ES2901134T3 - Medio de cultivo que comprende oligopéptidos - Google Patents

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Abstract

Un medio de cultivo, tal como un medio de cultivo celular, que comprende al menos un dipéptido de 2 aminoácidos de longitud, siendo dichos aminoácidos, aminoácidos naturales y siendo uno de dichos aminoácidos lisina (Lys), en donde el dipéptido no comprende glicina (Gly) y ácido glutámico (Glu), en donde el dipéptido es Lys-Xxx, en donde Xxx se selecciona de Cys, Cyss, Tyr, Val, Leu e Ile y en donde dicho dipéptido está presente en dicho medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 10 mM.

Description

DESCRIPCIÓN
Medio de cultivo que comprende oligopéptidos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a procedimientos de producción biotecnológicos. Más específicamente, la presente invención se refiere a medios de cultivo mejorados para su uso en procedimientos de producción biotecnológicos, procedimientos que emplean dichos medios mejorados y a productos obtenidos de los procedimientos que usan los medios de cultivo mejorados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los procedimientos biotecnológicos se usan ampliamente para la producción de productos biológicos. Estos procedimientos implican típicamente el cultivo de células en un medio de cultivo en condiciones permisibles para el crecimiento y la formación del producto por las células cultivadas. Las células útiles en la producción biotecnológica son células bacterianas, células fúngicas, células de levadura y células de origen animal o vegetal.
El cultivo de células animales se ha usado desde hace tiempo para la producción de productos biológicos, tales como proteínas terapéuticas, polipéptidos, oligopéptidos u otras moléculas biológicas, tales como polisacáridos terapéuticos. En dichos procedimientos de cultivo celular, las células animales, normalmente modificadas genéticamente para producir un producto deseado, se cultivan en un medio de cultivo líquido, sólido o semisólido para la proliferación celular y la formación de producto. Una ventaja significativa del cultivo celular es el hecho de que las células animales y las células vegetales pueden realizar modificaciones postraduccionales del producto primario, tales como plegamiento y modificación postraduccional de un polipéptido.
En los procedimientos de producción biotecnológicos, en particular en cultivos de células animales, el control y optimización de las condiciones del cultivo celular es fundamental para la proliferación celular y la formación de producto. Un factor decisivo es la composición media. La concentración y calidad del producto de cultivo celular final depende en gran medida de la composición del medio. Los cultivos de células animales y vegetales son particularmente exigentes en términos de la composición de nutrientes requerida y las condiciones de cultivo. Los nutrientes requeridos no solo incluyen fuentes básicas de carbono, nitrógeno y energía, tales como azúcar y amoniaco, sino también nutrientes más complejos, tales como aminoácidos esenciales, factores de crecimiento y vitaminas. Por esta razón, se ha usado la complementación de medios de cultivo de células animales con composiciones complejas de nutrientes, tales como suero, para proporcionar a las células animales una amplia variedad de nutrientes. Sin embargo, las preocupaciones regulatorias y de seguridad, así como los problemas con la heterogeneidad de las fuentes disponibles de sueros, han llevado a la industria a esforzarse por eliminar el suero y otros medios no definidos de los procedimientos industriales de cultivo celular. Sin embargo, los cultivos celulares que crecen en medios sin suero a menudo muestran deficiencias nutricionales. Por esta razón, se ha realizado un gran esfuerzo para identificar los componentes nutricionales de medios complejos, así como sus concentraciones óptimas, que se requieren para el crecimiento y la formación de proteínas satisfactorias en cultivos celulares.
Se sabe que el suministro de aminoácidos a cultivos celulares tiene un efecto significativo sobre la velocidad de crecimiento y la producción. La glutamina se usa de forma rutinaria en medios de cultivo celular, ya que es una fuente importante de carbono, nitrógeno y energía para las células cultivadas. Se demostró que la cantidad de glutamina necesaria para el crecimiento óptimo de cultivos de células animales es de 3 a 10 veces mayor que la cantidad de otros aminoácidos (Eagle et al., Science 130: 432-37). Sin embargo, la glutamina como nutriente es inestable cuando se disuelve en agua a temperaturas elevadas, tal como las condiciones de esterilización por calor, porque se forman piroglutamato y amoniaco con el calor (Roth et al. 1988, In Vitro Cellular & Developmental Biology 24 (7): 696- 98). Por esta razón, se usa a menudo glutamato en medios de cultivo celular en lugar de glutamina (Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-based Therapies, 52, Sadettin et al., Eds., Taylor and Francis Group, 2006). Otros grupos han intentado evitar la formación de sustancias no deseadas, tales como el piroglutamato y amoniaco, añadiendo dipéptidos que contienen glutamina, tales como alanil-glutamina o glicil-glutamina, al medio de cultivo celular (Roth et al. (1988), In Vitro Cellular & Developmental Biology 24 (7): 696-98). Sin embargo, otros grupos han propuesto acilar dipéptidos con el fin de hacerlos más estables en condiciones de esterilización por calor. El documento US 5.534.538 describe N-acil-dipéptidos y su uso en productos de nutrición enteral o parenteral esterilizados por calor, así como en medios de cultivo celular.
Franek et al. (2002, Biotechnol. Prog. 18, 155-158; documento US 2004/0072341) cribaron varios oligopéptidos sintéticos (incluyendo oligo-Gly, oligo-Ala) según su efecto en una línea celular de ratón en medio sin suero. Describieron que, aunque el aminoácido solo y los dipéptidos ensayados no alteraban significativamente el rendimiento del cultivo, la tri-, tetra- y penta-glicina, así como la tri- y tetra-alanina, mejoraban la densidad de células viables y la viabilidad celular.
Franek et al. (2003, Biotechnol. Prog. 19, 169-174) también ensayaron en una variedad de péptidos que contienen lisina seleccionados aleatoriamente su efecto en las células de hibridoma usando un medio basal sin suero. Estos eran Gly-Lys, Gly-Lys-Gly, Gly-His-Lys, Lys-Lys-Lys, Gly-Phe-Gly y Gly-Gly-Lys-Ala-Ala. Los autores encontraron una supresión del crecimiento celular y un aumento de los títulos de tri, tetra y pentapéptidos. Sin embargo, es difícil sacar conclusiones ya que el medio basal también contenía los constituyentes peptídicos. Además, los autores usaban una concentración de 0,2% (p/v) y no discutían la potencial implicación en la solubilidad.
El documento WO 2011/133902 describe medios de cultivo celular que comprenden dipéptidos, en donde los dipéptidos incluyen aminoácidos que tienen una baja solubilidad en agua, en este caso tirosina y cisteína. La cisteína no solo tiene una baja solubilidad en agua, sino que también es inestable, debido a la presencia del grupo tiol reactivo. Los autores han descubierto que mediante la incorporación de tirosina y cisteína en dipéptidos, se pueden mejorar los problemas de solubilidad y estabilidad de los aminoácidos. Los autores también encontraron una vida útil mejorada de los medios de cultivo celular resultantes. En una realización, el aminoácido restante del dipéptido (no cisteína ni tirosina) es asparagina.
El documento WO 2012/019160 describe cultivos de células animales, en donde durante la fase de producción el medio sin suero se complementa con dipéptidos que contienen Tyr e His. Se describen los efectos positivos de la adición de los dipéptidos que contienen Tyr e His en el crecimiento y la formación del producto. Esto también incluye Tyr-Lys,
Aunque se mencionan diferentes dipéptidos en los documentos WO 2011/133902 y WO 2012/019160, solo se describe un efecto para los dipéptidos L-alanil-L-tirosina y L-alanil-L-cistina. Siendo la solubilidad de estos dipéptidos de alanilo de 8,7 g/l y 15,3 g/l respectivamente, es mayor que para los aminoácidos correspondientes (cistina: 0,1 g/l, tirosina: 0,4 g/l). Sin embargo, estos valores son bajos en comparación con otros aminoácidos, por lo que la aplicación en medios de alta concentración como los utilizados en el procedimiento de alimentación está limitada. Como desventaja adicional, cuando se usan dipéptidos de alanilo, se libera L-alanina, que no está contenida en medios de cultivo celular convencionales como, p. ej., DMEM y RPMI 1640 (Sigma) y que parece no ser requerida por las células. De hecho, cuando se usaba L-alanil-L-glutamina en lugar de L-glutamina en medios de cultivo celular, se encontraba una concentración cuatro veces mayor de alanina en el medio de cultivo celular (M. Christie, J. Butler, Biotechnol. 37 (1994) 277). Dado que las células tienden a acumular L-alanina como informaron DeBerardinis et al (2007, Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 19345-50), existe la necesidad de oligopéptidos biodisponibles sin alanina. Chalisova et al. (2015, Advances in Gerontology vol. 5, n° 3, páginas 180-183) describen dipéptidos que contienen Lys, que se usan en cultivo de tejidos, sin embargo, en concentraciones muy bajas de 0,001 a 1 ng/ml.
Los documentos EP 0220379 y DE3538310 describen el uso de dipéptidos y tripéptidos que contienen glutamina en medios de cultivo celular. La glutamina se añade en forma de dipéptidos, con el fin de evitar problemas derivados de la inestabilidad de la glutamina a temperaturas elevadas. Los dipéptidos que contienen glutamina se usan como fuente de glutamina insensible a la temperatura.
Mientras que los medios de cultivo de células descritos en la técnica anterior proporcionan rendimiento y propiedades satisfactorios para ciertos procedimientos de cultivo de células, los medios de cultivo de la técnica anterior todavía no son óptimos. Todavía existe la necesidad de medios de cultivo mejorados adicionales que promuevan un mejor crecimiento y formación de productos en los procedimientos de producción biotecnológicos.
En particular, hay una necesidad de medios de cultivo celular que comprendan oligopéptidos en concentraciones más altas, especialmente oligopéptidos hechos de aminoácidos contenidos en los medios convencionales, tales como p. ej. DMEM y RPMI-1640. Además, dichos oligopéptidos deberían ser fáciles de preparar sin la necesidad de utilizar grupos protectores específicos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Las deficiencias anteriores de medios de cultivo conocidos se abordan mediante la presente invención. La invención está definida por los términos de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas de la invención se definen por las reivindicaciones dependientes. Por lo tanto, la invención se refiere a un medio de cultivo, preferiblemente un medio de cultivo celular, que comprende al menos un dipéptido de 2 unidades de aminoácidos de longitud, siendo dichas unidades de aminoácidos, aminoácidos naturales y siendo al menos una unidad de aminoácidos lisina (Lys), en donde el oligopéptido no comprende glicina (Gly) y ácido glutámico (Glu), en donde el dipéptido es Lys-Xxx, en donde Xxx se selecciona de Cys, Cyss, Tyr, Val, Leu e Ile, y en donde dicho oligopéptido está presente en dicho medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 10 mM.
La invención se refiere además al uso de un medio de cultivo de la invención para el cultivo de células, preferiblemente células vegetales, células animales o células de mamífero.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de fabricación de un producto de cultivo celular que comprende las etapas de (i) proporcionar una célula capaz de producir dicho producto de cultivo celular; (ii) poner en contacto dicha célula con un medio de cultivo según la invención; y (iii) obtener dicho producto de cultivo celular a partir de dicho medio de cultivo o de dicha célula.
Las realizaciones preferidas de la invención se describen con más detalle en la siguiente descripción detallada de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 representa la densidad de células viables máxima con medio TC-42 obtenido con oligopéptidos según la invención.
La Figura 2 representa la densidad de células viables máxima con medio TC-42 obtenido con oligopéptidos según la invención.
La Figura 3 representa la densidad de células viables máxima con medio TC-42 obtenido con oligopéptidos según la invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Un "medio de cultivo", según la invención, se entenderá que es un medio líquido o sólido que contiene nutrientes, siendo el medio adecuado para nutrir y mantener la vida y/o la formación de producto de las células en el cultivo. Las células cultivadas, según la invención, pueden ser células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, células animales, tales como células de mamífero o células de insecto, y/o células vegetales, p. ej., algas. Típicamente, un medio de cultivo proporciona aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, al menos una fuente de energía, lípidos y oligoelementos, todos requeridos por la célula para mantener la vida, el crecimiento y/o la formación de producto. El medio de cultivo también puede contener componentes que mejoran el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa mínima, incluyendo hormonas y factores de crecimiento. El medio de cultivo tiene preferiblemente un pH y una concentración de sal que mantiene la vida, el crecimiento y/o la formación de productos de las células. Un medio de cultivo, según la invención, comprende preferiblemente todos los nutrientes necesarios para mantener la vida y la proliferación del cultivo celular. Los medios de cultivo preferidos son medios definidos.
Un "medio definido", según la invención es un medio que no contiene extractos celulares, hidrolizados de células, o hidrolizados de proteínas. Los medios definidos preferidos no comprenden componentes de composición desconocida. Como entiende habitualmente el experto en la técnica, los medios definidos normalmente carecen de componentes derivados de animales. Preferiblemente, todos los componentes de un medio definido tienen una estructura química conocida. Los medios definidos preferidos son medios sin suero. Otros medios definidos preferidos son medios sintéticos. Los medios de cultivo distintos de los medios de cultivo definidos se denominan medios de cultivo "complejos".
Un "medio de cultivo celular" se entenderá que es un medio de cultivo adecuado para mantener la vida, la proliferación y/o la formación de producto de células animales y/o células vegetales. En determinadas realizaciones, se puede distinguir entre un medio basal y un medio de alimentación.
Un "medio basal" se entenderá que es una solución o sustancia que contiene nutrientes en el que se inicia un cultivo de células. Un "medio de alimentación" se entenderá que es una solución o sustancia con la que se alimenta a las células tras el inicio del procedimiento de cultivo. En determinadas realizaciones, un medio de alimentación contiene uno o más componentes que no están presentes en un medio basal. El medio de alimentación también puede carecer de uno o más componentes presentes en un medio basal. Preferiblemente, la concentración de nutrientes en el medio de alimentación excede la concentración en el medio basal para evitar una pérdida de productividad por dilución.
Un "nutriente", según la presente invención, es un compuesto o sustancia química que necesitan las células para vivir y crecer. Preferiblemente, la célula absorbe el nutriente del entorno. Los nutrientes pueden ser "nutrientes orgánicos" y "nutrientes inorgánicos". Los nutrientes orgánicos incluyen carbohidratos, grasas, proteínas (o sus unidades estructurales, p. ej., aminoácidos) y vitaminas. Los nutrientes inorgánicos son compuestos inorgánicos tales como, p. ej., minerales dietéticos y oligoelementos. Los "nutrientes esenciales" son nutrientes que la célula no puede sintetizar por sí misma y que, por lo tanto, deben ser aportados a la célula por el medio de cultivo.
Un "producto de cultivo celular", según la invención, se entenderá que es cualquier compuesto biológico útil producido por las células en cultivo celular. Los productos de cultivo celular preferidos de la invención son proteínas terapéuticas, proteínas de diagnóstico, polisacáridos terapéuticos, tales como heparina, anticuerpos, p. ej., anticuerpos monoclonales, factores de crecimiento, interleuquina, hormonas peptídicas, enzimas y virus. En otras realizaciones, que incluyen pero no se limitan al cultivo de células madre para uso terapéutico, la propia célula debe entenderse como el producto de cultivo celular.
Un "aminoácido", en el contexto de la presente invención, se entenderá que es una molécula que comprende un grupo funcional amino (-NH2) y un grupo funcional ácido carboxílico (-COOH), junto con una cadena lateral específica del aminoácido respectivo. En el contexto de la presente invención, se incluyen aminoácidos tanto alfa como beta. Los aminoácidos preferidos de la invención son alfa-aminoácidos, en particular los 20 "aminoácidos naturales" que incluyen cistina como sigue (tabla 1):
Alanina (Ala/A)
Arginina (Arg/R)
Asparagina (Asn/N)
Ácido aspártico (Asp/D)
Cisteína (Cys/C)
Cistina (Cyss/C2) Ácido glutámico (Glu/E)
Glutamina (Gln/Q)
Glicina (Gly/G)
Histidina (His/H)
Isoleucina (Ile/l)
Leucina (Leu/L)
Lisina (Lys/K)
Metionina (Met/M)
Fenilalanina (Phe/F)
Prolina (Pro/P)
Serina (Ser/S)
Treonina (Thr/T)
Triptófano (Trp/W)
Tirosina (Tyr/Y)
Valina (Val/V)
En el contexto de estas invenciones, los péptidos de Cys que forman un enlace disulfuro, que contienen por lo tanto la cisteína, se describirán por X2-Cyss.
En el contexto de la presente invención, la expresión "aminoácidos naturales" se entenderá que incluye tanto la forma L como la forma D de los 20 amino ácidos citados anteriores. Sin embargo, se prefiere la forma L. En una realización, el término "aminoácido" también incluye análogos o derivados de esos aminoácidos.
Un "amino ácido libre", según la invención, se entiende que es un aminoácido que tiene su extremo amino y su grupo funcional (alfa-) carboxílico en forma libre, es decir, no unidos covalentemente a otras moléculas, p. ej., una aminoácido que no forma un enlace peptídico. Los aminoácidos libres también pueden estar presentes como sales o en forma de hidrato. Cuando se hace referencia a un aminoácido como parte de o en un oligopéptido, se entenderá que se refiere a la parte respectiva de la estructura de oligopéptido derivada del respectivo aminoácido, según los mecanismos conocidos de bioquímica y biosíntesis de péptidos.
Un "factor de crecimiento", según la invención, se entenderá que es cualquier sustancia de origen natural capaz de estimular el crecimiento celular, proliferación y diferenciación celular. Los factores de crecimiento preferidos están en forma de proteína u hormona esteroidea. Según una realización de la invención, la expresión "factor de crecimiento" se interpretará como que se refiere a un factor de crecimiento seleccionado de la lista que consiste en factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), que incluye FGF ácido y FGF básico, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento transformante (TGF), incluyendo TGFafa y TGFbeta, citoquinas, tales como interleuquinas 1,2, 6, factor estimulador de granulocitos y factor inhibidor de leucocitos (LIF).
Un "oligopéptido", como se describe en el presente documento se entenderá que es un compuesto peptídico que consiste en 2 a 20 aminoácidos. Los oligopéptidos más preferidos son oligopéptidos que consisten en 2-10 aminoácidos, 2-6 aminoácidos, 2-5 aminoácidos, 2-4 aminoácidos o 2-3 aminoácidos. Los oligopéptidos según la invención son dipéptidos.
Un "péptido" se entenderá que es una molécula que comprende al menos dos amino ácidos acoplados covalentemente entre sí por un enlace peptídico (R1-CO-NH-R2).
La expresión "Xxx", cuando se usa en el presente documento en conexión con un aminoácido, se entenderá que se refiere a cualquier aminoácido natural mencionado en lo que antecede.
La expresión "N-acilado", con referencia a un compuesto químico, tal como un aminoácido, se entenderá que significa que el compuesto N-acilado está modificado por la adición de un grupo acilo a un grupo funcional nitrógeno de dicho compuesto. Preferiblemente, el grupo acilo se añade al grupo alfa-amino del aminoácido.
Una "forma estéril" de una composición de nutrientes, medio de cultivo, medio de cultivo celular, o similar, se entenderá que define la ausencia de cualquier materia viva en dicha composición, medio de cultivo, medio de cultivo celular o similar.
Un "medio de cultivo sólido", en el contexto de la presente invención, se entenderá que es cualquier medio de cultivo no líquido o no gaseoso. Los medios de cultivo sólidos preferidos de la invención son medios de cultivo de tipo gel, tales como agar-agar, carragenina o gelatina.
"Pases de células" (también conocido como subcultivo o división de células), en el contexto de la presente invención, se entiende que significa la transferencia de un pequeño número de células a un nuevo recipiente de cultivo. Las células se pueden cultivar durante más tiempo si se dividen con regularidad, ya que evita la senescencia asociada con una densidad celular alta prolongada. Los cultivos en suspensión se pasan fácilmente con una pequeña cantidad de cultivo que contiene algunas células diluidas en un volumen mayor de medio nuevo.
La presente invención se refiere en general a un medio de cultivo, preferiblemente un medio de cultivo celular, comprendiendo dicho medio de cultivo al menos un dipéptido de 2 aminoácidos de longitud, siendo dichos aminoácidos, aminoácidos naturales, y siendo al menos una unidad de aminoácido lisina (Lys), en donde el oligopéptido no comprende glicina (Gly) y ácido glutámico (Glu), en donde el dipéptido es Lys-Xxx, en donde Xxx se selecciona de Cys, Cyss, Tyr, Val, Leu e Ile, y en donde dicho oligopéptido está presente en dicho medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 10 mM. El uso de lisina evita la acumulación de aminoácidos antieconómicos tales como la alanina, que es un constituyente clave de la mayoría de los péptidos disponibles en el mercado para aplicaciones de cultivo celular.
El dipéptido Tyr-Lys preferiblemente está excluido.
Según la presente invención, el o el aminoácido N-terminal es una unidad de lisina. Debe indicarse que la secuencia C- y N-terminal puede tener una influencia en el cultivo celular como se pone de manifiesto por el número CAS diferente.
Sorprendentemente, se encontró que los péptidos de lisina tienen una solubilidad más alta de lo que se esperaría basándose en los datos publicados (calculado usando el Scifinder y el Software Advanced Chemistry Development (ACD/Labs) V11.02 (© 1994-2016 ACD/Labs). Para el hidrocloruro de bis-L-lisil-L-cistina, se encontró una solubilidad de >50% (p/p), lo cual excede considerablemente la solubilidad calculada de 4,2% (p/p).
En la tabla 1 se resumen las solubilidades de diferentes aminoácidos y dipéptidos. También se encontró que las realizaciones preferidas de los péptidos de lisina permiten además que las células crezcan, a diferencia de otros péptidos de lisina que no conducen al crecimiento celular. Esto es sorprendente ya que A. Nagamatsu y T. Hayashida (Chemical & Pharmaceutical Bulletin 22, 2680 (1974)) han analizado la hidrólisis de Lys-Leu, Lys-Tyr y Lys-Lys con plasmina y tripsina y han encontrado que ninguno de estos péptidos era escindido. Al combinar una alta solubilidad con biodisponibilidad, los péptidos de lisina ofrecen nuevas formas de resolver el problema de preparar medios de cultivo celular y alimentos con altas concentraciones de aminoácidos.
Tabla 1: Solubilidades de aminoácidos y dipéptidos (g/1000 g de solución)
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Según la presente invención el oligopéptido es un dipéptido.
Los presentes autores de la invención encontraron que los medios de cultivo de este tipo tienen propiedades superiores frente a los medios de cultivo celular de la técnica anterior.
Los dipéptidos Lys-Xxx se pueden sintetizar por acoplamiento simplemente de una lisina doblemente N-protegida con uno o más aminoácidos. Esto es significativamente más fácil de hacer que la síntesis de la secuencia inversa Xxx-Lys, para cuya síntesis no sólo es necesario un aminoácido Xxx N-protegido, sino también una lisina e-protegida selectivamente. Los derivados comunes de lisina para la síntesis de los dipéptidos Lys-Xxx son, por ejemplo, bis-N,N-carboxibencil-L-lisina (Z-Lys(Z)-OH) y bis-N,N-terc-butiloxicarbonil-L-lisina (Boc-Lys(Boc)-OH).
En el intervalo de pH, en el que se usan los medios de cultivo celular (normalmente pH 7,2 - 7,4), los dipéptidos de lisilo están en la forma de sus sales que resultan de la protonación de uno de los grupos amino. Para la formación de sales se pueden usar todos los ácidos que sean compatibles con el cultivo celular. Las sales más comunes son cloruro, sulfato, nitrato, fosfato y carbonato. Sin embargo, también se pueden usar ácidos orgánicos como, por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico, ácido glutámico o ácido aspártico.
Los dipéptidos de lisilo se disuelven en agua significativamente más fácilmente que los correspondientes dipéptidos de alanilo.
Según la presente invención, el oligopéptido es Lys-Xxx, en donde Xxx es cualquier aminoácido natural como se define en lo que antecede, con exclusión de Gly.
En una realización, un aminoácido con una baja solubilidad, incluyendo, pero no limitado a Tyr, Cys, Leu, Ile, Val, se sustituye total o parcialmente por un péptido Lys-Xxx. Al mismo tiempo, la cantidad de lisina (ya sea en forma de sal o sin sal) se reduce en la misma cantidad. Debido a la alta demanda de lisina de la célula, la sustitución del aminoácido con una baja solubilidad por el péptido de Lys Lys-Xxx se puede realizar sin exceder la cantidad de lisina en la formulación original.
En realizaciones preferidas, el oligopéptido no está N-acilado. Se sabe que la N-acilación mejora la estabilidad térmica de ciertos oligopéptidos; sin embargo, se ha encontrado que los oligopéptidos N-acilados también pueden conducir a una menor densidad de células viables y viabilidad.
En una realización, el medio de cultivo comprende además al menos un carbohidrato, al menos un aminoácido libre, al menos una sal inorgánica, un agente de tamponamiento y/o al menos una vitamina. En una realización particularmente preferida, el medio de cultivo comprende todos de al menos un carbohidrato, al menos un aminoácido libre, al menos una sal inorgánica, un agente de tamponamiento y al menos una vitamina.
En una realización de la invención, el medio de cultivo no contiene un factor de crecimiento. Según esta realización, el oligopéptido de la invención se puede usar en lugar de un factor de crecimiento para promover el crecimiento y/o la proliferación de las células en cultivo. En otra realización de la invención, el medio de cultivo no contiene ningún lípido.
Según otra realización de la invención, el medio de cultivo está en forma líquida, en forma de un gel, un polvo, un granulado, un pelet o en forma de un comprimido.
En realizaciones preferidas, el medio de cultivo de la invención es un medio definido o un medio sin suero. Por ejemplo, los oligopéptidos de la invención se pueden suplementar al medio CHOMACS CD de Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemania), al medio PowerCHO-2 CD disponible de LONZA (Basilea, Suiza), al medio Acti-CHO P de PAA (PAA Laboratories, Pasching, Austria), al medio Ex-Cell CD CHO disponible de Sa FC, al medio SFM4CHO y al medio CDM4CHO de ThermoFisher (Waltham, EE. UU.). Los oligopéptidos de la invención también se pueden suplementar al medio DMEM (Life Technologies Corp., Carlsbad, EE. UU.). Sin embargo, la invención no se limita a la suplementación de los medios anteriores.
En otras realizaciones preferidas, el medio de cultivo es un medio líquido en forma 2 veces, 3 veces, 3,33 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces concentrada (volumen/volumen), con respecto a la concentración de dicho medio en uso. Esto permite la preparación de un medio de cultivo "listo para usar" por simple dilución del medio concentrado con el respectivo volumen de agua estéril. Dichas formas concentradas del medio de la invención también se pueden usar por adición de las mismas a un cultivo, p. ej., en un procedimiento de cultivo discontinuo alimentado.
Los medios de cultivo de la presente invención contienen preferiblemente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento sostenido y la formación de productos. Las recetas para preparar medios de cultivo, en particular medios de cultivo celular, son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Óztürk y Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006). Varios medios de cultivo están disponibles comercialmente de diversas fuentes.
Los medios de cultivo de la invención incluyen preferiblemente una fuente de carbohidratos. El principal carbohidrato usado en los medios de cultivo celular es la glucosa, suplementada de forma rutinaria de 5 a 25 nM. Además, se puede usar cualquier hexosa, tal como galactosa, fructosa o manosa o una combinación.
El medio de cultivo típicamente también incluye al menos los aminoácidos esenciales (es decir, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Probar, Val), así como ciertos aminoácidos no esenciales. Se incluye típicamente un aminoácido no esencial en el medio de cultivo celular si la línea celular no es capaz de sintetizar el aminoácido o si la línea celular no puede producir cantidades suficientes del aminoácido para mantener el crecimiento máximo. Además, las células de mamíferos también pueden usar glutamina como una fuente de energía principal. La glutamina a menudo se incluye en concentraciones más altas que otros aminoácidos (2-8 mM). Sin embargo, como se ha indicado antes, la glutamina se puede descomponer espontáneamente para formar amoniaco y ciertas líneas celulares producen amoniaco más rápido, que es tóxico.
Los medios de cultivo de la invención comprenden preferiblemente sales. Las sales se añaden al medio de cultivo celular para mantener condiciones isotónicas y prevenir los desequilibrios osmóticos. La osmolalidad de un medio de cultivo de la invención es de aproximadamente 300 mOsm/kg, aunque muchas líneas celulares pueden tolerar una variación de aproximadamente 10 por ciento de este valor o superior. La osmolalidad de algunos cultivos de células de insectos tiende a ser mayores que 300 mOsm/kg, y esta puede ser 0,5 por ciento, 1 por ciento, de 2 a 5 por ciento, 5-10 por ciento, 10-15 por ciento, 15-20 por ciento, 20-25 por ciento, 25-30 por ciento mayor que 300 mOsm/kg. Las sales más comúnmente usadas en el medio de cultivo celular incluyen Na+ , K+, Mg2+, Ca2+, Cl, SO42-, PO43- y HCO3-(p. ej., CaCl2 , KCI, NaCl, NaHCO3 , Na2HPO4).
Otros elementos inorgánicos pueden estar presentes en el medio de cultivo. Incluyen Mn, Cu, Zn, Mo, Va, Se, Fe, Ca, Mg, Si y Ni. Muchos de estos elementos están implicados en la actividad enzimática. Se pueden proporcionar en forma de sales tales como CaCl2 , Fe(NO3)3 , MgCl2 , MgSO4 , MnCl2 , NaCl, NaHCO3 , Na2HPO4 , e iones de los oligoelementos, tales como selenio, vanadio y zinc. Estas sales inorgánicas y oligoelementos se pueden obtener en el mercado, por ejemplo, de Sigma (Saint Louis, Missouri).
Los medios de cultivo de la invención comprenden preferiblemente vitaminas. Las células usan típicamente las vitaminas como cofactores. Los requisitos de vitaminas de cada línea celular varían mucho, aunque generalmente se necesitan vitaminas adicionales si el medio de cultivo celular contiene poco o no contiene suero o si las células crecen con alta densidad. Las vitaminas de ejemplo presentes preferiblemente en los medios de cultivo de la invención incluyen biotina, cloruro de colina, ácido fólico, i-inositol, nicotinamida, D-pantotenato de Ca++, piridoxal, riboflavina, tiamina, piridoxina, niacinamida, A, B6 , B12, C, D3 , E, K y ácido p-aminobenzoico (PABA).
Los medios de cultivo de la invención también pueden comprender suero. El suero es el líquido sobrenadante de la sangre coagulada. Los componentes del suero incluyen factores de unión, micronutrientes (p. ej., oligoelementos), factores de crecimiento (p. ej., hormonas, proteasas) y elementos protectores (p. ej., antitoxinas, antioxidantes, antiproteasas). El suero está disponible de una variedad de fuentes animales que incluyen suero humano, bovino o equino. Cuando se incluye en el medio de cultivo celular según la invención, el suero se añade típicamente en una concentración de 5-10% (en vol.). Los medios de cultivo celular preferidos están exentos de suero.
Para promover el crecimiento celular en ausencia o suero o en medio reducido en suero, se puede añadir uno o más de los siguientes polipéptidos a un medio de cultivo celular de la invención: por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), que incluye FGF ácido y FGF básico, insulina, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento epitelial (EGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor de crecimiento transformante (TGF), que incluye TGFalfa y TGFbeta, cualquier citoquina, tal como interleuquinas 1, 2, 6, factor estimulador de granulocitos, factor inhibidor de leucocitos (LIF), etc.
Sin embargo, el medio de cultivo de la invención también puede no incluir ninguno de los factores de crecimiento mencionados anteriormente. Según este aspecto de la invención, el oligopéptido de la invención se usa en lugar de cualquier factor de crecimiento para promover la proliferación de las células. En otras palabras, según este aspecto de la invención, la presencia del oligopéptido de la invención hace prescindible la presencia de un factor de crecimiento.
En otras realizaciones, el medio de cultivo celular no comprende polipéptidos (es decir, péptidos con más de 20 aminoácidos).
También se pueden añadir uno o más lípidos a un medio de cultivo celular de la invención, tales como ácido linoleico, ácido linolénico, ácido araquidónico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido polienóico y/o ácidos grasos de 12, 14, 16, 18, 20 o 24 átomos de carbono, cada átomo de carbono ramificado o no ramificado), fosfolípidos, lecitina (fosfatidilcolina) y colesterol. Uno o más de estos lípidos se pueden incluir como suplementos en medios sin suero. El ácido fosfatídico y el ácido lisofosfatídico estimulan el crecimiento de ciertas células dependientes del anclaje, tales como MDCK, epitelio de ratón y otras líneas celulares de riñón, mientras que la fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilinositol estimulan el crecimiento de fibroblastos humanos en medios sin suero. También se ha demostrado que la etanolamina y el colesterol promueven el crecimiento de ciertas líneas celulares. En cierta forma de realización, el medio de cultivo celular no contiene un lípido.
También se pueden añadir una o más proteínas transportadoras, tales como albúmina de suero bovino (BSA) o transferrina, al medio de cultivo celular. Las proteínas transportadoras pueden ayudar en el transporte de ciertos nutrientes u oligoelementos. La BSA se usa típicamente como transportador de lípidos, tales como los ácidos linoleico y oleico, que son insolubles en solución acuosa. Además, la BSA también puede servir como transportador para ciertos metales, tales como Fe, Cu y Ni. En formulaciones sin proteínas, se pueden usar como transportadores lipídicos sustitutos de la BSA que no sean de origen animal, tales como ciclodextrina.
También se pueden añadir una o más proteínas de unión, tales como fibronectina, laminina y pronectina, a un medio de cultivo celular para ayudar a promover la unión de las células dependientes de anclaje a un sustrato.
El medio de cultivo celular puede incluir opcionalmente uno o más agentes de tamponamiento. Los agentes de tamponamiento adecuados incluyen, pero no se limitan a N-[2-hidroxietil]-piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES), MOPS, MES, fosfato, bicarbonato y otros agentes de tamponamiento adecuados para usar en aplicaciones de cultivo celular. Un agente de tamponamiento adecuado es uno que proporciona capacidad de tamponamiento sin citotoxicidad sustancial para las células cultivadas. La selección de agentes de tamponamiento adecuados está dentro del ámbito de los expertos en la técnica del cultivo celular.
Se pueden añadir compuestos polianiónicos o policatiónicos al medio de cultivo para prevenir que las células se aglomeren y para promover el crecimiento de las células en suspensión.
En una realización preferida, el medio de cultivo está en forma líquida. Sin embargo, el medio de cultivo también puede ser un medio sólido, tal como un medio de tipo gel, p. ej., un medio que contiene agar-agar, carragenina o gelatina.
Preferiblemente, el medio de cultivo está en forma estéril.
En realizaciones preferidas de la invención, el oligopéptido que contiene Lys está presente en dicho medio de cultivo en una concentración de 0,01 a 20 g/l, o de 0,1 a 10 g/l, o de 0,5 a 5 g/l. En otras realizaciones preferidas de la invención, el oligopéptido que contiene Lys está presente en una concentración superior a 0,01,0,02, 0,04, 0,08, 0,2, 0. 4 o 1 mM. También se prefieren los medios de cultivo en los que el oligopéptido que contiene Lys está presente en una concentración de menos de 50, 20, 10, 5 o 2 mM. Preferiblemente, el oligopéptido que contiene Lys está presente en el medio en una concentración de 0,01 mM a 40 mM, o de 0,1 mM a 20 mM, o de 0,1 mM a 10 mM, o de 0,5 mM a 10 mM, o de 1 mM a 10 mM, o de 1 mM a 8 mM, o de 1 mM a 6 mM.
Las concentraciones anteriores se dan como concentraciones en el medio no concentrado, es decir, la concentración como está presente en el cultivo real. Los medios concentrados pueden incluir concentraciones X veces más altas.
En ciertas realizaciones, el medio de cultivo celular de la invención comprende tanto oligopéptidos que contienen Lys como exentos de Lys. En una realización preferida, el oligopéptido que contiene Lys se añade a un medio de cultivo disponible en el mercado, p. ej., a un medio de cultivo celular definido o a un medio de cultivo celular complejo.
El medio de cultivo de la presente invención puede estar en forma concentrada. Puede estar, p. ej., en forma 2 veces, 3 veces, 3,33 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces concentrada (con respecto a una concentración que mantiene el crecimiento y la formación de productos de las células). Dichos medios de cultivo concentrados son útiles para preparar el medio de cultivo para usar por dilución del medio de cultivo concentrado con un disolvente acuoso, tal como agua. Dichos medios de cultivo concentrados se pueden usar en cultivos discontinuos, pero también se usan ventajosamente en cultivos continuos o discontinuos alimentados, en los que se añade una composición de nutrientes concentrada a un cultivo de células en curso, p. ej., para reponer los nutrientes consumidos por las células durante el cultivo.
En otras realizaciones de la invención, el medio de cultivo está en forma seca, p. ej., en forma de un polvo seco, o en forma de gránulos, o en forma de pellets, o en forma de comprimidos.
La presente invención también se refiere al uso de un medio de cultivo de la invención para el cultivo de células. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un medio de cultivo de la invención para producir un producto de cultivo celular.
Una realización preferida de la invención se refiere al uso de un medio de cultivo según la invención para cultivar células animales o células vegetales, más preferido células de mamífero. En realizaciones específicas, las células que se van a cultivar son células CHO, células COS, células VERO, células BHK, células HEK, células HELA, células AE-1, células de insecto, células fibroblastos, células musculares, células nerviosas, células madre, células de piel, células endoteliales y células de hibridoma. Las células preferidas de la invención son células CHO y células de hibridoma. Las células más preferidas de la invención son células CHO. Las células CHO particularmente preferidas de la invención son células CHO DG44 y CHO DP12.
También se incluye en el alcance de la presente invención un método de cultivo de células, comprendiendo dicho método poner en contacto dichas células con un medio de cultivo celular según la invención. En una realización de la invención, el método de cultivo de células comprende poner en contacto la célula con un medio de cultivo basal en condiciones que mantienen el cultivo de la célula y complementar el medio de cultivo de células basales con un medio concentrado según la presente invención. En realizaciones preferidas, el medio de cultivo basal se suplementa con el alimento o medio concentrado durante más de un día.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir un medio de cultivo según la invención, en donde dicho medio de cultivo comprende al menos un oligopéptido según la invención. Los métodos para producir un medio de cultivo según la invención comprenden al menos una etapa de añadir un oligopéptido de la invención al medio de cultivo. Asimismo, un aspecto de la invención se refiere al uso de un oligopéptido que contiene Lys de la invención para producir un medio de cultivo celular.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de modificación de un medio de cultivo, en donde dicha modificación de dicho medio de cultivo comprende la adición de al menos un oligopéptido de la invención a dicho medio de cultivo.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de producción de un medio de cultivo líquido, comprendiendo dicho método proporcionar medio sólido según la invención, p. ej., en forma de un polvo seco, o en forma de gránulos, o en forma de pellets, o en forma de comprimidos; y disolver dicho medio de cultivo sólido en un medio acuoso, tal como agua.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un oligopéptido según la invención en un medio de cultivo para el cultivo de células. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un oligopéptido según la invención para el cultivo de células.
La invención también se refiere a métodos de fabricación de un producto de cultivo celular que comprenden las etapas de (i) proporcionar una célula capaz de producir dicho producto de cultivo celular; (ii) poner en contacto dicha célula con un medio de cultivo de la invención; y (iii) obtener dicho producto de cultivo celular a partir de dicho medio de cultivo o de dicha célula. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de un oligopéptido según la invención para la fabricación de un producto de cultivo celular.
En procedimientos preferidos, el producto de cultivo celular es una proteína terapéutica, una proteína de diagnóstico, un polisacárido, tal como heparina, un anticuerpo, un anticuerpo monoclonal, un factor de crecimiento, una interleuquina, virus, partícula similar a virus o una enzima.
El cultivo de células, según la invención, se puede realizar en cultivo discontinuo, en cultivo discontinuo alimentado o en cultivo continuo.
EJEMPLOS
Procedimiento general
Se investigó la influencia de los dipéptidos de L-lisina en el crecimiento de células de ovario de hámster chino (CHO) productoras de anticuerpos (subclón DG44; Life Technologies Coopera, Carslbad, EE. UU.) en comparación con medios que contienen o bien los correspondientes aminoácidos libres o los correspondientes dipéptidos de L-alanina. Para este propósito, las células se cultivaron en un medio TC-42 producido por Xell AG, Bielefeld, Alemania, en el que faltaban los aminoácidos proporcionados en los experimentos por dipéptidos. Las concentraciones de estos aminoácidos se ajustaron de tal manera que, teniendo en cuenta una hidrólisis completa de los dipéptidos en los aminoácidos, la concentración de todos los aminoácidos era la misma en todos los medios ensayados en este experimento.
Partiendo de un cultivo preparatorio se ajustó una densidad de células viables (VCD) inicial de 0,3-106 células/ml en matraces con agitación añadiendo el medio de ensayo. Después de 2-4 días, una parte del cultivo celular se transfirió a un nuevo matraz de agitación y se ajustó una densidad de células viables (VCD) inicial de 0.3-106 células/ml añadiendo nuevos medios de ensayo. Esto se hizo dos veces y después le siguió al crecimiento celular la medición de la densidad de células viables (VCD) durante hasta 24 días.
Experimento 1: Comparación de los crecimientos celulares obtenidos con medios TC-42 en los que la L-cisteína/L-cistina se sustituye por bis-L-alanil-L-cistina, bis-L-prolil-L-cistina o bis-L-lisil-L-cistina y la L-leucina se sustituye por L-lisil-L-leucina
Para este experimento un medio TC-42 producido por Xell AG, Bielefeld, Alemania, en el que se dejaron deliberadamente fuera de la formulación inicial la L-alanina, L-lisina, L-prolina, L-cisteína, L-cistina y L-leucina. Después, se añadieron estos aminoácidos y los dipéptidos bis-L-alanil-L-cistina, bis-L-prolil-L-cistina, tetrahidrocloruro de bis-L-lisil-L-cistina y L-lisil-L-leucina, respectivamente, al medio de ensayo en la concentración indicada en la tabla 2.
Figure imgf000011_0001
Las densidades de células viables (VCD) obtenidas con los medios de la tabla 2 a diferentes tiempos se dan en la tabla 3.
Tabla 3: Densidades de células viables (VCD) y densidades celulares máximas (VCD máx.)
obtenidas con los medios dados en la tabla 2.
Figure imgf000012_0001
Experimento 2: Comparación de los crecimientos celulares obtenidos con medios TC-42 en los que la L-tirosina se sustituye por L-alanil-L-tirosina o L-lisil-L-tirosina
Para este experimento se usó un medio TC-42 producido por Xell AG, Bielefeld, Alemania, en el que estaban ausentes la L-alanina, L-lisina y L-tirosina. Después, se añadieron estos aminoácidos y los dipéptidos L-alanil-L-tirosina dihidrato y acetato de L-lisil-L-tirosina, respectivamente, al medio de ensayo en la concentración indicada en la tabla 4.
Tabla 4: Concentración de aminoácidos y dipéptidos usados en los medios de ensayo del experimento 2.
Figure imgf000013_0001
Las densidades de células viables (VCD) obtenidas con los medios de la tabla 4 a diferentes tiempos se dan en la tabla 5.
Tabla 5: Densidades de células viables (VCD) y densidades celulares máximas (VCD máx.)
obtenidas con los medios dados en la tabla 4.
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000014_0001
Experimento 3: Comparación de los crecimientos celulares obtenidos con medios TC-42 en los que la L-valina y L-isoleucina, respectivamente, se sustituyen por L-lisil-L-valina o L-lisil-L-isoleucina, respectivamente. Para este experimento se usó un medio TC-42 producido por Xell AG, Bielefeld, Alemania, en el que estaban ausentes la L-lisina, L-valina y L-isoleucina. Después, se añadieron estos aminoácidos y los dipéptidos L-lisil-L-valina y L-lisil-L-isoleucina, respectivamente, al medio de ensayo en la concentración indicada en la tabla 6.
Tabla 6: Concentración de aminoácidos y dipéptidos usados en los medios de ensayo del experimento 3.
Figure imgf000014_0002
Las densidades de células viables (VCD) obtenidas con los medios de la tabla 6 a diferentes tiempos se dan en la tabla 7.
Tabla 7: Densidades de células viables (VCD) y densidades celulares máximas (VCD máx.)
obtenidas con los medios dados en la tabla 6.
Figure imgf000014_0003
Figure imgf000015_0001
La comparación de un medio de referencia con otros medios que contienen la misma cantidad molar de cisteína y cistina en forma de dipéptidos mostraron que la bis-lisil-L-cisteína conducía a un rendimiento comparable al de la bisalanil-L-cistina (fig .1). En ambos casos, las células pudieron usar los péptidos para el crecimiento. En las mismas condiciones, casi no se puede observar crecimiento con la bis-proli-cistina, lo que sugiere que las células no pueden usar este dipéptido. Esto muestra que la bis-lisil-L-cisteína se puede usar como sustitución de los aminoácidos libres. En comparación con la bis-alanil-L-cistina, la bis-lisil-L-cisteína combina una solubilidad sorprendentemente alta (tabla 1) con biodisponibilidad.
En una segunda serie de ensayos se compararon medios que contenían los dipéptidos L-alanil-L-tirosina y L-lisil-L-tirosina con el medio de referencia que contiene cantidades equimolares de tirosina. Como se puede ver en la fig. 2, las curvas de crecimiento de los diferentes medios no muestran diferencias significativas. En cuanto a la densidad celular máxima, ambos dipéptidos parecen producir incluso valores ligeramente superiores. Esto muestra que la L-lisil-L-tirosina se puede usar como sustitución de los aminoácidos libres. En comparación con la L-alanil-L-tirosina previamente descrita, la lisil-L-tirosina combina una solubilidad sorprendentemente alta (tabla 1) con biodisponibilidad.
En una serie de ensayos adicionales, se compararon medios que contienen L-lisil-L-valina y L-lisil-L-isoleucina con un medio de referencia que contiene L-lisina o L-valina en cantidades equimolares. Mientras que la L-lisil-L-valina producía una curva de crecimiento y una densidad celular máxima casi igual a la del medio de referencia, la L-lisil-L-isoleucina generaba un crecimiento más lento y una densidad celular máxima más baja (fig. 3). En ambos casos, los aminoácidos libres podrían ser sustituidos por péptidos de lisilo.
Los ensayos comparativos muestran claramente que los dipéptidos de lisilo de cistina y tirosina son un sustituto adecuado para los aminoácidos de baja solubilidad. La explotación de los dipéptidos de lisilo es al menos tan buena como la de los dipéptidos de L-alanilo usados comercialmente. El uso de dipéptidos de lisilo no da como resultado un aumento indeseable de un aminoácido en el medio, ya que la lisina, que es liberada de los dipéptidos de lisilo, está presente en los cultivos celulares habituales en concentraciones considerablemente más altas que la alanina.
Como los dipéptidos de lisilo presentan una solubilidad considerablemente mayor, se pueden disolver mucho más fácil y más rápido que los aminoácidos o dipéptidos de alanilo y su aplicación parece beneficiosa en medios de cultivo deshidratados que se preparan poco antes del uso.
Su mayor solubilidad también facilita la producción de concentraciones que se pueden diluir a la concentración deseada antes de usar. En particular, los dipéptidos de lisilo permiten concentraciones más altas y, por tanto, factores de concentración más altos que los aminoácidos libres o los dipéptidos de alanilo, que se han usado hasta la fecha. Los cultivos celulares a gran escala, como se usan, por ejemplo, en la producción de proteínas farmacológicas, a menudo se cultivan durante varias semanas. Durante este periodo, los nutrientes gastados se reemplazan con frecuencia. Para evitar aumentar el volumen del medio tanto como sea posible, se usan medios de alimentación altamente dosificados. Dichos medios de alimentación pueden contener nutrientes en concentraciones de un factor de 5 a 1000 mayor que las de los medios de trabajo. Por esto los dipéptidos de lisilo son particularmente adecuados.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un medio de cultivo, tal como un medio de cultivo celular, que comprende al menos un dipéptido de 2 aminoácidos de longitud, siendo dichos aminoácidos, aminoácidos naturales y siendo uno de dichos aminoácidos lisina (Lys), en donde el dipéptido no comprende glicina (Gly) y
ácido glutámico (Glu),
en donde el dipéptido es Lys-Xxx,
en donde Xxx se selecciona de Cys, Cyss, Tyr, Val, Leu e Ile y
en donde dicho dipéptido está presente en dicho medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 10 mM.
2. El medio de cultivo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la relación entre lisina y otros aminoácidos es 0,5.
3. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo además dicho medio de cultivo al menos un carbohidrato, al menos un aminoácido libre, al menos una sal inorgánica, un agente de tamponamiento y/o al menos una vitamina.
4. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho medio no contiene un factor de crecimiento.
5. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho medio de cultivo está en forma líquida, en forma de un gel, un polvo, un granulado, un pellet o un comprimido.
6. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho medio de cultivo celular es un medio sin suero o un medio definido.
7. El medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho medio de cultivo está en forma 2 veces, 3 veces, 3,33 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces concentrada, con respecto a la concentración de dicho medio en uso.
8. Uso de un medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, para cultivar células.
9. Uso de la reivindicación 8, en donde dichas células son células animales o células vegetales, preferiblemente células de mamífero.
10. Uso de la reivindicación 9, en donde dichas células se seleccionan de la lista que consiste en células CHO, células COS, células VERO, células BHK, células HEK, células HELA, células AE-1, células de insectos, células fibroblastos, células musculares, células nerviosas, células madre, células de la piel, células endoteliales y células de hibridoma.
11. Uso de un dipéptido de 2 aminoácidos de longitud, siendo dichos aminoácidos, aminoácidos naturales y siendo un aminoácido Lys, y no comprendiendo dicho dipéptido Gly, Glu, Asn, Ala y
Gln, en donde el dipéptido es Lys-Xxx,
en donde Xxx se selecciona de Cys, Cyss, Tyr, Val, Leu e Ile y
en donde dicho dipéptido está presente en dicho medio de cultivo en una concentración de 0,1 a 10 mM, en un medio de cultivo para cultivar células.
12. Método de fabricación de un producto de cultivo celular que comprende las etapas de
proporcionar una célula capaz de producir dicho producto de cultivo celular;
poner en contacto dicha célula con un medio de cultivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y obtener dicho producto de cultivo celular a partir de dicho medio de cultivo o de dicha célula.
13. Método de la reivindicación 12, en donde dicho producto de cultivo celular se selecciona del grupo que consiste en proteína terapéutica, proteína de diagnóstico, polisacárido, tal como heparina, anticuerpo, anticuerpo monoclonal, factor de crecimiento, interleuquina, virus, partícula similar a virus y enzima.
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