CN110418837B - 包含寡肽的培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及培养基，优选细胞培养基，其包含至少一种长度为2‑10个氨基酸的寡肽，所述氨基酸为天然氨基酸，并且所述氨基酸中的至少一个为赖氨酸(Lys)并且另外一个氨基酸选自半胱氨酸(Cys)、胱氨酸(Cyss)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)和异亮氨酸(Ile)，并且所述寡肽以至少0.1mM的量存在。本发明还涉及本发明所述的培养基用于培养细胞、优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。本发明的另一方面涉及制备细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明所述的培养基接触；和(iii)从所述培养基或所述细胞中获得所述细胞培养产物。
Description
发明领域
本发明涉及生物技术生产方法。更具体地，本发明涉及用于生物技术生产方法的改进的培养基、使用这种改进的培养基的方法以及使用改进的培养基从该方法获得的产物。
发明背景
生物技术方法广泛用于生物产物的生产。这些方法通常涉及在培养细胞生长和产物形成所允许的条件下在培养基中培养细胞。在生物技术生产中有用的细胞是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞和动物或植物来源的细胞。
长期以来，动物细胞培养物已被用于生产生物产物，例如治疗性蛋白质、多肽、寡肽或其他生物分子，例如治疗性多糖。在这种细胞培养方法中，通常经遗传修饰以产生所需产物的动物细胞在液体、固体或半固体培养基中培养用于细胞增殖和产物形成。细胞培养的一个显著优点是这样的事实：动物细胞和植物细胞能够进行初级产物的翻译后修饰，例如多肽的折叠和翻译后修饰。
在生物技术生产过程中、特别是在动物细胞培养中，细胞培养条件的控制和优化对于细胞增殖和产物形成是至关重要的。一个决定性因素是培养基组成。最终细胞培养产物的浓度和质量在很大程度上取决于培养基组成。动物和植物细胞培养在所需的营养组成和培养条件方面是特别苛刻的。所需的营养物质不仅包括基本的碳源、氮源和能源(如糖和氨)，而且包括更复杂的营养物质(如必需氨基酸、生长因子和维生素)。为此，已经使用具有复杂营养组成(例如血清)的动物细胞培养基的补充来为动物细胞提供多种营养物质。然而，监管和安全问题以及可用的血清来源的异质性问题导致该行业努力从工业细胞培养工艺中消除血清和其他非成分确定的培养基。然而，在无血清培养基中生长的细胞培养物通常显示出营养不良。为此，已经进行了很多努力来鉴定复杂培养基的那些营养成分，以及它们的最佳浓度，这是细胞培养物中令人满意的生长和蛋白质形成所需的。
已知用氨基酸供应细胞培养物对生长速率和产量具有显著影响。谷氨酰胺常规用于细胞培养基，因为它是培养细胞的重要的碳源、氮源和能源。已经证明，动物细胞培养物的最佳生长所需的谷氨酰胺的量是其他氨基酸量的3至10倍(Eagle等人，Science 130：432-37)。然而，谷氨酰胺作为营养物质在高温(例如加热灭菌条件)下溶解于水时是不稳定的，因为在加热时形成了焦热谷氨酸和氨(Roth等人，1988，In Vitro Cellular&Developmental Biology 24(7)：696-98)。为此，谷氨酸而不是谷氨酰胺通常用于细胞培养基(Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-based Therapies，52，Sadettin等人，Eds.，Taylor and Francis Group，2006)。其他研究小组试图通过向细胞培养基中加入含谷氨酰胺的二肽(如丙氨酰谷氨酰胺或甘氨酰谷氨酰胺)来避免形成不需要的物质，如焦谷氨酸和氨(Roth等人(1988)，In Vitro Cellular&Developmental Biology24(7)：696-98)。然而其他研究小组已提出酰化二肽以使其在加热灭菌条件下更稳定。US5,534,538描述了N-酰基二肽及其在加热灭菌的肠内或肠胃外营养产物以及细胞培养基中的用途。
Franek等人(2002，Biotechnol.Prog.18，155-158；US 2004/0072341)筛选了各种合成寡肽(包括寡聚-Gly、寡聚-Ala)对无血清培养基中小鼠细胞系的影响。他们报道，虽然单个氨基酸和测试的二肽没有显著改变培养性能，但三-、四-和五-甘氨酸以及三-和四-丙氨酸增强了活细胞密度和细胞活力。
Franek等人(2003，Biotechnol.Prog.19，169-174)也使用无血清基础培养基测试了多种随机选择的含赖氨酸的肽对杂交瘤细胞的影响。这些肽是Gly-Lys、Gly-Lys-Gly、Gly-His-Lys、Lys-Lys-Lys、Gly-Phe-Gly和Gly-Gly-Lys-Ala-Ala。作者发现了细胞生长的抑制和三肽、四肽和五肽的增加的滴度。然而，由于基础培养基也含有肽成分，因此很难得出结论。此外，作者使用0.2％(w/v)的浓度，并没有讨论对溶解度的潜在影响。
WO2011/133902公开了包含二肽的细胞培养基，其中二肽包括在水中具有低溶解度的氨基酸，在这种情况下为酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸不仅在水中具有低溶解度，而且由于存在反应性巯基，它也是不稳定的。作者已经发现，通过在二肽中掺入酪氨酸和半胱氨酸，可以改善氨基酸的溶解度和稳定性问题。作者还发现了所得细胞培养基的保存期限得到改善。在一个实施方案中，二肽的剩余氨基酸(不是半胱氨酸或酪氨酸)是天冬酰胺。
WO2012/019160公开了动物细胞培养物，其中在生产阶段期间，无血清培养基补充有含Tyr和His的二肽。描述了添加含Tyr和His的二肽对生长和产物形成的积极效果。这还包括Tyr-Lys。
尽管在WO2011/133902和WO2012/019160中提及了不同的二肽，但仅描述了二肽L-丙氨酰-L-酪氨酸和L-丙氨酰-L-胱氨酸的作用。这些丙氨酰-二肽的溶解度分别为8.7g/ltr和15.3g/ltr，这对于相应的氨基酸(胱氨酸：0.1g/ltr，酪氨酸：0.4g/ltr)是更高的。然而，与其他氨基酸相比，这些值是较低的，由此在高浓度培养基(如在补料工艺中所使用的)中的应用受到限制。另一个缺点是，当使用丙氨酰-二肽时，释放出L-丙氨酸，其不包含在常规细胞培养基(例如，DMEM和RPMI 1640(Sigma))中并且似乎不是细胞所需要的。事实上，当在细胞培养基中使用L-丙氨酰-L-谷氨酰胺代替L-谷氨酰胺时，在细胞培养基中发现了四倍浓度的丙氨酸(M.Christie,J.Butler,Biotechnol.37(1994)277)。如DeBerardinis等人(2007，Proc Natl Acad Sci U S A.104,19345-50)所报道的，细胞倾向于积累L-丙氨酸，因此需要不含丙氨酸的生物可利用的寡肽。
EP 0220379和DE3538310公开了含有谷氨酰胺的二肽和三肽在细胞培养基中的用途。谷氨酰胺以二肽的形式加入，以避免由高温下谷氨酰胺的不稳定性引起的问题。含谷氨酰胺的二肽用作温度不敏感的谷氨酰胺来源。
虽然上述现有技术中描述的细胞培养基为某些细胞培养工艺提供了令人满意的性能和性质，但现有技术的培养基仍然不是最佳的。仍然需要进一步改进的培养基，其促进生物技术生产工艺中的更好的生长和产物形成。
特别地，需要包含更高浓度的寡肽的细胞培养基，尤其是由标准培养基(例如DMEM和RPMI-1640)中包含的氨基酸制备的寡肽。此外，这种寡肽应易于制备而无需使用特定的保护基团。
发明概述
本发明解决了已知培养基的上述缺点。本发明由所附独立权利要求的术语限定。本发明的优选实施方案由从属权利要求限定。
因此，本发明涉及培养基，优选细胞培养基，其包含至少一种长度为2-10个氨基酸的寡肽，所述氨基酸是天然氨基酸，并且所述氨基酸中的至少一个是赖氨酸(Lys)，并且另外一个氨基酸选自半胱氨酸(Cys)、胱氨酸(Cyss)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)和异亮氨酸(Ile)，并且寡肽以至少0.1mM的量存在。
本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞、优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。
本发明的另一方面涉及制备细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明的培养基接触；和(iii)从所述培养基或所述细胞中获得所述细胞培养产物。
在本发明的以下详细描述中更详细地描述了本发明的优选实施方案。
附图简要说明
图1描绘了用根据本发明的寡肽获得的TC-42培养基的最大活细胞密度。
图2描绘了用根据本发明的寡肽获得的TC-42培养基的最大活细胞密度。
图3描绘了用根据本发明的寡肽获得的TC-42培养基的最大活细胞密度。
图4描绘了用根据本发明的寡肽获得的TC-42培养基的最终抗体滴度。
发明详述
根据本发明，“培养基”应理解为含有营养物质的液体或固体培养基，该培养基适于滋养和支持培养物中细胞的生命和/或产物形成。根据本发明，培养的细胞可以是细菌细胞，酵母细胞，真菌细胞，动物细胞，如哺乳动物细胞或昆虫细胞，和/或植物细胞，如藻类。通常，培养基提供必需和非必需氨基酸、维生素、至少一种能源、脂质和微量元素，所有这些都是细胞维持生命、生长和/或产物形成所需的。培养基还可含有增加生长和/或存活率(以高于最小比率)的组分，包括激素和生长因子。培养基优选具有一定pH和盐浓度，其支持细胞的生命、生长和/或产物形成。根据本发明的培养基优选包含维持细胞培养物的生命和增殖所必需的所有营养物。优选的培养基是确定的培养基。
根据本发明，“成分确定的培养基”是不含细胞提取物、细胞水解产物或蛋白质水解产物的培养基。优选的成分确定的培养基不包含未知组成的组分。如本领域技术人员通常理解的，成分确定的培养基通常不含动物来源的组分。优选地，成分确定的培养基的所有组分具有已知的化学结构。优选的成分确定的培养基是无血清培养基。其他优选的成分确定的培养基是合成培养基。除了成分确定的培养基之外的培养基被称为“复杂”培养基。
“细胞培养基”应理解为适于维持动物细胞和/或植物细胞的生命、增殖和/或产物形成的培养基。在某些实施方案中，可以区分基础培养基和补料培养基。
“基础培养基”应理解为其中起始细胞培养的含有营养物质的溶液或物质。“补料培养基”应理解为在培养过程开始后用于给细胞补料的溶液或物质。在某些实施方案中，补料培养基含有一种或多种不存在于基础培养基中的组分。补料培养基还可以缺少基础培养基中存在的一种或多种组分。优选地，补料培养基中的营养物质浓度超过基础培养基中的浓度，以避免通过稀释损失生产力。
根据本发明，“营养物质”是细胞生存和生长所需的化合物或物质。营养物质优选由细胞从环境中吸收。营养物质可以是“有机营养物质”和“无机营养物质”。有机营养物质包括碳水化合物、脂肪、蛋白质(或其结构单元，例如氨基酸)和维生素。无机营养物质是无机化合物，例如膳食矿物质和微量元素。“必需营养物质”是细胞不能自身合成的营养物质，因此必须通过培养基提供给细胞。
根据本发明，“细胞培养产物”应理解为细胞培养中由细胞产生的任何有用的生物化合物。本发明优选的细胞培养产物是治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、治疗性多糖例如肝素、抗体例如单克隆抗体、生长因子、白细胞介素、肽激素、酶和病毒。在其他实施方案(包括但不限于用于治疗用途的干细胞的培养)中，细胞本身应理解为细胞培养产物。
在本发明的上下文中，“氨基酸”应理解为包含氨基官能团(-NH2)和羧酸官能团(-COOH)以及各自氨基酸所特有的侧链的分子。在本发明的上下文中，包括α-氨基酸和β-氨基酸。本发明优选的氨基酸是α-氨基酸，特别是如下20个“天然氨基酸”，包括胱氨酸：
丙氨酸(Ala/A)
精氨酸(Arg/R)
天冬酰胺(Asn/N)
天冬氨酸(Asp/D)
半胱氨酸(Cys/C)
胱氨酸(Cyss/C2)
谷氨酸(Glu/E)
谷氨酰胺(Gln/Q)
甘氨酸(Gly/G)
组氨酸(His/H)
异亮氨酸(Ile/I)
亮氨酸(Leu/L)
赖氨酸(Lys/K)
甲硫氨酸(Met/M)
苯丙氨酸(Phe/F)
脯氨酸(Pro/P)
丝氨酸(Ser/S)
苏氨酸(Thr/T)
色氨酸(Trp/W)
酪氨酸(Tyr/Y)
缬氨酸(Val/V)
在本发明的上下文中，形成二硫键因此含有半胱氨酸的Cys-肽应由X2-Cyss描述。
在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括上面列出的20个氨基酸的L-形式和D-形式。然而，L形式是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
根据本发明，“游离氨基酸”被理解为具有游离形式的氨基及(α-)羧基官能团的氨基酸，即不与其他分子共价结合，例如，不是形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以以盐的形式或以水合物的形式存在。当将氨基酸称为寡肽的一部分或在寡肽中时，这将理解为各自寡肽结构的根据已知的生物化学和肽生物合成机制衍生自各自氨基酸的该部分。
根据本发明，“生长因子”应理解为能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的任何天然存在的物质。优选的生长因子是蛋白质或类固醇激素的形式。根据本发明的一个实施方案，表述“生长因子”应解释为与选自以下的生长因子有关：成纤维细胞生长因子(FGF)，包括酸性FGF和碱性FGF，胰岛素，胰岛素样生长因子(IGF)，上皮生长因子(EGF)，神经生长因子(NGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，和转化生长因子(TGF)，包括TGFα和TGFβ，细胞因子，如白细胞介素1、2、6，粒细胞刺激因子和白细胞抑制因子(LIF)。
根据本发明，“寡肽”应理解为由2至20个氨基酸组成的肽化合物。更优选的本发明的寡肽是由2-10个氨基酸、2-6个氨基酸、2-5个氨基酸、2-4个氨基酸或2-3个氨基酸组成的寡肽。根据本发明，最优选的寡肽是二肽。
“肽”应理解为包含通过肽键(R1-CO-NH-R2)彼此共价偶联的至少两个氨基酸的分子。
当在本文中与氨基酸结合使用时，表述“Xxx”应理解为指上文所列的任何天然氨基酸。
关于化学化合物如氨基酸的表述“N-酰化”应理解为意指N-酰化化合物通过向所述化合物的氮官能团加入酰基来修饰。优选地，将酰基加到氨基酸的α-氨基上。
营养组合物、培养基、细胞培养基等的“无菌形式”应理解为限定所述组合物、培养基、细胞培养基等中不存在任何生物。
在本发明的上下文中，“固体培养基”应理解为任何非液体或非气体培养基。本发明优选的固体培养基是凝胶样培养基，例如琼脂、角叉菜胶或明胶。
在本发明的上下文中，“细胞传代”(也称为细胞的传代培养或分瓶)应理解为意指将少量细胞转移到新的培养容器中。如果细胞定期分瓶，它们可以培养更长的时间，因为它避免了与持久的高细胞密度相关的衰老。悬浮培养物用含有在较大体积的新鲜培养基中稀释的少量细胞的少量培养物容易地传代。
本发明一般涉及培养基，优选细胞培养基，所述培养基包含至少一种长度为2-10个氨基酸的寡肽，所述氨基酸是天然氨基酸，并且所述氨基酸中的至少一个是赖氨酸(Lys)，并且另外一个氨基酸选自半胱氨酸(Cys)、胱氨酸(Cyss)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)和异亮氨酸(Ile)，并且寡肽以至少0.1mM的量存在。赖氨酸的使用避免了浪费的氨基酸如丙氨酸的积累，丙氨酸是用于细胞培养应用的大多数商业上可获得的肽的关键组分。
优选排除二肽Tyr-Lys。
在优选的实施方案中，C-或N-末端氨基酸是赖氨酸单元。应注意，C-和N-末端序列可对细胞培养物产生影响，如不同的CAS编号所证明的。
令人惊讶的是，发现赖氨酸肽具有比基于公开数据所预期的溶解度(使用Scifinder和Advanced Chemistry Development(ACD/Labs)Software V11.02(1994-2016ACD/Labs)计算)更高的溶解度。对于双-L-赖氨酰-L-胱氨酸盐酸盐，发现溶解度>50％(w/w)，其显著超过计算的4.2％(w/w)的溶解度。
在表1中，总结了不同氨基酸和二肽的溶解度。还发现，与不导致细胞生长的其他赖氨酸肽相反，赖氨酸肽的优选实施方案还允许细胞生长。这是令人惊讶的，因为A.Nagamatsu和T.Hayashida(Chemical&Pharmaceutical Bulletin 22,2680(1974))用纤溶酶和胰蛋白酶分析了Lys-Leu、Lys-Tyr和Lys-Lys的水解，发现这些肽都不被裂解。通过将高溶解度与生物利用度相结合，lys-肽提供了解决制备具有高氨基酸浓度的细胞培养基和补料的问题的新方法。
表1：氨基酸和二肽的溶解度(g/1000g溶液)
| 氨基酸 | Xxx1) | Gly-Xxx5) | Ala-Xxx5) | 计算的Lys-Xxx3) | 发现的Lys-Xxx |
| L-胱氨酸 | 0.1 | 504) | 8.72) | 42 | >5006) |
| L-酪氨酸 | 0.4 | 33 | 15.3 | 21 | >3307) |
| L-缬氨酸 | 81.3 | 370 | 102 | 287 | >4006) |
| L-亮氨酸 | 23.7 | 70 | 248 | 200 | >3307) |
| L-异亮氨酸 | 39.6 | 210 | 86 | 210 | >5007) |
1)CRC Handbook of Chemistry and Physics，58th Ed.，1977，第C-769页
2)WO 2011/133902，Life Techn.，第40页
3)SciFinder，使用Advanced Chemistry Development(ACD/Labs)SoftwareV11.021994-2016ACD/Labs)计算
4)MSDS Bachem AG
5)Product Brochure Peptides,Degussa AD,GB Industrie-undFeinchemikalien,1988
6)作为盐酸盐
7)作为乙酸盐
在其他优选的实施方案中，寡肽的长度为2-6个氨基酸、2-5个氨基酸、2-4个氨基酸或2-3个氨基酸。在特别优选的实施方案中，寡肽是二肽。
本发明人发现这种培养基具有优于现有技术细胞培养基的优异性质。
肽尤其是二肽Lys-Xxx可以通过简单地将双重N-保护的赖氨酸与一个或多个氨基酸偶联来合成。这比合成反向序列Xxx-Lys(其合成不仅需要N-保护的氨基酸Xxx，还需要选择性ε-保护的赖氨酸)明显更容易。用于合成二肽Lys-Xxx的赖氨酸的常见衍生物是例如双-N,N-羧基苄基-L-赖氨酸(Z-Lys(Z)-OH)和双-N,N-叔丁氧基羰基-L赖氨酸(Boc-Lys(Boc)-OH)。
在其中使用细胞培养基的pH范围内(通常pH 7.2-7.4)，赖氨酰二肽是由氨基中的一个的质子化产生的其盐的形式。为了形成盐，可以使用与细胞培养相容的所有酸。最常见的盐是氯化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐和碳酸盐。然而，也可以使用有机酸，例如甲酸、乙酸、乳酸、谷氨酸或天冬氨酸。
赖氨酰二肽比相应的丙氨酰二肽明显更容易溶于水。
在一个实施方案中，寡肽是Lys-Xxx或Xxx-Lys，其中Xxx是选自Cys、Cyss、Leu、Tyr、Val和Ile的天然氨基酸。在另一个特别优选的实施方案中，寡肽是Lys-Xxx，其中Xxx是选自Cys、Cyss、Leu、Tyr、Val和Ile及其任何组合的天然氨基酸。
在另一个有利的构型中，寡肽选自Lys-Cys、Lys2-Cyss、Lys-Leu、Lys-Tyr、Lys-Val和Lys-Ile。
在一个实施方案中，具有低溶解度的氨基酸(包括但不限于Tyr，Cys，Leu，Ile，Val)被Lys-Xxx或Xxx-Lys肽完全或部分替换。同时，赖氨酸(盐或无盐形式)的量减少相同的量。由于细胞对赖氨酸的高需求，可以在不超过原始制剂中的赖氨酸量的情况下实现用Lys-Xxx或Xxx-Lys肽替换具有低溶解度的氨基酸。
在优选的实施方案中，寡肽不是N-酰化的。已知N-酰化可改善某些寡肽的热稳定性；然而，已发现N-酰化寡肽也可导致较差的活细胞密度和活力。
在一个实施方案中，培养基还包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。在特别优选的实施方案中，培养基包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和至少一种维生素中的全部。
在本发明的一个实施方案中，培养基不含生长因子。根据该实施方案，可以使用本发明的寡肽代替生长因子来促进培养中细胞的生长和/或增殖。在本发明的另一个实施方案中，培养基不含任何脂质。
根据本发明的另一个实施方案，培养基是液体形式，凝胶、粉末、颗粒、小丸的形式，或片剂形式。
在优选的实施方案中，本发明的培养基是成分确定的培养基或无血清培养基。例如，本发明的寡肽可以补充到Miltenyi Biotech(Bergisch Gladbach，Germany)的CHOMACSCD培养基、可从LONZA(Basel,Switzerland)获得的PowerCHO-2CD培养基、PAA(PAALaboratories，Pasching，Austria)的Acti-CHO P培养基、可从SAFC获得的Ex-Cell CD CHO培养基、ThermoFisher(Waltham，USA)的SFM4CHO培养基和CDM4CHO培养基。本发明的寡肽也可以补充到DMEM培养基(Life Technologies Corp.，Carlsbad，USA)。然而，本发明不限于补充上述培养基。
在其他优选的实施方案中，培养基是相对于所述培养基的使用浓度的2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩的形式(体积/体积)的液体培养基。这允许通过用各自体积的无菌水简单稀释浓缩培养基来制备“即用型”培养基。本发明培养基的这种浓缩形式也可以通过将其添加至培养物中(例如在补料分批培养过程中)来使用。
本发明的培养基优选含有持续生长和产物形成所需的所有营养物质。用于制备培养基，特别是细胞培养基的配方是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Cell CultureTechnology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,and Wei-ShouHu eds.,Taylor and Francis Group 2006)。各种培养基可从各种来源商购获得。
本发明的培养基优选包含碳水化合物源。细胞培养基中使用的主要碳水化合物是葡萄糖，通常以5至25nM补充。另外，可以使用任何己糖，例如半乳糖、果糖或甘露糖或其组合。
培养基通常还包括至少必需氨基酸(即His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Try、Val)以及某些非必需氨基酸。如果细胞系不能合成氨基酸或细胞系不能产生足够量的氨基酸以支持最大生长，则非必需氨基酸通常包括在细胞培养基中。此外，哺乳动物细胞也可以使用谷氨酰胺作为主要能量来源。包含的谷氨酰胺的浓度通常高于其他氨基酸(2-8mM)。然而，如上所述，谷氨酰胺可以自发地分解形成氨，并且某些细胞系更快地产生氨，这是有毒的。
本发明的培养基优选包含盐。将盐加入细胞培养基中以维持等渗条件并防止渗透不平衡。本发明的培养基的重量摩尔渗透压浓度为约300mOsm/kg，尽管许多细胞系可以耐受该值的约10％或更高的变化。一些昆虫细胞培养物的重量摩尔渗透压浓度倾向于高于300mOsm/kg，这可能是比300mOsm/kg高0.5％、1％、2％-5％、5％-10％、10％-15％、15％-20％、20％-25％、25％-30％。细胞培养基中最常用的盐包括Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO4 2-、PO4 3-和HCO3 -(例如，CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)。
其他无机元素可以存在于培养基中。它们包括Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si和Ni。许多这些元素参与酶活性。它们可以以盐(例如CaCl2、Fe(NO3)3、MgCl2、MgSO4、MnCl2、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)和微量元素的离子(例如硒、钒和锌)的形式提供。这些无机盐和微量元素可以从商业上获得，例如从Sigma(Saint Louis，Missouri)获得。
本发明的培养基优选包含维生素。维生素通常被细胞用作辅助因子。每种细胞系的维生素需求差异很大，尽管如果细胞培养基含有很少或没有血清或如果细胞以高密度生长，通常需要额外的维生素。优选存在于本发明培养基中的示例性维生素包括生物素、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、D-Ca++-泛酸、吡哆醛、核黄素、硫胺素、吡哆醇、烟酰胺(niacinamide)、维生素A、B6、B12、C、D3、E、K和对氨基苯甲酸(PABA)。
本发明的培养基还可包含血清。血清是凝固血液的上清液。血清组分包括附着因子、微量营养物质(例如微量元素)、生长因子(例如激素、蛋白酶)和保护性元素(例如抗毒素、抗氧化剂、抗蛋白酶)。血清可从多种动物来源获得，包括人、牛或马血清。当包含在根据本发明的细胞培养基中时，通常以5-10％(体积)的浓度添加血清。优选的细胞培养基是无血清的。
为了在不存在血清或减少血清的培养基中促进细胞生长，可以将一种或多种以下多肽添加到本发明的细胞培养基中：例如，成纤维细胞生长因子(FGF)，包括酸性FGF和碱性FGF，胰岛素，胰岛素样生长因子(IGF)，上皮生长因子(EGF)，神经生长因子(NGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，和转化生长因子(TGF)，包括TGFα和TGFβ，任何细胞因子，如白细胞介素1、2、6，粒细胞刺激因子，白细胞抑制因子(LIF)等。
然而，本发明的培养基也可以不包括上面列出的生长因子。根据本发明的这个方面，使用本发明的寡肽代替任何生长因子来促进细胞的增殖。换句话说，根据本发明的这个方面，本发明的寡肽的存在使得生长因子的存在是可有可无的。
在其他实施方案中，细胞培养基不含多肽(即，具有多于20个氨基酸的肽)。
还可以将一种或多种脂质加入到本发明的细胞培养基中，例如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、棕榈油酸、油酸、多烯酸和/或12、14、16、18、20或24个碳原子(每个碳原子是分枝或非分枝的)的脂肪酸、磷脂、卵磷脂(磷脂酰胆碱)和胆固醇。可以将这些脂质中的一种或多种作为补充物包含在无血清培养基中。磷脂酸和溶血磷脂酸刺激某些锚定依赖性细胞(例如MDCK、小鼠上皮细胞和其他肾细胞系)的生长，而磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇刺激人成纤维细胞在无血清培养基中的生长。乙醇胺和胆固醇也已被证明可促进某些细胞系的生长。在某些实施方案中，细胞培养基不含脂质。
还可以将一种或多种载体蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)或转铁蛋白加入细胞培养基中。载体蛋白可以帮助运输某些营养物质或微量元素。BSA通常用作不溶于水溶液的脂质例如亚油酸和油酸的载体。此外，BSA还可以作为某些金属例如Fe、Cu和Ni的载体。在无蛋白质制剂中，非动物来源的BSA替代物例如环糊精可用作脂质载体。
还可以将一种或多种附着蛋白例如纤连蛋白、层粘连蛋白和pronectin添加到细胞培养基中，以帮助促进锚定依赖性细胞与基质的附着。
细胞培养基可任选地包含一种或多种缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于N-[2-羟乙基]-哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸盐、碳酸氢盐和适用于细胞培养应用的其它缓冲剂。合适的缓冲剂是提供缓冲能力而对培养的细胞没有实质细胞毒性的缓冲剂。合适的缓冲剂的选择在细胞培养领域的普通技术范围内。
可以将聚阴离子或聚阳离子化合物添加到培养基中以防止细胞聚集并促进细胞在悬浮液中的生长。
在优选的实施方案中，培养基是液体形式。然而，培养基也可以是固体培养基，例如凝胶样培养基，例如含有琼脂、角叉菜胶或明胶的培养基。
优选地，培养基是无菌形式。
在本发明的优选实施方案中，含Lys的寡肽以0.01至20g/l、或0.1至10g/l、或0.5至5g/l的浓度存在于所述培养基中。在本发明的其它优选实施方案中，含Lys的寡肽以高于0.1、0.2、0.4或1mM的浓度存在。还优选的是其中含Lys的寡肽以小于50、20、10、5或2mM的浓度存在的培养基。优选地，含Lys的寡肽在培养基中的浓度为0.1mM至20mM，或0.1mM至10mM，或0.5mM至10mM，或1mM至10mM，或1mM至8mM，或1mM至6mM。
上述浓度是以在非浓缩培养基中的浓度(即实际培养物中存在的浓度)给出。浓缩培养基可包含X倍的浓度。
在某些实施方案中，本发明的细胞培养基包含含Lys的寡肽和游离赖氨酸。在一个优选的实施方案中，将含Lys的寡肽加入市售培养基中，例如加入成分确定的细胞培养基或复杂细胞培养基中。
本发明的培养基可以是浓缩形式。它可以是例如2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍浓缩形式(相对于支持细胞的生长和产物形成的浓度)。这种浓缩的培养基有助于制备培养基用于通过用水性溶剂如水稀释浓缩的培养基来使用。这种浓缩的培养基可以用于分批培养，但也有利地用于补料分批或连续培养，其中将浓缩的营养组合物添加到正在进行的细胞培养中，例如以补充培养期间细胞消耗的营养物。
在本发明的其他实施方案中，培养基是干燥形式，例如干粉形式，或颗粒形式，或小丸形式，或片剂形式。
本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞的用途。本发明的另一方面涉及本发明的培养基用于生产细胞培养产物的用途。
本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的培养基用于培养动物细胞或植物细胞，最优选的哺乳动物细胞的用途。在具体的实施方案中，待培养的细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。优选的本发明的细胞是CHO细胞和杂交瘤细胞。最优选的本发明的细胞是CHO细胞。特别优选的本发明的CHO细胞是CHO DG44和CHO DP12细胞。
还包括在本发明范围内的是培养细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的细胞培养基接触。在本发明的一个实施方案中，培养细胞的方法包括在支持培养细胞的条件下使细胞与基础培养基接触，并用本发明的浓缩培养基补充基础细胞培养基。在优选的实施方案中，基础培养基在超过一天的时间内用浓缩的补料或培养基补充。
本发明的另一方面涉及产生根据本发明的培养基的方法，其中所述培养基包含至少一种根据本发明的寡肽。产生根据本发明的培养基的方法包括向培养基中加入本发明的寡肽的至少一个步骤。同样，本发明的一个方面涉及本发明的含Lys的寡肽用于产生细胞培养基的用途。
本发明的另一方面涉及修饰培养基的方法，其中所述培养基的所述修饰包括向所述培养基中加入至少一种本发明的寡肽。
本发明的另一方面涉及制备液体培养基的方法，所述方法包括提供根据本发明的固体培养基，例如以干粉形式，或以颗粒形式，或以小丸形式，或以片剂形式；和将所述固体培养基溶解在水性培养基如水中。
本发明的另一方面涉及根据本发明的寡肽用于在培养基中培养细胞的用途。本发明的另一方面涉及根据本发明的寡肽用于细胞培养的用途。
本发明还涉及制备细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与本发明的培养基接触；和(iii)从所述培养基或所述细胞中获得所述细胞培养产物。同样，本发明涉及根据本发明的寡肽用于制备细胞培养产物的用途。
在优选的方法中，细胞培养产物是治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、多糖例如肝素、抗体、单克隆抗体、生长因子、白细胞介素、病毒、病毒样颗粒或酶。
根据本发明的细胞培养可以以分批培养、补料分批培养或连续培养进行。
实施例
一般程序
研究了与含有相应游离氨基酸或相应L-丙氨酸二肽的培养基相比，L-赖氨酸二肽对产生抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(亚克隆DG44；Life Technologies Cooperation，Carslbad，USA)的生长的影响。为此目的，将细胞培养在由Xell AG,Bielefeld,Germany生产的TC-42培养基(其中缺乏在实验中由二肽提供的氨基酸)中。调节这些氨基酸的浓度以使得考虑到二肽完全水解成氨基酸，所有氨基酸的浓度在该实验中测试的所有培养基中是相同的。
从预备培养物开始，通过添加测试培养基在摇瓶中调节0.3·106个细胞/ml的初始活细胞密度(VCD)。2-4天后，将一部分细胞培养物转移到新的摇瓶中，并通过添加新的测试培养基调节0.3·106个细胞/ml的初始活细胞密度(VCD)。这进行两次，然后在细胞生长后测量活细胞密度(VCD)长达24天。
实验1：用TC-42培养基获得的细胞生长的比较，其中L-半胱氨酸/L-胱氨酸被双-L-丙氨酰-L-胱氨酸、双-L-脯氨酰-L-胱氨酸或双-L-赖氨酰-L-胱氨酸取代，并且L-亮氨酸被L-赖氨酰-L-亮氨酸取代
对于此实验，由Xell AG,Bielefeld,Germany生产的TC-42培养基中，故意将L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-脯氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-亮氨酸排除在初始制剂之外。然后将这些氨基酸和二肽双-L-丙氨酰-L-胱氨酸、双-L-脯氨酰-L-胱氨酸、双-L-赖氨酰-L-胱氨酸四氢氯化物和L-赖氨酰-L-亮氨酸以表2中列出的浓度分别加入到测试培养基中。
表2：实验1的测试培养基中使用的氨基酸和二肽的浓度。
表3中列出了在不同时间用表2的培养基获得的活细胞密度(VCD)。
表3：使用表2中列出的培养基获得的活细胞密度(VCD)和最大细胞密度(最大VCD)。
| 时间 | 参考 | Ala2-Cyss | Lys2-Cyss | Pro2-Cyss | Lys-Leu |
| 0.0 | 0.32 | 0.26 | 0.31 | 0.31 | 0.33 |
| 0.7 | 0.46 | 0.42 | 0.39 | 0.37 | 0.39 |
| 2.0 | 1.05 | 0.47 | 0.54 | 0.32 | 0.59 |
| 2.7 | 1.32 | 0.67 | 0.83 | 0.21 | 0.81 |
| 3.6 | 1.68 | 0.84 | 1.02 | 0.18 | 0.92 |
| 3.7 | 0.37 | 0.36 | 0.39 | 0.30 | 0.34 |
| 4.7 | 0.71 | 0.71 | 0.62 | 0.24 | 0.56 |
| 5.8 | 1.48 | 1.52 | 1.18 | 0.14 | 0.94 |
| 6.7 | 2.20 | 2.34 | 1.98 | 0.08 | 1.40 |
| 6.8 | 0.34 | 0.32 | 0.30 | 0.32 | 0.30 |
| 7.8 | 0.51 | 0.48 | 0.43 | 0.43 | 0.45 |
| 8.7 | 1.03 | 1.06 | 0.98 | 0.41 | 0.79 |
| 9.7 | 2.05 | 1.79 | 1.82 | 0.34 | 1.24 |
| 10.6 | 3.21 | 3.19 | 2.88 | 0.27 | 1.81 |
| 11.6 | 4.79 | 4.89 | 4.75 | 0.79 | 2.38 |
| 12.8 | 5.93 | 7.65 | 6.68 | 3.12 | |
| 13.6 | 7.79 | 10.01 | 9.20 | 3.66 | |
| 15.0 | 9.98 | 11.62 | 11.93 | 4.52 | |
| 15.9 | 12.67 | 15.06 | 13.66 | 5.47 | |
| 16.7 | 13.80 | 14.38 | 13.41 | 6.10 | |
| 17.8 | 15.04 | 14.05 | 14.16 | 6.03 | |
| 18.7 | 15.57 | 14.28 | 14.15 | 7.23 | |
| 19.9 | 16.80 | 10.51 | |||
| 20.7 | 18.54 | 12.43 | |||
| 21.8 | 18.30 | 12.15 | |||
| 22.8 | 18.46 | 11.82 | |||
| 最大VCD | 18.54 | 15.06 | 14.16 | 0.79 | 12.43 |
实验2：用TC-42培养基获得的细胞生长的比较，其中L-酪氨酸被L-丙氨酰-L-酪氨酸或L-赖氨酰-L-酪氨酸取代
对于此实验，使用由Xell AG,Bielefeld,Germany生产的TC-42培养基，其中缺乏L-丙氨酸、L-赖氨酸和L-酪氨酸。然后将这些氨基酸和二肽L-丙氨酰-L-酪氨酸二水合物和L-赖氨酰-L-酪氨酸乙酸盐分别以表4中列出的浓度加入到测试培养基中。
表4：实验2的测试培养基中使用的氨基酸和二肽的浓度。
表5中列出了在不同时间用表4的培养基获得的活细胞密度(VCD)。
表5：使用表4中列出的培养基获得的活细胞密度(VCD)和最大细胞密度(最大VCD)。
| 时间[d] | 参考 | Ala-Tyr | Lys-Tyr |
| 0.0 | 0.43 | 0.38 | 0.42 |
| 0.7 | 0.63 | 0.51 | 0.53 |
| 1.7 | 1.33 | 1.22 | 0.82 |
| 2.7 | 2.03 | 2.22 | 1.68 |
| 2.7 | 0.39 | 0.35 | 0.39 |
| 4.0 | 0.97 | 0.77 | 0.87 |
| 4.9 | 1.95 | 1.59 | 1.55 |
| 5.7 | 2.65 | 1.93 | 2.29 |
| 6.7 | 4.97 | 2.82 | 3.08 |
| 6.7 | 0.31 | 0.31 | 0.32 |
| 7.7 | 0.54 | 0.48 | 0.52 |
| 8.7 | 1.16 | 1.17 | 1.16 |
| 9.7 | 1.92 | 1.92 | 1.89 |
| 11.0 | 3.94 | 4.11 | 4.07 |
| 11.8 | 5.61 | 6.12 | 6.17 |
| 12.7 | 7.76 | 8.29 | 8.35 |
| 13.7 | 9.51 | 10.49 | 10.64 |
| 14.7 | 10.92 | 12.44 | 12.64 |
| 15.7 | 10.88 | 11.34 | 12.39 |
| 16.7 | 10.69 | 12.42 | 12.49 |
| 17.9 | 11.13 | 11.06 | 11.76 |
| 18.9 | 10.99 | 11.31 | 12.39 |
| 19.7 | 10.76 | 11.20 | 12.06 |
| 20.7 | 10.67 | 11.13 | 12.06 |
| 21.7 | 10.74 | 11.24 | 12.10 |
| 最大VCD | 11.13 | 12.44 | 12.64 |
实验3：用TC-42培养基获得的细胞生长的比较，其中L-缬氨酸和L-异亮氨酸分别被L-赖氨酰-L-缬氨酸和L-赖氨酰-L-异亮氨酸取代。
对于此实验，使用由Xell AG,Bielefeld,Germany生产的TC-42培养基，其中缺乏L-赖氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸。然后将这些氨基酸和二肽L-赖氨酰-L-缬氨酸和L-赖氨酰-L-异亮氨酸分别以表6中列出的浓度加入到测试培养基中。
表6：实验3的测试培养基中使用的氨基酸和二肽的浓度。
表7中列出了在不同时间用表6的培养基获得的活细胞密度(VCD)。
表7：使用表6中列出的培养基获得的活细胞密度(VCD)和最大细胞密度(最大VCD)。
| 时间 | 参考 | Lys-Ile | Lys-Val |
| 0.0 | 0.44 | 0.44 | 0.43 |
| 2.8 | 2.77 | 1.78 | 2.04 |
| 3.0 | 0.45 | 0.48 | 0.50 |
| 6.8 | 4.35 | 3.36 | 4.37 |
| 6.9 | 0.36 | 0.39 | 0.39 |
| 7.9 | 0.66 | 0.60 | 0.61 |
| 8.8 | 1.21 | 1.04 | 1.15 |
| 9.8 | 2.28 | 1.73 | 2.07 |
| 10.8 | 3.87 | 2.73 | 3.35 |
| 11.8 | 6.38 | 4.62 | 5.79 |
| 12.9 | 8.53 | 5.77 | 8.34 |
| 13.8 | 11.54 | 7.19 | 11.08 |
| 14.8 | 16.25 | 9.27 | 15.45 |
| 15.9 | 16.29 | 9.45 | 16.84 |
| 16.9 | 17.34 | 9.40 | 17.25 |
| 17.9 | 16.73 | 10.56 | 16.27 |
| 18.8 | 14.62 | 10.67 | 14.62 |
| 19.8 | 9.18 | ||
| 21.0 | 8.77 | ||
| 最大VCD | 17.34 | 10.67 | 17.25 |
参考培养基与含有相同摩尔量半胱氨酸和二肽形式的胱氨酸的其他培养基的比较显示，双-赖氨酰-L-半胱氨酸具有与双-丙氨酰-L-胱氨酸相当的性能(图1)。在两种情况下，细胞都能够利用肽进行生长。在相同条件下，用双-脯氨酰-胱氨酸几乎没有观察到生长，这表明细胞不能利用这种二肽。这表明双-赖氨酰-L-半胱氨酸可用作游离氨基酸的替代物。与双-丙氨酰-L-胱氨酸相比，双-赖氨酰-L-半胱氨酸结合了令人惊讶的高溶解度(表1)和生物利用度。
另外，通过比较在参考培养基中培养的细胞和在含有二肽双-丙氨酰-L-胱氨酸或双-赖氨酰-L-半胱氨酸的培养基中生长24天的细胞来分析了对抗体产生的影响(图4)。两者都导致增加至少30％的更高的抗体产量；使用双-赖氨酰-L-半胱氨酸，抗体产量增加了近50％。
在第二个测试系列中，将含有二肽L-丙氨酰-L-酪氨酸和L-赖氨酰-L-酪氨酸的培养基与含有等摩尔量酪氨酸的参考培养基进行比较。从图2中可以看出，不同培养基的生长曲线无显著差异。关于最大细胞密度，两种二肽甚至似乎产生略微更高的值。这表明L-赖氨酰-L-酪氨酸可用作游离氨基酸的替代物。与先前报道的L-丙氨酰-L-酪氨酸相比，赖氨酰-L-酪氨酸结合了令人惊讶的高溶解度(表1)和生物利用度。
在进一步的测试系列中，将含有L-赖氨酰-L-缬氨酸和L-赖氨酰-L-异亮氨酸的培养基与含有等摩尔量的L-赖氨酸或L-缬氨酸的参考培养基进行比较。虽然L-赖氨酰-L-缬氨酸产生生长曲线并且最大细胞密度几乎与参考培养基的那些相匹配，但L-赖氨酰-L-异亮氨酸产生较慢的生长和较低的最大细胞密度(图3)。在两种情况下，游离氨基酸都可以被赖氨酰肽取代。
对比试验清楚地证明胱氨酸和酪氨酸的赖氨酰二肽是低溶解度氨基酸的合适替代物。赖氨酰二肽的利用至少与商业上使用的L-丙氨酰二肽的利用一样好。赖氨酰二肽的使用不会导致培养基中氨基酸的不希望的增加，因为从赖氨酰二肽释放的赖氨酸以比丙氨酸高得多的浓度存在于通常的细胞培养物中。
由于赖氨酰二肽表现出显著更高的溶解度，它们可以比氨基酸或丙氨酰二肽更容易和更快地溶解，它们的应用似乎在使用前不久制备的脱水培养基中是有益的。
它们的增加的溶解度也有助于产生可在使用前稀释至所需浓度的浓度。特别地，赖氨酰二肽能够实现比迄今为止使用的游离氨基酸或丙氨酰二肽更高的浓度并因此实现更高的浓度因子。用于例如药理学蛋白质生产的大规模细胞培养物通常培养数周。在此期间，经常更换用过的营养物质。为了尽可能避免增加培养基的体积，使用高剂量的补料培养基。这种补料培养基可含有浓度比工作培养基浓度高5至1,000倍的营养物质。为此，赖氨酰二肽是特别适合的。
Claims (16)
1.一种培养基，其包含至少一种寡肽，所述寡肽中的氨基酸是天然氨基酸，并且所述氨基酸中的至少一个是赖氨酸(Lys)，
其中所述寡肽以0.1mM至10mM的浓度存在于所述培养基中，并且
其中所述寡肽是Lys2-Cyss。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基还包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。
3.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基不含生长因子。
4.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基为液体形式，凝胶、粉末、颗粒、小丸形式，或片剂形式。
5.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基是无血清培养基。
6.根据权利要求1所述的培养基，其中所述培养基是成分确定的培养基。
7.根据权利要求1所述的培养基，其中相对于所述培养基的使用浓度，所述培养基是2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩的形式。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的培养基，其中所述培养基是细胞培养基。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的培养基用于培养细胞的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述细胞是动物细胞或植物细胞。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
12.根据权利要求9所述的用途，其中所述细胞选自CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。
13.寡肽用于在培养基中培养细胞的用途，所述寡肽中的氨基酸是天然氨基酸，并且所述氨基酸中的至少一个是赖氨酸(Lys)，
其中所述寡肽是Lys2-Cyss，
并且其中所述寡肽以0.1mM至10mM的浓度存在于所述培养基中。
14.制备细胞培养产物的方法，其包括以下步骤：
提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；
将所述细胞与根据权利要求1-8中任一项所述的培养基接触；和
从所述培养基或从所述细胞中获得所述细胞培养产物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞培养产物选自治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、多糖、抗体、生长因子、白细胞介素、病毒、病毒样颗粒和酶。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞培养产物是肝素或单克隆抗体。
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