CN118055938A - 二肽盐及其在细胞培养中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及二肽盐及其在细胞培养中的用途。本发明进一步涉及培养基和本发明的培养基用于培养细胞的用途，优选用于培养植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途，以及制造细胞培养产品的方法。

Description

二肽盐及其在细胞培养中的用途
发明领域
本发明涉及二肽盐及其在细胞培养中的用途。此外，本发明涉及生物技术生产方法。更具体地说，本发明涉及用于生物技术生产方法的改进的培养基、使用这种改进的培养基的方法，以及从使用所述改进的培养基的方法中获得的产品。
发明背景
化学成分确定的二肽是细胞培养基配方中广泛使用的高可溶性和稳定的氨基酸前体。为了增加某些限制性氨基酸如L-酪氨酸或L-胱氨酸的溶解度，高可溶性氨基酸如甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸和L-赖氨酸可以被偶联形成二肽，这导致那些限制性氨基酸的高可溶性天然二肽前体。例如，WO 2011/133902公开了包含二肽的细胞培养基，其中所述二肽包括在水中具有低溶解度的氨基酸，在这种情况下是酪氨酸和半胱氨酸。作者发现，通过在二肽中掺入酪氨酸和半胱氨酸，可以改善氨基酸的溶解度和稳定性问题。更高的稳定性和溶解度使得能够配制化学成分确定的高浓度培养基，这是运行强化和高产的工业细胞培养方法所必需的。
WO 2012/019160公开了动物细胞培养物，其中在生产阶段，用含Tyr和His的二肽补充无血清培养基。描述了添加含Tyr和His的二肽对生长和产物形成的积极作用。
由于其在中性pH下的高溶解度，L-赖氨酸特别适合作为二肽形成的伴侣，以提高低溶解度氨基酸的溶解度。这一见解已被用于合成高可溶性形式的L-胱氨酸、L-酪氨酸和支链氨基酸L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸。EP3372671公开了含有Lys的二肽，其比赖氨酸残基被L-丙氨酸或L-甘氨酸取代的肽具有显著增加的溶解度。这些肽对细胞的生长和活力具有有益的作用。
然而，除了以二肽的形式提供高可溶性营养素外，还需要以高度生物相容性和稳定的形式提供这些营养素。高度生物相容的形式能够提供高浓度的这些营养素，以解决代谢或生物加工的限制。稳定性需要足以防止在液体或干粉培养基和补充剂中在较长时间内降解。也需要足够的稳定性从而以干燥形式运输和储存单个成分，最好是在环境温度下。特别是在进料培养基中，营养素以较高浓度存在。此外，储存培养基还应含有较高浓度的可溶性营养素，因为这些培养基被稀释以用于细胞培养的最终应用。这些问题没有得到充分解决，仍然需要改进这些参数。
发明概述
本发明解决了上述缺点。本发明由所附独立权利要求的术语限定。本发明的优选实施方案由从属权利要求限定。
令人惊奇的是，发现这些参数可以通过制备和使用含有碱性氨基酸的二肽的正确盐形式来改善，特别是对于含有L-赖氨酸的二肽。
当制备各种盐酸盐并将其与不含无机抗衡离子的赖氨酸二肽的碱性内盐进行比较时，发现氯化物形式显著提高了干粉的储存稳定性。
还发现在细胞培养过程中，肽中的L-赖氨酸的二盐酸盐形式在高浓度下的生物相容性低于一盐酸盐形式(并且这不是由pH效应引起的)。
例如，在(Lys-Cys)2的情况下，二盐酸盐(2HCl)形式可以以显著高于四盐酸盐(4HCl)形式的浓度提供。事实上，虽然高浓度的二盐酸盐形式提高了细胞活力，但四盐酸盐形式在相同浓度下却降低了细胞活力。
根据本发明的组合物还可以是化妆品、营养补充剂、用于临床营养的营养液、或细胞或组织培养基(基础培养基、补料培养基或灌注培养基)的组成部分。
本发明进一步涉及本发明的培养基用于培养细胞，优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。
本发明的另一方面涉及一种制造细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明的培养基接触；(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。
在下面的发明详述中进一步详细描述本发明的优选实施方案。
发明详述
在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括上面列出的20种氨基酸的L-型和D-型。然而，L-型是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
根据本发明，“游离氨基酸”，例如“游离”半胱氨酸，应被理解为其氨基及其(α-)羧基官能团呈游离形式的氨基酸，即不与其他分子共价结合，例如，不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以盐或水合物形式存在。当提及作为二肽的一部分或在二肽中的氨基酸时，这应理解为是指根据生物化学和肽生物合成的已知机制衍生自相应氨基酸的各二肽结构的部分。
本发明一般涉及一种二肽盐，其包含由两个氨基酸组成的二肽和氯抗衡离子，所述氨基酸是天然氨基酸，其中至少一个氨基酸是碱性氨基酸，其中碱性氨基酸与氯离子的摩尔比为0.8和1.2。
在本发明的优选实施方案中，二肽是Xxx-Yyy或Yyy-Xxx，其中Xxx是碱性氨基酸，Yyy是另一种氨基酸。
在本发明的优选实施方案中，其他氨基酸Yyy选自半胱氨酸/胱氨酸(Cys)或酪氨酸(Tyr)。
在另一个优选的实施方案中，二肽是Xxx-Cys或Cys-Xxx，并且其中二肽盐是(Xxx-Cys)2 2HCl或(Cys-Xxx)2 2HCl的形式。
碱性氨基酸优选选自赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)。碱性氨基酸可以在N-末端或C-末端位置。
在进一步优选的实施方案中，二肽盐是根据式I的(Lys-Cys)2 2HCl：
式I
“肽”应理解为包含通过α-肽键(R1-CO-NH-R2)彼此共价偶联的至少两个氨基酸的分子。
“二肽”应被理解为包含通过α-肽键(R1-CO-NH-R2)彼此共价偶联的两个氨基酸的分子。
在本发明的上下文中，“氨基酸”应被理解为包含氨基官能团(-NH2)和羧酸官能团(-COOH)以及各氨基酸特有的侧链的分子。在本发明的上下文中，包括α-和β-氨基酸。本发明优选的氨基酸是α-氨基酸，特别是如下20种“天然氨基酸”，包括胱氨酸：
丙氨酸(Ala/A)
精氨酸(Arg/R)
天冬酰胺(Asn/N)
天冬氨酸(Asp/D)
半胱氨酸(Cys/C)
胱氨酸(Cyss/C2)
谷氨酸(Glu/E)
谷氨酰胺(Gln/Q)
甘氨酸(Gly/G)
组氨酸(His/H)
异亮氨酸(Ile/I)
亮氨酸(Leu/L)
赖氨酸(Lys/K)
甲硫氨酸(Met/M)
苯丙氨酸(Phe/F)
脯氨酸(Pro/P)
丝氨酸(Ser/S)
苏氨酸(Thr/T)
色氨酸(Trp/W)
酪氨酸(Tyr/Y)
缬氨酸(Val/V)
在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括上面列出的20种氨基酸的L-型和D-型。然而，L-型是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
根据本发明，“游离氨基酸”(例如“游离半胱氨酸”)应被理解为其氨基及其(α-)羧基官能团呈游离形式(即不与其他分子共价结合)的氨基酸，例如不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以盐或水合物形式存在。当提及作为二肽的一部分或在二肽中的氨基酸时，这应理解为是指根据生物化学和肽生物合成的已知机制衍生自相应氨基酸的各二肽结构的部分。
就化学化合物而言，例如氨基酸，表述“N-酰化的”应被理解为意指通过将酰基添加至所述化合物的氮官能团而修饰的N-酰化化合物。优选地，将酰基添加到氨基酸的α-氨基上。
二肽盐可以是固体(结晶粉末、附聚物等)的形式，或者以水溶液的形式提供。浓缩储备溶液的浓度应大于25mM，优选大于100mM，最优选大于200mM。
二肽盐也可以与其他常用的不含碱性氨基酸的二肽，例如Ala-Gln、Gly-Gln、Ala-Tyr、Gly-Tyr或Ala-Cys或(Ala-Cys)2一起使用。
在本发明的上下文中，通过氧化的半胱氨酸残基形成二硫键的Cys-肽应通过(Xxx-Cys)2或(Cys-Xxx)2来描述。所述肽也可以以水合物形式存在。这种二硫键介导的Cys-二肽二聚体，例如(Xxx-Cys)2，仍然被认为是在本发明意义上的二肽。
优选地，所述组合物在25℃下的pH值为至少5或优选为至少6。
在优选实施方案中，二肽盐处于还原状态(＝游离巯基)或氧化状态(＝二硫键键合的)，优选处于氧化状态。
在优选的实施方案中，二肽未被N-酰化。N-酰化已知可提高某些二肽的热稳定性；然而，已发现N-酰化二肽也可导致较差的活细胞密度和活力。
本发明还涉及包含根据本发明的组合物的化妆品、营养补充剂、用于临床营养的营养液或生物药品制剂。
化妆品可以是洗发水、护发素、乳液、霜剂或用于处理皮肤或头发的其他制剂。营养补充剂可以是液体形式，例如糖浆或浓缩咖啡(shots)，或固体形式，例如胶囊、软胶囊、软糖。该组合物还可以是用于临床肠内或肠胃外营养的营养液的一部分，例如，氨基酸溶液如Aminoven(Fresenius Kabi)的一部分。组合物也可以是生物药品制剂的一部分，其优选选自抗体或疫苗制剂。
此外，本发明还涉及细胞或组织培养基。
本发明的另一主题涉及包含根据本发明的组合物的细胞或组织培养基，其进一步包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。在特别优选的实施方案中，培养基包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和至少一种维生素中的全部。
在本发明的一个实施方案中，培养基不含生长因子。根据该实施方案，可以使用本发明的二肽盐代替生长因子来促进培养基中细胞的生长和/或增殖。在本发明的另一个实施方案中，培养基不含任何脂质。
根据本发明的另一个实施方案，培养基是液体形式、凝胶、粉末、颗粒、丸粒的形式或片剂的形式。
在优选的实施方案中，本发明的培养基是确定成分培养基或无血清培养基。例如，本发明的组合物可以补充至Miltenyi Biotech(Bergisch Gladbach，Germany)的CHOMACSCD培养基、可从LONZA(Basel，Switzerland)获得的PowerCHO-2CD培养基、PAA(PAALaboratories,Pasching,Austria)的Acti-CHO P培养基、可从SAFC获得的Ex-Cell CD CHO培养基、ThermoFisher(Waltham,USA)的SFM4CHO培养基和CDM4CHO培养基。本发明的二肽还可以补充到DMEM培养基(Life Technologies Corp.，Carlsbad，USA)中。然而，本发明不限于上述培养基的补充。
在其他优选的实施方案中，相对于使用中的所述培养基的浓度，所述培养基是2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式(体积/体积)的液体培养基。这允许通过用相应体积的无菌水对浓缩培养基进行简单稀释来制备“即用型”培养基。本发明的培养基的这种浓缩形式还可以通过将其添加到培养物中来使用，例如在补料分批培养或灌注过程中。
本发明的细胞培养基(细胞或组织培养基础、补料或灌注培养基)可优选含有持续生长和产物形成所需的所有营养物。用于制备培养基、特别是细胞培养基的配方是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Cell Culture Technology for Pharmaceutical andCell-Based Therapies,and Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group2006)。各种培养基可在商业上从各种来源获得。
本发明的培养基可优选包含碳水化合物源。细胞培养基中使用的主要碳水化合物是葡萄糖，通常补充量为5至25mM。另外，可以使用任何己糖，例如半乳糖、果糖或甘露糖或其组合。
培养基通常还可以至少包含必需氨基酸(即，His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Try、Val)以及非必需氨基酸。如果细胞系不能合成氨基酸或者如果细胞系不能产生足够量的氨基酸以支持最大生长，则细胞培养基中通常包含非必需氨基酸。此外，哺乳动物细胞还可以利用谷氨酰胺作为主要能量来源。包含的谷氨酰胺的浓度通常高于其他氨基酸(2-8mM)。然而，如上所述，谷氨酰胺可以自发分解形成氨，并且某些细胞系更快地产生氨，这是有毒的。
本发明的培养基可优选包含盐。将盐添加到细胞培养基中以维持等渗条件并防止渗透失衡。本发明的培养基的重量摩尔渗透压浓度为约300mOsm/kg，尽管许多细胞系可以耐受该值的约10％的变动或更高。一些昆虫细胞培养物的重量摩尔渗透压浓度往往高于300mOsm/kg，这可能是比300mOsm/kg高0.5％、1％、2-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％，25-30％。细胞培养基中最常用的盐包括Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO4 2-、PO4 3-、和HCO3 -(例如，CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)。
培养基中可以存在其他无机元素。它们包括Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si和Ni。许多这些元素都参与酶活性。它们可以以盐形式提供，例如CaCl2、Fe(NO3)3、MgCl2、MgSO4、MnCl2、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4，以及以微量元素的离子形式提供，例如硒、钒和锌。这些无机盐和微量元素可以从商业上获得，例如从Sigma(Saint Louis,Missouri)获得。
本发明的培养基优选包含维生素。维生素通常被细胞用作辅因子。每种细胞系的维生素需求差异很大，但如果细胞培养基含有很少或不含血清或者细胞以高密度生长，通常需要额外的维生素。优选存在于本发明培养基中的示例性维生素包括生物素、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺、D-泛酸钙、吡哆醛、核黄素、硫胺素、吡哆醇、烟酰胺、A、B6、B12、C、D3、E、K和对氨基苯甲酸(PABA)。
本发明的培养基还可以包含血清。血清是凝固血液的上清液。血清成分包括附着因子、微量营养素(例如微量元素)、生长因子(例如激素、蛋白酶)和保护性元素(例如抗毒素、抗氧化剂、抗蛋白酶)。血清可从多种动物来源获得，包括人、牛或马血清。当包含在根据本发明的细胞培养基中时，血清通常以5-10％(体积)的浓度添加。优选的细胞培养基是无血清的。
为了在无血清或在血清减少的培养基中促进细胞生长，可以将一种或多种以下多肽添加至本发明的细胞培养基中：例如，成纤维细胞生长因子(FGF)，包括酸性FGF和碱性FGF、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)，包括TGFα和TGFβ、任何细胞因子，如白细胞介素1、2、6、粒细胞刺激因子、白细胞抑制因子(LIF)等。
在其他实施方案中，细胞培养基不包含多肽(即，具有多于20个氨基酸的肽)。
还可以将一种或多种脂质添加至本发明的细胞培养基中，例如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、棕榈油酸、油酸、多烯酸和/或12、14、16、18、20或24个碳原子的脂肪酸，每个碳原子为支链或非支链的、磷脂、卵磷脂(磷脂酰胆碱)和胆固醇。这些脂质中的一种或多种可以作为补充物包含在无血清培养基中。磷脂酸和溶血磷脂酸刺激某些贴壁依赖性细胞例如MDCK、小鼠上皮细胞和其他肾细胞系的生长，而磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇刺激无血清培养基中人成纤维细胞的生长。乙醇胺和胆固醇也被证明可以促进某些细胞系的生长。在某些实施方案中，细胞培养基不含脂质。
还可以将一种或多种载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或转铁蛋白添加到细胞培养基中。载体蛋白可以帮助运输某些营养素或微量元素。BSA通常用作不溶于水溶液的脂质(例如亚油酸和油酸)的载体。此外，BSA还可以作为某些金属，例如Fe、Cu和Ni的载体。在无蛋白质制剂中，BSA的非动物源性替代品(例如环糊精)可用作脂质载体。
一种或多种附着蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白和pronectin，也可以添加到细胞培养基中，以帮助促进贴壁依赖性细胞附着到基质上。
细胞培养基可以任选地包含一种或多种缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于N-[2-羟乙基]-哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸盐、碳酸氢盐和其他适用于细胞培养应用的缓冲剂。合适的缓冲剂是提供缓冲能力而对培养的细胞没有显著细胞毒性的缓冲剂。合适缓冲剂的选择在细胞培养领域中普通技术人员的范围内。
可以将聚阴离子或聚阳离子化合物添加到培养基中以防止细胞聚集并促进悬浮细胞的生长。
在一个优选的实施方案中，培养基是液体形式。然而，培养基也可以是固体培养基，例如凝胶状培养基，例如含有琼脂、角叉菜胶或明胶的培养基(粉末、聚集粉末、速溶粉末等)。优选地，培养基是无菌形式的。
本发明的培养基可以是浓缩形式。它可以是例如2倍至100倍浓缩形式，优选2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍(相对于支持细胞生长和产物形成的浓度)浓缩形式。这种浓缩的培养基有助于通过用水性溶剂(例如水)稀释浓缩的培养基来制备供使用的培养基。此类浓缩培养基可用于分批培养，但也有利地用于补料分批或连续培养，其中将浓缩营养组合物添加到正在进行的细胞培养中，例如以补充培养期间细胞消耗的营养物。
在本发明的其他实施方案中，培养基是干燥形式，例如干粉形式、或颗粒形式、或丸粒形式、或片剂形式。
本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞的用途。本发明的另一个方面涉及本发明的培养基用于生产细胞培养产品的用途。
本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的培养基用于培养动物细胞或植物细胞、最优选哺乳动物细胞的用途。在具体实施方案中，待培养的细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。本发明优选的细胞是CHO细胞和杂交瘤细胞。本发明最优选的细胞是CHO细胞。本发明特别优选的CHO细胞是CHO DG44细胞和CHODP12细胞。
本发明的范围还包括培养细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的细胞培养基接触。在本发明的一个实施方案中，培养细胞的方法包括在支持细胞培养的条件下使细胞与基础培养基接触，并用根据本发明的浓缩培养基补充基础细胞培养基。在优选的实施方案中，用浓缩的补料或培养基在不只一天中对基础培养基进行补充。
本发明的另一方面涉及生产根据本发明的培养基的方法，其中所述培养基包含根据本发明的组合物。生产根据本发明的培养基的方法包括至少一个将本发明的组合物添加到培养基中的步骤。同样，本发明的一个方面涉及本发明的组合物用于生产细胞培养基的用途。
本发明的另一方面涉及改良培养基的方法，其中所述培养基的所述改良包括将本发明的组合物添加至所述培养基中。
本发明的另一个方面涉及生产液体培养基的方法，所述方法包括提供根据本发明的固体培养基，例如以干粉形式、颗粒形式、丸粒形式、或片剂形式提供；并将所述固体培养基溶解在水性介质，例如水中。
本发明的另一方面涉及根据本发明的组合物在用于培养细胞的培养基中的用途。本发明的另一个方面涉及根据本发明的组合物用于细胞培养的用途。
本发明还涉及制造细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与本发明的培养基接触；(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。同样，本发明涉及根据本发明的组合物用于制造细胞培养产物的用途。
在优选的方法中，细胞培养产物是治疗蛋白、诊断蛋白、多糖例如肝素、抗体、单克隆抗体、生长因子、白细胞介素、病毒、病毒样颗粒或酶。
根据本发明，细胞的培养可以分批培养、补料分批培养或连续培养进行。
实施例
材料：
表1：用于体外活力测定的材料
表2：用于细胞因子释放测定的装置
方法:
(Lys-Cys)2盐的制备
使用溶液中常用的保护基团进行肽合成。粗产物通过色谱方法纯化，最后通过离子交换色谱制备不同的盐形式。随后冷冻干燥得到不含氯化物的内盐(碱性形式)、二盐酸盐(四个赖氨酸氨基中的两个氨基被两个作为抗衡离子的氯离子质子化)和四盐酸盐形式(所有四个赖氨酸氨基被四个作为抗衡离子的氯离子质子化)。
因此，(Lys-Cys)2的粗溶液通过强酸性IEX进行脱盐。用氨洗脱以生成(Lys-Cys)2游离碱。使用吸附树脂进行进一步纯化。一旦游离碱被纯化，就通过冷冻干燥对其进行干燥。或者，可以使用稀释的HCl(pH＝5)将(Lys-Cys)2游离碱转化为(Lys-Cys)2.2HCl盐。(Lys-Cys)2.2HCl可以通过在EtOH中结晶并随后干燥来分离。
为了验证和表征2HCl盐，使用0.1N HCl绘制了(Lys-Cys)2游离碱的滴定曲线。pH跃升证实了1摩尔(Lys-Cys)2游离碱与2摩尔HCl的化学计量。使用0.1N NaOH反向滴定(Lys-Cys)2.2HCl也证实了该化学计量。
通过使用>4当量的稀盐酸(pH＝2.0)将(Lys-Cys)2游离碱与过量的HCl成盐，从而制备并分离(Lys-Cys)2.4HCl盐。通过在丁醇中结晶并随后干燥来分离4HCl盐。
对间充质干细胞和中国仓鼠卵巢细胞的体外细胞毒性测定(亚克隆K1)：
分别用人骨髓基质细胞、间充质干细胞(MSC)或中国仓鼠卵巢细胞(亚克隆K1)进行测定。在第一步中，将细胞接种在透明的96孔细胞培养板中，并在CO2培养箱(37℃，5％CO2，95％湿度)中以10.000个细胞/孔的细胞密度和100μl/孔的最终体积温育24小时。在24小时的静息时间后，丢弃上清液，并将制备的二肽测试化合物以100μl/孔的最终体积添加到细胞中。对照置于不含二肽的培养基中。
所有样品直接溶解在相关细胞培养基中。提前将样品的pH值调整至pH7，以排除由于可能的较低pH值对细胞活力的影响。
(Lys-Cys)2的不同盐形式以两种不同浓度进行测试，每个样品一式三份进行测试。
在CO2培养箱(37℃、5％CO2、95％湿度)中温育24小时后，根据制造商手册制备测试试剂，并将20μl试剂添加到孔中以获得120μl/孔的最终体积。
由于代谢活跃的细胞将MTS还原成甲臜产物，因此可以在多板读数器中在490nm波长处测量甲臜的吸光度信号。该信号与培养基中活细胞的数量成正比。
实施例1：Cys-肽的不同盐形式对细胞活力的影响
将CHO-K1以及MSC细胞培养24小时，然后添加不同的(Lys-Cys)2盐。在(Lys-Cys)2的二盐酸盐形式和四盐酸盐形式存在下培养细胞，每种肽以1mM和10mM的两种不同浓度应用。用所述二肽培养24小时后，使用CellTiterAQueous非放射性细胞增殖测定(MTS)评估细胞活力。CHO-K1和MSC细胞的这些活力测定结果如图1和2所示。
图1显示了与添加不含(Lys-Cys)2的培养基的对照相比，不同盐形式的(Lys-Cys)2对CHO-K1细胞活力的影响。误差线代表标准差。
图2显示了与添加不含(Lys-Cys)2的培养基的对照相比，不同盐形式的(Lys-Cys)2对MSC细胞活力的影响。误差线代表标准差。
在这些活力评估中，发现在细胞培养期间，含有完全质子化的碱性氨基酸和两个氯抗衡离子的肽在高浓度下的生物相容性低于含有仅部分质子化且具有一个氯抗衡离子的碱性氨基酸的肽(并且这不是由pH效应引起的)。例如，在(Lys-Cys)2的情况下，二盐酸盐(2HCl)形式可以以显著高于四盐酸盐(4HCl)形式的浓度提供。事实上，虽然高浓度的2HCl形式提高了细胞活力，但相同浓度的4HCl形式却降低了细胞活力。
实施例2：氯化物盐与碱性形式相比的改善的储存稳定性
在25℃下和在60℃下使用(Lys-Cys)2的不同盐形式进行了储存稳定性测试。用HPLC方法测量稳定性。发现二盐酸盐和四盐酸盐都显著地比不含氯化物的碱性形式更稳定。

Claims (13)

1.一种二肽盐，所述二肽盐包含由两个氨基酸组成的二肽和氯抗衡离子，所述氨基酸是天然氨基酸，其中至少一个氨基酸是碱性氨基酸，其中碱性氨基酸与氯离子的摩尔比为0.8至1.2。
2.根据权利要求1所述的二肽盐，其中所述二肽是Xxx-Yyy或Yyy-Xxx，其中Xxx是碱性氨基酸，Yyy是另一种氨基酸。
3.根据前述权利要求中任一项所述的二肽盐，其中所述另一种氨基酸Yyy选自半胱氨酸/胱氨酸(Cys)或酪氨酸(Tyr)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的二肽盐，其中所述二肽是Xxx-Cys或Cys-Xxx，并且其中所述二肽盐是(Xxx-Cys)2 2HCl或(Cys-Xxx)22HCl的形式。
5.根据前述权利要求中任一项所述的二肽盐，其中所述碱性氨基酸选自赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的二肽盐，其中所述二肽盐是根据式I的(Lys-Cys)22HCl：
式I
7.一种化妆品、营养补充剂、临床营养用营养液或生物药品制剂，其包含根据前述权利要求中任一项所述的二肽盐。
8.一种细胞培养基，所述培养基包含根据权利要求1至6中任一项所述的二肽盐，所述培养基还包含至少一种碳水化合物，和/或至少一种另外的游离氨基酸，和/或至少一种无机盐，和/或缓冲剂和/或至少一种维生素。
9.根据权利要求8所述的培养基，其中所述培养基为液体形式、凝胶、粉末、颗粒、丸粒形式或片剂形式。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的培养基，其中相对于使用中的培养基的浓度，所述培养基是2倍至100倍浓缩的形式，优选2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的培养基用于培养细胞的用途，优选作为水性储备溶液或补料溶液用于培养细胞的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述细胞选自由CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞、免疫细胞如NK细胞或T细胞，和杂交瘤细胞组成的组。
13.制造细胞培养产物的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；
-使所述细胞与权利要求8至10中任一项所述的培养基接触；和
-从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。
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