CN114667351A - 蛋白质的制造方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种以动物细胞为表达宿主的目标蛋白质的制造方法。其通过在使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强的条件下培养具有目标蛋白质生产能力的动物细胞而制造目标蛋白质。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞的培养方法。本发明的一个方式涉及基于动物细胞的蛋白质等目标物质的制造方法。
背景技术
常利用动物细胞作为重组蛋白质的表达宿主。
作为以中国仓鼠卵巢株(CHO)为表达宿主的重组蛋白质的制造方法，已报道了流加以使得培养基中的磷酸浓度为1.5～3.5mM的方式而含有磷酸的流加培养基的方法(专利文献1)。
此外，还已知有：使用含有高浓度的胆碱的培养基培养细胞方法(专利文献2)、使用含有高浓度的丝氨酸的培养基培养细胞的方法(专利文献3)和使用含有高浓度的胺的培养基培养细胞的方法(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：US6924124
专利文献2：WO2011/134921A1
专利文献3：WO2008/136398A1
专利文献4：WO2007/077217A2
发明内容
本发明所解决的技术问题
本发明的问题在于：提供一种提高动物细胞的培养成绩(例如，动物细胞的增殖、基于动物细胞的目标物质生产)的新技术。
解决问题的技术手段
本发明者们发现：通过增强动物细胞的培养时的培养基中的磷酸、钾等的特定的成分的浓度，能够提高动物细胞的培养成绩(例如，动物细胞的增殖、基于动物细胞的目标物质生产)，从而完成了本发明。
即，本发明如以下所例示的。
[1]
一种目标物质的制造方法，其包含：
用培养基培养具有目标物质生产能力的动物细胞的步骤；以及，
回收目标物质的步骤，其中，
所述培养在下述(A)和/或(B)的条件下实施：
(A)将所述培养基中的磷酸浓度增强至4mM以上的条件；
(B)将所述培养基中的钾浓度增强至1mM以上的条件。
[2]
根据所述方法，其中，
所述目标物质为蛋白质。
[3]
一种动物细胞的培养方法，其包含：
用培养基培养动物细胞的步骤，
所述培养在下述(A)和/或(B)的条件下实施：
(A)将所述培养基中的磷酸浓度增强至4mM以上的条件；
(B)将所述培养基中的钾浓度增强至1mM以上的条件。
[4]
根据所述方法，其中，
所述培养至少在将所述培养基中的磷酸浓度增强了的条件下实施。
[5]
根据所述方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的磷酸浓度为11mM以上。
[6]
根据所述方法，其中，
磷酸和/或钾在培养开始时以所述浓度而被含有在所述培养基中。
[7]
根据所述方法，其中，
将磷酸和/或钾供给至该培养基中以使得培养开始后在所述培养基中以所述浓度含有磷酸和/或钾。
[8]
根据所述方法，其中，
磷酸和/或钾以所述浓度而被含有在所述培养基中，所述浓度为培养的整个期间内的平均值。
[9]
根据所述方法，其中，
在培养的整个期间内，磷酸以每天0.05mM以上的供给量供给至所述培养基中。
[10]
根据所述方法，其中，
在培养的整个期间内，磷酸以每天0.5mM以上的供给量供给至所述培养基中。
[11]
根据所述方法，其中，
在培养的整个期间内，钾以每天0.2mM以上的供给量供给至所述培养基中。
[12]
根据所述方法，其中，
所述培养通过使用了磷酸浓度为4mM以上的流加培养基的灌流培养来实施。
[13]
根据所述方法，其中，
所述培养通过使用了磷酸浓度为11mM以上的流加培养基的灌流培养来实施。
[14]
根据所述方法，其中，
所述培养在胺的存在下实施。
[15]
根据所述方法，其中，
所述胺为1,4-丁二胺。
[16]
根据所述方法，其中，
所述培养在胆碱和/或丝氨酸的存在下实施。
[17]
根据所述方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的胺浓度为0.002mM以上。
[18]
根据所述方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的胆碱浓度为0.2mM以上。
[19]
根据所述方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的丝氨酸浓度为2mM以上。
[20]
根据所述方法，其中，
所述胺、胆碱和/或丝氨酸在培养开始时以所述浓度而被含有在所述培养基中。
[21]
根据所述方法，其中，
将所述胺、胆碱和/或丝氨酸供给至该培养基中以使得培养开始后在所述培养基中以所述浓度含有所述胺、胆碱和/或丝氨酸。
[22]
根据所述方法，其中，
所述胺、胆碱和/或丝氨酸以所述浓度而被含有在所述培养基中，所述浓度为培养的整个期间内的平均值。
[23]
根据所述方法，其中，
在培养的整个期间内，所述胺以每天0.0005mM以上的供给量供给至所述培养基中。
[24]
根据所述方法，其中，
在培养的整个期间内，胆碱以每天0.05mM以上的供给量供给至所述培养基中。
[25]
根据所述方法，其中，
在培养的整个期间内，丝氨酸以每天0.5mM以上的供给量供给至所述培养基中。
[26]
一种用于动物细胞培养的培养基，其中，
磷酸浓度和/或钾浓度得到了增强。
[27]
根据所述培养基，其中，
至少磷酸浓度得到了增强。
[28]
根据所述培养基，其进一步含有胺。
[29]
根据所述培养基，其中，
所述胺为1,4-丁二胺。
[30]
根据所述培养基，其进一步含有胆碱和/或丝氨酸。
[31]
根据所述培养基，其为初始培养基。
[32]
根据所述培养基，其为流加培养基。
附图说明
[图1]显示流加培养基中的磷酸浓度对CHO细胞的增殖的影响的图。
[图2]显示流加培养基中的磷酸浓度对基于CHO细胞的抗体生产的影响的图。
[图3]显示培养液中的磷酸浓度的推移的图。
[图4]显示流加培养基中的磷酸浓度对基于CHO细胞的抗体生产的影响的图。
[图5]显示流加培养基中的磷酸、胺、胆碱和丝氨酸的浓度对基于CHO细胞的抗体生产的影响的图。
[图6]显示流加培养基中的磷酸和钾的浓度对基于CHO细胞的抗体生产的影响的图。
[图7]显示基础培养基和流加培养基中的磷酸浓度对灌流培养(Perfusion培养)中的基于CHO细胞的抗体生产的影响的图。
[图8]显示流加培养基中的磷酸浓度对灌流培养(Perfusion培养)中的基于CHO细胞的抗体生产的影响的图。
本发明的具体实施方式
<1>本发明的方法
本发明的方法为动物细胞的培养方法，其为包含用培养基培养动物细胞的步骤，并且所述培养在使所述培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强了的条件下实施的方法。
在一个方式中，可以通过动物细胞的培养制造目标物质。即，在动物细胞具有目标物质生产能力的情况下，可以通过该细胞的培养制造目标物质。即，本发明的方法的一个方式可以为目标物质的制造方法，其包含用培养基培养具有目标物质生产能力的动物细胞的步骤和回收目标物质的步骤，所述培养在使所述培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强了的条件下实施。
目标物质只要能够通过动物细胞而制造，就无特别限制。作为目标物质，可以举出蛋白质。作为目标物质而制造的蛋白质也称为“目标蛋白质”。
动物细胞无特别限制。动物细胞例如可以根据动物细胞的用途等各条件而适宜选择。例如，在将动物细胞用于目标蛋白质的制造的情况下，动物细胞只要能够表达目标蛋白质，就无特别限制。动物细胞也称为“宿主”、“表达宿主”、或“宿主细胞”。作为动物，可以举出哺乳类、鸟类、两栖类。作为动物，特别可以举出哺乳类。作为哺乳类，可以举出啮齿类、灵长类。作为啮齿类，可以举出仓鼠、小鼠、大鼠、豚鼠。作为仓鼠，可以举出中国仓鼠。作为灵长类，可以举出人类、猴子、黑猩猩。作为猴子，可以举出非洲绿猴。作为鸟类，可以举出鸡。作为两栖类，可以举出非洲爪蟾。此外，作为动物细胞来源的组织或细胞，无特别限制。就作为动物细胞来源的组织或细胞而言，可以举出卵巢、肾脏、肾上腺、舌上皮、嗅觉上皮、松果体、甲状腺、黑色素细胞。作为中国仓鼠的细胞，可以举出中国仓鼠卵巢株(CHO)。作为CHO，具体而言，可以举出CHO-DG44、CHO-K1。作为人类细胞，可以举出人类胎儿肾细胞来源的细胞株(HEK)。作为HEK，具体而言，可以举出HEK293、HEK293T。作为非洲绿猴的细胞，可以举出非洲绿猴肾细胞来源的细胞株(COS)。作为COS，具体而言，可以举出COS-1。作为非洲爪蟾的细胞，具体而言，可以举出非洲爪蟾卵母细胞。
“具有目标物质生产能力的动物细胞”是指，具有生产目标物质的能力的动物细胞。“具有目标物质生产能力的动物细胞”具体而言可以是指，具有在以培养基进行培养时，生成目标物质(例如，表达目标蛋白质)，并在培养物中将其积蓄至可以回收的程度的能力的动物细胞。“在培养物中的积蓄”具体而言可以是指，在培养基中、细胞表层、细胞内或这些的组合中的积蓄。需要说明的是，也将目标物质积蓄于细胞外(例如，培养基中或细胞表层)的情况称为目标物质的“分泌”或“分泌生产”。即，动物细胞可以具有目标物质的分泌生产能力(分泌生产目标物质的能力)。就目标物质的积蓄量而言，例如，作为培养物中的积蓄量，可以为10μg/L以上、1mg/L以上、100mg/L以上或1g/L以上。动物细胞可以具有1种目标物质的生产能力，也可以具有2种或其以上的目标物质的生产能力。
动物细胞可以本来就具有目标物质生产能力，也可以进行编辑以使得其具有目标物质生产能力。此外，动物细胞也可以进行编辑而使得其本来具有的目标物质生产能力得到增强。就具有目标物质生产能力的动物细胞而言，例如，可通过如所上述地赋予动物细胞目标物质生产能力，或者，如所上所述地使动物细胞的目标物质生产能力增强，而取得。例如，目标蛋白质生产能力可通过编码目标蛋白质的基因的导入而赋于或增强。编码目标蛋白质的基因也称为“目标蛋白质基因”。
目标蛋白质只要可以以动物细胞为宿主而表达，就无特别限制。蛋白质可以是宿主来源的蛋白质，也可以是异源蛋白质(heterologous protein)。“异源蛋白质(heterologous protein)”是指，对于生成该蛋白质的宿主(即，具有目标蛋白质生产能力的动物细胞)而言是外来性(exogenous)的蛋白质。目标蛋白质例如可以是天然存在的蛋白质，也可以是对它们进行了编辑的蛋白质，也可以是人工设计了氨基酸序列的蛋白质。目标蛋白质例如可以是微生物来源的蛋白质，可以是植物来源的蛋白质，可以是动物来源的蛋白质，也可以是病毒来源的蛋白质。目标蛋白质特别可以是人类来源的蛋白质。目标蛋白质可以是单体蛋白质，也可以是多聚体蛋白质。目标蛋白质可以是分泌性蛋白质，也可以是非分泌性蛋白质。需要说明的是，“蛋白质”中也包含寡肽、多肽等被称为肽的物质。
作为目标蛋白质，具体而言，可以举出酶、生理活性蛋白、受体蛋白、抗原蛋白、其它蛋白质。
作为酶，可以举出纤维素酶、转谷氨酰胺酶、蛋白质谷氨酰胺酶、异麦芽糖葡聚糖酶、蛋白酶、内肽酶、外肽酶、氨肽酶、羧肽酶、胶原酶和几丁质酶。
作为生理活性蛋白，可以举出生长因子(growth factor)、激素、细胞因子、抗体关联分子。
作为生长因子，可以举出：表皮生长因子(Epidermal growth factor；EGF)、胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1；IGF-1)、转化生长因子(Transforminggrowth factor；TGF)、神经生长因子(Nerve growth factor；NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor；BDNF)、血管内皮细胞生长因子(Vascularendothelial growth factor；VEGF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colonystimulating factor；G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor；PDGF)、促红细胞生成素(Erythropoietin；EPO)、血小板生成素(Thrombopoietin；TPO)、酸性成纤维细胞生长因子(Acidic fibroblast growth factor；aFGF或FGF1)、碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor；bFGF或FGF2)、角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor；KGF-1或FGF7、KGF-2或FGF10)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor；HGF)、干细胞因子(Stem Cell Factor；SCF)、激活素(Activin)。作为激活素，可以举出激活素A、C、E。
作为激素，可以举出胰岛素、胰高血糖素、生长抑素(somatostatin)、人类生长激素(human growth hormone；hGH)、甲状旁腺激素(parathyroid hormone；PTH)、降钙素(calcitonin)、艾塞那肽(exenatide)。
作为细胞因子，可以举出白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子(Tumor NecrosisFactor；TNF)。
此外，生理活性蛋白可以是蛋白质整体，也可以是其一部分。作为蛋白质的一部分，例如，可以举出具有生理活性的部分。作为具有生理活性的部分，具体而言，例如，可以举出包含甲状旁腺激素(parathyroid hormone；PTH)的成熟体的N末端34氨基酸残基的生理活性肽Teriparatide。
“抗体关联分子”可以是指，包含含有选自构成完全抗体的结构域的单一结构域或2或其以上的结构域的组合的分子种的蛋白质。作为构成完全抗体的结构域，可以举出作为重链的结构域的VH、CH1、CH2和CH3，以及作为轻链的结构域的VL和CL。抗体关联分子只要包含上述的分子种，可以是单体蛋白质，也可以是多聚体蛋白质。需要说明的是，在抗体关联分子为多聚体蛋白质的情况下，可以是包含单一种类的亚基的同多聚体，也可以是包含2或其以上的种类的亚基的异多聚体。作为抗体关联分子，具体而言，可以举出完全抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fc、包含重链(H链)和轻链(L链)的二聚体、Fc融合蛋白、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、二硫键Fv(sdFv)、双特异抗体(diabody)、VHH片段(nanobody(注册商标))。作为抗体关联分子，更具体而言，可以举出曲妥珠单抗(Trastuzumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、纳武单抗(Nivolumab)。
作为受体蛋白，可以举出针对生理活性蛋白或其它的生理活性物质的受体蛋白。作为其它的生理活性物质，可以举出多巴胺等神经递质。需要说明的是，受体蛋白也可以是对应的配体未知的孤儿受体。
抗原蛋白只要能够引起免疫应答就无特别限制。抗原蛋白例如可以根据预定的免疫应答的对象而适宜选择。抗原蛋白例如可作为疫苗使用。
作为其它蛋白质，可以举出肝型脂肪酸结合蛋白(Liver-type fatty acid-binding protein(LFABP))、荧光蛋白、免疫球蛋白结合蛋白、白蛋白、丝心蛋白样蛋白、细胞外蛋白。作为荧光蛋白，可以举出绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein(GFP))。作为免疫球蛋白结合蛋白，可以举出Protein A、Protein G、Protein L。作为白蛋白，可以举出人类血清白蛋白。作为丝心蛋白样蛋白，可以举出WO2017/090665、WO2017/171001中公开的蛋白质。
作为细胞外蛋白，可以举出纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、骨桥蛋白、层粘连蛋白、它们的部分序列。层粘连蛋白是具有包含α链、β链和γ链的异三聚体结构的蛋白质。作为层粘连蛋白，可以举出哺乳类的层粘连蛋白。作为层粘连蛋白的亚基链(即，α链、β链和γ链)，可以举出5种α链(α1～α5)、3种β链(β1～β3)、3种γ链(γ1～γ3)。层粘连蛋白通过这些亚基链的组合而构成各种同源异构体。作为层粘连蛋白，具体而言，例如，可以举出层粘连蛋白111、层粘连蛋白121、层粘连蛋白211、层粘连蛋白213、层粘连蛋白221、层粘连蛋白311、层粘连蛋白321、层粘连蛋白332、层粘连蛋白411、层粘连蛋白421、层粘连蛋白423、层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白523。作为层粘连蛋白的部分序列，可以举出作为层粘连蛋白的E8片段的层粘连蛋白E8。层粘连蛋白E8具体而言是具有包含α链的E8片段(α链E8)、β链的E8片段(β链E8)和γ链的E8片段(γ链E8)的异三聚体结构的蛋白质。层粘连蛋白E8的亚基链(即，α链E8、β链E8和γ链E8)也总称为“E8亚基链”。作为E8亚基链，可以举出所述例示的层粘连蛋白亚基链的E8片段。层粘连蛋白E8通过这些E8亚基链的组合而构成各种同源异构体。作为层粘连蛋白E8，具体而言，例如，可以举出层粘连蛋白111E8、层粘连蛋白121E8、层粘连蛋白211E8、层粘连蛋白221E8、层粘连蛋白332E8、层粘连蛋白421E8、层粘连蛋白411E8、层粘连蛋白511E8、层粘连蛋白521E8。
就目标蛋白质而言，例如，可以是具有如上所述的蛋白质的公知或天然的氨基酸序列的蛋白质。此外，目标蛋白质例如也可以是具有如上所述的蛋白质的公知或天然的氨基酸序列的蛋白质的变体。作为变体，可以举出具有在公知或天然的氨基酸序列中，在1或者数个位置处的1或数个氨基酸发生了置换、缺失、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质。具体而言，“1或数个”可以是指，例如为1～50个，1～40个，1～30个，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。作为变体，可以举出具有相对于公知或天然的氨基酸序列整体，例如，具有50％以上，65％以上，80％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上的同一性的氨基酸序列的蛋白质。需要说明的是，以来源生物种所特定的蛋白质不限于在该生物种中发现的蛋白质本身，还包含具有该生物种中发现的蛋白质的氨基酸序列的蛋白质和它们的变体。变体可以在该生物种中发现，也可以不发现。即，例如，“人类来源蛋白质”不限于在人类中发现的蛋白质本身，还包含具有在人类中发现的蛋白质的氨基酸序列的蛋白质和它们的变体。
需要说明的是，氨基酸序列间的“同一性”是指，使用通过blastp进行默认设定的Scoring Parameters(Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11,Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment)而算出的氨基酸序列间的同一性。
目标蛋白质基因只要编码如上所述的目标蛋白质，就无特别限制。目标蛋白质基因例如可以是具有编码如上所述的蛋白质的基因的公知或天然的碱基序列的基因。此外，目标蛋白质基因例如也可以是具有编码如上所述的蛋白质的基因的公知或天然的碱基序列的基因的变体。目标蛋白质基因例如可以进行编辑以使其编码具有如上述所例示的变体序列的蛋白质。目标蛋白质基因也可以是将任意的密码子置换为等价的密码子的基因。目标蛋白质基因例如可以以根据宿主细胞的密码子使用频度而具有最适宜的密码子的方式进行编辑。
需要说明的是，本发明中，就“基因”这一用语而言，只要能够编码对应的表达产物，就不限于DNA，可以包含任意的多核苷酸。即，“目标蛋白质基因”可以是指，编码目标蛋白质的任意的多核苷酸。目标蛋白质基因可以是DNA，可以是RNA，也可以是其组合。目标蛋白质基因可以是单链，也可以是双链。目标蛋白质基因可以是单链DNA，也可以是单链RNA。目标蛋白质基因可以是双链DNA，可以是双链RNA，也可以是包含DNA链和RNA链的杂交链。目标蛋白质基因也可以在单一的多核苷酸链中包含DNA残基和RNA残基这两者。目标蛋白质基因可以包含内含子，也可以不包含。目标蛋白质基因的方式可以根据目标蛋白质的表达手段等各条件而适宜选择。
“具有(氨基酸或碱基)序列”这一表达，如果没有特别记载，则表示该“包含(氨基酸或碱基)序列”，也包含该“由(氨基酸或碱基)序列构成”的情况。
目标蛋白质由目标蛋白质基因表达。即，具有目标蛋白质生产能力的动物细胞具有目标蛋白质基因。具体而言，具有目标蛋白质生产能力的动物细胞以能够表达的方式具有目标蛋白质基因。需要说明的是，具有目标蛋白质生产能力的动物细胞只要具有目标蛋白质基因直至表达期望程度的目标蛋白质时即可。即，具有目标蛋白质生产能力的动物细胞在目标蛋白质表达后，可以具有目标蛋白质基因，也可以不具有。需要说明的是，“目标蛋白质基因的表达”和“目标蛋白质的表达”可以同义地使用。
目标蛋白质基因可以通过从具有目标蛋白质基因的生物中克隆而取得。在克隆中，可以利用包含该基因的基因组DNA、cDNA等核酸。此外，目标蛋白质基因也可以通过化学合成而取得(Gene,60(1),115-127(1987))。
取得的目标蛋白质基因可以直接利用，或适宜地编辑后利用。即，通过编辑目标蛋白质基因，可以取得其变体。基因的编辑可以通过公知的手法进行。例如，可以通过部位特异性变异法，向DNA的目标部位导入目标变异。作为部位特异性变异法，可以举出使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.andFrits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。此外，也可以通过化学合成直接取得目标蛋白质基因的变体。
将目标蛋白质基因导入宿主细胞的形态无特别限制。只要目标蛋白质基因以能够表达的方式保持在宿主细胞中即可。具体而言，例如，在将目标蛋白质基因以DNA等需要转录的形态导入的情况下，只要目标蛋白质基因在可在该宿主细胞中发挥功能的启动子的控制下以能够表达的方式保持在宿主细胞中即可。在宿主细胞中，目标蛋白质基因可以存在于染色体外，也可以导入到染色体上。在导入2种或其以上的基因的情况下，只要各基因以能够表达的方式保持在宿主细胞中即可。
用于使目标蛋白质基因表达的启动子只要可在宿主细胞中发挥功能，就无特别限制。“在宿主细胞中发挥功能的启动子”是指，在宿主细胞中具有启动子活性的启动子。启动子可以是宿主细胞来源的启动子，也可以是异源来源的启动子。启动子可以是目标蛋白质基因的固有的启动子，也可以是其他的基因的启动子。启动子也可以是比目标蛋白质基因的固有的启动子更强力的启动子。作为动物细胞中发挥功能的启动子，可以举出SV40启动子、EF1a启动子、RSV启动子、CMV启动子、SRalpha启动子。此外，作为启动子，可以通过使用各种报告基因，取得原来的启动子的高活性型并利用。启动子的强度的评价法和强力的启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等。
目标蛋白质基因例如可以使用包含该基因的载体导入宿主细胞中。包含目标蛋白质基因的载体也称为“目标蛋白质基因的表达载体”。目标蛋白质基因的表达载体例如可以通过将包含目标蛋白质基因的DNA片段与载体连接而构建。通过将目标蛋白质基因的表达载体导入宿主细胞，可以将该基因导入宿主细胞。载体可以具备药剂耐性基因等标记。此外，载体也可以具备用于使插入的基因表达的启动子等的表达调节序列。载体可根据宿主细胞的种类、目标蛋白质基因的导入形态等各条件而适宜选择。作为可在向动物细胞的基因导入中使用的载体，可以举出质粒载体、病毒载体。作为病毒载体，例如，可以举出逆转录病毒载体、腺病毒载体。作为质粒载体，例如，可以举出pcDNA系列载体(pcDNA3.1等；ThermoFisher Scientific)、BApo-CMV系列载体(Takara Bio)、CI-neo(Promega)。需要说明的是，根据载体的种类、构成，载体可以导入宿主细胞的染色体中，可以在宿主细胞的染色体外自主复制，或可以暂时地保持在宿主细胞的染色体外。例如，具有SV40复制起点等病毒的复制起点的载体，可以在动物细胞的染色体外自主复制。具体而言，例如，pcDNA系列载体具有SV40复制起点，可以在表达SV40的大T抗原的宿主细胞(COS-1、HEK293T等)中，在染色体外自主复制。
此外，目标蛋白质基因例如也可通过将包含该基因的核酸片段导入宿主细胞，而导入宿主细胞。作为这样的核酸片段，可以举出直链状DNA、直链状RNA。作为直链状RNA，例如，可以举出mRNA、cRNA。
将载体、核酸片段等核酸导入宿主细胞的方法可以根据宿主细胞的种类等各条件而适宜选择。作为向动物细胞中导入载体、核酸片段等核酸的方法，可以举出DEAE葡聚糖法、磷酸钙法、脂转染法、电穿孔法、显微注射法。此外，在载体为病毒载体的情况下，可以通过使该载体(病毒)感染宿主细胞，而将该载体导入宿主细胞。
此外，也可以以使得目标蛋白质基因的表达增大的方式对本来具有目标蛋白质基因的细胞进行编辑并使用。“基因的表达增大”是指，该基因的每细胞的表达量与非编辑细胞相比有所增大。此处的“非编辑细胞”是指，没有进行使目标基因的表达增大的编辑的对照细胞。作为非编辑细胞，可以举出野生型的细胞、作为编辑对象的细胞。作为使目标蛋白质基因的表达增大的手法，可以举出使目标蛋白质基因的拷贝数增加、或使目标蛋白质基因的转录效率、翻译效率提高。目标蛋白质基因的拷贝数的增加可通过将目标蛋白质基因导入宿主细胞而达成。目标蛋白质基因的导入可以通过上述方式实施。需要说明的是，导入的目标蛋白质基因可以是宿主细胞来源的，也可以是异源来源的。目标蛋白质基因的转录效率、翻译效率的提高可通过启动子等基因的表达调节序列的编辑而达成。例如，目标蛋白质基因的转录效率的提高可通过用更强力的启动子置换目标蛋白质基因的启动子而达成。
动物细胞的培养在使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强了的条件下实施。动物细胞的培养例如可以在至少使培养基中的磷酸浓度增强了的条件下实施。“使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强了的条件”也称为“磷酸/钾增强条件”。“使培养基中的磷酸浓度增强了的条件”特别也称为“磷酸增强条件”。“使培养基中的钾浓度增强了的条件”特别也称为“钾增强条件”。“培养基中的磷酸浓度和钾浓度都没有增强的条件”也称为“对照条件”。作为对照条件，可以举出动物细胞的培养中利用的一般的条件。作为对照条件，具体而言，可以举出不满足以下例示的磷酸/钾增强条件的条件。
通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，能够使动物细胞的培养成绩提高。具体而言，通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，与在对照条件下培养动物细胞的情况相比，可提高动物细胞的培养成绩。此外，例如，通过在使培养基中的磷酸浓度和钾浓度这两者增强了的条件下培养动物细胞，与在仅使培养基中的磷酸浓度和钾浓度中的一者增强了的条件下培养动物细胞的情况相比，可以提高动物细胞的培养成绩。作为动物细胞的培养成绩的提高，可以举出动物细胞的增殖的提高、动物细胞的生存率的提高、基于动物细胞的目标物质生产的提高、动物细胞的培养期间的延长。
即，通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，例如，可以使动物细胞的增殖和/或生存率提高。具体而言，通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，与在对照条件下培养动物细胞的情况相比，可以提高动物细胞的增殖和/或生存率。通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，就动物细胞的活细胞密度而言，在培养中，例如，可以达到培养开始时的活细胞密度的1.5倍以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、5倍以上、7倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上、200倍以上、500倍以上或1000倍以上的密度。通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，就动物细胞的活细胞密度而言，在培养中，例如，可以达到1.5×107cells/mL以上、1.6×107cells/mL以上、1.7×107cells/mL以上、1.8×107cells/mL以上、1.9×107cells/mL以上、2×107cells/mL以上、3×107cells/mL以上、5×107cells/mL以上、7×107cells/mL以上、1×108cells/mL以上或1×109cells/mL以上的密度。动物细胞的活细胞数例如可以通过活死细胞自动分析仪Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)或流式细胞仪guava easy Cyte(Luminex公司)测定。
此外，在动物细胞具有目标蛋白质生产能力等目标物质生产能力的情况下，通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，例如，可以提高基于动物细胞的目标蛋白质等目标物质的生产。具体而言，在动物细胞具有目标蛋白质生产能力等的目标物质生产能力的情况下，通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，与在对照条件下培养动物细胞的情况相比，可以提高基于动物细胞的目标蛋白质等目标物质的生产。
此外，通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，例如，可以延长动物细胞的培养期间。具体而言，通过在磷酸/钾增强条件下培养动物细胞，与在对照条件下培养动物细胞的情况相比，可以延长动物细胞的培养期间。作为动物细胞的培养期间的延长，可以举出动物细胞的增殖的持续期间的延长、保持动物细胞的(即，动物细胞生存)期间的延长、基于动物细胞的目标蛋白质等目标物质的生产的持续期间的延长。
换言之，本发明的方法的一个方式可以是使动物细胞的增殖提高的方法。此外，本发明的方法的一个方式可以是使动物细胞的生存率提高的方法。此外，本发明的方法的一个方式可以是使基于动物细胞的目标物质生产提高的方法。此外，本发明的方法的一个方式可以是使动物细胞的培养期间延长的方法。
“动物细胞的培养”不限于以动物细胞的增殖为目的的培养，也包含动物细胞的保持、基于动物细胞的目标物质的制造等不以动物细胞的增殖为目的的培养。
就培养基组成、培养条件而言，除了使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强以外，只要能够达成动物细胞的培养的目的，就无特别限制。例如，在以动物细胞的增殖为目的的情况下，培养基组成、培养条件可以以使得动物细胞增殖的方式构成。此外，例如，在以动物细胞的保持为目的的情况下，培养基组成、培养条件可以以使得动物细胞被保持(即，动物细胞生存)的方式构成。此外，例如，在以目标蛋白质等目标物质的生产为目的的情况下，培养基组成、培养条件可以以使得目标物质被生产(例如，目标蛋白质表达)的方式构成。在不以动物细胞的增殖为目的的情况下，在培养时，动物细胞可以增殖，也可以不增殖。在不以动物细胞的增殖为目的的情况下，典型来说，在培养时，动物细胞可以增殖。就培养基组成、培养条件而言，例如，可以根据动物细胞的种类等各条件而适宜设定。就培养而言，除了使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强之外，例如，可以直接使用动物细胞的培养中利用的通常的培养基和通常的条件，或进行适宜改变而实施。
培养例如可以使用液体培养基实施。作为可以在动物细胞的培养中利用的培养基，具体而言，可以举出D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、CELLiST BasalMedia BASAL4P(味之素株式会社)、Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)、RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific)、CD293(Thermo Fisher Scientific)、CHO-S-SFMII(ThermoFisher Scientific)、CHO-SF(Sigma-Aldrich)、EX-CELL CD CHO(Sigma-Aldrich)、EX-CELLTM302(Sigma-Aldrich)、IS CHO-CD(Irvine Scientific)、IS CHO-CDXP(IrvineScientific)。培养基例如可以含有碳源、氨基酸、维生素、无机盐、磷酸、胆碱、胺、pH缓冲剂、生长因子、血清、血清白蛋白、选择药剂、基因表达诱导剂等各种培养基成分。作为碳源，可以举出葡萄糖。作为氨基酸，可以举出构成蛋白质的20种氨基酸、它们的衍生物。氨基酸例如可以为L体。作为氨基酸，具体而言，可以举出谷氨酰胺、丝氨酸。作为谷氨酰胺，可以举出L-谷氨酰胺。作为丝氨酸，可以举出L-丝氨酸。作为胺，可以举出1,4-丁二胺(也称为“腐胺”)、胍丁胺、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、二乙胺、三乙胺、乙烯二胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N,N-二异丙基乙基胺、四甲基乙烯二胺、六亚甲基二胺、亚精胺、精胺、金刚烷胺。作为芳香族胺，可以举出苯胺、苯乙胺、甲苯胺、儿茶酚胺、1,8-双(二甲氨基)萘。作为杂环式胺，可以举出吡咯烷、哌啶、哌嗪、吗啉、奎宁环、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、吡咯、吡唑、咪唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、噁唑、噻唑、4-二甲基氨基吡啶。作为胺，特别可以举出1,4-丁二胺、乙醇胺、亚精胺、精胺。作为胺，进一步特别可以举出1,4-丁二胺。
可以形成盐的成分都可以以游离的形式使用，可以以盐的形式使用，也可以以它们的组合的形式使用。即，例如，“氨基酸”这一用语，只要没有特别说明，则可以指游离的氨基酸、或其盐、或它们的组合。此外，例如，“磷酸”这一用语，只要没有特别说明，则可以指游离的磷酸、或其盐，或它们的组合。此外，例如，“胆碱”这一用语，只要没有特别说明，则可以指游离的胆碱、或其盐、或它们的组合。此外，例如，“胺”这一用语，只要没有特别说明，则可以指游离的胺、或其盐、或它们的组合。就盐而言，只要能够在动物细胞的培养中利用，就无特别限制。例如，作为对于磷酸基、羧基等酸性基团的盐，可以举出与铵盐、钠、钾等碱金属的盐，与钙、镁等碱土金属的盐，与所述例示的胺的盐、与精氨酸或赖氨酸等碱性氨基酸的盐。此外，例如，作为对于氨基等碱性基团的盐，可以举出与盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、溴化氢酸等无机酸的盐、与乙酸、柠檬酸、苯甲酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、单宁酸、酪酸、海苯酸、帕莫酸、庚酸、葵酸、茶氯酸、水杨酸、乳酸、草酸、扁桃酸、苹果酸等有机羧酸的盐、与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等有机磺酸的盐。具体而言，例如，作为磷酸的盐，特别可以举出磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾。此外，具体而言，例如，作为胆碱的盐，特别可以举出重酒石酸胆碱。
培养开始时的动物细胞的接种量例如可以是1×103cells/mL以上、1×104cells/mL以上、1×105cells/mL以上、1×106cells/mL以上或1×107cells/mL以上，也可以是1×1010cells/mL以下、1×109cells/mL以下、1×108cells/mL以下、1×107cells/mL以下、1×106cells/mL以下、1×105cells/mL以下或1×104cells/mL以下。
培养可以分为种培养和主培养而实施。种培养和主培养的培养条件可以相同，也可以不同。在以目标蛋白质等目标物质的生产为目的的情况下，目标物质只要至少在主培养期间生产即可。例如，可以通过种培养使动物细胞充分增殖，再通过主培养制造目标蛋白质等目标物质。
培养可以通过分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)或它们的组合而实施。作为流加培养或连续培养，可以举出灌流培养(perfusion culture)。需要说明的是，培养开始时的培养基也称为“初始培养基”或“基础培养基”。此外，在流加培养或连续培养中向培养系(例如，初始培养基)中供给的培养基也称为“流加培养基”。此外，在流加培养或连续培养中向培养系中供给流加培养基的步骤也称为“流加”。流加可以在培养的整个期间实施，也可以仅在培养的一部分期间中实施。此外，流加可以连续地实施，也可以间歇地实施。在培养(特别是，灌流培养等流加培养或连续培养)时，也可以实施培养液的除去。培养液的除去，例如，可以是包含动物细胞的培养液的除去，也可以是培养上清的除去。此外，也可以从除去的培养液中回收动物细胞，放回培养系中。培养液的除去可以在培养的整个期间实施，也可以仅在培养的一部分期间中实施。培养液的除去可以连续地实施，也可以间歇地实施。培养液的除去和流加可以同时进行，也可以不同时进行。除去的培养液的量优选为与流加的流加培养基的量是同等量。“同等量”例如是指，相对于流加的流加培养基的量为93～107％(v/v)的量。需要说明的是，在培养分为种培养和主培养而进行的情况下，种培养和主培养的培养形态可以相同，也可以不同。
磷酸等各种成分可以含有在初始培养基、流加培养基、或这两者中。即，在培养的过程中，可以将磷酸等各种成分单独地或以任意的组合供给至培养基中。这些成分的每一种都可以1次或多次供给，也可以连续地供给。初始培养基和流加培养基的组成(例如，含有的成分的种类和/或浓度)可以相同，也可以不同。即，初始培养基中含有的成分的种类和流加培养基中含有的成分的种类可以相同，也可以不同。此外，初始培养基中含有的各成分的浓度和流加培养基中含有的各成分的浓度可以相同，也可以不同。例如，在流加培养基用于灌流培养的情况下，初始培养基和流加培养基的组成可以是相同的。此外，也可以使用组成(例如，含有的成分的种类和/或浓度)不同的2种或其以上的流加培养基。例如，在间歇地进行多次流加的情况下，各流加培养基的组成可以相同，也可以不同。此外，磷酸等各种成分可以以粉末等不含有在流加培养基中的形态，供给至培养基。
培养例如可以在5％CO2等含有CO2的氛围下实施。培养基的pH例如可以为中性附近。“中性附近”例如是指，pH6～8、pH6.5～7.5、或pH6.8～7.2。培养中，可以根据需要调整培养基的pH。培养基的pH可以使用氨气、氨水、碳酸钠、重碳酸钠、碳酸钾、重碳酸钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁等各种碱性或酸性物质进行调整。培养温度例如可以为36～38℃。培养期间例如可以是0.5天以上、1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、12天以上、15天以上或20天以上，可以是50天以下、40天以下、30天以下、25天以下、20天以下、15天以下、12天以下、10天以下、9天以下、8天以下或7天以下，也可以是它们不矛盾的组合。培养期间具体而言，例如可以是1～30天、3～25天、或5～20天。培养时，可以适宜诱导目标蛋白质的表达等基因表达。
磷酸等各种成分可以以任意的形态存在在培养基中。例如，在某种成分为可离子化的成分的情况下，该成分在培养基中可以离子化，也可以不离子化。
“某种成分的浓度”可以是指，在该成分可能以多种形态存在于液体中的情况下，溶解的该成分的总浓度。即，例如，“某种成分的浓度”可以是指，在该成分可能以分子和离子的形态存在于液体中的情况下，该成分的分子的浓度和离子的浓度的合计。例如，“培养基中的某种成分的浓度”可以是指，在该成分可能以多种形态存在于培养基中的情况下，培养基中溶解的该成分的总浓度。即，例如，“培养基中的某种成分的浓度”可以是指，在该成分可能以分子和离子的形态存在于培养基中的情况下，培养基中的该成分的分子的浓度和离子的浓度的合计。
例如，“磷酸浓度”可以是指，溶解的磷酸分子种的总浓度。即，“磷酸浓度”具体而言可以是指，磷酸分子(H3PO4)的浓度和磷酸离子(PO4 3-、HPO4 2-和H2PO4 -)的浓度的合计。例如，“培养基中的磷酸浓度”可以是指，培养基中溶解的磷酸分子种的总浓度。即，例如，“培养基中的磷酸浓度”具体而言可以是指，培养基中的磷酸分子(H3PO4)的浓度和培养基中的磷酸离子(PO4 3-、HPO4 2-和H2PO4 -)的浓度的合计。
就培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度的增强的程度而言，只要动物细胞的培养成绩(例如，动物细胞的增殖、基于动物细胞的目标物质生产)提高，就无特别限制。培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度的增强的程度可以根据动物细胞的种类、培养期间的长度、期望的目标物质生产量等各条件而适宜设定。
“培养在使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强了的条件下实施”例如可以是指，培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度为给定的范围。
培养基中的磷酸浓度例如可以是0.2mM以上、0.5mM以上、1mM以上、1.5mM以上、2mM以上、2.5mM以上、3mM以上、3.5mM以上、4mM以上、4.5mM以上、5mM以上、5.5mM以上、6mM以上、6.5mM以上、7mM以上、7.5mM以上、8mM以上、8.5mM以上、9mM以上、9.5mM以上、10mM以上、11mM以上、12mM以上、13mM以上、14mM以上、15mM以上、16mM以上、17mM以上、18mM以上、19mM以上或20mM以上，可以是100mM以下、70mM以下、50mM以下、40mM以下、30mM以下、29mM以下、28mM以下、27mM以下、26mM以下、25mM以下、24mM以下、23mM以下、22mM以下、21mM以下、20mM以下、19mM以下、18mM以下、17mM以下、16mM以下、15mM以下、14mM以下、13mM以下、12mM以下、11mM以下、10mM以下、9mM以下、8mM以下、7mM以下、6mM以下或5mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。培养基中的磷酸浓度特别可以为4mM以上。培养基中的磷酸浓度进一步特别可以为11mM以上。培养基中的磷酸浓度具体而言，例如可以是0.2～100mM、4～70mM、11～50mM、11～40mM、11～30mM、11～27mM或10～25mM。
培养基中的钾浓度例如可以是0.2mM以上、0.5mM以上、1mM以上、2mM以上、3mM以上、4mM以上、5mM以上、6mM以上、7mM以上、8mM以上、9mM以上或10mM以上，可以是50mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下、15mM以下、12mM以下、10mM以下、9mM以下、8mM以下、7mM以下、6mM以下或5mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。培养基中的钾浓度特别可以为1mM以上。培养基中的钾浓度具体而言，例如可以是0.2～50mM、0.5～30mM或1～10mM。
培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度可以在培养的整个期间中都增强，也可以仅在培养的一部分的期间中增强。即，“培养在使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强了的条件下实施”是指，只要培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度在培养的至少一部分的期间中增强即可，不需要培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度在培养的整个期间中都增强。
培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度例如可以在培养的整个期间中被增强至所述例示的浓度，也可以仅在培养的一部分的期间中被增强至所述例示的浓度。即，“培养在使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强至某一浓度的条件下实施”或“培养在某一磷酸浓度和/或钾浓度的培养基中实施”是指，培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度在培养的至少一部分的期间中在该浓度的范围内即可，不需要培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度在培养的整个期间中都在该浓度的范围内。磷酸和/或钾例如可以在培养开始时以所述例示的浓度含有在培养基中，也可以在培养开始后以使其为所述例示的浓度的方式供给至培养基中。此外，磷酸和/或钾例如可以在培养开始时以所述例示的浓度含有在培养基中，并且，在培养开始后(例如，消耗后)进一步以使其为所述例示的浓度的方式供给至培养基中。在培养分为种培养和主培养进行的情况下，培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度只要至少在主培养的期间、即主培养的整个期间或主培养的一部分的期间中被增强即可。即，培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度在种培养的期间，可以增强，也可以不增强。此时，关于培养的记载(例如，“培养期间(培养的期间)”、“培养开始”)可以认为是关于主培养的。
就“一部分的期间”而言，只要动物细胞的培养成绩(例如，动物细胞的增殖、基于动物细胞的目标物质生产)提高，就无特别限制。“一部分的期间”可以根据动物细胞的种类、培养期间的长度、期望的目标物质生产量等各条件而适宜设定。“一部分的期间”例如可以为培养的整个期间的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或99％以上的期间。此外，“一部分的期间”例如可以是0.5天以上、1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、12天以上或15天以上的期间。
此外，培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度，例如，就培养的整个期间的平均值而言，可以增强至所述例示的浓度。即，“培养在使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强至某一浓度的条件下实施”或“培养在某一磷酸浓度和/或钾浓度的培养基中实施”可以是指，培养的整个期间的培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度的平均值在该浓度的范围内。就“培养的整个期间的培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度的平均值”而言，只要能够掌握培养的整个期间中的磷酸浓度和/或钾浓度的变动，就无特别限制，例如，可以是指在培养的整个期间中每60分钟、每30分钟、每20分钟或每10分钟测定的培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度的平均值。
此外，“培养在使培养基中的磷酸浓度和/或钾浓度增强了的条件下实施”可以是指，例如，向培养基中的磷酸和/或钾的供给量为给定的范围。
就向培养基中的磷酸的供给量而言，例如可以是，在培养的整个期间，每天0.05mM以上、0.1mM以上、0.15mM以上、0.2mM以上、0.25mM以上、0.3mM以上、0.35mM以上、0.4mM以上、0.45mM以上、0.5mM以上、0.55mM以上、0.6mM以上、0.65mM以上、0.7mM以上、0.75mM以上、0.8mM以上、0.85mM以上、0.9mM以上、0.95mM以上或1mM以上，可以是5mM以下、4mM以下、3mM以下、2mM以下或1mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。向培养基中的磷酸的供给量，特别可以是，在培养的整个期间，每天0.05mM以上。向培养基中的磷酸的供给量，进一步特别可以是，在培养的整个期间，每天0.5mM以上。向培养基中的磷酸的供给量具体而言，例如可以是，在培养的整个期间，每天0.05～5mM、0.1～4mM、0.4～3mM或0.7～2mM。
就向培养基中的钾的供给量而言，例如可以是，在培养的整个期间，每天0.05mM以上、0.1mM以上、0.15mM以上、0.2mM以上、0.25mM以上、0.3mM以上、0.35mM以上、0.4mM以上、0.45mM以上或0.5mM以上，可以是5mM以下、4.5mM以下、4mM以下、3.5mM以下、3mM以下、2.5mM以下、2mM以下、1.5mM以下、1mM以下、0.7mM以下、0.5mM以下或0.2mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。向培养基中的钾的供给量特别可以是，在培养的整个期间，每天0.2mM以上。向培养基中的钾的供给量具体而言，例如可以是，在培养的整个期间，每天0.05～5mM、0.1～3mM或0.2～1mM。
磷酸和/或钾例如可以连续地向培养基中供给，也可以间歇地向培养基供给。磷酸和/或钾例如可以每天向培养基供给，也可以每隔数天向培养基供给。
就向培养基中的磷酸和/或钾的供给而言，例如可以在动物细胞的活细胞密度为1.5×106cells/mL以上、1.6×106cells/mL以上、1.7×106cells/mL以上、1.8×106cells/mL以上、1.9×106cells/mL以上、2×106cells/mL以上、3×106cells/mL以上、5×106cells/mL以上、7×106cells/mL以上、1×107cells/mL以上或1×108cells/mL以上的密度的时间点实施。
培养可以在胺、胆碱和/或丝氨酸的存在下实施。培养例如可以在至少培养基中的磷酸浓度被增强的情况下，在胺、胆碱和/或丝氨酸的存在下实施。培养例如可以至少在胺的存在下实施。培养例如也可以至少在胆碱和/或丝氨酸的存在下实施。
“培养在胺、胆碱和/或丝氨酸的存在下实施”，例如可以是指，培养基含有胺、胆碱和/或丝氨酸。
培养基中的胺浓度例如可以是0.001mM以上、0.002mM以上、0.005mM以上、0.01mM以上、0.02mM以上、0.03mM以上、0.04mM以上、0.05mM以上、0.06mM以上、0.07mM以上、0.08mM以上、0.09mM以上或0.1mM以上，可以是0.5mM以下、0.4mM以下、0.3mM以下、0.2mM以下、0.15mM以下、0.12mM以下、0.1mM以下、0.09mM以下、0.08mM以下、0.07mM以下、0.06mM以下、0.05mM以下、0.04mM以下、0.03mM以下、0.02mM以下或0.01mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。培养基中的胺浓度特别可以是0.002mM以上。培养基中的胺浓度进一步特别可以是0.007mM以上。培养基中的胺浓度具体而言，例如可以是0.002～0.5mM、0.005～0.2mM或0.007～0.1mM。
培养基中的胆碱浓度例如可以是0.1mM以上、0.2mM以上、0.5mM以上、1mM以上、2mM以上、3mM以上、4mM以上、5mM以上、6mM以上、7mM以上、8mM以上、9mM以上或10mM以上，可以是50mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下、15mM以下、12mM以下、10mM以下、9mM以下、8mM以下、7mM以下、6mM以下、5mM以下、4mM以下、3mM以下、2mM以下或1mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。培养基中的胆碱浓度特别可以是0.2mM以上。培养基中的胆碱浓度进一步特别可以是1mM以上。培养基中的胆碱浓度具体而言，例如可以是0.2～50mM、0.5～20mM或1～10mM。
培养基中的丝氨酸浓度例如可以是0.5mM以上、1mM以上、2mM以上、3mM以上、4mM以上、5mM以上、6mM以上、7mM以上、8mM以上、9mM以上、10mM以上、12mM以上、15mM以上、20mM以上、25mM以上、30mM以上、35mM以上、40mM以上、50mM以上、60mM以上、70mM以上、80mM以上、90mM以上或100mM以上，可以是500mM以下、400mM以下、300mM以下、200mM以下、150mM以下、100mM以下、70mM以下、50mM以下、40mM以下、30mM以下、20mM以下、15mM以下、12mM以下、10mM以下、9mM以下、8mM以下、7mM以下、6mM以下或5mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。培养基中的丝氨酸浓度特别可以是2mM以上。培养基中的丝氨酸浓度进一步特别可以是10mM以上。培养基中的丝氨酸浓度具体而言，例如可以是1～200mM、2～100mM、4～50mM、2～500mM、5～200mM或10～100mM。
胺、胆碱和/或丝氨酸可以在培养的整个期间中含有在培养基中，也可以仅在培养的一部分的期间含有在培养基中。即，“培养在胺、胆碱和/或丝氨酸的存在下实施”或“培养在含有胺、胆碱和/或丝氨酸的培养基中实施”是指，胺、胆碱和/或丝氨酸在培养的至少一部分的期间中含有在培养基中即可，不需要胺、胆碱和/或丝氨酸在培养的整个期间中都含有在培养基中。
胺、胆碱和/或丝氨酸例如可以在培养的整个期间中以所述例示的浓度含有在培养基中，也可以仅在培养的一部分的期间中以所述例示的浓度含有在培养基中。即，“培养在某一浓度的胺、胆碱和/或丝氨酸的存在下实施”或“培养在某一胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度的培养基中实施”是指，培养基中的胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度在培养的至少一部分的期间中在该浓度的范围内即可，不需要培养基中的胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度在培养的整个期间中都在该浓度的范围内。
关于“一部分的期间”，可以准用磷酸/钾增强条件中的关于“一部分的期间”的记载。
此外，培养基中的胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度，例如，就培养的整个期间的平均值而言，可以设定为所述例示的浓度。即，“培养在一定浓度的胺、胆碱和/或丝氨酸的存在下实施”或“培养在一定胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度的培养基中实施”可以是指，培养的整个期间的培养基中的胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度的平均值在该浓度的范围内。就“培养的整个期间的培养基中的胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度的平均值”而言，只要能掌握培养的整个期间中的胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度的变动，就无特别限制，例如，可以是指在培养的整个期间中每60分钟、每30分钟、每20分钟或每10分钟测定得到的培养基中的胺浓度、胆碱浓度和/或丝氨酸浓度的平均值。
此外，“培养在胺、胆碱和/或丝氨酸的存在下实施”可以是指，例如，向培养基中供给胺、胆碱和/或丝氨酸。
就向培养基中的胺的供给量而言，例如可以是，在培养的整个期间，每天0.0002mM以上、0.0005mM以上、0.001mM以上、0.0015mM以上、0.002mM以上、0.0025mM以上、0.003mM以上、0.0035mM以上、0.004mM以上、0.0045mM以上或0.005mM以上，可以是0.025mM以下、0.02mM以下、0.015mM以下、0.01mM以下、0.007mM以下、0.005mM以下、0.002mM以下或0.001mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。向培养基中的胺的供给量特别可以是，在培养的整个期间，每天0.0005mM以上。向培养基中的胺的供给量例如可以是，在培养的整个期间，每天0.0005～0.025mM、0.001～0.015mM、0.002～0.007mM或0.003～0.004mM。
就向培养基中的胆碱的供给量而言，例如可以是，在培养的整个期间，每天0.02mM以上、0.05mM以上、0.1mM以上、0.15mM以上、0.2mM以上、0.25mM以上、0.3mM以上、0.35mM以上、0.4mM以上、0.45mM以上或0.5mM以上，可以是2.5mM以下、2mM以下、1.5mM以下、1mM以下、0.7mM以下、0.5mM以下、0.2mM以下或0.1mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。向培养基中的胆碱的供给量特别可以是，在培养的整个期间，每天0.05mM以上。向培养基中的胆碱的供给量例如可以是，培养的整个期间，每天0.05～2.5mM、0.1～1.5mM、0.2～0.7mM或0.3～0.5mM。
就向培养基中的丝氨酸的供给量而言，例如可以是，在培养的整个期间，每天0.1mM以上、0.2mM以上、0.3mM以上、0.4mM以上、0.5mM以上、0.6mM以上、0.7mM以上、0.8mM以上、0.9mM以上、1mM以上、1.2mM以上、1.5mM以上、2mM以上、2.5mM以上、3mM以上、3.5mM以上、4mM以上、4.5mM以上或5mM以上，可以是25mM以下、20mM以下、15mM以下、10mM以下、7mM以下、5mM以下、4mM以下、3mM以下、2mM以下、1mM以下、0.7mM以下或0.5mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。向培养基中的丝氨酸的供给量特别可以是，在培养的整个期间，每天0.5mM以上。向培养基中的丝氨酸的供给量例如可以是，在培养的整个期间，每天0.2～10mM、0.4～5mM、0.8～3mM、0.5～25mM、1～15mM、2～7mM或3.5～5mM。
胺、胆碱和/或丝氨酸例如可以连续地向培养基中供给，也可以间歇地向培养基中供给。胺、胆碱和/或丝氨酸例如可以每天向培养基中供给，也可以每隔数天向培养基中供给。
在通过流加培养基的流加将磷酸向培养基中供给的情况下，就流加培养基中的磷酸浓度而言，只要能够得到期望的磷酸的供给量，就无特别限制。流加培养基中的磷酸浓度例如可以为所述例示的培养基中的磷酸浓度。例如，在流加培养基用于灌流培养的情况下，流加培养基中的磷酸浓度可以为所述例示的培养基中的磷酸浓度。此外，流加培养基中的磷酸浓度例如可以是，所述例示的培养基中的磷酸浓度的超过1倍、1.1倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、5倍以上、7倍以上、10倍以上、15倍以上或20倍以上的浓度，可以是100倍以下、70倍以下、50倍以下、30倍以下、20倍以下、10倍以下或5倍以下的浓度，也可以是它们不矛盾的组合。此外，流加培养基中的磷酸浓度例如可以是10mM以上、20mM以上、30mM以上、50mM以上、70mM以上、100mM以上、150mM以上或200mM以上，可以是1000mM以下、700mM以下、500mM以下、300mM以下、200mM以下、100mM以下、70mM以下或50mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。流加培养基中的磷酸浓度具体而言，例如可以是10～1000mM、30～500mM或50～200mM。
在通过流加培养基的流加将胺向培养基中供给的情况下，就流加培养基中的胺浓度而言，只要能够得到期望的胺的供给量，就无特别限制。流加培养基中的胺浓度例如可以为所述例示的培养基中的胺浓度。例如，在流加培养基用于灌流培养的情况下，流加培养基中的胺浓度可以为所述例示的培养基中的胺浓度。此外，流加培养基中的胺浓度例如可以是，所述例示的培养基中的胺浓度的超过1倍、1.1倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、5倍以上、7倍以上、10倍以上、15倍以上或20倍以上的浓度，可以是100倍以下、70倍以下、50倍以下、30倍以下、20倍以下、10倍以下或5倍以下的浓度，也可以是它们不矛盾的组合。此外，流加培养基中的胺浓度例如可以是0.05mM以上、0.1mM以上、0.2mM以上、0.3mM以上、0.5mM以上、0.7mM以上、1mM以上或1mM以上，可以是5mM以下、3mM以下、2mM以下、1mM以下、0.7mM以下、0.5mM以下、0.3mM以下或0.2mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。流加培养基中的胺浓度具体而言可以是，例如，0.05～5mM、0.1～3mM或0.2～1mM。
在通过流加培养基的流加将胆碱向培养基中供给的情况下，就流加培养基中的胆碱浓度而言，只要能够得到期望的胆碱的供给量，就无特别限制。流加培养基中的胆碱浓度例如可以为所述例示的培养基中的胆碱浓度。例如，在流加培养基用于灌流培养的情况下，流加培养基中的胆碱浓度可以为所述例示的培养基中的胆碱浓度。此外，流加培养基中的胆碱浓度例如可以是，所述例示的培养基中的胆碱浓度的超过1倍、1.1倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、5倍以上、7倍以上、10倍以上、15倍以上或20倍以上的浓度，可以是100倍以下、70倍以下、50倍以下、30倍以下、20倍以下、10倍以下或5倍以下的浓度，也可以是它们不矛盾的组合。此外，流加培养基中的胆碱浓度例如可以是5mM以上、10mM以上、20mM以上、30mM以上、50mM以上、70mM以上或100mM以上，可以是500mM以下、300mM以下、200mM以下、100mM以下、70mM以下、50mM以下、30mM以下或20mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。流加培养基中的胆碱浓度具体而言，例如可以是5～500mM、10～300mM或20～100mM。
在通过流加培养基的流加将丝氨酸向培养基中供给的情况下，就流加培养基中的丝氨酸浓度而言，只要能够得到期望的丝氨酸的供给量，就无特别限制。流加培养基中的丝氨酸浓度例如可以为所述例示的培养基中的丝氨酸浓度。例如，在流加培养基用于灌流培养的情况下，流加培养基中的丝氨酸浓度可以为所述例示的培养基中的丝氨酸浓度。此外，流加培养基中的丝氨酸浓度例如可以是，所述例示的培养基中的丝氨酸浓度的超过1倍、1.1倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、3倍以上、5倍以上、7倍以上、10倍以上、15倍以上或20倍以上的浓度，可以是100倍以下、70倍以下、50倍以下、30倍以下、20倍以下、10倍以下或5倍以下的浓度，也可以是它们不矛盾的组合。此外，流加培养基中的丝氨酸浓度例如可以是20mM以上、30mM以上、50mM以上、70mM以上、100mM以上、200mM以上、300mM以上、500mM以上、700mM以上或1000mM以上，可以是5000mM以下、3000mM以下、2000mM以下、1000mM以下、700mM以下、500mM以下、300mM以下、200mM以下、100mM以下或70mM以下，也可以是它们不矛盾的组合。流加培养基中的丝氨酸浓度具体而言，例如可以是30～2000mM、50～1000mM、70～500mM、50～5000mM、100～3000mM或200～1000mM。
各种成分的浓度例如可以通过化合物的检测或鉴定中使用的公知的方法进行测定。作为这样的方法，例如，可以举出HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS、NMR。这些方法也可以用于确认目标物质的生成。这些方法可以单独使用1种，也可以适宜组合使用2种或其以上。
可以如上所述地培养动物细胞。在动物细胞具有目标蛋白质生产能力等目标物质生产能力的情况下，通过如上所述地培养动物细胞，目标物质会生成(例如，目标蛋白质表达)，由此可以得到含有目标物质的培养物。就目标蛋白质等目标物质而言，具体而言，可以积蓄在培养基中、细胞表层、细胞内、或它们的组合中。
以下，将特别参照制造目标蛋白质的情况，对目标蛋白质的生成的确认、回收、纯化等操作进行说明，对于目标蛋白质以外的目标物质，也可以适宜地实施这样的操作。
目标蛋白质是否生成，可通过蛋白质的检测或鉴定中使用的公知的方法而确认。作为这样的方法，例如，可以举出SDS-PAGE、蛋白质印迹法(Western blotting)、质谱法、N末端氨基酸序列解析、酶活性测定。这些方法可以单独使用1种，也可以适宜组合使用2种或其以上。
目标蛋白质可以适宜地回收。具体而言，目标蛋白质可以以含有目标蛋白质的适当的区分的形式而回收。作为这样的区分，例如可以举出：培养物、培养上清、培养细胞、培养细胞的处理物(破碎物、溶解物、提取物(无细胞提取液)。培养细胞例如可以以在丙烯酰胺、卡拉胶等载体上固定化了的固定化细胞的形态而取得。
目标蛋白质可以进一步纯化至期望的程度。
在目标蛋白质积蓄在培养基中的情况下，目标蛋白质例如可以在将细胞等固体成分通过离心分离等从培养物中除去后，从上清中纯化而得。
在目标蛋白质积蓄在细胞内中的情况下，目标蛋白质例如可在对细胞进行破碎、溶解或提取等处理后，从处理物中纯化而得。细胞可通过离心分离等从培养物中回收。细胞的破碎、溶解或提取等处理可以通过公知的方法进行。作为这样的方法，例如可以举出超音波破碎法、动力磨机法、珠破碎、法压破碎、溶菌酶处理。这些方法可以单独使用1种，也可以适宜组合使用2种或其以上。
在目标蛋白质积蓄在细胞表层中的情况下，目标蛋白质例如可在进行了可溶化后，从可溶化物中纯化而得。可溶化可以通过公知的方法进行。作为这样的方法，例如，可以举出盐浓度的上升、表面活性剂的使用。这些方法可以单独使用1种，也可以适宜组合使用2种或其以上。
目标蛋白质的纯化(例如，从如上所述的上清、处理物或可溶化物中纯化)可以通过蛋白质的纯化中使用的公知的方法进行。作为这样的方法，例如，可以举出硫酸铵馏分、离子交换色谱、疏水色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、等电点沉淀。这些方法可以单独使用1种，也可以适宜组合使用2种或其以上。
目标蛋白质可以以游离的状态取得，也可以以固定化在树脂等固相上而得到的固定化酶的状态而取得。
回收的目标蛋白质可以适宜地制剂化。剂型无特别限制，可以根据目标蛋白质的使用用途等各条件而适宜设定。作为剂型，例如可以举出液剂、悬浮剂、散剂、锭剂、丸剂、胶囊剂。在制剂化中，例如，可以使用赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、稳定化剂、调味剂、调气味剂、香料、稀释剂、表面活性剂等药理学上容许的添加剂。
<2>本发明的培养基
本发明的培养基是磷酸浓度和/或钾浓度得到了增强的、动物细胞培养用的培养基。本发明的培养基例如可以在本发明的方法中使用。
关于本发明的培养基，例如，可以准用本发明的方法中使用的培养基的记载(也包含流加培养基的记载)。
本发明的培养基含有磷酸和/或钾。本发明的培养基可以进一步含有胺、胆碱和/或丝氨酸。就本发明的培养基而言，例如，在至少含有磷酸的情况下，可以含有胺、胆碱和/或丝氨酸。本发明的培养基例如可以至少含有胺。本发明的培养基例如可以至少含有胆碱和/或丝氨酸。
本发明的培养基例如可以是基础培养基(初始培养基)，也可以是流加培养基。流加培养基例如可以是在流加培养或连续培养中使用的培养基。流加培养基例如，特别可以是灌流培养中使用的培养基。
关于本发明的培养基中的磷酸浓度，例如，可以准用所述例示的本发明的方法中的培养基中的磷酸浓度的记载(也包含流加培养基中的磷酸浓度的记载)。
关于本发明的培养基中的钾浓度，例如，可以准用所述例示的本发明的方法中的培养基中的钾浓度的记载(也包含流加培养基中的钾浓度的记载)。
关于本发明的培养基中的胺浓度，例如，可以准用所述例示的本发明的方法中的培养基中的胺浓度的记载(也包含流加培养基中的胺浓度的记载)。
关于本发明的培养基中的胆碱浓度，例如，可以准用所述例示的本发明的方法中的培养基中的胆碱浓度的记载(也包含流加培养基中的胆碱浓度的记载)。
关于本发明的培养基中的丝氨酸浓度，例如，可以准用所述例示的本发明的方法中的培养基中的丝氨酸浓度的记载(也包含流加培养基中的丝氨酸浓度的记载)。
实施例
以下，将参照非限定性的实施例，对本发明进行进一步具体的说明。
实施例1：基于向流加培养基中添加磷酸的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果的评价
在本实施例中，对基于向流加培养基中添加磷酸的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果进行了评价。作为CHO细胞，使用了以使其生产抗体阿达木单抗的方式进行了编辑的CHODG-44系统的细胞。
(1)基础培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Basal media(含有味之素株式会社：BASAL4P；终浓度1.9mM的磷酸)中添加LR3-IGF-1(终浓度10μg/mL)、葡聚糖硫酸钠(终浓度400mg/L)和L-谷氨酰胺(终浓度6mM)，调制了基础培养基。
(2)流加培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Feed media(味之素株式会社：FEED2)中添加葡萄糖(终浓度75g/L)和磷酸二氢钠(终浓度0、125、250、500、1000、4000或7000mg/L(即，0.0、1.0、2.1、4.2、8.3、33.3或58.3mM))，调制了磷酸浓度不同的7种流加培养基。
(3)培养实验
将用调制的基础培养基调整至3×105cells/mL而得到的CHO细胞悬浮液30mL接种至125mL烧瓶(CORNING：431143)中，进行了14天的培养。就培养而言，对于所有的实验组以n＝2的方式实施。培养温度设为37℃，搅拌速度设为110rpm。在培养开始的第4、7、9、11天分别添加2.1mL调制的流加培养基。在培养开始的第4、7、9、11和14天取样细胞培养液，活细胞数使用活死细胞自动分析仪Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)测定，抗体产生量使用Octet QK(FORTEBIO公司)测定。
(4)培养结果
活细胞数的推移和培养第14天的抗体产生量如图1和2所示。可以明显看出，随着流加培养基中的磷酸浓度的增大，活细胞数和抗体产生量提高。
实施例2：基于向流加培养基中添加磷酸的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果的评价
在本实施例中，对基于向流加培养基中添加磷酸的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果进行了评价。作为CHO细胞，使用了以使其生产抗体阿达木单抗的方式进行了编辑的CHODG-44系统的细胞。
(1)基础培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Basal media(含有味之素株式会社：BASAL4P；终浓度1.9mM的磷酸)中添加LR3-IGF-1(终浓度10μg/mL)、磷酸二氢钠(115mg/L(即，终浓度2.9mM))、葡聚糖硫酸钠(终浓度400mg/L)和L-谷氨酰胺(终浓度6mM)，调制了基础培养基。
(2)流加培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Feed media(味之素株式会社：FEED2)中添加葡萄糖(终浓度75g/L)和磷酸二氢钠(终浓度0、1000、2000、3000、4000或5000mg/L(即，0.0、8.3、16.7、25、33.3或41.7mM))，调制了磷酸浓度不同的6种流加培养基。
(3)培养实验
将用调制的基础培养基调整至3×105cells/mL而得到的CHO细胞悬浮液30mL接种至125mL烧瓶(CORNING：431143)中，进行了14天的培养。就培养而言，对于所有的实验组以n＝2的方式实施。培养温度设为37℃，搅拌速度设为110rpm。在培养开始的第4、7、9、11天分别添加2.1mL调制的流加培养基。在培养开始的第4、7、9、11和14天取样细胞培养液，活细胞数用活死细胞自动分析仪Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)测定，抗体产生量使用CEDEX Bio HT(Roche Diagnostics公司)测定。
(4)培养结果
培养液中的磷酸浓度的推移和培养第14天的抗体产生量如图3和4所示。通过添加含有终浓度2000mg/L磷酸二氢钠的流加培养基，再现了先行日本专利(US6924124)所述的磷酸浓度(培养液中的磷酸浓度1.5～3.5mM)。通过添加含有与先行日本专利的条件相比更高浓度的磷酸的流加培养基，可以明显看出，与先行日本专利的条件相比，抗体的生产性有所提高。
实施例3：基于向流加培养基中添加磷酸以及丝氨酸、胆碱或胺的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果的评价
在本实施例中，对基于向流加培养基中添加磷酸以及丝氨酸、胆碱或胺的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果进行了评价。作为CHO细胞，使用了以使其生产抗体阿达木单抗的方式进行了编辑的CHO S系统的细胞。
(1)基础培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Basal media(含有味之素株式会社：BASAL4P；终浓度1.9mM的磷酸)中添加LR3-IGF-1(终浓度10μg/mL)、磷酸二氢钠(115mg/L(即，与Basal media中含有的磷酸的合计为终浓度2.9mM))、葡聚糖硫酸钠(终浓度400mg/L)和L-谷氨酰胺(终浓度6mM)，调制了基础培养基。
(2)流加培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Feed media(味之素株式会社：FEED2)中添加葡萄糖(终浓度75g/L)、磷酸二氢钠(终浓度0或2500mg/L(即，0.0或20.8mM))和根据需要的以下的成分(A)、(B)、(C)或(D)，调制了10种流加培养基：
(A)1,4-丁二胺(终浓度12.8mg/L(即，0.145mM))；
(B)丝氨酸(终浓度20000mg/L(即，190mM))、重酒石酸胆碱(终浓度4400mg/L(即，17.4mM))和1,4-丁二胺(终浓度12.8mg/L(即，0.145mM))；
(C)1.5倍浓度的成分(B)(即，丝氨酸：30000mg/L、重酒石酸胆碱：6600mg/L和1,4-丁二胺：19.2mg/L)；
(D)2倍浓度的成分(B)(即，丝氨酸：40000mg/L、重酒石酸胆碱：8800mg/L和1,4-丁二胺：25.6mg/L)。
(3)培养实验
将用调制的基础培养基调整至3×105cells/mL而得到的CHO细胞悬浮液4mL接种至6孔烧瓶(CORNING：3471)中，进行了14天的培养。就培养而言，对于所有的实验组以n＝2的方式实施。培养温度设为37℃，搅拌速度设为110rpm。在培养开始的第4、7、9、11天分别添加280μL调制的流加培养基。在培养开始第4、7、9、11、14天取样细胞培养液，活细胞数用流式细胞仪guava easyCyte(Luminex公司)测定，抗体产生量使用CEDEX Bio HT(RocheDiagnostics公司)测定。
(4)培养结果
培养第14天的抗体产生量如图5所示。在不向流加培养基中添加磷酸二氢钠的条件下，未观察到丝氨酸、重酒石酸胆碱或1,4-丁二胺的添加效果。与之相对，可以明确地看出：在向流加培养基中添加磷酸二氢钠的条件下，通过添加1,4-丁二胺，抗体的生产性提高，通过添加丝氨酸、重酒石酸胆碱和1,4-丁二胺，抗体的生产性进一步提高。特别是，在以1.5倍浓度添加丝氨酸、重酒石酸胆碱和1,4-丁二胺的情况下，表现出了最大的抗体浓度。
实施例4：基于向流加培养基中添加磷酸或钾的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果的评价
在本实施例中，对基于向流加培养基中添加磷酸或钾的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果进行了评价。作为CHO细胞，使用了以使其生产抗体赫赛汀(Herceptin)的方式进行了编辑的CHO S系统的细胞。
(1)基础培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Basal media(含有味之素株式会社：BASAL3；终浓度1.9mM的磷酸)中添加LR3-IGF-1(终浓度10μg/mL)和L-谷氨酰胺(终浓度6mM)，调制了基础培养基。
(2)流加培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Feed media(味之素：FEED2)中添加磷酸氢二钠(终浓度0或4510mg/L(即，0.0或20.8mM))和氯化钾(终浓度0或2850mg/L(即，0.0或38.2mM))，调制4种流加培养基。
(3)培养实验
将用调制的基础培养基调整至3×105cells/mL而得到的CHO细胞悬浮液30mL接种至125mL烧瓶(CORNING：431143)中，进行了14天的培养。就培养而言，对于所有的实验组以n＝2的方式实施。培养温度设为37℃，搅拌速度设为110rpm。在培养开始的第4、6、8、10、12天分别添加1.2mL调制的流加培养基。在培养开始的第4、7、9、11和14天取样细胞培养液，活细胞数使用活死细胞自动分析仪Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)测定，抗体产生量使用CEDEX Bio HT(Roche Diagnostics公司)测定。此外，在培养开始的第4、7、9、11天取样细胞培养液，使用CEDEX Bio HT(Roche Diagnostics公司)测定葡萄糖浓度，添加500g/L葡萄糖水溶液以使得葡萄糖的终浓度为11g/L。
(4)培养结果
培养第14天的抗体产生量如图6所示。在向流加培养基中添加了磷酸和/或钾的组中，与无添加组相比，抗体生产量显示为高值。此外，在添加了磷酸和钾的组中，与磷酸单独添加组和钾单独添加组相比，抗体产生量显示为高值。
实施例5：Perfusion培养中的基于磷酸强化培养基的抗体生产的提高效果的评价
在本实施例中，在Perfusion培养中，对基于向基础培养基和流加培养基中添加磷酸的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果进行了评价。作为CHO细胞，使用了以使其生产抗体阿达木单抗的方式进行了编辑的CHO S系统的细胞。
(1)基础培养基和流加培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Basal media(含有味之素株式会社：BASAL4P；终浓度1.9mM的磷酸)中添加LR3-IGF-1(终浓度10μg/mL)、磷酸二氢钠(添加量0、1450或1690mg/L(即，与Basal media中含有的磷酸的合计为终浓度1.9、14或16mM))和L-谷氨酰胺(终浓度6mM)，调制了基础培养基和流加培养基。
(2)培养实验
使用微生物反应器ambr15(sartorius:001-0881)将用调制的基础培养基调整至25×105cells/mL而得到的10mL的CHO细胞悬浮液培养8天。在培养中进行管理以使得：pH7.2±0.1、DO相对于饱和浓度为50％、培养温度37℃、搅拌速度＝1000rpm。此外，细胞数达到200×105cells/mL后，每天测定细胞数，在以使得培养基交换后的培养液中的细胞浓度为200×105cells/mL的方式除去过剩的细胞培养液后，实施了培养基交换。培养基交换是如下实施的：对培养液进行离心分离，将离心上清除去至剩下3.68mL，添加与基础培养基相同的新鲜的流加培养基6.32mL，进行搅拌。在培养基交换后，重新开始培养。活细胞数使用活死细胞自动分析仪Vi-CELLTM XR(Beckman Coulter公司)测定，抗体产生量使用CEDEXBio HT(Roche Diagnostics公司)测定。
(3)培养结果
培养第8天的抗体产生量如图7所示。在将基础培养基和流加培养基的磷酸浓度增强至14mM以上的情况下，与不增强基础培养基和流加培养基的磷酸浓度的情况相比，可以明显看出，抗体浓度有所增加。
实施例6：Perfusion培养中的基于磷酸强化培养基的抗体生产的提高效果的评价
在本实施例中，在Perfusion培养中，对基于向流加培养基中添加磷酸的CHO细胞的增殖以及抗体生产的提高效果进行了评价。作为CHO细胞，使用了以使其生产抗体阿达木单抗的方式进行了编辑的CHO S系统的细胞。
(1)基础培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Basal media(含有味之素株式会社：BASAL4P；终浓度1.9mM的磷酸)中添加LR3-IGF-1(终浓度10μg/mL)和L-谷氨酰胺(终浓度6mM)，调制了基础培养基。
(2)流加培养基的调制
向CELLiST(注册商标)Basal media(含有味之素株式会社：BASAL4P；终浓度1.9mM的磷酸)中添加LR3-IGF-1(终浓度10μg/mL)、磷酸二氢钠(添加量0、490或730mg/L(即，与Basal media中含有的磷酸的合计为终浓度1.9、6或8mM))和L-谷氨酰胺(终浓度6mM)，调制了流加培养基。
(3)培养实验
使用微生物反应器ambr15(sartorius:001-0881)，将用调制的基础培养基调整至25×105cells/mL而得到的10mL的CHO细胞悬浮液培养12天。在培养中进行管理以使得：pH7.2±0.1、DO相对于饱和浓度为50％、培养温度37℃、搅拌速度＝1000rpm。此外，在细胞数到达150×105cells/mL后，每天测定细胞数，在以使得培养基交换后的培养液中的细胞浓度为150×105cells/mL的方式去除过剩的细胞培养液后，实施了培养基交换。培养基交换如下实施：对培养液进行离心分离，将离心上清除去至剩下3.68mL，添加新鲜的流加培养基6.32mL。在培养基交换后，重新开始培养。活细胞数使用活死细胞自动分析仪Vi-CELLTMXR(Beckman Coulter公司)测定，抗体产生量使用CEDEX Bio HT(Roche Diagnostics公司)测定。
(4)培养结果
培养第8天的抗体产生量如图8所示。在使流加培养基的磷酸浓度增强至6mM以上的情况下，与不增强流加培养基的磷酸浓度的情况相比，可以明显看出，抗体浓度有所增加。
工业实用性
根据本发明，可以使动物细胞的培养成绩(例如，动物细胞的增殖、基于动物细胞的目标物质生产)提高。
Claims (32)
1.一种目标物质的制造方法，其包含：
用培养基培养具有目标物质生产能力的动物细胞的步骤；以及，
回收目标物质的步骤，其中，
所述培养在下述(A)和/或(B)的条件下实施：
(A)将所述培养基中的磷酸浓度增强至4mM以上的条件；
(B)将所述培养基中的钾浓度增强至1mM以上的条件。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述目标物质为蛋白质。
3.一种动物细胞的培养方法，其包含：
用培养基培养动物细胞的步骤，
所述培养在下述(A)和/或(B)的条件下实施：
(A)将所述培养基中的磷酸浓度增强至4mM以上的条件；
(B)将所述培养基中的钾浓度增强至1mM以上的条件。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述培养至少在将所述培养基中的磷酸浓度增强了的条件下实施。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的磷酸浓度为11mM以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，
磷酸和/或钾在培养开始时以所述浓度而被含有在所述培养基中。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
将磷酸和/或钾供给至该培养基中以使得培养开始后在所述培养基中以所述浓度含有磷酸和/或钾。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
磷酸和/或钾以所述浓度而被含有在所述培养基中，所述浓度为培养的整个期间内的平均值。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，
在培养的整个期间内，磷酸以每天0.05mM以上的供给量供给至所述培养基中。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
在培养的整个期间内，磷酸以每天0.5mM以上的供给量供给至所述培养基中。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
在培养的整个期间内，钾以每天0.2mM以上的供给量供给至所述培养基中。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，
所述培养通过使用了磷酸浓度为4mM以上的流加培养基的灌流培养来实施。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，
所述培养通过使用了磷酸浓度为11mM以上的流加培养基的灌流培养来实施。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，
所述培养在胺的存在下实施。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，
所述胺为1,4-丁二胺。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，
所述培养在胆碱和/或丝氨酸的存在下实施。
17.根据权利要求14～16中任一项所述的方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的胺浓度为0.002mM以上。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的胆碱浓度为0.2mM以上。
19.根据权利要求16～18中任一项所述的方法，其中，
所述培养时的所述培养基中的丝氨酸浓度为2mM以上。
20.根据权利要求14～19中任一项所述的方法，其中，
所述胺、胆碱和/或丝氨酸在培养开始时以所述浓度而被含有在所述培养基中。
21.根据权利要求14～20中任一项所述的方法，其中，
将所述胺、胆碱和/或丝氨酸供给至该培养基中以使得培养开始后在所述培养基中以所述浓度含有所述胺、胆碱和/或丝氨酸。
22.根据权利要求14～21中任一项所述的方法，其中，
所述胺、胆碱和/或丝氨酸以所述浓度而被含有在所述培养基中，所述浓度为培养的整个期间内的平均值。
23.根据权利要求14～22中任一项所述的方法，其中，
在培养的整个期间内，所述胺以每天0.0005mM以上的供给量供给至所述培养基中。
24.根据权利要求16～23中任一项所述的方法，其中，
在培养的整个期间内，胆碱以每天0.05mM以上的供给量供给至所述培养基中。
25.根据权利要求16～24中任一项所述的方法，其中，
在培养的整个期间内，丝氨酸以每天0.5mM以上的供给量供给至所述培养基中。
26.一种用于动物细胞培养的培养基，其中，
磷酸浓度和/或钾浓度得到了增强。
27.根据权利要求26所述的培养基，其中，
至少磷酸浓度得到了增强。
28.根据权利要求26或27所述的培养基，其进一步含有胺。
29.根据权利要求28所述的培养基，其中，
所述胺为1,4-丁二胺。
30.根据权利要求26～29中任一项所述的培养基，其进一步含有胆碱和/或丝氨酸。
31.根据权利要求26～30中任一项所述的培养基，其为初始培养基。
32.根据权利要求26～30中任一项所述的培养基，其为流加培养基。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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