CN116751737B - 无血清无蛋白培养基和制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种无血清无蛋白培养基，所述培养基由(a)第一组份：氨基酸、维生素、无机盐和碳源；(b)第二组分：聚胺和肽类；(c)第三组分：锰离子、嘌呤类和嘧啶类；和(d)第四组分：非离子活性剂组成，所述肌肽类在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为4‑50mM；所述锰离子在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.001‑0.05mM。本发明的培养基化学组分确定，不同培养基批次成分可控重复性好，减少了培养基批次间变异，有利于培养基的产品质量控制，最大限度地减少针对当前培养基批次的确认；采用本发明的培养基，CHO细胞的培养中，表达产物中的杂质更少，如表达的酸性峰比例和聚体比例显著降低。

Description

无血清无蛋白培养基和制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地涉及一种无血清无蛋白培养基和制备方法及其应用。
背景技术
现有的广泛使用于许多细胞培养中的培养基，均包含血清或蛋白质组分，一般都含有生长因子和广泛类型的有益于细胞生长和培养的未被表征的物质，这些物质是潜在变异源，不利于产品的质量控制。而且，以血清或蛋白为基础的细胞培养基存在成分不明确，不同批次之间质量差异大，影响细胞标准化培养的缺陷。
目前，针对CHO平台细胞的培养一般使用含血清、带蛋白的培养基，在培养过程中，血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。但是，血清含一些对细胞产生毒性的物质，影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。此外，血清中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响可能导致实验失败或实验结果不可靠性。血清生产制作过程复杂、批间差异大，使得实验和生产的标准化困难，而培养基中蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。
因此，本领域亟需开发化学组分确定并且不含血清和不含蛋白的培养基，使得细胞培养过程中产生杂质少易于分离纯化。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种无血清无蛋白培养基，所述培养基化学组分确定并且不含血清和不含蛋白，从而使得细胞培养过程中产生杂质少易于分离纯化。
本发明的第一方面，提供了一种无血清无蛋白培养基，所述培养基包括以下组分：
(a)第一组份：氨基酸、维生素、无机盐和碳源；
(b)第二组分：聚胺和肽类；
(c)第三组分：锰离子、嘌呤类和嘧啶类；和
(d)第四组分：非离子活性剂；
其中，所述第一组份中的氨基酸选自下组：L-酪氨酸二钠盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-色氨酸、L-赖氨酸单盐酸盐、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯基丙氨酸、L-甘氨酸盐酸盐、L-丙氨酸、L -精氨酸单盐酸盐、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、或其组合；
所述第一组份中的维生素选自下组：维生素B1盐酸盐、维生素B2、烟酰胺、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素H、酒石酸氢胆碱、叶酸、α-硫辛酸、或其组合；
所述第一组份中的无机盐选自下组：亚硒酸钠、硫酸锌、硫酸铜、硫酸铁(II)、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、磷酸钠、碳酸氢钠、硫代硫酸钠、或其组合 ；
所述第一组份中的碳源选自下组：葡萄糖、丙酮酸钠、或其组合；
所述第二组分中的聚胺选自下组：腐胺或其衍生物、亚精胺或其衍生物、精胺或其衍生物、尸胺或其衍生物、或其组合；
所述第二组分中的肽类选自下组：肌肽类、多肽化合物、或其组合；
所述第三组分中的锰离子选自下组：氯化锰、螯合锰或其组合；
所述第三组分中的嘌呤类选自下组：次黄嘌呤、腺嘌呤或其组合；
所述第四组分中的非离子表面活性剂选自下组：Pluronic F-68、Tween、或其组合。
在另一优选例中，所述培养基包括以下组分：
(a)第一组份：氨基酸、维生素、无机盐和碳源；
(b)第二组分：聚胺和肽类；
(c)第三组分：锰离子、嘌呤类和嘧啶类；和
(d)第四组分：非离子活性剂；
其中，所述第一组份包括以下氨基酸或其盐：L-酪氨酸二钠盐、L-半胱氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯基丙氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸；
所述第一组份包括以下维生素：维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素H、酒石酸氢胆碱、叶酸和α-硫辛酸；
所述第一组份中的无机盐包括：亚硒酸钠、硫酸锌、硫酸铜、硫酸铁(II)、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、磷酸钠、碳酸氢钠、和硫代硫酸钠；
所述第一组份中的碳源选自下组：葡萄糖、丙酮酸钠、或其组合；
所述第二组分中的聚胺选自下组：腐胺、亚精胺、精胺、尸胺、或其组合；
所述第二组分中的肽类选自下组：(i)肌肽类、或(ii)肌肽类与多肽化合物的组合，其中，所述多肽化合物选自二肽、三肽；所述二肽选自二肽谷氨酰胺，二肽谷氨酰胺是含谷氨酰胺的二肽，例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺；所述三肽选自L-还原型谷胱甘肽；
所述第三组分中的锰离子选自下组：氯化锰、螯合锰或其组合；
所述第三组分中的嘌呤类选自下组：次黄嘌呤、腺嘌呤或其组合；
所述第三组分中的嘧啶类选自下组：胸苷、尿苷、胞嘧苷；
所述肌肽类在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为4-50mM(较佳地5-25mM，更佳地8-20mM)；
所述锰离子在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.001-0.05mM(0.002～0.010mM，更佳地0.003～0.008mM)。
在另一优选例中，所述无血清无蛋白培养基的pH为6.8-7.5，较佳地pH 为7.0-7.2。
在另一优选例中，所述培养基适合用于CHO细胞培养。
在另一优选例中，所述第四组分中的非离子表面活性剂选自下组：Pluronic F- 68、Tween、或其组合。
在另一优选例中，所述第一组分中氨基酸的各组分在所述无血清无蛋白培养基的浓度为：
L-酪氨酸二钠盐 1-5mM
L-半胱氨酸盐酸盐 1-5mM
L-色氨酸 0.1-1 mM
L-赖氨酸单盐酸盐 0.5-5 mM
L-组氨酸 0.1-2 mM
L-苏氨酸 2-10 mM
L -缬氨酸 0.1-5 mM
L-异亮氨酸 0.1-5 mM
L-亮氨酸 1-5 mM
L-甲硫氨酸 0.1-2 mM
L-苯基丙氨酸 0.1-5 mM
L-甘氨酸盐酸盐 2-10 mM
L-丙氨酸 0.5-10 mM
L -精氨酸单盐酸盐 1- 8 mM
L-天冬酰胺 1-8 mM
L-脯氨酸 2-8 mM
L-丝氨酸 0.1-5 mM
L-谷氨酸 0.1-3 mM
L-天冬氨酸 0.1 -3 mM。
在另一优选例中，所述第一组分中维生素的各组分在所述无血清无蛋白培养基的浓度为：
维生素B1盐酸盐 0.005- 0.1 mM
维生素B2 0.001-0.008 mM
烟酰胺 0.1-1 mM
维生素B5 0.01-1 mM
维生素B6 0.001-0.05 mM
维生素B12 0.001-0.01 mM
维生素H 0.001-0.05 mM
酒石酸氢胆碱 0.5-2 mM
叶酸 0.001-0.02 mM
α-硫辛酸 0.005-0.05 mM。
在另一优选例中，所述第一组分中无机盐的各组分在所述无血清无蛋白培养基的浓度为：
亚硒酸钠 0.00005-0.0001 mM
硫酸锌 0.001-0.01 mM
硫酸铜 0.0005-0.001 mM
硫酸铁(II) 0.05-0.5 mM
硫酸镁 0.01-1 mM
氯化钙 0.1-1 mM
氯化钾 0.5-5 mM
磷酸钠 0.5-2 mM
碳酸氢钠 10-30 mM
硫代硫酸钠 2-6 mM。
在另一优选例中，所述第一组份中的碳源在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为2-15 g/L。
在另一优选例中，所述第一组份中的碳源葡萄糖在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为1-10g/L。
在另一优选例中，所述第一组份中的碳源丙酮酸钠在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为1-5g/L。
在另一优选例中，所述第二组分中的聚胺在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.01-0.1mM。
在另一优选例中，所述肌肽类在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为5-80mM。
在另一优选例中，所述第二组分中的肌肽类选自下组：L-肌肽、L-高肌肽、L-鹅肌肽、或其组合。
在另一优选例中，所述多肽化合物选自下组：二肽、三肽、四肽、五肽、或其组合。
在另一优选例中，所述二肽选自：二肽谷氨酰胺，进一步的选自L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在另一优选例中，所述三肽选自：L-还原型谷胱甘肽。
在另一优选例中，所述L-还原型谷胱甘肽在无血清无蛋白培养基中的浓度为0.0001-0.001mM。
在另一优选例中，所述螯合锰选自下组：氨基酸螯合锰、EDTA锰或其组合。
在另一优选例中，所述锰离子在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.0001-0.05mM。
在另一优选例中，所述嘌呤类在所述无血清无蛋白培养基中浓度为2-20mg/L。
在另一优选例中，所述嘧啶类选自胸苷。
在另一优选例中，所述嘧啶类在所述无血清无蛋白培养基中浓度为1-10mg/L。
在另一优选例中，所述非离子表面活性剂在所述无血清无蛋白培养基中浓度为0.5-2g/L。
在另一优选例中，所述第二组分、第三组分和第四组分可分别浓缩形成第二组分浓缩液、第三组分浓缩液和第四组分浓缩液。
在另一优选例中，所述第二组分浓缩液、第三组分浓缩液和第四组分浓缩液可分别冷冻处理形成第二组分冻干粉剂、第三组分冻干粉剂和第四组分冻干粉剂。
在另一优选例中，所述浓缩液或冻干粉剂加入第一组分中，代替细胞的培养基中的人血清、人血小板裂解液等成分。
在本发明的第二方面，提供了一种如第一方面所述无血清无蛋白培养基的制备方法，所述方法包括步骤：
(S1)提供第一组分中的各组分溶解于溶剂中，得到第一组分的溶解液I；
(S2)提供第二组分、第三组分和第四组分中的各组分，分别溶解于溶剂中，得到第二组分的溶解液、第三组分的溶解液和第四组分的溶解液；
(S3)将步骤(S2)中得到的各组分溶解液混合后过滤，得到混合的溶解液II；和
(S4)将溶解液I和溶解液II混匀后过滤，得到无血清无蛋白培养基。
在另一优选例中，所述溶剂选自：注射用水。
在另一优选例中，所述无血清无蛋白培养基的制备方法包括步骤：
(S1)提供第一组分中的各组分溶解于溶剂中，得到第一组分的溶解液I；
(S2)提供第二组分、第三组分和第四组分中的各组分，分别溶解于溶剂中，得到第二组分的溶解液、第三组分的溶解液和第四组分的溶解液；
(S3)将步骤(S2)中得到的各组分溶解液混合后过滤，得到溶解液II；
(S4)将步骤(S3)中所述混合的溶解液II经预冻、升华和干燥处理，得到溶解液II冻干粉剂；和
(S5)用无菌水将所述溶解液II冻干粉剂复溶后形成溶解液II，将溶解液I和溶解液II混匀后过滤，得到无血清无蛋白培养基。
在另一优选例中，所述无血清无蛋白培养基的制备方法包括步骤：
(1)提供第一组分中的各组分溶解于溶剂中，得到第一组分的溶解液I；
(2)提供第二组分、第三组分和第四组分中的各组分，分别溶解于溶剂中，得到第二组分的溶解液、第三组分的溶解液和第四组分的溶解液；
(3)将步骤(2)中所述的各组分的溶解液浓缩经冻干处理形成各组分溶解液的冻干粉剂；和
(4)用无菌水将步骤(3)所述各组分溶解液冻干粉剂复溶后混合形成溶解液II，将溶解液I和溶解液II混匀后过滤，得到无血清无蛋白培养基。
在另一优选例中，所述冻干粉剂的制备方法包括步骤：
(a)预冻处理：在-35～-45℃的温度下，将溶解液保持2～4小时；
(b)升华处理：(b1)在预冻处理后，对整个工作系统抽真空至真空度＜10pa；(b2)在15～25℃的温度下，升华干燥12-24小时；
(c)干燥处理：在6-8℃的温度下，干燥2～4小时；和
(d)在步骤(c)结束后，向工作系统中输入空气，使工作系统的压力达到0.8-1.2个标准大气压，得到溶解液的冻干粉剂。
在另一优选例中，所述溶解液II冻干粉剂是溶解液II经预冻、升华和干燥处理得到。
在另一优选例中，所述第二组分的溶解液的制备方法为：将聚胺和肽类混合得到第二组分的溶解液。
在另一优选例中，所述第二组分的溶解液的制备方法为：将腐胺、亚精胺、精胺、尸胺和L-肌肽、L-高肌肽、L-鹅肌肽混合后得到第二组分的溶解液。
在另一优选例中，所述第三组分的溶解液的制备方法为：将锰离子、嘌呤类和嘧啶类溶解于溶剂中得到第三组分的溶解液。
在另一优选例中，所述第三组分的溶解液的制备方法为：将氨基酸螯合锰和/或EDTA锰、次黄嘌呤和/或腺嘌呤、胸苷溶解于溶剂中得到第三组分的溶解液。
在另一优选例中，所述第四组分的溶解液的制备方法为：将Pluronic F-68和Tween溶解于溶剂中得到第四组分的溶解液。
在本发明的第三方面，提供了一种如第一方面所述无血清无蛋白培养基的用途，所述培养基用于CHO细胞的培养。
在另一优选例中，所述培养基用于CHO细胞亚型的培养。
在另一优选例中，所述CHO细胞选自下组：CHO-K1、CHO-GS、CHO-DG44。
在本发明第四方面，提供了一种发酵生产目的蛋白的方法，包括如下步骤：
（i）在适合表达的条件下，在第一方面所述培养基存中，培养基因工程化的细胞，所述细胞是CHO细胞，并表达目的蛋白；和
（ii）从发酵产物中分离所述的目的蛋白。
在另一优选例中，所述目的蛋白是抗体。
在另一优选例中，所述的目的蛋白是抗TNF-ɑ受体和IL23受体的Fc融合蛋白。
在另一优选例中，所述的目的蛋白是抗IL23单克隆抗体、抗IL17A单克隆抗体的蛋白。
在另一优选例中，所述目的蛋白的酸性峰比例小于15%，所述抗体的聚体比例小于15%，按目的蛋白的总重量计。
在另一优选例中，所述目的蛋白的酸性峰比例为9-13%。
在另一优选例中，所述目的蛋白的聚体比例小于7-10%。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在本申请实施例3培养基和市售对照培养基中培养CHO-K1细胞的不同培养天数的细胞密度。
图2显示了在本申请实施例3培养基和市售对照培养基中培养CHO-K1细胞的不同培养天数的细胞活率。
图3显示了在本本申请实施例3培养基中培养CHO-K1细胞的不同细胞代次的活细胞密度。
图4显示了CHO-K1、CHO-GS和CHO-DG44重组细胞株在本申请实施例3培养基和市售对照培养基中活细胞密度随时间变化的曲线图。
图5显示了CHO-K1、CHO-GS和CHO-DG44重组细胞株在本申请实施例3培养基和市售对照培养基中活细胞活率随时间变化的曲线图。
图6显示了CHO-K1、CHO-GS和CHO-DG44重组细胞株在本申请实施例3培养基和市售对照培养基中产物浓度随时间变化的曲线图。
图7显示了CHO-K1和CHO-K1(对照)重组细胞株在本申请实施例3培养基和市售对照培养基培养过程中产物酸性峰比例随时间变化的柱形图。
图8显示了CHO-K1、CHO-GS和CHO-DG44重组细胞株在本申请实施例3培养基中产物酸性峰比例随时间变化的柱形图。
图9显示了CHO-K1和CHO-K1(对照)重组细胞株在本申请实施例3培养基和市售对照培养基中产物聚体比例随时间变化的柱形图。
图10显示了CHO-K1、CHO-GS和CHO-DG44重组细胞株在本申请实施例3培养基中产物聚体比例随时间变化的柱形图。
图11显示了CHO-K1重组细胞株采用本申请实施例3的培养基和对比例1的培养基A中酸性峰比例所时间变化的柱形图。
图12显示了CHO-K1在本申请实施例3的培养基和对比例2的培养基B中细胞生长情况，其中，图12A为活细胞密度随时间变化的曲线图，图12B为细胞活率随时间变化的曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量的筛选，首次意外地开发了一种无血清无蛋白培养基，所述培养基由(a)第一组份：氨基酸，维生素，无机盐，碳源；(b)第二组分：聚胺，肽类；(c)第三组分：锰离子，嘌呤类和嘧啶类；和(d)第四组分：非离子活性剂组成。本发明的无血清无蛋白培养基化学组分确定，减少培养批次间变异，从而有利于产品质量控制和成本控制。本发明的培养基不含血清和蛋白，让健康和稳健的细胞成活率更加高，细胞密度更加大，以及重组蛋白的高滴度产生、重组蛋白品质更加好，在CHO细胞中也具有了良好的适用性和稳定性。在此基础上完成了本实验。
术语
无血清无蛋白培养基
在本发明中所述无血清是指：在本发明的培养基各组分中，无动物源血清成分。
在本发明中所述无蛋白是指：不含有动物蛋白的培养基。
无血清无蛋白培养基
本发明所述无血清无蛋白培养基，包括：
第一组分：氨基酸，维生素，无机盐，碳源；
第二组分：还包括聚胺，肽类；
第三组分：螯合锰，嘌呤类和嘧啶类；
第四组分：非离子活性剂。
所述无血清无蛋白培养基第一组分中氨基酸的各组分在所述无血清无蛋白培养基中的浓度(mM)如表1所示。
表1 第一组分中氨基酸的各组分在培养基中的浓度
所述第一组分中无机盐各组分在所述无血清无蛋白培养基中的浓度如表2所示(mM)。
表2：第一组分中无机盐的各组分在培养基中的浓度
所述第一组分中维生素的各组分在所述无血清无蛋白培养基中的浓度如表3所示(mM)。
表3 第一组分中维生素的各组分在培养基中的浓度
所述无血清无蛋白培养基第一组分还具有如下所示浓度的碳来源组分：葡萄糖1-10g/L，丙酮酸钠1-5g/L。
所述无血清无蛋白培养基第二组分包括：聚胺和肽类。
所述无血清无蛋白培养基第二组分肽类选自下组：肌肽类、多肽化合物、或其组合。
所述无血清无蛋白培养基第二组分还包括聚胺，代表性的聚胺或者其衍生物包括(但并不限于)：腐胺、亚精胺、精胺、尸胺、或其组合。
进一步的，腐胺、亚精胺、精胺、尸胺中的一种或/和多种组合的总浓度在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.01-0.1mM。
所述无血清无蛋白培养基中肌肽类为L-肌肽、L-高肌肽、L-鹅肌肽中一种或/和多种组合。
进一步的，所述L-肌肽、L-高肌肽、L-鹅肌肽的一种或/和多种组合总浓度在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为5-80mM。
在本发明中，所述肌肽类在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为4-50mM，较佳地5-25mM，更佳地8-20mM。
在本发明中，所述无血清无蛋白培养基多肽化合物为二肽、三肽、四肽、五肽等，二肽如二肽谷氨酰胺(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，三肽如L-还原型谷胱甘肽。
进一步的，还原型谷胱甘肽在无血清无蛋白培养基中的浓度为0.0001-0.001mM。
所述无血清无蛋白培养基第三组分包括：锰离子、嘌呤类和嘧啶类。
所述无血清无蛋白培养基第三组分包含锰离子，进一步的为氨基酸螯合锰、和/或EDTA锰、和/或氯化锰，所述锰离子在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.0001-0.05mM。
在本发明中，所述锰离子在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.001-0.05mM，较佳地0.002～0.010mM，更佳地0.003～0.008mM。
所述无血清无蛋白培养基还包括：次黄嘌呤和/或腺嘌呤（浓度通常为2-20mg/L）、胸苷（浓度通常为1-10mg/L）。
所述无血清无蛋白培养基第四组分包括(但并不限于)如下非离子表面活性剂：Pluronic F-68，Tween、或其组合。典型地，非离子表面活性剂的浓度为0.5-2g/L。
所述无血清无蛋白培养基的pH6.8-7.5，较佳地pH 7.0-7.2。
本发明所述无血清无蛋白培养基，其中的第一组分可以提供细胞代谢、生长、增值所需的氨基酸、维生素、碳源、无机盐等成分。
第二组分含有抗衰、抗氧化和修护DNA损伤的所需的聚胺和肌肽类。
第三组分含有调控蛋白糖基化修饰和DNA合成基本原料如螯合锰，嘌呤类和嘧啶类。
第四组分含有降低表面张力，防止剪切力过大对细胞损伤消泡等作用，如Pluronic F-68、Tween。
无血清无蛋白培养基通过四种组分的协同作用，可代替血清、血小板裂解液等动物源成分。培养基的成分明确、不同批次之间重复性好、重组蛋白聚体少，重组蛋白碱性峰占比高、临床安全性高，满足CHO细胞体外培养的需求。
进一步的，本发明的无血清无蛋白培养基为包含上述第二组分、第三组分和第四组分的浓缩液，或者是所述浓缩液的冻干粉剂，浓缩液或冻干粉剂的添加剂均适合加入第一组分中，代替细胞的培养基中的人血清、人血小板裂解液等成分。
在一些优选的实施方案中，无血清无蛋白培养基的第二组分、第三组分、第四组分为冻干粉剂。本发明在实验中发现，现有的无血清无蛋白培养基中在储存和运输中存在稳定性不高的问题，其中的肽类等活性成分易失活，在2-8℃的温度下也无法长期存储。针对上述问题，本发明将浓缩液型的添加剂冻干为冻干粉剂，或者以多肽化合物形式进行存储，其稳定性大大提高，各组分活性不易丧失，适合长期的贮存、运输；且冻干粉剂具有良好的可复溶性，在添加于第一培养基后，各组分仍具有高的物质活性。
在本发明的优选的实施例中，使用本发明的培养基进行细胞培养时，锰离子的加入能够明显降低细胞酸性峰的表达，显著的提高了培养基的质量。
优选地，所述锰离子的浓度较佳地为0.003～0.008mM。
在本发明的优选的实施例中，使用本发明的培养基进行细胞培养时，肌肽类的加入能够明显提高细胞密度和细胞活率，显著的提高了培养基的质量。
优选地，所述肌肽类的浓度较佳地为8-20mM。
在本发明的一个实施例中，制备培养基中将第二组分的肽类浓度降低，会导致重组CHO-K1细胞在培养基B中高甘露糖、去岩澡糖和唾液酸的表达显著上升，使重组蛋白活性降低，进而降低重组蛋白的品质。
在本发明中，通过特定浓度范围的肽类和特定浓度范围的锰离子共同调控培养基，使得培养基的质量显著提高。
在本发明中，代表性的无血清无蛋白培养基可以参见上述表格各成分及浓度制备得到。
无血清无蛋白培养基的制备方法
本发明的无血清无蛋白培养基的包括第一组分、第二组分、第三组分、第四组分。
所述培养基各组分总质量为100v/v%计，所述第一组分为55 v/v %-80 v/v %，所述第二组分为10 v/v %-20 v/v %，所述第三组分为8 v/v %-20 v/v %，所述第四组分为0.1 v/v %-5 v/v %。
无血清无蛋白培养基的制备方法包括制备培养基第一组分的溶解液I，和制备无血清培养基第二组分、第三组分、第四组分的溶解液II；然后将溶解液I与溶解液II混匀后过滤，得到无血清无蛋白培养基。
在一些具体的实施方案中，无血清无蛋白培养基的添加剂的制备方法包括如下步骤：将所述第二组分、第三组分和第四组分的溶解液混合后过滤，得到混合的溶解液II；进一步地，将所述混合的溶解液经预冻、升华和干燥处理，得到溶解液II冻干粉剂。
在本发明中，本发明人还发现，将第二组分、第三组分、第四组混合后再溶解，形成的混合液会发生沉淀凝聚成团现象，不利于培养基的制备。
优选地，在本发明中，为了有效减少各组分混合时发生聚集成团的现象，将第二组分、第三组分、第四组分分别溶解后形成各组分的溶解液，混合三种溶解液，过滤后得到混合的溶解液II。
对于第二组分的溶解液，可以是将包含腐胺、亚精胺、精胺、尸胺中一种或/和多种组合，和L-肌肽、L-高肌肽、L-鹅肌肽中一种或/和多种组合，混合后得到。
对于第三组分的溶解液，可以是将氨基酸螯合锰和/或EDTA锰、次黄嘌呤和或腺嘌呤、胸苷溶解于溶剂中得到。
对于第四组分的溶解液，可以是将Pluronic F-68和Tween中的一种或多种溶解于溶剂中得到。
制备冻干粉剂
在本发明中，为保留各物质组分的活性，将混有第二组分、第三组分、第四组分的混合的溶解液依次经预冻、升华和干燥处理，得到溶解液II冻干粉剂。
预冻处理，是在-35～-45℃的温度下，保持2～4小时。
升华处理，预冻处理后，然后对整个工作系统抽真空；当真空度小于10pa后，在15～25℃的温度下，升华干燥12-24小时。
干燥处理，是在6-8℃的温度下，干燥2～4小时。
干燥处理结束后，向工作系统中输入空气，使工作系统的压力达到0.8-1.2个标准大气压，得到冻干粉剂的添加剂。
本发明制备的冻干粉剂，在制备过程中对组分的活性损耗少，冻干粉剂质量稳定性高、具有良好的复溶性，用无菌水复溶后，即可用于细胞培养、扩增和传代。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本发明的培养基化学组分确定，不同培养基批次成分可控重复性好，减少了培养基批次间变异，有利于培养基的产品质量控制，最大限度地减少针对当前培养基批次的确认。
2. 采用本发明的培养基，在细胞培养过程中，健康和稳健的细胞成活率高，细胞密度大，重组蛋白产量更高、重组蛋白品质更好。
3.采用本发明的培养基，CHO细胞的培养中，表达产物中的杂质更少，如表达的酸性峰比例和聚体比例显著降低。
4.本发明的培养基将溶解液II制成冻干粉剂，其稳定性显著提高，各组分活性不易丧失，适合长期的贮存、运输。
5.本发明的培养基适用于多种哺乳动物细胞，特别地CHO细胞培养中，细胞密度大、细胞成活率高，在细胞传代中细胞密度也能和成活率均能保持较高水平，且表达产物中的杂质显著降低，具有了良好的适用性和稳定性。
6.本发明培养基在CHO培养过程中，表达的重组蛋白，聚体少、酸性峰少
7.采用本发明的培养基，重组CHO-K1细胞的高甘露糖、去岩澡糖和唾液酸的表达显著下降，使重组蛋白活性高，进而提高重组蛋白的品质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。
实施例1 基础培养基的制备-无血清无蛋白培养基第一组分溶解液I
在本实验中，按照表4、表5、表6、表7所列浓度提供氨基酸各组分、无机盐各组分、维生素各组分和碳源各组分，溶解于1L注射用水，充分溶解后混匀，过滤，得到无血清无蛋白培养基第一组分，即无血清无蛋白培养基第一组分溶解液I。
表4：第一组分中氨基酸的各组分在培养基中的浓度
表5：第一组分中无机盐的各组分在培养基中的浓度
表6：第一组分中维生素的各组分在培养基中的浓度
表7：第一组分中碳源的各组分在培养基中的浓度
实施例2 制备无血清无蛋白培养基第二组分溶解液II
将第二组分聚胺、肽类，第三组分氯化锰、次黄嘌呤和胸苷，第四组分中PluronicF-68溶解于1L注射用水，充分溶解后混匀，过滤，得到无血清无蛋白培养基溶解液II，各组分浓度如表8所示。
表8：各组分浓度
为了便于保存，可将溶解液II的组分制成为冻干粉剂，制备方法包括如下步骤：
(1)用灭菌注射用水，分别溶解表8中第二组分、第三组分和第四组分，混合三类组分的溶解液，充分混匀后过滤；
(2)预冻：箱内温度降-45℃，保持3小时；
(3)升华：将冷凝器的温度降到-55℃以下，对整个系统抽真空；
控制真空度在10pa以下，隔板温度控制在25℃，升华干燥24小时。
(4)干燥：提高板层温度至5℃，干燥5小时；
(5)冷冻干燥完成后，往冻干箱中输入混合气体，使箱内压力达到1.1个标准大气压，然后出塞，出箱。
实施例3 制备无血清无蛋白培养基
用无菌水将实施例2中制备得到的溶解液II冻干粉剂复溶后，过滤得到溶解液II；
将溶解液II加入到实施例1中制备的无血清无蛋白培养基第一组分溶解液I的基础培养基中，充分溶解后混匀，过滤，得到无血清无蛋白培养基。
本实施例的无血清无蛋白培养基和补料培养基，均为无动物源血清成分，也不含蛋白的培养基，因此本实验制备得到培养基为无血清无蛋白培养基。
实施例4 细胞培养效果评价实验
1、细胞培养
市售培养基为SFM4CHO(可购自Hyclone公司)：该市售培养基属于非动物源性，化学成分明确，该培养基是无蛋白，无血清的培养基，适合高密度悬浮细胞培养。
在250ml摇瓶中，分别以0.5×106 CHO-K1细胞/毫升接种于80ml体积的实施例3制备的培养基和市售培养基中，市售培养基为SFM4CHO(Hyclone)。摇床培养参数为：6%CO2，36.5℃，130r/min，pH 7.0-7.2，第5、7、9、11、13、15天取样检测活细胞密度和细胞活率，同时利用生化分析仪监控葡萄糖的含量，当葡萄糖浓度<2g/L时提高葡萄糖终浓度至6g/L，同时第5、7、9、11、14天分别补加初始体积3%(V/V)初始培养重量的市售补料培养基FEED XP(购自Sartorius公司)。
试验结果：如图1、图2所示，与市售培养基SFM4CHO(Hyclone)相比，本发明培养基在活细胞密度、细胞活率维持方面有显著性的提高。
实施例5 培养基在CHO细胞中的适用性和稳定性
CHO细胞广泛应用于生物制药行业的细胞培养中，随着CHO细胞的研究发展，产生了不同遗传特性的CHO细胞亚型，对市面上已有的三大CHO细胞亚型(CHO-K1、CHO-GS和CHO-DG44)进行了研究，验证本发明提供的经过成分优化的培养基的广泛适用性。
本发明提供的培养基在现有CHO平台项目细胞CHO-K1(其中包含编码抗TNF-ɑ受体和IL23受体Fc融合蛋白的基因序列)、CHO-GS(其中包含编码抗IL23单克隆抗体的基因序列)和CHO-DG44(其中包含编码IL17A单克隆抗体的基因序列)中的初步传代稳定性表现的验证：
用本发明提供的培养基将上述细胞按0.5×106细胞/毫升的密度稀释至新的摇瓶中，置于36.5度，6%CO2，130转/分钟的二氧化碳摇床中，培养每3天传代一次。
如图3所示，活细胞密度在细胞CHO-K1的不同细胞代次保持稳定增长。如图4所示，采用本发明实施例3的培养基，在不同的培养天数，三大CHO细胞中的活细胞密度均高于对照组。如图5所示，三大CHO细胞中的细胞活率均维持在99.5%以上，各平台项目细胞株稳定。
因此，本发明制备的无血清无蛋白培养基在培养细胞过程中，不同细胞代次保持稳定增长，活细胞密度和细胞活率均维持较高水平，细胞生长的稳定性好。此外，本发明的无血清无蛋白培养基在CHO平台的各细胞株的培养中，均能维持较好的细胞密度和细胞活率，培养基具有良好的适用性。
实施例6 培养基在CHO细胞培养中对表达产物的影响
6.1方法
试验材料：包含编码抗TNF-ɑ受体和IL23受体Fc融合蛋白的基因序列的重组CHO-K1细胞。
试验方法：
(1)按照常规方法对上述重组CHO细胞进行复苏和摇瓶扩增培养；
在实验组，采用的培养基为实施例3中制备的无血清无蛋白培养基。
对照组采用的培养基为购买的市售培养基(SFM4CHO,Hyclone)。
除了采用的培养基不同之外，实验组和对照组的其他实验条件相同，细胞株均为包含编码抗TNF-ɑ受体和IL23受体Fc融合蛋白的基因序列的重组CHO-K1细胞。
此外，为了便于比较培养基对于不同细胞系的生长和活力的影响，对实施例6和实施例7的各组在相同培养条件下进行培养。
(2)按照初始接种密度0.5×106个/ml，将步骤(1)中所述的重组CHO细胞接种于本申请实施例3中所述的各成分含量的培养基进行培养，DO控制为30%～70%，pH控制为7.0～7.2。在培养的第1-4天将培养温度控制在36.0℃～37.0℃，在培养至第5天将培养温度降至33.0℃。
(3)培养至第3、5、7、9、11、13天，分别流加5%(w/w)初始培养重量的市售补料培养基IS CHO FEED-CD XP(可购自Irvinei)。
关于补充培养基IS CHO FEED-CD XP(Irvinei)的成分介绍：属于非动物源性，化学成分明确，无蛋白，无血清的补料培养基。
6.2 结果
6.2.1 CHO平台细胞的细胞生长情况
如图4所示，本发明提供的培养基在现有CHO平台细胞的重组细胞株的Fed-Batch流加批培养中表现更优，能达到更高的活细胞密度，具体能够达到(15～25)×106细胞/毫升的活细胞密度。
如图5所示，在本发明提供的培养基中CHO平台细胞的细胞活率维持较好。
根据各平台项目细胞初步传代稳定性结果可以看出，本发明提供的培养基在CHO-K1、CHO-GS和CHO-DG44三大平台项目细胞中具有良好的适应性，细胞生长良好，生长速率稳定，代次间没有显著差异。
6.2.2 CHO细胞的表达产物
6.2.2.1 产物浓度
如图6和表9所示，与市售无血清培养基相比，采用本发明实施例3的无血清无蛋白的培养基中，CHO细胞目的产物浓度达到更高水平(2～8克/升)，在培养15天后培养基中CHO细胞目的产物浓度达到3.1克/升以上，均远高于对照组的产物浓度。
表9：CHO平台项目细胞在不同培养基中培养的过程中产物浓度
6.2.2.2 酸性峰比例
如图7和表10所示，与对照组相比，在本发明提供的培养基中，在细胞培养过程中CHO-K1的酸性峰比例低于15%，且酸性峰的比例相比对照组降低了50%以上，远低于对照组。
表10 CHO-K1在不同培养基中培养的过程中酸性峰比例
如图9和表11所示，与对照组相比，在本发明提供的培养基中，CHO-K1的聚体比例显著下降，仅是对照组的10%以下，产品碱性峰占比达到90%以上。
表11 CHO-K1在本实施例3培养基培养中的聚体比例
实施例7 培养基在CHO-DG44细胞和CHO-GS细胞培养中对表达产物的影响
在本实施例中，重复实施例6，不同点仅在于，(1)采用以下细胞系：包含编码抗IL23单克隆抗体的基因序列的重组CHO-GS细胞、包含编码抗IL17A单克隆抗体的基因序列体基因序列的CHO-DG44细胞；(2)不设对照组，培养基均采用实施例3中制备的无血清无蛋白培养。
结果
如图8和表12所示，其中表12列出了实施例6和7中基于CHO平台的三大细胞系在本发明提供的培养基中培养过程中的酸性峰比例结果，结果显示CHO的三大平台项目细胞在培养中的酸性峰比例低于15%。
表12 CHO的三大平台项目细胞在本实施例3培养基培养中的酸性峰比例
如图10和表13所示，其中表13列出了实施例6和7中基于CHO平台的三大细胞系在本发明提供的培养基中培养过程中的聚体比例的结果，结果表明，采用本发明培养基中，CHO的三大平台项目细胞在培养中的聚体比例出乎意料地显著下降，仅为约9-15％。
表13 CHO的三大平台项目细胞在本实施例3培养基培养中的聚体比例
对比例1 制备不含锰元素的无蛋白无血清培养基A
在本实验中，所用培养基的各组分同实施例1和实施例2，制备方法同实施例3，不同之处在于：将第三组分中的氯化锰去除，从而制得对比培养基A(锰离子浓度为0mM)。
在相同培养条件下，分别在实施例3的培养基(锰离子浓度为0.005mM)和对比培养基A(锰离子浓度为0mM)中，培养表达包含编码抗TNF-ɑ受体和IL23受体Fc融合蛋白的基因序列的重组CHO-K1细胞。与实施例3的培养基相比，采用对比培养基A进行细胞培养过程，细胞密度和细胞活率基本没有影响，但是CHO-K1细胞的酸性峰比例显著升高，如图11和表14所示。
表14 CHO-K1细胞在本实施例3培养基培养和对比培养基A中的酸性峰比例
由上述结果可以看出，与本发明实施例3制得的培养基相比，未加入锰离子制得的培养基（对比培养基A），在CHO-K1细胞的培养的过程中产生的酸性峰比例最高增加了308％，说明锰离子的添加能够显著减少细胞培养过程中的酸性峰比例，显著提高培养基质量。
对比例2 制备低浓度肽类的无蛋白无血清培养基B
在本实验中，所用培养基的各组分同实施例1和实施例2，制备方法同实施例3，不同之处在于：第二组分中的肽类浓度为1mM。制备得到对比例培养基B。
在相同培养条件下，分别在实施例3的培养基(肽类浓度为10mM)和对比培养基B(肽类浓度为1mM)中，培养表达包含编码抗TNF-ɑ受体和IL23受体Fc融合蛋白的基因序列的重组CHO-K1细胞。
表15 CHO-K1细胞在本实施例3培养基培养和培养基B中的细胞生长情况
如图12和表15所示，与实施例3的培养基相比，采用对比培养基B进行细胞培养过程，第二组分肽类浓度降低后，CHO-K1细胞的密度和活率明显降低，说明低浓度的肽类不利于本发明的培养基制备。
此外，在本实验中，采用实施例3培养基和对比培养基B，对表达包含编码抗TNF-ɑ受体和IL23受体Fc融合蛋白的基因序列的重组CHO-K1细胞进行培养，经鉴定其表达蛋白N-糖基化的修饰率（%）如表16所示。
表16：表达蛋白位于Fc片段上N糖基化位点修饰率
在本实验中，重组CHO-K1细胞在N-糖基化各位点的分析如表17所示。在重组CHO-K1细胞的表达蛋白的各位点上，表达的高甘露糖、去岩澡糖和唾液酸的增加，会导致重组蛋白活性的降低。结果显示，与本发明的配方制备的培养基（实施例3）相比，在制备培养基中将第二组分的肽类浓度降低，会导致重组CHO-K1细胞在培养基B中高甘露糖、去岩澡糖和唾液酸的表达显著上升，使重组蛋白活性降低，进而降低重组蛋白的品质。
表17：表达蛋白在N-糖基化各位点的修饰率
结果
通过上述实验结果可以看到，使用本发明的培养基（实施例3的培养基）进行细胞培养时，锰离子的加入能够明显降低细胞酸性峰的表达，显著的提高了培养基的质量。肌肽类的加入能够明显提高细胞密度和细胞活率，显著的提高了培养基的质量，并且第二组分的肽类浓度降低，还会会导致重组CHO-K1细胞在培养基B中高甘露糖、去岩澡糖和唾液酸的表达显著上升，使重组蛋白活性降低，进而降低重组蛋白的品质。
因此，本发明通过特定浓度范围的肽类和特定浓度范围的锰离子共同调控培养基，显著提高了培养基的质量。本发明制备得到的培养基在细胞培养过程中，健康和稳健的细胞成活率高，细胞密度大，重组蛋白产量更高、重组蛋白品质更好。尤其是，采用本发明的培养基在CHO细胞的培养中，细胞密度大、细胞成活率高，在细胞传代中细胞密度也能和成活率均能保持较高水平，且表达产物中的杂质显著降低，具有了良好的适用性和稳定性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：
(a)第一组份：氨基酸、维生素、无机盐和碳源；
(b)第二组分：聚胺和肽类；
(c)第三组分：锰离子、嘌呤类和嘧啶类；和
(d)第四组分：非离子活性剂；
其中，所述第一组份包括以下氨基酸或其盐：L-酪氨酸二钠盐、L-半胱氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯基丙氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L -精氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸；
所述第一组份包括以下维生素：维生素B1、维生素B2、烟酰胺、维生素B5、维生素B6、维生素B12、维生素H、酒石酸氢胆碱、叶酸和α-硫辛酸；
所述第一组份中的无机盐包括：亚硒酸钠、硫酸锌、硫酸铜、硫酸铁(II)、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、磷酸钠、碳酸氢钠、和硫代硫酸钠；
所述第一组份中的碳源选自下组：葡萄糖、丙酮酸钠、或其组合；
所述第二组分中的聚胺选自下组：腐胺、亚精胺、精胺、尸胺、或其组合；
所述第二组分中的肽类选自下组：(i)肌肽类、或(ii)肌肽类与多肽化合物的组合，其中，所述多肽化合物选自二肽谷氨酰胺、L-还原型谷胱甘肽；
所述第三组分中的锰离子选自下组：氯化锰、螯合锰或其组合；
所述第三组分中的嘌呤类选自下组：次黄嘌呤、腺嘌呤或其组合；
所述第三组分中的嘧啶类选自下组：胸苷、尿苷、胞嘧苷；
所述肌肽类在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为4-50mM；
所述锰离子在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.001-0.05mM；
所述无血清无蛋白培养基的pH为6.8-7.5。
2. 如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述第一组分中氨基酸的各组分在所述无血清无蛋白培养基的浓度为：
L-酪氨酸二钠盐 1-5mM
L-半胱氨酸盐酸盐 1-5mM
L-色氨酸 0.1-1 mM
L-赖氨酸单盐酸盐 0.5-5 mM
L-组氨酸 0.1-2 mM
L-苏氨酸 2-10 mM
L -缬氨酸 0.1-5 mM
L-异亮氨酸 0.1-5 mM
L-亮氨酸 1-5 mM
L-甲硫氨酸 0.1 -2 mM
L-苯基丙氨酸 0.1-5 mM
L-甘氨酸盐酸盐 2-10 mM
L-丙氨酸 0.5-10 mM
L -精氨酸单盐酸盐 1- 8 mM
L-天冬酰胺 1-8 mM
L-脯氨酸 2-8 mM
L-丝氨酸 0.1-5 mM
L-谷氨酸 0.1-3 mM
L-天冬氨酸 0.1 -3 mM。
3. 如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述第一组分中维生素的各组分在所述无血清无蛋白培养基的浓度为：
维生素B1盐酸盐 0.005- 0.1 mM
维生素B2 0.001-0.008 mM
烟酰胺 0.1-1 mM
维生素B5 0.01-1 mM
维生素B6 0.001-0.05 mM
维生素B12 0.001-0.01 mM
维生素H 0.001-0.05 mM
酒石酸氢胆碱 0.5-2 mM
叶酸 0.001-0.02 mM
α-硫辛酸 0.005-0.05 mM。
4. 如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述第一组分中无机盐的各组分在所述无血清无蛋白培养基的浓度为：
亚硒酸钠 0.00005-0.0001 mM
硫酸锌 0.001-0.01 mM
硫酸铜 0.0005-0.001 mM
硫酸铁(II) 0.05-0.5 mM
硫酸镁 0.01-1 mM
氯化钙 0.1-1 mM
氯化钾 0.5-5 mM
磷酸钠 0.5-2 mM
碳酸氢钠 10-30 mM
硫代硫酸钠 2-6 mM。
5.如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述第二组分中的聚胺在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为0.01-0.1mM。
6.如权利要求1所述培养基，其特征在于，所述肌肽类在所述无血清无蛋白培养基中的浓度为5-25mM。
7.一种如权利要求1所述无血清无蛋白培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(S1)提供第一组分中的各组分溶解于溶剂中，得到第一组分的溶解液I；
(S2)提供第二组分、第三组分和第四组分中的各组分，分别溶解于溶剂中，得到第二组分的溶解液、第三组分的溶解液和第四组分的溶解液；
(S3)将步骤(S2)中得到的各组分溶解液混合后过滤，得到混合的溶解液II；和
(S4)将溶解液I和溶解液II混匀后过滤，得到无血清无蛋白培养基。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述无血清无蛋白培养基的制备方法包括步骤：
(S1)提供第一组分中的各组分溶解于溶剂中，得到第一组分的溶解液I；
(S2)提供第二组分、第三组分和第四组分中的各组分，分别溶解于溶剂中，得到第二组分的溶解液、第三组分的溶解液和第四组分的溶解液；
(S3)将步骤(S2)中得到的各组分溶解液混合后过滤，得到溶解液II；
(S4)将步骤(S3)中所述混合的溶解液II经预冻、升华和干燥处理，得到溶解液II冻干粉剂；和
(S5)用无菌水将所述溶解液II冻干粉剂复溶后形成溶解液II，将溶解液I和溶解液II混匀后过滤，得到无血清无蛋白培养基。
9.一种如权利要求1所述无血清无蛋白培养基的用途，其特征在于，所述培养基用于CHO细胞的培养。
10. 一种发酵生产目的蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（i）在适合表达的条件下，在权利要求1所述培养基存中，培养基因工程化的细胞，所述细胞是CHO细胞，并表达目的蛋白；和
（ii）从发酵产物中分离所述的目的蛋白。
11.如权利要求10所述方法，其特征在于，所述目的蛋白的酸性峰比例小于15%，所述目的蛋白的聚体比例小于15%，按目的蛋白的总重量计。
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