한 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 단백질은, 숙주 유래의 단백질이어도 되고, 이종 단백질(heterologous protein)이어도 된다. 「이종 단백질(heterologous protein)」이란, 동 단백질을 생산하는 숙주(즉, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포)에 있어서 외래성(exogenous)인 단백질을 말한다. 목적 단백질은, 예를 들어 천연에 존재하는 단백질이어도 되고, 그것들을 개변한 단백질이어도 되고, 인공적으로 아미노산 서열을 디자인한 단백질이어도 된다. 목적 단백질은, 예를 들어 미생물 유래의 단백질이어도 되고, 식물 유래의 단백질이어도 되고, 동물 유래의 단백질이어도 되고, 바이러스 유래의 단백질이어도 된다. 목적 단백질은, 특히 인간 유래의 단백질이어도 된다. 목적 단백질은, 단량체 단백질이어도 되고, 다량체 단백질이어도 된다. 목적 단백질은, 분비성 단백질이어도 되고, 비분비성 단백질이어도 된다. 또한, 「단백질」에는 올리고펩티드나 폴리펩티드 등의 펩티드라고 불리는 것도 포함된다.
목적 단백질로서, 구체적으로는 효소, 생리 활성 단백질, 리셉터 단백질, 항원 단백질, 그 밖의 단백질을 들 수 있다.
효소로서는, 셀룰라아제, 트랜스글루타미나아제, 프로테인글루타미나아제, 이소말토덱스트라나아제, 프로테아제, 엔도펩티다아제, 엑소펩티다아제, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 콜라게나아제 및 키티나아제를 들 수 있다.
생리 활성 단백질로서는, 성장 인자(증식 인자), 호르몬, 사이토카인, 항체 관련 분자를 들 수 있다.
성장 인자(증식 인자)로서는, 상피 성장 인자(Epidermal growth factor; EGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(Insulin-like growth factor-1; IGF-1), 트랜스포밍 성장 인자(Transforming growth factor; TGF), 신경 성장 인자(Nerve growth factor; NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관 내피세포 증식 인자(Vascular endothelial growth factor; VEGF), 과립구 콜로니 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor; GM-CSF), 혈소판 유래 성장 인자(Platelet-derived growth factor; PDGF), 에리트로포이에틴(Erythropoietin; EPO), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin; TPO), 산성 섬유 아세포 증식 인자(Acidic fibroblast growth factor; aFGF 또는 FGF1), 염기성 섬유 아세포 증식 인자(Basic fibroblast growth factor; bFGF 또는 FGF2), 각질 세포 증식 인자(Keratinocyte growth factor; KGF-1 또는 FGF7이나, KGF-2 또는 FGF10), 간세포 증식 인자(Hepatocyte growth factor; HGF), 줄기세포 인자(Stem Cell Factor; SCF), 액티빈(Activin)을 들 수 있다. 액티빈으로서는, 액티빈 A, C, E를 들 수 있다.
호르몬으로서는, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴(somatostatin), 인간 성장 호르몬(human growth hormone; hGH), 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH), 칼시토닌(calcitonin), 엑세나티드(exenatide)를 들 수 있다.
사이토카인으로서는, 인터류킨, 인터페론, 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis Factor; TNF)를 들 수 있다.
또한, 생리 활성 단백질은, 단백질 전체여도 되고, 그의 일부여도 된다. 단백질의 일부로서는, 예를 들어 생리 활성을 갖는 부분을 들 수 있다. 생리 활성을 갖는 부분으로서, 구체적으로는 예를 들어 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH)의 성숙체의 N 말단 34아미노산 잔기로 이루어지는 생리 활성 펩티드 테리파라타이드(Teriparatide)를 들 수 있다.
「항체 관련 분자」란, 완전 항체를 구성하는 도메인으로부터 선택되는 단일의 도메인 또는 2 혹은 그 이상의 도메인의 조합으로 이루어지는 분자종을 포함하는 단백질을 의미해도 된다. 완전 항체를 구성하는 도메인으로서는, 중쇄의 도메인인 VH, CH1, CH2 및 CH3, 그리고 경쇄의 도메인인 VL 및 CL을 들 수 있다. 항체 관련 분자는, 상술한 분자종을 포함하는 한, 단량체 단백질이어도 되고, 다량체 단백질이어도 된다. 또한, 항체 관련 분자가 다량체 단백질인 경우에는, 단일 종류의 서브 유닛으로 이루어지는 호모 다량체여도 되고, 2 또는 그 이상의 종류의 서브 유닛으로 이루어지는 헤테로 다량체여도 된다. 항체 관련 분자로서, 구체적으로는 완전 항체, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fc, 중쇄(H쇄)와 경쇄(L쇄)로 이루어지는 2량체, Fc 융합 단백질, 중쇄(H쇄), 경쇄(L쇄), 단쇄 Fv(scFv), sc(Fv)2, 디술피드 결합 Fv(sdFv), 디아바디(diabody), VHH 프래그먼트(nanobody(등록 상표))를 들 수 있다. 항체 관련 분자로서, 보다 구체적으로는 트라스투주맙(Trastuzumab), 아달리무맙(Adalimumab), 니볼루맙(Nivolumab)을 들 수 있다.
리셉터 단백질로서는, 생리 활성 단백질이나 그 밖의 생리 활성 물질에 대한 리셉터 단백질을 들 수 있다. 그 밖의 생리 활성 물질로서는, 도파민 등의 신경 전달 물질을 들 수 있다. 또한, 리셉터 단백질은, 대응하는 리간드가 알려져 있지 않은 고아 수용체여도 된다.
항원 단백질은, 면역 응답을 야기할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 항원 단백질은, 예를 들어 상정하는 면역 응답의 대상에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 항원 단백질은, 예를 들어 백신으로서 사용할 수 있다.
그 밖의 단백질로서는, 간-타입 지방산 결합 단백질(Liver-type fatty acid-binding protein)(LFABP), 형광 단백질, 면역 글로불린 결합 단백질, 알부민, 피브로인 유사 단백질, 세포 외 단백질을 들 수 있다. 형광 단백질로서는, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein)(GFP)을 들 수 있다. 면역 글로불린 결합 단백질로서는, Protein A, Protein G, Protein L을 들 수 있다. 알부민으로서는, 인간 혈청 알부민을 들 수 있다. 피브로인 유사 단백질로서는, WO2017/090665나 WO2017/171001에 개시된 것을 들 수 있다.
세포 외 단백질로서는, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 오스테오폰틴, 라미닌, 그것들의 부분 서열을 들 수 있다. 라미닌은 α쇄, β쇄 및 γ쇄로 이루어지는 헤테로 3량체 구조를 갖는 단백질이다. 라미닌으로서는 포유류의 라미닌을 들 수 있다. 라미닌의 서브 유닛쇄(즉, α쇄, β쇄 및 γ쇄)로서는, 5종의 α쇄(α1 내지 α5), 3종의 β쇄(β1 내지 β3), 3종의 γ쇄(γ1 내지 γ3)를 들 수 있다. 라미닌은, 이들 서브 유닛쇄의 조합에 의해 여러 가지의 아이소폼을 구성한다. 라미닌으로서, 구체적으로는 예를 들어 라미닌 111, 라미닌 121, 라미닌 211, 라미닌 213, 라미닌 221, 라미닌 311, 라미닌 321, 라미닌 332, 라미닌 411, 라미닌 421, 라미닌 423, 라미닌 511, 라미닌 521, 라미닌 523을 들 수 있다. 라미닌의 부분 서열로서는, 라미닌의 E8 단편인 라미닌 E8을 들 수 있다. 라미닌 E8은, 구체적으로는 α쇄의 E8 단편(α쇄 E8), β쇄의 E8 단편(β쇄 E8) 및 γ쇄의 E8 단편(γ쇄 E8)으로 이루어지는 헤테로 3량체 구조를 갖는 단백질이다. 라미닌 E8의 서브 유닛쇄(즉, α쇄 E8, β쇄 E8 및 γ쇄 E8)를 총칭하여 「E8 서브 유닛쇄」라고도 한다. E8 서브 유닛쇄로서는, 상기 예시한 라미닌 서브 유닛쇄의 E8 단편을 들 수 있다. 라미닌 E8은, 이들 E8 서브 유닛쇄의 조합에 의해 여러 가지의 아이소폼을 구성한다. 라미닌 E8로서, 구체적으로는 예를 들어 라미닌 111E8, 라미닌 121E8, 라미닌 211E8, 라미닌 221E8, 라미닌 332E8, 라미닌 421E8, 라미닌 411E8, 라미닌 511E8, 라미닌 521E8을 들 수 있다.
목적 단백질은, 예를 들어 상기와 같은 단백질의 공지 또는 천연의 아미노산 서열을 갖는 단백질이어도 된다. 또한, 목적 단백질은, 예를 들어 상기와 같은 단백질의 공지 또는 천연의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 배리언트여도 된다. 배리언트로서는, 공지 또는 천연의 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 수개의 위치에서의 1 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 「1 또는 수개」란, 구체적으로는 예를 들어 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개를 의미해도 된다. 배리언트로서는, 공지 또는 천연의 아미노산 서열 전체에 대하여, 예를 들어 50％ 이상, 65％ 이상, 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 97％ 이상, 특히 바람직하게는 99％ 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질도 들 수 있다. 또한, 유래하는 생물종에서 특정되는 단백질은, 당해 생물종에 있어서 발견되는 단백질 그 자체에 한정되지 않고, 당해 생물종에 있어서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 그것들의 배리언트를 포함하는 것으로 한다. 배리언트는, 당해 생물종에 있어서 발견되어도 되고, 발견되지 않아도 된다. 즉, 예를 들어 「인간 유래 단백질」이란, 인간에 있어서 발견되는 단백질 그 자체에 한정되지 않고, 인간에 있어서 발견되는 단백질의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 그것들의 배리언트를 포함하는 것으로 한다.
또한, 아미노산 서열간의 「동일성」이란, blastp에 의해 디폴트 설정의 평가 세부항목들(Scoring Parameters)(Matrix: BLOSUM62; Gap Costs: Existence=11, Extension=1; Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment)을 사용하여 산출되는 아미노산 서열간의 동일성을 의미한다.
목적 단백질 유전자는, 상기와 같은 목적 단백질을 코딩하는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 상기와 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 공지 또는 천연의 염기 서열을 갖는 유전자여도 된다. 또한, 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 상기와 같은 단백질을 코딩하는 유전자의 공지 또는 천연의 염기 서열을 갖는 유전자의 배리언트여도 된다. 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 상기 예시한 바와 같은 배리언트 서열을 갖는 단백질을 코딩하도록 개변되어도 된다. 목적 단백질 유전자는, 임의의 코돈을 그것과 등가의 코돈으로 치환한 것이어도 된다. 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 따라 최적의 코돈을 갖도록 개변되어 있어도 된다.
또한, 본 발명에 있어서, 「유전자」라는 용어는, 대응하는 발현 산물을 코딩하는 한, DNA에 한정되지 않고, 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함해도 된다. 즉, 「목적 단백질 유전자」란, 목적 단백질을 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 의미해도 된다. 목적 단백질 유전자는, DNA여도 되고, RNA여도 되고, 그의 조합이어도 된다. 목적 단백질 유전자는, 단일쇄여도 되고, 이중쇄여도 된다. 목적 단백질 유전자는, 단일쇄 DNA여도 되고, 단일쇄 RNA여도 된다. 목적 단백질 유전자는, 이중쇄 DNA여도 되고, 이중쇄 RNA여도 되고, DNA쇄와 RNA쇄로 이루어지는 하이브리드쇄여도 된다. 목적 단백질 유전자는, 단일의 폴리뉴클레오티드쇄 중에, DNA 잔기와 RNA 잔기의 양쪽을 포함하고 있어도 된다. 목적 단백질 유전자는, 인트론을 포함하고 있어도 되고, 포함하고 있지 않아도 된다. 목적 단백질 유전자의 양태는, 목적 단백질의 발현 수단 등의 여러 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
「(아미노산 또는 염기) 서열을 갖는다」라는 표현은, 특기하지 않는 한, 당해 「(아미노산 또는 염기) 서열을 포함하는」것을 의미하고, 당해 「(아미노산 또는 염기) 서열로 이루어지는」경우도 포함한다.
목적 단백질은, 목적 단백질 유전자로부터 발현된다. 즉, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 목적 단백질 유전자를 갖는다. 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 구체적으로는 목적 단백질 유전자를 발현 가능하게 갖는다. 또한, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 원하는 정도로 목적 단백질을 발현할 때까지 목적 단백질 유전자를 갖고 있으면 충분하다. 즉, 목적 단백질 생산능을 갖는 동물 세포는, 목적 단백질의 발현 후에는, 목적 단백질 유전자를 가져도 되고, 갖지 않아도 된다. 또한, 「목적 단백질 유전자의 발현」과 「목적 단백질의 발현」은 동일 의미로 사용되어도 된다.
목적 단백질 유전자는, 목적 단백질 유전자를 갖는 생물로부터의 클로닝에 의해 취득할 수 있다. 클로닝에는, 동 유전자를 포함하는 게놈 DNA나 cDNA 등의 핵산을 이용할 수 있다. 또한, 목적 단백질 유전자는, 화학 합성에 의해서도 취득할 수 있다(Gene, 60(1), 115-127(1987)).
취득한 목적 단백질 유전자는, 그대로 혹은 적절하게 개변하여 이용할 수 있다. 즉, 목적 단백질 유전자를 개변함으로써, 그의 배리언트를 취득할 수 있다. 유전자의 개변은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들어, 부위 특이적 변이법에 의해, DNA의 목적 부위에 목적의 변이를 도입할 수 있다. 부위 특이적 변이법으로서는, PCR을 사용하는 방법(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press(1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382(1987))이나, 파지를 사용하는 방법(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987))을 들 수 있다. 또한, 목적 단백질 유전자의 배리언트를 화학 합성에 의해 직접 취득해도 된다.
목적 단백질 유전자를 숙주 세포에 도입하는 형태는 특별히 제한되지 않는다. 목적 단백질 유전자는, 발현 가능하게 숙주 세포에 유지되어 있으면 된다. 구체적으로는, 예를 들어 목적 단백질 유전자를 DNA 등의 전사를 요하는 형태로 도입하는 경우, 숙주 세포에 있어서, 목적 단백질 유전자는, 당해 숙주 세포에서 기능하는 프로모터의 제어 하에서 발현 가능하게 유지되어 있으면 된다. 숙주 세포에 있어서, 목적 단백질 유전자는, 염색체 밖에 존재해도 되고, 염색체 상에 도입되어 있어도 된다. 2개 또는 그 이상의 유전자를 도입하는 경우, 각 유전자가 발현 가능하게 숙주 세포에 유지되어 있으면 된다.
목적 단백질 유전자를 발현시키기 위한 프로모터는, 숙주 세포에 있어서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 「숙주 세포에 있어서 기능하는 프로모터」란, 숙주 세포에 있어서 프로모터 활성을 갖는 프로모터를 말한다. 프로모터는, 숙주 세포 유래의 프로모터여도 되고, 이종 유래의 프로모터여도 된다. 프로모터는, 목적 단백질 유전자의 고유의 프로모터여도 되고, 다른 유전자의 프로모터여도 된다. 프로모터는, 목적 단백질 유전자의 고유의 프로모터보다 강력한 프로모터여도 된다. 동물 세포에 있어서 기능하는 프로모터로서는, SV40 프로모터, EF1a 프로모터, RSV 프로모터, CMV 프로모터, SRalpha 프로모터를 들 수 있다. 또한, 프로모터로서는, 각종 리포터 유전자를 사용함으로써, 재래의 프로모터의 고활성형인 것을 취득하여 이용해도 된다. 프로모터의 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128(1995)) 등에 기재되어 있다.
목적 단백질 유전자는, 예를 들어 동 유전자를 포함하는 벡터를 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 목적 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 「목적 단백질 유전자의 발현 벡터」라고도 한다. 목적 단백질 유전자의 발현 벡터는, 예를 들어 목적 단백질 유전자를 포함하는 DNA 단편을 벡터와 연결함으로써 구축할 수 있다. 목적 단백질 유전자의 발현 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써, 동 유전자를 숙주 세포에 도입할 수 있다. 벡터는, 약제 내성 유전자 등의 마커를 구비하고 있어도 된다. 또한, 벡터는, 삽입된 유전자를 발현하기 위한 프로모터 등의 발현 조절 서열을 구비하고 있어도 된다. 벡터는, 숙주 세포의 종류나 목적 단백질 유전자의 도입 형태 등의 여러 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 동물 세포로의 유전자 도입에 사용할 수 있는 벡터로서는, 플라스미드 벡터나 바이러스 벡터를 들 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 예를 들어 레트로바이러스 벡터나 아데노바이러스 벡터를 들 수 있다. 플라스미드 벡터로서는, 예를 들어 pcDNA 시리즈 벡터(pcDNA3.1 등; Thermo Fisher Scientific), pBApo-CMV 시리즈 벡터(다카라 바이오), pCI-neo(Promega)를 들 수 있다. 또한, 벡터의 종류나 구성에 따라서는, 벡터는 숙주 세포의 염색체에 도입될 수 있고, 숙주 세포의 염색체 밖에서 자율 복제할 수 있거나, 혹은 숙주 세포의 염색체 밖에 일시적으로 유지될 수 있다. 예를 들어, SV40 복제 기점 등의 바이러스의 복제 기점을 갖는 벡터는, 동물 세포의 염색체 밖에서 자율 복제할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 pcDNA 시리즈 벡터는 SV40 복제 기점을 갖고 있고, SV40의 라지 T항원을 발현하는 숙주 세포(COS-1이나 HEK293T 등)에 있어서 염색체 밖에서 자율 복제할 수 있다.
또한, 목적 단백질 유전자는, 예를 들어 동 유전자를 포함하는 핵산 단편을 숙주 세포에 도입함으로써도, 숙주 세포에 도입할 수 있다. 그러한 핵산 단편으로서는, 직쇄상 DNA나 직쇄상 RNA를 들 수 있다. 직쇄상 RNA로서는, 예를 들어 mRNA나 cRNA를 들 수 있다.
벡터나 핵산 단편 등의 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법은, 숙주 세포의 종류 등의 여러 조건에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 동물 세포에 벡터나 핵산 단편 등의 핵산을 도입하는 방법으로서는, DEAE 덱스트란법, 인산칼슘법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법, 마이크로 인젝션법을 들 수 있다. 또한, 벡터가 바이러스 벡터인 경우에는, 동 벡터(바이러스)를 숙주 세포에 감염시킴으로써, 숙주 세포에 동 벡터를 도입할 수 있다.
또한, 본래적으로 목적 단백질 유전자를 갖는 세포를, 목적 단백질 유전자의 발현이 증대되도록 개변하여 사용해도 된다. 「유전자의 발현이 증대된다」란, 동 유전자의 세포당 발현량이 비개변 세포와 비교하여 증대되는 것을 의미한다. 여기서 말하는 「비개변 세포」란, 표적의 유전자의 발현이 증대되도록 개변되어 있지 않은 대조 세포를 의미한다. 비개변 세포로서는, 야생형의 세포나 개변원의 세포를 들 수 있다. 목적 단백질 유전자의 발현을 증대시키는 방법으로서는, 목적 단백질 유전자의 카피수를 증가시키는 것이나 목적 단백질 유전자의 전사 효율이나 번역 효율을 향상시키는 것을 들 수 있다. 목적 단백질 유전자의 카피수의 증가는, 목적 단백질 유전자를 숙주 세포에 도입함으로써 달성할 수 있다. 목적 단백질 유전자의 도입은, 상술한 바와 같이 실시할 수 있다. 또한, 도입되는 목적 단백질 유전자는, 숙주 세포 유래여도 되고, 이종 유래여도 된다. 목적 단백질 유전자의 전사 효율이나 번역 효율의 향상은, 프로모터 등의 유전자의 발현 조절 서열의 개변에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질 유전자의 전사 효율의 향상은, 목적 단백질 유전자의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환함으로써 달성할 수 있다.
동물 세포의 배양은, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건에서 실시된다. 동물 세포의 배양은, 예를 들어 적어도 배지 중의 인산 농도를 증강한 조건에서 실시되어도 된다. 「배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건」을 「인산/칼륨 증강 조건」이라고도 한다. 「배지 중의 인산 농도를 증강한 조건」을 특히 「인산 증강 조건」이라고도 한다. 「배지 중의 칼륨 농도를 증강한 조건」을 특히 「칼륨 증강 조건」이라고도 한다. 「배지 중의 인산 농도 및 칼륨 농도 전부가 증강되어 있지 않은 조건」을 「대조 조건」이라고도 한다. 대조 조건으로서는, 동물 세포의 배양에 이용되는 일반적인 조건을 들 수 있다. 대조 조건으로서, 구체적으로는 이하에 예시하는 인산/칼륨 증강 조건을 충족하지 않는 조건을 들 수 있다.
인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 동물 세포의 배양 성적을 향상시킬 수 있다. 구체적으로는, 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 대조 조건에서 동물 세포를 배양하는 경우와 비교하여, 동물 세포의 배양 성적을 향상시킬 수 있다. 또한, 예를 들어 배지 중의 인산 농도 및 칼륨 농도의 양쪽을 증강한 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 배지 중의 인산 농도 및 칼륨 농도의 한쪽만을 증강한 조건에서 동물 세포를 배양하는 경우와 비교하여, 동물 세포의 배양 성적이 향상되어도 된다. 동물 세포의 배양 성적의 향상으로서는, 동물 세포의 증식의 향상, 동물 세포의 생존율의 향상, 동물 세포에 의한 목적 물질 생산의 향상, 동물 세포의 배양 기간의 연장을 들 수 있다.
즉, 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 예를 들어 동물 세포의 증식 및/또는 생존율이 향상되어도 된다. 구체적으로는, 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 대조 조건에서 동물 세포를 배양하는 경우와 비교하여, 동물 세포의 증식 및/또는 생존율이 향상되어도 된다. 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 동물 세포의 생세포 밀도는, 배양 중에, 예를 들어 배양 개시 시의 생세포 밀도의 1.5배 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 90배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상 또는 1000배 이상의 밀도에 도달해도 된다. 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 동물 세포의 생세포 밀도는, 배양 중에, 예를 들어 1.5×107cells/mL 이상, 1.6×107cells/mL 이상, 1.7×107cells/mL 이상, 1.8×107cells/mL 이상, 1.9×107cells/mL 이상, 2×107cells/mL 이상, 3×107cells/mL 이상, 5×107cells/mL 이상, 7×107cells/mL 이상, 1×108cells/mL 이상 또는 1×109cells/mL 이상의 밀도에 도달해도 된다. 동물 세포의 생세포수는, 예를 들어 생사(生死)세포 오토 애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만ㆍ콜터사) 또는 플로 사이토미터 guava easy Cyte(Luminex사)를 사용하여 측정할 수 있다.
또한, 동물 세포가 목적 단백질 생산능 등의 목적 물질 생산능을 갖는 경우, 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 예를 들어 동물 세포에 의한 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산이 향상되어도 된다. 구체적으로는, 동물 세포가 목적 단백질 생산능 등의 목적 물질 생산능을 갖는 경우, 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 대조 조건에서 동물 세포를 배양하는 경우와 비교하여, 동물 세포에 의한 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산이 향상되어도 된다.
또한, 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 예를 들어 동물 세포의 배양 기간이 연장되어도 된다. 구체적으로는, 인산/칼륨 증강 조건에서 동물 세포를 배양함으로써, 대조 조건에서 동물 세포를 배양하는 경우와 비교하여, 동물 세포의 배양 기간이 연장되어도 된다. 동물 세포의 배양 기간의 연장으로서는, 동물 세포의 증식이 계속되는 기간의 연장, 동물 세포가 유지되는(즉, 동물 세포가 생존하는) 기간의 연장, 동물 세포에 의한 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산이 계속되는 기간의 연장을 들 수 있다.
환언하면, 본 발명의 방법의 일 양태는, 동물 세포의 증식을 향상시키는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명의 방법의 일 양태는, 동물 세포의 생존율을 향상시키는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명의 방법의 일 양태는, 동물 세포에 의한 목적 물질 생산을 향상시키는 방법이어도 된다. 또한, 본 발명의 방법의 일 양태는, 동물 세포의 배양 기간을 연장하는 방법이어도 된다.
「동물 세포의 배양」에는, 동물 세포의 증식을 목적으로 하는 것에 한정되지 않고, 동물 세포의 유지나 동물 세포에 의한 목적 물질의 제조 등의, 동물 세포의 증식을 목적으로 하지 않는 것도 포함되어도 된다.
배지 조성이나 배양 조건은, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 증강되는 것 이외에는, 동물 세포의 배양의 목적을 달성할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 동물 세포의 증식을 목적으로 하는 경우, 배지 조성이나 배양 조건은, 동물 세포가 증식되도록 구성할 수 있다. 또한, 예를 들어 동물 세포의 유지를 목적으로 하는 경우, 배지 조성이나 배양 조건은, 동물 세포가 유지되도록(즉, 동물 세포가 생존하도록) 구성할 수 있다. 또한, 예를 들어 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산을 목적으로 하는 경우, 배지 조성이나 배양 조건은, 목적 물질이 생산되도록(예를 들어, 목적 단백질이 발현되도록) 구성할 수 있다. 동물 세포의 증식을 목적으로 하지 않는 경우, 배양 시에 동물 세포는 증식해도 되고, 증식하지 않아도 된다. 동물 세포의 증식을 목적으로 하지 않는 경우라도, 전형적으로는, 배양 시에 동물 세포는 증식해도 된다. 배지 조성이나 배양 조건은, 예를 들어 동물 세포의 종류 등의 여러 조건에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 배양은, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 증강되는 것 이외에는, 예를 들어 동물 세포의 배양에 이용되는 통상의 배지 및 통상의 조건을 그대로, 혹은 적절하게 개변하여 사용하여 실시할 수 있다.
배양은, 예를 들어 액체 배지를 사용하여 실시할 수 있다. 동물 세포의 배양에 이용할 수 있는 배지로서, 구체적으로는 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), CELLiST Basal Media BASAL4P(아지노모토 가부시키가이샤), Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific), RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific), CD293(Thermo Fisher Scientific), CHO-S-SFMII(Thermo Fisher Scientific), CHO-SF(Sigma-Aldrich), EX-CELL CD CHO(Sigma-Aldrich), EX-CELLTM302(Sigma-Aldrich), IS CHO-CD(Irvine Scientific), IS CHO-CDXP(Irvine Scientific)를 들 수 있다. 배지는, 예를 들어 탄소원, 아미노산, 비타민, 무기염, 인산, 콜린, 아민, pH 완충제, 성장 인자, 혈청, 혈청 알부민, 선택 약제, 유전자 발현 유도제 등의 각종 배지 성분을 함유하고 있어도 된다. 탄소원으로서는 글루코오스를 들 수 있다. 아미노산으로서는, 단백질을 구성하는 20종류의 아미노산이나 그것들의 유도체를 들 수 있다. 아미노산은, 예를 들어 L체여도 된다. 아미노산으로서, 구체적으로는 글루타민이나 세린을 들 수 있다. 글루타민으로서는 L-글루타민을 들 수 있다. 세린으로서는 L-세린을 들 수 있다. 아민으로서는, 1,4-부탄디아민(「푸트레신」이라고도 함), 아그마틴, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 에틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N,N-디이소프로필에틸아민, 테트라메틸에틸렌디아민, 헥사메틸렌디아민, 스페르미딘, 스페르민, 아만타딘을 들 수 있다. 방향족 아민으로서는, 아닐린, 페네틸아민, 톨루이딘, 카테콜아민, 1,8-비스(디메틸아미노)나프탈렌을 들 수 있다. 복소환식 아민으로서는, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 퀴누클리딘, 1,4-디아자비시클로[2.2.2]옥탄, 피롤, 피라졸, 이미다졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 옥사졸, 티아졸, 4-디메틸아미노피리딘을 들 수 있다. 아민으로서는, 특히 1,4-부탄디아민, 에탄올아민, 스페르미딘, 스페르민을 들 수 있다. 아민으로서, 또한 특히 1,4-부탄디아민을 들 수 있다.
염을 형성할 수 있는 성분은, 모두, 프리체로서 사용되어도 되고, 염으로서 사용되어도 되고, 그것들의 조합으로서 사용되어도 된다. 즉, 예를 들어 「아미노산」이라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 아미노산, 혹은 그의 염, 또는 그것들의 조합을 의미해도 된다. 또한, 예를 들어 「인산」이라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 인산, 혹은 그의 염, 또는 그것들의 조합을 의미해도 된다. 또한, 예를 들어 「콜린」이라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 콜린, 혹은 그의 염, 또는 그것들의 조합을 의미해도 된다. 또한, 예를 들어 「아민」이라는 용어는, 특기하지 않는 한, 프리체의 아민, 혹은 그의 염, 또는 그것들의 조합을 의미해도 된다. 염은, 동물 세포의 배양에 이용할 수 있는 것이면, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 인산기나 카르복실기 등의 산성기에 대한 염으로서는, 암모늄염, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속과의 염, 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리 토류 금속과의 염, 상기 예시한 바와 같은 아민과의 염, 아르기닌이나 리신 등의 염기성 아미노산과의 염을 들 수 있다. 또한, 예를 들어 아미노기 등의 염기성기에 대한 염으로서는, 염산, 황산, 인산, 질산, 브롬화수소산 등의 무기산과의 염, 아세트산, 시트르산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 숙신산, 탄닌산, 부티르산, 히벤즈산, 파모산, 에난트산, 데칸산, 테오클산, 살리실산, 락트산, 옥살산, 만델산, 말산 등의 유기 카르복실산과의 염, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 유기 술폰산과의 염을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 인산의 염으로서는, 특히 인산2수소나트륨, 인산수소2나트륨, 인산2수소칼륨, 인산수소2칼륨을 들 수 있다. 또한, 구체적으로는, 예를 들어 콜린의 염으로서는, 특히 중타르타르산콜린을 들 수 있다.
배양 개시 시의 동물 세포의 파종량은, 예를 들어 1×103cells/mL 이상, 1×104cells/mL 이상, 1×105cells/mL 이상, 1×106cells/mL 이상 또는 1×107cells/mL 이상이어도 되고, 1×1010cells/mL 이하, 1×109cells/mL 이하, 1×108cells/mL 이하, 1×107cells/mL 이하, 1×106cells/mL 이하, 1×105cells/mL 이하 또는 1×104cells/mL 이하여도 된다.
배양은, 종 배양과 본 배양으로 나누어 실시해도 된다. 종 배양과 본 배양의 배양 조건은, 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 목적 단백질 등의 목적 물질의 생산을 목적으로 하는 경우, 목적 물질은 적어도 본 배양의 기간에 생산되면 된다. 예를 들어, 종 배양에 의해 동물 세포를 충분히 증식시키고 나서, 본 배양에 의해 목적 단백질 등의 목적 물질을 제조해도 된다.
배양은, 회분 배양(batch culture), 유가 배양(Fed-batch culture), 연속 배양(continuous culture), 또는 그것들의 조합에 의해 실시할 수 있다. 유가 배양 또는 연속 배양으로서는, 관류 배양(perfusion culture)을 들 수 있다. 또한, 배양 개시 시의 배지를, 「초발 배지」또는 「기초 배지」라고도 한다. 또한, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 배양계(예를 들어, 초발 배지)에 공급되는 배지를, 「유가 배지」라고도 한다. 또한, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 배양계에 유가 배지를 공급하는 것을, 「유가」라고도 한다. 유가는, 배양의 전기간을 통하여 실시되어도 되고, 배양의 일부의 기간에 있어서만 실시되어도 된다. 또한, 유가는, 연속적으로 실시되어도 되고, 간헐적으로 실시되어도 된다. 배양(특히, 관류 배양 등의 유가 배양 또는 연속 배양) 시에는, 배양액의 인발이 실시되어도 된다. 배양액의 인발은, 예를 들어 동물 세포를 포함하는 배양액의 인발이어도 되고, 배양 상청의 인발이어도 된다. 또한, 인발한 배양액으로부터 동물 세포를 회수하여 배양계로 되돌려도 된다. 배양액의 인발은, 배양의 전기간을 통하여 실시되어도 되고, 배양의 일부의 기간에 있어서만 실시되어도 된다. 배양액의 인발은, 연속적으로 실시되어도 되고, 간헐적으로 실시되어도 된다. 배양액의 인발과 유가는, 동시에 행해져도 되고, 그렇지 않아도 된다. 인발하는 배양액의 양은, 유가하는 유가 배지의 양과 동등량인 것이 바람직하다. 「동등량」이란, 예를 들어 유가하는 유가 배지의 양에 대하여 93 내지 107％(v/v)의 양을 의미해도 된다. 또한, 배양이 종 배양과 본 배양으로 나누어 행해지는 경우, 종 배양과 본 배양의 배양 형태는, 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다.
인산 등의 각종 성분은, 초발 배지, 유가 배지, 또는 그 양쪽에 함유되어 있어도 된다. 즉, 배양의 과정에 있어서, 인산 등의 각종 성분을 단독으로, 혹은 임의의 조합으로 배지에 공급해도 된다. 이들 성분은, 모두, 1회 또는 복수회 공급되어도 되고, 연속적으로 공급되어도 된다. 초발 배지와 유가 배지의 조성(예를 들어, 함유하는 성분의 종류 및/또는 농도)은, 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 즉, 초발 배지에 함유되는 성분의 종류는, 유가 배지에 함유되는 성분의 종류와 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 또한, 초발 배지에 함유되는 각 성분의 농도는, 유가 배지에 함유되는 각 성분의 농도와 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 초발 배지와 유가 배지의 조성은 동일해도 된다. 또한, 조성(예를 들어, 함유하는 성분의 종류 및/또는 농도)이 다른 2종 또는 그 이상의 유가 배지를 사용해도 된다. 예를 들어, 복수회의 유가가 간헐적으로 행해지는 경우, 각 유가 배지의 조성은, 동일해도 되고, 그렇지 않아도 된다. 또한, 인산 등의 각종 성분은, 분말 등의 유가 배지에 함유되지 않는 형태로, 배지에 공급해도 된다.
배양은, 예를 들어 5％ CO2 등의 CO2 함유 분위기 하에서 실시해도 된다. 배지의 pH는, 예를 들어 중성 부근이어도 된다. 「중성 부근」이란, 예를 들어 pH6 내지 8, pH6.5 내지 7.5 또는 pH6.8 내지 7.2를 의미해도 된다. 배양 중, 필요에 따라 배지의 pH를 조정할 수 있다. 배지의 pH는 암모니아 가스, 암모니아수, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 탄산마그네슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 등의 각종 알칼리성 또는 산성 물질을 사용하여 조정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 36 내지 38℃여도 된다. 배양 기간은, 예를 들어 0.5일 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 12일 이상, 15일 이상 또는 20일 이상이어도 되고, 50일 이하, 40일 이하, 30일 이하, 25일 이하, 20일 이하, 15일 이하, 12일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하 또는 7일 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배양 기간은, 구체적으로는 예를 들어 1 내지 30일, 3 내지 25일 또는 5 내지 20일이어도 된다. 배양 시에는, 적절하게 목적 단백질의 발현 등의 유전자 발현을 유도해도 된다.
인산 등의 각종 성분은, 어느 형태로 배지 중에 존재해도 된다. 예를 들어, 어떤 성분이 이온화될 수 있는 성분인 경우, 당해 성분은 배지 중에서 이온화되어 있어도 되고, 이온화되어 있지 않아도 된다.
「어떤 성분의 농도」란, 당해 성분이 복수의 형태로 액체 중에 존재할 수 있는 경우, 용해되어 있는 당해 성분의 총 농도를 의미해도 된다. 즉, 예를 들어 「어떤 성분의 농도」란, 당해 성분이 분자 및 이온의 형태로 액체 중에 존재할 수 있는 경우, 당해 성분의 분자의 농도 및 이온의 농도의 합계를 의미해도 된다. 예를 들어, 「배지 중의 어떤 성분의 농도」란, 당해 성분이 복수의 형태로 배지 중에 존재할 수 있는 경우, 배지 중에 용해되어 있는 당해 성분의 총 농도를 의미해도 된다. 즉, 예를 들어 「배지 중의 어떤 성분의 농도」란, 당해 성분이 분자 및 이온의 형태로 배지 중에 존재할 수 있는 경우, 배지 중의 당해 성분의 분자의 농도 및 이온의 농도의 합계를 의미해도 된다.
예를 들어, 「인산 농도」란, 용해되어 있는 인산 분자종의 총 농도를 의미해도 된다. 즉, 「인산 농도」란, 구체적으로는 인산 분자(H3PO4)의 농도 및 인산 이온(PO4 3-, HPO4 2- 및 H2PO4 -)의 농도의 합계를 의미해도 된다. 예를 들어, 「배지 중의 인산 농도」란, 배지 중에 용해되어 있는 인산 분자종의 총 농도를 의미해도 된다. 즉, 예를 들어 「배지 중의 인산 농도」란, 구체적으로는 배지 중의 인산 분자(H3PO4)의 농도 및 배지 중의 인산 이온(PO4 3-, HPO4 2- 및 H2PO4 -)의 농도의 합계를 의미해도 된다.
배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 증강 정도는, 동물 세포의 배양 성적(예를 들어, 동물 세포의 증식이나 동물 세포에 의한 목적 물질 생산)이 향상되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 증강 정도는, 동물 세포의 종류, 배양 기간의 길이, 원하는 목적 물질 생산량 등의 여러 조건에 따라 적절하게 설정할 수 있다.
「배양이 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건에서 실시된다」란, 예를 들어 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 소정의 범위인 것을 의미해도 된다.
배지 중의 인산 농도는, 예를 들어 0.2mM 이상, 0.5mM 이상, 1mM 이상, 1.5mM 이상, 2mM 이상, 2.5mM 이상, 3mM 이상, 3.5mM 이상, 4mM 이상, 4.5mM 이상, 5mM 이상, 5.5mM 이상, 6mM 이상, 6.5mM 이상, 7mM 이상, 7.5mM 이상, 8mM 이상, 8.5mM 이상, 9mM 이상, 9.5mM 이상, 10mM 이상, 11mM 이상, 12mM 이상, 13mM 이상, 14mM 이상, 15mM 이상, 16mM 이상, 17mM 이상, 18mM 이상, 19mM 이상 또는 20mM 이상이어도 되고, 100mM 이하, 70mM 이하, 50mM 이하, 40mM 이하, 30mM 이하, 29mM 이하, 28mM 이하, 27mM 이하, 26mM 이하, 25mM 이하, 24mM 이하, 23mM 이하, 22mM 이하, 21mM 이하, 20mM 이하, 19mM 이하, 18mM 이하, 17mM 이하, 16mM 이하, 15mM 이하, 14mM 이하, 13mM 이하, 12mM 이하, 11mM 이하, 10mM 이하, 9mM 이하, 8mM 이하, 7mM 이하, 6mM 이하 또는 5mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지 중의 인산 농도는, 특히 4mM 이상이어도 된다. 배지 중의 인산 농도는, 또한 특히 11mM 이상이어도 된다. 배지 중의 인산 농도는, 구체적으로는 예를 들어 0.2 내지 100mM, 4 내지 70mM, 11 내지 50mM, 11 내지 40mM, 11 내지 30mM, 11 내지 27mM 또는 10 내지 25mM이어도 된다.
배지 중의 칼륨 농도는, 예를 들어 0.2mM 이상, 0.5mM 이상, 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상, 4mM 이상, 5mM 이상, 6mM 이상, 7mM 이상, 8mM 이상, 9mM 이상 또는 10mM 이상이어도 되고, 50mM 이하, 40mM 이하, 30mM 이하, 20mM 이하, 15mM 이하, 12mM 이하, 10mM 이하, 9mM 이하, 8mM 이하, 7mM 이하, 6mM 이하 또는 5mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지 중의 칼륨 농도는, 특히 1mM 이상이어도 된다. 배지 중의 칼륨 농도는, 구체적으로는 예를 들어 0.2 내지 50mM, 0.5 내지 30mM 또는 1 내지 10mM이어도 된다.
배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도는, 배양의 전기간에 있어서 증강되어 있어도 되고, 배양의 일부의 기간에만 증강되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건에서 실시된다」란, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 배양의 적어도 일부의 기간에 있어서 증강되어 있으면 충분하며, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 배양의 전기간에 있어서 증강되어 있는 것을 요하지 않는다.
배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도는, 예를 들어 배양의 전기간에 있어서 상기 예시한 농도로 증강되어 있어도 되고, 배양의 일부의 기간에만 상기 예시한 농도로 증강되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 어떤 농도로 증강한 조건에서 실시된다」또는 「배양이 어떤 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 배지에서 실시된다」란, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 배양의 적어도 일부의 기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있으면 충분하며, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 배양의 전기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있는 것을 요하지 않는다. 인산 및/또는 칼륨은, 예를 들어 배양 개시 시에 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양 개시 후에 상기 예시한 농도로 되도록 배지에 공급되어도 된다. 또한, 인산 및/또는 칼륨은, 예를 들어 배양 개시 시에 상기 예시한 농도로 배지에 함유되며, 또한 배양 개시 후(예를 들어, 소비 후)에 상기 예시한 농도로 되도록 배지에 더 공급되어도 된다. 배양이 종 배양과 본 배양으로 나누어 행해지는 경우, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도는, 적어도 본 배양의 기간에, 즉 본 배양의 전기간 또는 본 배양의 일부의 기간에 증강되어 있으면 된다. 즉, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도는, 종 배양의 기간에는 증강되어 있어도 되고, 증강되어 있지 않아도 된다. 이러한 경우, 배양에 대한 기재(예를 들어, 「배양 기간(배양의 기간)」이나 「배양 개시」)는, 본 배양에 대한 것으로서 바꿔 읽을 수 있다.
「일부의 기간」은, 동물 세포의 배양 성적(예를 들어, 동물 세포의 증식이나 동물 세포에 의한 목적 물질 생산)이 향상되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 「일부의 기간」은, 동물 세포의 종류, 배양 기간의 길이, 원하는 목적 물질 생산량 등의 여러 조건에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 「일부의 기간」은, 예를 들어 배양의 전기간의 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 97％ 이상 또는 99％ 이상의 기간이어도 된다. 또한, 「일부의 기간」은, 예를 들어 0.5일 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 12일 이상 또는 15일 이상의 기간이어도 된다.
또한, 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도는, 예를 들어 배양의 전기간을 통한 평균값으로서, 상기 예시한 농도로 증강되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 어떤 농도로 증강한 조건에서 실시된다」또는 「배양이 어떤 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 배지에서 실시된다」란, 배양의 전기간을 통한 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 평균값이 당해 농도의 범위 내에 있는 것을 의미해도 된다. 「배양의 전기간을 통한 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 평균값」이란, 배양의 전기간에 있어서의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 변동을 파악할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여 60분마다, 30분마다, 20분마다 또는 10분마다 측정된 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도의 평균값을 의미해도 된다.
또한, 「배양이 배지 중의 인산 농도 및/또는 칼륨 농도를 증강한 조건에서 실시된다」란, 예를 들어 배지에 대한 인산 및/또는 칼륨의 공급량이 소정의 범위인 것을 의미해도 된다.
배지에 대한 인산의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상, 0.1mM 이상, 0.15mM 이상, 0.2mM 이상, 0.25mM 이상, 0.3mM 이상, 0.35mM 이상, 0.4mM 이상, 0.45mM 이상, 0.5mM 이상, 0.55mM 이상, 0.6mM 이상, 0.65mM 이상, 0.7mM 이상, 0.75mM 이상, 0.8mM 이상, 0.85mM 이상, 0.9mM 이상, 0.95mM 이상 또는 1mM 이상이어도 되고, 5mM 이하, 4mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하 또는 1mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지에 대한 인산의 공급량은, 특히 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상이어도 된다. 배지에 대한 인산의 공급량은, 또한 특히 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.5mM 이상이어도 된다. 배지에 대한 인산의 공급량은, 구체적으로는 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05 내지 5mM, 0.1 내지 4mM, 0.4 내지 3mM 또는 0.7 내지 2mM이어도 된다.
배지에 대한 칼륨의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상, 0.1mM 이상, 0.15mM 이상, 0.2mM 이상, 0.25mM 이상, 0.3mM 이상, 0.35mM 이상, 0.4mM 이상, 0.45mM 이상 또는 0.5mM 이상이어도 되고, 5mM 이하, 4.5mM 이하, 4mM 이하, 3.5mM 이하, 3mM 이하, 2.5mM 이하, 2mM 이하, 1.5mM 이하, 1mM 이하, 0.7mM 이하, 0.5mM 이하 또는 0.2mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지에 대한 칼륨의 공급량은, 특히 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.2mM 이상이어도 된다. 배지에 대한 칼륨의 공급량은, 구체적으로는 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05 내지 5mM, 0.1 내지 3mM 또는 0.2 내지 1mM이어도 된다.
인산 및/또는 칼륨은, 예를 들어 연속적으로 배지에 공급되어도 되고, 간헐적으로 배지에 공급되어도 된다. 인산 및/또는 칼륨은, 예를 들어 매일 배지에 공급되어도 되고, 수일 간격으로 배지에 공급되어도 된다.
배지에 대한 인산 및/또는 칼륨의 공급은, 예를 들어 동물 세포의 생세포 밀도가 1.5×106cells/mL 이상, 1.6×106cells/mL 이상, 1.7×106cells/mL 이상, 1.8×106cells/mL 이상, 1.9×106cells/mL 이상, 2×106cells/mL 이상, 3×106cells/mL 이상, 5×106cells/mL 이상, 7×106cells/mL 이상, 1×107cells/mL 이상 또는 1×108cells/mL 이상의 밀도인 시점에서 실시해도 된다.
배양은, 아민, 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시되어도 된다. 배양은, 예를 들어 적어도 배지 중의 인산 농도가 증강되어 있는 경우에, 아민, 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시되어도 된다. 배양은, 예를 들어 적어도 아민의 존재 하에서 실시되어도 된다. 배양은, 예를 들어 적어도 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시되어도 된다.
「배양이 아민, 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시된다」란, 예를 들어 배지가 아민, 콜린 및/또는 세린을 함유하는 것을 의미해도 된다.
배지 중의 아민 농도는, 예를 들어 0.001mM 이상, 0.002mM 이상, 0.005mM 이상, 0.01mM 이상, 0.02mM 이상, 0.03mM 이상, 0.04mM 이상, 0.05mM 이상, 0.06mM 이상, 0.07mM 이상, 0.08mM 이상, 0.09mM 이상 또는 0.1mM 이상이어도 되고, 0.5mM 이하, 0.4mM 이하, 0.3mM 이하, 0.2mM 이하, 0.15mM 이하, 0.12mM 이하, 0.1mM 이하, 0.09mM 이하, 0.08mM 이하, 0.07mM 이하, 0.06mM 이하, 0.05mM 이하, 0.04mM 이하, 0.03mM 이하, 0.02mM 이하 또는 0.01mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지 중의 아민 농도는, 특히 0.002mM 이상이어도 된다. 배지 중의 아민 농도는, 또한 특히 0.007mM 이상이어도 된다. 배지 중의 아민 농도는, 구체적으로는 예를 들어 0.002 내지 0.5mM, 0.005 내지 0.2mM 또는 0.007 내지 0.1mM이어도 된다.
배지 중의 콜린 농도는, 예를 들어 0.1mM 이상, 0.2mM 이상, 0.5mM 이상, 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상, 4mM 이상, 5mM 이상, 6mM 이상, 7mM 이상, 8mM 이상, 9mM 이상 또는 10mM 이상이어도 되고, 50mM 이하, 40mM 이하, 30mM 이하, 20mM 이하, 15mM 이하, 12mM 이하, 10mM 이하, 9mM 이하, 8mM 이하, 7mM 이하, 6mM 이하, 5mM 이하, 4mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하 또는 1mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지 중의 콜린 농도는, 특히 0.2mM 이상이어도 된다. 배지 중의 콜린 농도는, 또한 특히 1mM 이상이어도 된다. 배지 중의 콜린 농도는, 구체적으로는 예를 들어 0.2 내지 50mM, 0.5 내지 20mM 또는 1 내지 10mM이어도 된다.
배지 중의 세린 농도는, 예를 들어 0.5mM 이상, 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상, 4mM 이상, 5mM 이상, 6mM 이상, 7mM 이상, 8mM 이상, 9mM 이상, 10mM 이상, 12mM 이상, 15mM 이상, 20mM 이상, 25mM 이상, 30mM 이상, 35mM 이상, 40mM 이상, 50mM 이상, 60mM 이상, 70mM 이상, 80mM 이상, 90mM 이상 또는 100mM 이상이어도 되고, 500mM 이하, 400mM 이하, 300mM 이하, 200mM 이하, 150mM 이하, 100mM 이하, 70mM 이하, 50mM 이하, 40mM 이하, 30mM 이하, 20mM 이하, 15mM 이하, 12mM 이하, 10mM 이하, 9mM 이하, 8mM 이하, 7mM 이하, 6mM 이하 또는 5mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지 중의 세린 농도는, 특히 2mM 이상이어도 된다. 배지 중의 세린 농도는, 또한 특히 10mM 이상이어도 된다. 배지 중의 세린 농도는, 구체적으로는 예를 들어 1 내지 200mM, 2 내지 100mM, 4 내지 50mM, 2 내지 500mM, 5 내지 200mM 또는 10 내지 100mM이어도 된다.
아민, 콜린 및/또는 세린은, 배양의 전기간에 있어서 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양의 일부의 기간에만 배지에 함유되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 아민, 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시된다」또는 「배양이 아민, 콜린 및/또는 세린을 함유하는 배지에서 실시된다」란, 아민, 콜린 및/또는 세린이 배양의 적어도 일부의 기간에 있어서 배지에 함유되어 있으면 충분하며, 아민, 콜린 및/또는 세린이 배양의 전기간에 있어서 배지에 함유되어 있는 것을 요하지 않는다.
아민, 콜린 및/또는 세린은, 예를 들어 배양의 전기간에 있어서 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 되고, 배양의 일부의 기간에만 상기 예시한 농도로 배지에 함유되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 어떤 농도의 아민, 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시된다」또는 「배양이 어떤 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도의 배지에서 실시된다」란, 배지 중의 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도가 배양의 적어도 일부의 기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있으면 충분하며, 배지 중의 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도가 배양의 전기간에 있어서 당해 농도의 범위 내에 있는 것을 요하지 않는다.
「일부의 기간」에 대해서는, 인산/칼륨 증강 조건에 있어서의 「일부의 기간」에 대한 기재를 준용할 수 있다.
또한, 배지 중의 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도는, 예를 들어 배양의 전기간을 통한 평균값으로서, 상기 예시한 농도로 설정되어 있어도 된다. 즉, 「배양이 어떤 농도의 아민, 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시된다」또는 「배양이 어떤 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도의 배지에서 실시된다」란, 배양의 전기간을 통한 배지 중의 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도의 평균값이 당해 농도의 범위 내에 있는 것을 의미해도 된다. 「배양의 전기간을 통한 배지 중의 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도의 평균값」이란, 배양의 전기간에 있어서의 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도의 변동을 파악할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여 60분마다, 30분마다, 20분마다 또는 10분마다 측정된 배지 중의 아민 농도, 콜린 농도 및/또는 세린 농도의 평균값을 의미해도 된다.
또한, 「배양이 아민, 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시된다」란, 예를 들어 배지에 아민, 콜린 및/또는 세린이 공급되는 것을 의미해도 된다.
배지에 대한 아민의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.0002mM 이상, 0.0005mM 이상, 0.001mM 이상, 0.0015mM 이상, 0.002mM 이상, 0.0025mM 이상, 0.003mM 이상, 0.0035mM 이상, 0.004mM 이상, 0.0045mM 이상 또는 0.005mM 이상이어도 되고, 0.025mM 이하, 0.02mM 이하, 0.015mM 이하, 0.01mM 이하, 0.007mM 이하, 0.005mM 이하, 0.002mM 이하 또는 0.001mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지에 대한 아민의 공급량은, 특히 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.0005mM 이상이어도 된다. 배지에 대한 아민의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.0005 내지 0.025mMmM, 0.001 내지 0.015mM, 0.002 내지 0.007mM 또는 0.003 내지 0.004mM이어도 된다.
배지에 대한 콜린의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.02mM 이상, 0.05mM 이상, 0.1mM 이상, 0.15mM 이상, 0.2mM 이상, 0.25mM 이상, 0.3mM 이상, 0.35mM 이상, 0.4mM 이상, 0.45mM 이상 또는 0.5mM 이상이어도 되고, 2.5mM 이하, 2mM 이하, 1.5mM 이하, 1mM 이하, 0.7mM 이하, 0.5mM 이하, 0.2mM 이하 또는 0.1mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지에 대한 콜린의 공급량은, 특히 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상이어도 된다. 배지에 대한 콜린의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05 내지 2.5mM, 0.1 내지 1.5mM, 0.2 내지 0.7mM 또는 0.3 내지 0.5mM이어도 된다.
배지에 대한 세린의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.1mM 이상, 0.2mM 이상, 0.3mM 이상, 0.4mM 이상, 0.5mM 이상, 0.6mM 이상, 0.7mM 이상, 0.8mM 이상, 0.9mM 이상, 1mM 이상, 1.2mM 이상, 1.5mM 이상, 2mM 이상, 2.5mM 이상, 3mM 이상, 3.5mM 이상, 4mM 이상, 4.5mM 이상 또는 5mM 이상이어도 되고, 25mM 이하, 20mM 이하, 15mM 이하, 10mM 이하, 7mM 이하, 5mM 이하, 4mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하, 1mM 이하, 0.7mM 이하 또는 0.5mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 배지에 대한 세린의 공급량은, 특히 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.5mM 이상이어도 된다. 배지에 대한 세린의 공급량은, 예를 들어 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.2 내지 10mM, 0.4 내지 5mM, 0.8 내지 3mM, 0.5 내지 25mM, 1 내지 15mM, 2 내지 7mM 또는 3.5 내지 5mM이어도 된다.
아민, 콜린 및/또는 세린은, 예를 들어 연속적으로 배지에 공급되어도 되고, 간헐적으로 배지에 공급되어도 된다. 아민, 콜린 및/또는 세린은, 예를 들어 매일 배지에 공급되어도 되고, 수일 간격으로 배지에 공급되어도 된다.
유가 배지의 유가에 의해 인산을 배지에 공급하는 경우, 유가 배지 중의 인산 농도는, 원하는 인산의 공급량이 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유가 배지 중의 인산 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 인산 농도여도 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 유가 배지 중의 인산 농도는, 상기 예시한 배지 중의 인산 농도여도 된다. 또한, 유가 배지 중의 인산 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 인산 농도의 1배 초과, 1.1배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 15배 이상 또는 20배 이상의 농도여도 되고, 100배 이하, 70배 이하, 50배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하 또는 5배 이하의 농도여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 또한, 유가 배지 중의 인산 농도는, 예를 들어 10mM 이상, 20mM 이상, 30mM 이상, 50mM 이상, 70mM 이상, 100mM 이상, 150mM 이상 또는 200mM 이상이어도 되고, 1000mM 이하, 700mM 이하, 500mM 이하, 300mM 이하, 200mM 이하, 100mM 이하, 70mM 이하 또는 50mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 유가 배지 중의 인산 농도는, 구체적으로는 예를 들어 10 내지 1000mM, 30 내지 500mM 또는 50 내지 200mM이어도 된다.
유가 배지의 유가에 의해 아민을 배지에 공급하는 경우, 유가 배지 중의 아민 농도는, 원하는 아민의 공급량이 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유가 배지 중의 아민 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 아민 농도여도 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 유가 배지 중의 아민 농도는, 상기 예시한 배지 중의 아민 농도여도 된다. 또한, 유가 배지 중의 아민 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 아민 농도의 1배 초과, 1.1배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 15배 이상 또는 20배 이상의 농도여도 되고, 100배 이하, 70배 이하, 50배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하 또는 5배 이하의 농도여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 또한, 유가 배지 중의 아민 농도는, 예를 들어 0.05mM 이상, 0.1mM 이상, 0.2mM 이상, 0.3mM 이상, 0.5mM 이상, 0.7mM 이상, 1mM 이상 또는 1mM 이상이어도 되고, 5mM 이하, 3mM 이하, 2mM 이하, 1mM 이하, 0.7mM 이하, 0.5mM 이하, 0.3mM 이하 또는 0.2mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 유가 배지 중의 아민 농도는, 구체적으로는 예를 들어 0.05 내지 5mM, 0.1 내지 3mM 또는 0.2 내지 1mM이어도 된다.
유가 배지의 유가에 의해 콜린을 배지에 공급하는 경우, 유가 배지 중의 콜린 농도는, 원하는 콜린의 공급량이 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유가 배지 중의 콜린 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 콜린 농도여도 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 유가 배지 중의 콜린 농도는, 상기 예시한 배지 중의 콜린 농도여도 된다. 또한, 유가 배지 중의 콜린 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 콜린 농도의 1배 초과, 1.1배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 15배 이상 또는 20배 이상의 농도여도 되고, 100배 이하, 70배 이하, 50배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하 또는 5배 이하의 농도여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 또한, 유가 배지 중의 콜린 농도는, 예를 들어 5mM 이상, 10mM 이상, 20mM 이상, 30mM 이상, 50mM 이상, 70mM 이상 또는 100mM 이상이어도 되고, 500mM 이하, 300mM 이하, 200mM 이하, 100mM 이하, 70mM 이하, 50mM 이하, 30mM 이하 또는 20mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 유가 배지 중의 콜린 농도는, 구체적으로는 예를 들어 5 내지 500mM, 10 내지 300mM 또는 20 내지 100mM이어도 된다.
유가 배지의 유가에 의해 세린을 배지에 공급하는 경우, 유가 배지 중의 세린 농도는, 원하는 세린의 공급량이 얻어지는 한, 특별히 제한되지 않는다. 유가 배지 중의 세린 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 세린 농도여도 된다. 예를 들어, 유가 배지가 관류 배양에 사용되는 경우에, 유가 배지 중의 세린 농도는, 상기 예시한 배지 중의 세린 농도여도 된다. 또한, 유가 배지 중의 세린 농도는, 예를 들어 상기 예시한 배지 중의 세린 농도의 1배 초과, 1.1배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 7배 이상, 10배 이상, 15배 이상 또는 20배 이상의 농도여도 되고, 100배 이하, 70배 이하, 50배 이하, 30배 이하, 20배 이하, 10배 이하 또는 5배 이하의 농도여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 또한, 유가 배지 중의 세린 농도는, 예를 들어 20mM 이상, 30mM 이상, 50mM 이상, 70mM 이상, 100mM 이상, 200mM 이상, 300mM 이상, 500mM 이상, 700mM 이상 또는 1000mM 이상이어도 되고, 5000mM 이하, 3000mM 이하, 2000mM 이하, 1000mM 이하, 700mM 이하, 500mM 이하, 300mM 이하, 200mM 이하, 100mM 이하 또는 70mM 이하여도 되며, 그것들의 모순되지 않는 조합이어도 된다. 유가 배지 중의 세린 농도는, 구체적으로는 예를 들어 30 내지 2000mM, 50 내지 1000mM, 70 내지 500mM, 50 내지 5000mM, 100 내지 3000mM 또는 200 내지 1000mM이어도 된다.
각종 성분의 농도는, 예를 들어 화합물의 검출 또는 동정에 사용되는 공지된 방법에 의해 측정할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 HPLC, UPLC, LC/MS, GC/MS, NMR을 들 수 있다. 이들 방법은, 목적 물질이 생성된 것의 확인에도 이용할 수 있다. 이들 방법은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절하게 조합하여 사용해도 된다.
상기와 같이 하여 동물 세포를 배양할 수 있다. 동물 세포가 목적 단백질 생산능 등의 목적 물질 생산능을 갖는 경우, 상기와 같이 하여 동물 세포를 배양함으로써, 목적 물질이 생성(예를 들어, 목적 단백질이 발현)되고, 이로써 목적 물질을 함유하는 배양물이 얻어진다. 목적 단백질 등의 목적 물질은, 구체적으로는 배지 중, 세포 표층, 세포 내, 또는 그것들의 조합에 축적되어도 된다.
이하, 특히 목적 단백질을 제조하는 경우를 참조하여 목적 단백질의 생성의 확인, 회수, 정제 등의 조작에 대하여 설명하지만, 목적 단백질 이외의 목적 물질에 대해서도, 적절하게 그러한 조작을 실시할 수 있다.
목적 단백질이 생성된 것은, 단백질의 검출 또는 동정에 사용되는 공지된 방법에 의해 확인할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 SDS-PAGE, 웨스턴 블로팅(Western blotting), 질량 분석, N 말단 아미노산 서열 해석, 효소 활성 측정을 들 수 있다. 이들 방법은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절하게 조합하여 사용해도 된다.
목적 단백질은 적절하게 회수할 수 있다. 목적 단백질은, 구체적으로는 목적 단백질을 함유하는 적당한 분획으로서 회수할 수 있다. 그러한 분획으로서는, 예를 들어 배양물, 배양 상청, 배양 세포, 배양 세포의 처리물(파쇄물, 용해물, 추출물(무세포 추출액)을 들 수 있다. 배양 세포는, 예를 들어 아크릴아미드나 카라기난 등의 담체로 고정화한 고정화 세포의 형태로 취득되어도 된다.
목적 단백질은, 또한 원하는 정도로 정제되어도 된다.
배지 중에 목적 단백질이 축적되는 경우, 목적 단백질은, 예를 들어 세포 등의 고형분을 원심 분리 등에 의해 배양물로부터 제거한 후, 상청으로부터 정제할 수 있다.
세포 내에 목적 단백질이 축적되는 경우, 목적 단백질은, 예를 들어 세포를 파쇄, 용해 또는 추출 등의 처리에 제공한 후, 처리물로부터 정제할 수 있다. 세포는, 원심 분리 등에 의해 배양물로부터 회수할 수 있다. 세포의 파쇄, 용해 또는 추출 등의 처리는, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 초음파 파쇄법, 다이노 밀법, 비즈 파쇄, 프렌치 프레스 파쇄, 리소자임 처리를 들 수 있다. 이들 방법은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절하게 조합하여 사용해도 된다.
세포 표층에 목적 단백질이 축적되는 경우, 목적 단백질은, 예를 들어 가용화한 후, 가용화물로부터 정제할 수 있다. 가용화는, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 염 농도의 상승이나 계면 활성제의 사용을 들 수 있다. 이들 방법은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절하게 조합하여 사용해도 된다.
목적 단백질의 정제(예를 들어, 상기와 같은 상청, 처리물 또는 가용화물로부터의 정제)는, 단백질의 정제에 사용되는 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 그러한 방법으로서는, 예를 들어 황산암모늄 분획, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 등전점 침전을 들 수 있다. 이들 방법은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 또는 그 이상을 적절하게 조합하여 사용해도 된다.
목적 단백질은, 유리된 상태로 취득되어도 되고, 수지 등의 고상에 고정화된 고정화 효소의 상태로 취득되어도 된다.
회수한 목적 단백질은, 적절하게 제제화해도 된다. 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적 단백질의 사용 용도 등의 여러 조건에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 제형으로서는, 예를 들어 액제, 현탁제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제를 들 수 있다. 제제화 시에는, 예를 들어 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 안정화제, 교미제, 교취제, 향료, 희석제, 계면 활성제 등의 약리학적으로 허용되는 첨가제를 사용할 수 있다.
<2> 본 발명의 배지
본 발명의 배지는, 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 증강된 동물 세포 배양용 배지이다. 본 발명의 배지는, 예를 들어 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.
본 발명의 배지에 대해서는, 예를 들어 본 발명의 방법에 사용되는 배지의 기재(유가 배지의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
본 발명의 배지는 인산 및/또는 칼륨을 함유한다. 본 발명의 배지는, 또한 아민, 콜린 및/또는 세린을 함유하고 있어도 된다. 본 발명의 배지는, 예를 들어 적어도 인산을 함유하는 경우에, 아민, 콜린 및/또는 세린을 함유하고 있어도 된다. 본 발명의 배지는, 예를 들어 적어도 아민을 함유하고 있어도 된다. 본 발명의 배지는, 예를 들어 적어도 콜린 및/또는 세린을 함유하고 있어도 된다.
본 발명의 배지는, 예를 들어 기초 배지(초발 배지)여도 되고, 유가 배지여도 된다. 유가 배지는, 예를 들어 유가 배양 또는 연속 배양에 사용하는 것이어도 된다. 유가 배지는, 예를 들어 특히 관류 배양에 사용하는 것이어도 된다.
본 발명의 배지에 있어서의 인산 농도에 대해서는, 예를 들어 상기 예시한 본 발명의 방법에 있어서의 배지 중의 인산 농도의 기재(유가 배지 중의 인산 농도의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
본 발명의 배지에 있어서의 칼륨 농도에 대해서는, 예를 들어 상기 예시한 본 발명의 방법에 있어서의 배지 중의 칼륨 농도의 기재(유가 배지 중의 칼륨 농도의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
본 발명의 배지에 있어서의 아민 농도에 대해서는, 예를 들어 상기 예시한 본 발명의 방법에 있어서의 배지 중의 아민 농도의 기재(유가 배지 중의 아민 농도의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
본 발명의 배지에 있어서의 콜린 농도에 대해서는, 예를 들어 상기 예시한 본 발명의 방법에 있어서의 배지 중의 콜린 농도의 기재(유가 배지 중의 콜린 농도의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
본 발명의 배지에 있어서의 세린 농도에 대해서는, 예를 들어 상기 예시한 본 발명의 방법에 있어서의 배지 중의 세린 농도의 기재(유가 배지 중의 세린 농도의 기재도 포함함)를 준용할 수 있다.
실시예
이하, 비한정적인 실시예를 참조하여, 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 유가 배지에 대한 인산 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과의 평가
본 실시예에서는, 유가 배지에 대한 인산 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과를 평가하였다. CHO 세포로서는, 항체 아달리무맙을 생산하도록 개변된 CHO DG-44 계통의 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL4P; 최종 농도 1.9mM의 인산을 함유함)에 LR3-IGF-1(최종 농도 10㎍/mL), 덱스트란황산나트륨(최종 농도 400mg/L) 및 L-글루타민(최종 농도 6mM)을 첨가하여, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 유가 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Feed media(아지노모토 가부시키가이샤: FEED2)에 글루코오스(최종 농도 75g/L)와 인산2수소나트륨(최종 농도 0, 125, 250, 500, 1000, 4000 또는 7000mg/L(즉, 0.0, 1.0, 2.1, 4.2, 8.3, 33.3 또는 58.3mM))을 첨가하여, 인산 농도가 다른 7종류의 유가 배지를 조제하였다.
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 30mL를 125mL 플라스크(CORNING: 431143)에 파종하고, 14일간 배양을 행하였다. 배양은, 모든 실험군에 대하여 n=2에서 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 조제한 유가 배지를 배양 개시 4, 7, 9, 11일째에 각각 2.1mL 첨가하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11 및 14일째에 세포 배양액을 샘플링하여, 생세포수를 생사세포 오토 애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만ㆍ콜터사)을 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 Octet QK(FORTEBIO사)를 사용하여 측정하였다.
(4) 배양 결과
생세포수의 추이 및 배양 14일째의 항체 산생량을 도 1 및 2에 도시한다. 유가 배지 중의 인산 농도의 증대에 수반하여, 생세포수와 항체 산생량이 향상되는 것이 밝혀졌다.
실시예 2: 유가 배지에 대한 인산 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과의 평가
본 실시예에서는, 유가 배지에 대한 인산 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과를 평가하였다. CHO 세포로서는, 항체 아달리무맙을 생산하도록 개변된 CHO DG-44 계통의 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL4P; 최종 농도 1.9mM의 인산을 함유함)에 LR3-IGF-1(최종 농도 10㎍/mL), 인산2수소나트륨(115mg/L(즉, 최종 농도 2.9mM)), 덱스트란황산나트륨(최종 농도 400mg/L)과 L-글루타민(최종 농도 6mM)을 첨가하여, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 유가 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Feed media(아지노모토 가부시키가이샤: FEED2)에 글루코오스(최종 농도 75g/L)와 인산2수소나트륨(최종 농도 0, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000mg/L(즉, 0.0, 8.3, 16.7, 25, 33.3 또는 41.7mM))을 첨가하여, 인산 농도가 다른 6종류의 유가 배지를 조제하였다.
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 30mL를 125mL 플라스크(CORNING: 431143)에 파종하고, 14일간 배양을 행하였다. 배양은, 모든 실험군에 대하여 n=2에서 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 조제한 유가 배지를 배양 개시 4, 7, 9, 11일째에 각각 2.1mL 첨가하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11 및 14일째에 세포 배양액을 샘플링하여, 생세포수를 생사세포 오토 애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만ㆍ콜터사)을 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 CEDEX Bio HT(로슈ㆍ다이아그노스틱스사)를 사용하여 측정하였다.
(4) 배양 결과
배양액 중의 인산 농도의 추이 및 배양 14일째의 항체 산생량을 도 3 및 4에 도시한다. 최종 농도 2000mg/L 인산2수소나트륨을 함유하는 유가 배지를 첨가함으로써, 선행 특허(US6,924,124)에 기재된 인산 농도(배양액 중의 인산 농도 1.5 내지 3.5mM)를 재현하였다. 선행 특허의 조건보다 고농도의 인산을 함유하는 유가 배지를 첨가함으로써, 선행 특허의 조건과 비교하여 항체의 생산성이 향상되는 것이 밝혀졌다.
실시예 3: 유가 배지에 대한 인산 및 세린, 콜린 또는 아민의 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과의 평가
본 실시예에서는, 유가 배지에 대한 인산 및 세린, 콜린, 또는 아민의 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과를 평가하였다. CHO 세포로서는, 항체 아달리무맙을 생산하도록 개변된 CHO S 계통의 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL4P; 최종 농도 1.9mM의 인산을 함유함)에 LR3-IGF-1(최종 농도 10㎍/mL), 인산2수소나트륨(115mg/L(즉, Basal media에 함유되는 인산과의 합계로 최종 농도 2.9mM)), 덱스트란황산나트륨(최종 농도 400mg/L) 및 L-글루타민(최종 농도 6mM)을 첨가하여, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 유가 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Feed media(아지노모토 가부시키가이샤: FEED2)에 글루코오스(최종 농도 75g/L), 인산2수소나트륨(최종 농도 0 또는 2500mg/L(즉, 0.0 또는 20.8mM)), 및 필요에 따라 이하의 성분 (A), (B), (C) 또는 (D)를 첨가하여, 10종류의 유가 배지를 조제하였다:
(A) 1,4-부탄디아민(최종 농도 12.8mg/L(즉, 0.145mM));
(B) 세린(최종 농도 20,000mg/L(즉, 190mM)), 중타르타르산콜린(최종 농도 4,400mg/L(즉, 17.4mM)) 및 1,4-부탄디아민(최종 농도 12.8mg/L(즉, 0.145mM));
(C) 1.5배 농도의 성분 (B)(즉, 세린: 30,000mg/L, 중타르타르산콜린: 6,600mg/L 및 1,4-부탄디아민: 19.2mg/L);
(D) 2배 농도의 성분 (B)(즉, 세린: 40,000mg/L, 중타르타르산콜린: 8,800mg/L 및 1,4-부탄디아민: 25.6mg/L).
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 4mL를 6well 플라스크(CORNING: 3471)에 파종하고, 14일간 배양을 행하였다. 배양은, 모든 실험군에 대하여 n=2에서 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 조제한 유가 배지를 배양 개시 4, 7, 9, 11일째에 각각 280μL 첨가하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11, 14일째에 세포 배양액을 샘플링하여, 생세포수를 플로 사이토미터 guava easyCyte(Luminex사)를 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 CEDEX Bio HT(로슈ㆍ다이아그노스틱스사)를 사용하여 측정하였다.
(4) 배양 결과
배양 14일째의 항체 산생량을 도 5에 도시한다. 유가 배지 중에 인산2수소나트륨을 첨가하지 않는 조건에서는, 세린, 중타르타르산콜린 또는 1,4-부탄디아민의 첨가 효과는 확인되지 않았다. 한편, 유가 배지에 인산2수소나트륨을 첨가한 조건에서는, 1,4-부탄디아민을 첨가함으로써 항체의 생산성이 향상되고, 세린, 중타르타르산콜린 및 1,4-부탄디아민을 첨가함으로써 항체의 생산성이 더 향상되는 것이 밝혀졌다. 특히, 세린, 중타르타르산콜린 및 1,4-부탄디아민을 1.5배 농도로 첨가한 경우에 최대의 항체 농도를 나타내었다.
실시예 4: 유가 배지에 대한 인산 또는 칼륨의 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과의 평가
본 실시예에서는, 유가 배지에 대한 인산 또는 칼륨의 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과를 평가하였다. CHO 세포로서는, 항체 허셉틴(Herceptin)을 생산하도록 개변된 CHO S 계통의 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL3; 최종 농도 1.9mM의 인산을 함유함)에 LR3-IGF-1(최종 농도 10㎍/mL)과 L-글루타민(최종 농도 6mM)을 첨가하여, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 유가 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Feed media(아지노모토: FEED2)에 인산수소2나트륨(최종 농도 0 또는 4,510mg/L(즉, 0.0 또는 20.8mM))과 염화칼륨(최종 농도 0 또는 2,850mg/L(즉, 0.0 또는 38.2mM))을 첨가하여, 4종류의 유가 배지를 조제하였다.
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 3×105cells/mL로 조정한 CHO 세포 현탁액 30mL를 125mL 플라스크(CORNING: 431143)에 파종하고, 14일간 배양을 행하였다. 배양은, 모든 실험군에 대하여 n=2에서 실시하였다. 배양 온도는 37℃, 교반 속도는 110rpm으로 하였다. 조제한 유가 배지를 배양 개시 4, 6, 8, 10, 12일째에 각각 1.2mL 첨가하였다. 배양 개시 4, 7, 9, 11 및 14일째에 세포 배양액을 샘플링하여, 생세포수를 생사세포 오토 애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만ㆍ콜터사)을 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 CEDEX Bio HT(로슈ㆍ다이아그노스틱스사)를 사용하여 측정하였다. 또한, 배양 개시 4, 7, 9, 11일째에 세포 배양액을 샘플링하여, 글루코오스 농도를 CEDEX Bio HT(로슈ㆍ다이아그노스틱스사)를 사용하여 측정하고, 글루코오스의 최종 농도가 11g/L로 되도록 500g/L 글루코오스 수용액을 첨가하였다.
(4) 배양 결과
배양 14일째의 항체 산생량을 도 6에 도시한다. 유가 배지 중에 인산 및/또는 칼륨을 첨가한 군에서는, 무첨가군과 비교하여 항체 생산량은 높은 값을 나타내었다. 또한, 인산 및 칼륨을 첨가한 군에서는, 인산 단독 첨가군 및 칼륨 단독 첨가군과 비교하여 항체 산생량은 높은 값을 나타내었다.
실시예 5: 관류 배양에 있어서의 인산 강화 배지에 의한 항체 생산의 향상 효과의 평가
본 실시예에서는, 기초 배지 및 유가 배지에 대한 인산 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과를 관류 배양으로 평가하였다. CHO 세포로서는, 항체 아달리무맙을 생산하도록 개변된 CHO S 계통의 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지 및 유가 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL4P; 최종 농도 1.9mM의 인산을 함유함)에 LR3-IGF-1(최종 농도 10㎍/mL), 인산2수소나트륨(첨가량 0, 1450 또는 1690mg/L(즉, Basal media에 함유되는 인산과의 합계로 최종 농도 1.9, 14 또는 16mM)) 및 L-글루타민(최종 농도 6mM)을 첨가하여, 기초 배지 및 유가 배지를 조제하였다.
(2) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 25×105cells/mL로 조정한 10mL의 CHO 세포 현탁액을 마이크로 바이오리액터 ambr15(봉공근(sartorius): 001-0881)를 사용하여 8일간 배양을 행하였다. 배양 중에는, pH 7.2±0.1, DO를 포화 농도에 대하여 50％, 배양 온도 37℃, 교반 속도=1000rpm으로 되도록 관리하였다. 또한, 세포수가 200×105cells/mL에 도달한 후, 매일 세포수를 측정하고, 배지 교환 후의 배양액 중의 세포 농도가 200×105cells/mL로 되도록 과잉의 세포 배양액을 제거한 후, 배지 교환을 실시하였다. 배지 교환은, 배양액을 원심 분리하고, 원심 상청이 3.68mL 남도록 제거하고, 기초 배지와 동일한 신선한 유가 배지를 6.32mL 첨가하여 교반함으로써 실시하였다. 배지 교환 후에, 배양을 재개하였다. 생세포수를 생사세포 오토 애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만ㆍ콜터사)을 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 CEDEX Bio HT(로슈ㆍ다이아그노스틱스사)를 사용하여 측정하였다.
(3) 배양 결과
배양 8일째의 항체 산생량을 도 7에 도시한다. 기초 배지 및 유가 배지의 인산 농도를 14mM 이상으로 증강한 경우에는, 기초 배지 및 유가 배지의 인산 농도를 증강하지 않는 경우와 비교하여, 항체 농도가 증가하는 것이 밝혀졌다.
실시예 6: 관류 배양에 있어서의 인산 강화 배지에 의한 항체 생산의 향상 효과의 평가
본 실시예에서는, 유가 배지에 대한 인산 첨가에 의한 CHO 세포의 증식 및 항체 생산의 향상 효과를 관류 배양으로 평가하였다. CHO 세포로서는, 항체 아달리무맙을 생산하도록 개변된 CHO S 계통의 세포를 사용하였다.
(1) 기초 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL4P; 최종 농도 1.9mM의 인산을 함유함)에 LR3-IGF-1(최종 농도 10㎍/mL)과 L-글루타민(최종 농도 6mM)을 첨가하여, 기초 배지를 조제하였다.
(2) 유가 배지의 조제
CELLiST(등록 상표) Basal media(아지노모토 가부시키가이샤: BASAL4P; 최종 농도 1.9mM의 인산을 함유함)에 LR3-IGF-1(최종 농도 10㎍/mL), 인산2수소나트륨(첨가량 0, 490 또는 730mg/L(즉, Basal media에 함유되는 인산과의 합계로 최종 농도 1.9, 6 또는 8mM)) 및 L-글루타민(최종 농도 6mM)을 첨가하여, 유가 배지를 조제하였다.
(3) 배양 실험
조제한 기초 배지를 사용하여 25×105cells/mL로 조정한 10mL의 CHO 세포 현탁액을 마이크로 바이오리액터 ambr15(봉공근(sartorius): 001-0881)를 사용하여 12일간 배양을 행하였다. 배양 중에는, pH 7.2±0.1, DO를 포화 농도에 대하여 50％, 배양 온도 37℃, 교반 속도=1000rpm으로 되도록 관리하였다. 또한, 세포수가 150×105cells/mL에 도달한 후, 매일 세포수를 측정하고, 배지 교환 후의 배양액 중의 세포 농도가 150×105cells/mL로 되도록 과잉의 세포 배양액을 제거한 후, 배지 교환을 실시하였다. 배지 교환은, 배양액을 원심 분리하고, 원심 상청이 3.68mL 남도록 제거하고, 신선한 유가 배지를 6.32mL 첨가함으로써 실시하였다. 배지 교환 후에 배양을 재개하였다. 생세포수를 생사세포 오토 애널라이저 Vi-CELLTM XR(베크만ㆍ콜터사)을 사용하여 측정하고, 항체 산생량을 CEDEX Bio HT(로슈ㆍ다이아그노스틱스사)를 사용하여 측정하였다.
(4) 배양 결과
배양 8일째의 항체 산생량을 도 8에 도시한다. 유가 배지의 인산 농도를 6mM 이상으로 증강한 경우에는, 유가 배지의 인산 농도를 증강하지 않는 경우와 비교하여, 항체 농도가 증가하는 것이 밝혀졌다.
본 발명에 따르면, 동물 세포의 배양 성적(예를 들어, 동물 세포의 증식이나 동물 세포에 의한 목적 물질 생산)을 향상시킬 수 있다.

Claims (32)

  1. 목적 물질의 제조 방법으로서,
    목적 물질 생산능을 갖는 동물 세포를 배지에서 배양하는 것; 및
    목적 물질을 회수하는 것
    을 포함하고,
    상기 배양이, 하기 (A) 및/또는 (B)의 조건에서 실시되는 방법:
    (A) 상기 배지 중의 인산 농도를 4mM 이상으로 증강한 조건;
    (B) 상기 배지 중의 칼륨 농도를 1mM 이상으로 증강한 조건.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적 물질이 단백질인 방법.
  3. 동물 세포의 배양 방법으로서,
    동물 세포를 배지에서 배양하는 것
    을 포함하고,
    상기 배양이, 하기 (A) 및/또는 (B)의 조건에서 실시되는 방법:
    (A) 상기 배지 중의 인산 농도를 4mM 이상으로 증강한 조건;
    (B) 상기 배지 중의 칼륨 농도를 1mM 이상으로 증강한 조건.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이, 적어도 상기 배지 중의 인산 농도를 증강한 조건에서 실시되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 시의 상기 배지 중의 인산 농도가 11mM 이상인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 인산 및/또는 칼륨이, 배양 개시 시에 상기 농도로 상기 배지에 함유되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인산 및/또는 칼륨이, 배양 개시 후에 상기 농도로 상기 배지에 함유되도록 해당 배지에 공급되는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인산 및/또는 칼륨이, 배양의 전기간을 통한 평균값으로서, 상기 농도로 상기 배지에 함유되는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인산이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인산이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.5mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.2mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이, 인산 농도가 4mM 이상인 유가 배지를 사용한 관류 배양에 의해 실시되는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이, 인산 농도가 11mM 이상인 유가 배지를 사용한 관류 배양에 의해 실시되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 아민의 존재 하에서 실시되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아민이 1,4-부탄디아민인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양이 콜린 및/또는 세린의 존재 하에서 실시되는 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 시의 상기 배지 중의 아민 농도가 0.002mM 이상인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 배양 시의 상기 배지 중의 콜린 농도가 0.2mM 이상인 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 시의 상기 배지 중의 세린 농도가 2mM 이상인 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아민, 콜린 및/또는 세린이, 배양 개시 시에 상기 농도로 상기 배지에 함유되는 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아민, 콜린 및/또는 세린이, 배양 개시 후에 상기 농도로 상기 배지에 함유되도록 해당 배지에 공급되는 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아민, 콜린 및/또는 세린이, 배양의 전기간을 통한 평균값으로서, 상기 농도로 상기 배지에 함유되는 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아민이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.0005mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는 방법.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 콜린이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.05mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는 방법.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 세린이, 배양의 전기간을 통하여, 1일당 0.5mM 이상의 공급량으로 상기 배지에 공급되는 방법.
  26. 인산 농도 및/또는 칼륨 농도가 증강된, 동물 세포 배양용 배지.
  27. 제26항에 있어서, 적어도 인산 농도가 증강된 배지.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 아민을 더 함유하는 배지.
  29. 제28항에 있어서, 상기 아민이 1,4-부탄디아민인 배지.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 콜린 및/또는 세린을 더 함유하는 배지.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 초발 배지인 배지.
  32. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 유가 배지인 배지.
KR1020227017195A 2019-11-05 2020-11-05 단백질의 제조 방법 KR20220097421A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2019-200753 2019-11-05
JP2019200753 2019-11-05
PCT/JP2020/041377 WO2021090888A1 (ja) 2019-11-05 2020-11-05 タンパク質の製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220097421A true KR20220097421A (ko) 2022-07-07

Family

ID=75848562

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227017195A KR20220097421A (ko) 2019-11-05 2020-11-05 단백질의 제조 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220251622A1 (ko)
EP (1) EP4056678A4 (ko)
JP (1) JPWO2021090888A1 (ko)
KR (1) KR20220097421A (ko)
CN (1) CN114667351A (ko)
WO (1) WO2021090888A1 (ko)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924124B1 (en) 2002-08-23 2005-08-02 Immunex Corporation Feeding strategies for cell culture
WO2007077217A2 (en) 2006-01-04 2007-07-12 Baxter International Inc. Oligopeptide-free cell culture media
WO2008136398A1 (ja) 2007-04-26 2008-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 高濃度アミノ酸含有培地を用いた細胞の培養方法
WO2011134921A1 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Novartis Ag Improved cell culture medium

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0793880B2 (ja) * 1988-02-29 1995-10-11 森永製菓株式会社 モノクローナル抗体生産増強法
JPH0787799B2 (ja) * 1988-03-30 1995-09-27 森永製菓株式会社 モノクローナル抗体生産増強法
NZ575328A (en) * 2006-09-13 2012-06-29 Abbott Lab Cell culture improvements
DK2563904T3 (en) * 2010-04-26 2015-04-07 Novartis Ag Improved cell culture medium
CN102994441A (zh) * 2012-09-19 2013-03-27 上海瀚康生物医药科技有限公司 一种细胞培养基及其制备方法和用途
EP3382031B1 (en) 2015-11-25 2023-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing fibroin-like protein
WO2017171001A1 (ja) 2016-03-31 2017-10-05 味の素株式会社 フィブロイン様タンパク質改変体および細胞培養方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924124B1 (en) 2002-08-23 2005-08-02 Immunex Corporation Feeding strategies for cell culture
WO2007077217A2 (en) 2006-01-04 2007-07-12 Baxter International Inc. Oligopeptide-free cell culture media
WO2008136398A1 (ja) 2007-04-26 2008-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 高濃度アミノ酸含有培地を用いた細胞の培養方法
WO2011134921A1 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Novartis Ag Improved cell culture medium

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2021090888A1 (ko) 2021-05-14
EP4056678A4 (en) 2023-12-06
US20220251622A1 (en) 2022-08-11
EP4056678A1 (en) 2022-09-14
WO2021090888A1 (ja) 2021-05-14
CN114667351A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6064912B2 (ja) タンパク質の分泌生産法
KR102619848B1 (ko) 단백질의 분비 생산법
WO2013118544A1 (ja) タンパク質の分泌生産法
KR102337932B1 (ko) 단백질의 분비 생산법
EP2194126B1 (en) Method of constructing cells with high productivity of foreign protein
US20210246479A1 (en) Method for Secretory Production of Protein
JP2023184699A (ja) タンパク質の分泌生産法
JP5673986B1 (ja) タンパク質の沈殿による製造方法
KR20220097421A (ko) 단백질의 제조 방법
WO2023011442A1 (en) Selectable markers for eukaryotic expression system
AU2012324495B2 (en) Addition of iron to improve cell culture
WO2023120637A1 (ja) 動物細胞培養用の組成物
JP6697442B2 (ja) 真核細胞の比生産速度を増加させる方法
WO2023125389A1 (en) Novel markers for recombinant production system
WO2023282315A1 (ja) 非天然アミノ酸含有タンパク質の分泌生産法
JP2022544112A (ja) 発酵法で組換えタンパク質を放出する細菌株