CN117940556A - 包含二肽和微量元素的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含二肽和微量金属离子的组合物。更具体地，本发明涉及用于生物技术生产方法的改进的培养基、使用此类改进的培养基的方法、以及从使用所述改进的培养基的方法获得的产品。

Description

包含二肽和微量元素的组合物
发明领域
本发明涉及包含至少一种由两个氨基酸组成的二肽和至少一种微量金属离子的组合物，所述氨基酸是天然氨基酸并且至少一个所述氨基酸是半胱氨酸(Cys)。
此外，本发明涉及生物技术生产方法。更具体地，本发明涉及用于生物技术生产方法的改进的培养基、使用此类改进的培养基的方法、以及从使用所述改进的培养基的方法获得的产品。
发明背景
化学成分确定的二肽通常用于替代生物制药生产中使用的细胞培养基中难以配制的氨基酸。二肽的形成增加了谷氨酰胺的稳定性以及酪氨酸和胱氨酸的溶解度。众所周知的例子是丙氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-谷氨酰胺、甘氨酰-酪氨酸、丙氨酰-酪氨酸和N,N'-二-丙氨酰-胱氨酸。它们被有效地用作营养物，并且对其吸收和代谢进行了详细研究(Sánchez-Kopper et al.AMB Expr(2016)6:48,Verhagen et al.Eng Life Sci.(2020)；1-11)。
WO 2011/133902公开了包含二肽的细胞培养基，其中所述二肽包含在水中具有低溶解度的氨基酸，在这种情况下为酪氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸不仅在水中的溶解度低，而且由于反应性巯基基团的存在而不稳定。此外，使用较高浓度(例如10mM)的半胱氨酸会降低细胞活力。作者发现，通过在二肽中掺入酪氨酸和半胱氨酸，可以改善氨基酸的溶解度和稳定性问题。更高的稳定性和溶解度使得能够配制化学成分确定的高浓度培养基，这是运行强化和高产工业细胞培养方法所需的。
微量元素是所有动物和人类细胞支持新陈代谢所需的微量营养素。必需微量元素的例子有铁、锌和铜(Frieden,Journal of Chemical Education(1985),Vol 62,No 11,917-923)。微量元素过量提供时会变得有毒，并且很难提供足够但又不过量的这些微量营养素。
对于用于体外培养动物或人类细胞的细胞培养基的配制来说，例如在生物制药、基于细胞培养的单克隆抗体生产、病毒疫苗或细胞疗法的背景下，这是一个众所周知的挑战。在充足的供应和毒性作用之间取得平衡可能很困难，特别是在需要化学成分明确、无血清甚至无蛋白质的培养基时。微量金属通常作为其他培养基成分(例如氨基酸)的杂质存在，这一事实使情况变得更加复杂。
经典基础培养基配方中定义的微量元素浓度在不同配方之间的相对较宽的浓度范围内变化。例如，锌和铜的浓度在低纳摩尔至低微摩尔范围内，但大部分通常上是通过血清引入，其含有10至30μM的这些微量元素(Vargas Arigony et al.BioMed ResearchInternational(2013)Article ID 597282)。
当需要无血清、化学成分确定的培养基来提高现代生物制药细胞培养的安全性、一致性和性能时，这些微量元素必须以化学成分确定的形式添加，这意味着无机盐。
关于化学成分确定的生物生产培养基中微量金属含量的已发表数据有限。然而，研究表明，添加足够量的铜和锌对于支持生长、产物形成很重要，并且对初级代谢(例如乳酸消耗)有直接影响。它还被证明对产品质量具有积极影响。许多出版物中对浓度效应进行了系统研究。对于铜，描述了0.05至100μM之间的浓度(Yuk et al.Biotechnol.Prog.(2015),31；1:226-238；Chaderjian et al.Biotechnol.Prog.(2005),21:550-553)。对于锌，描述了3至150μM之间的浓度(Roca et al.Cytotechnoloy(2019)71:915-924；Grahamet al.Applied Microbiology and Biotechnology(2020),104:1097-1108)。在所有情况下，都可以证明添加的有益效果，但高浓度会导致性能或毒性降低。
文献中有证据表明，微量金属的毒性作用是由与其他培养基成分的氧化还原反应引起的，所述反应导致形成活性氧种类(ROS)，其在较高浓度下变得有毒(Keenan et al.,In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal(2018)54:555–558；Graham et al.,Biotechnology and Bioengineering.2019；116:3446–3456)。
氨基酸L-半胱氨酸参与与金属离子的氧化还原反应并有助于ROS的形成。在这些反应中，L-半胱氨酸被氧化成二硫键形式的L-胱氨酸。这在文献中对L-半胱氨酸存在下的Cu2+离子进行了描述。
由于细胞培养基中需要微量金属和足够量的半胱氨酸源以最大化细胞培养物的生产力，因此仍然需要改进细胞培养基配方以确保足够的微量金属供应而无毒性。还需要提供足够的半胱氨酸当量，同时向细胞提供足够的微量金属。因此，本发明的一个目标是提供一种细胞培养基，其提供半胱氨酸源并确保微量金属的供应，但同时具有降低的微量金属和半胱氨酸毒性。
发明概述
本发明解决了上述缺点。本发明由所附独立权利要求的术语限定。本发明的优选实施方案由从属权利要求限定。
令人惊奇地发现，向细胞培养基中添加二肽可降低金属离子的毒性。此外，发现添加二肽可降低L-半胱氨酸诱导的金属毒性。最后，发现用胱氨酸二肽替代L-半胱氨酸可以完全抑制L-半胱氨酸诱导的金属毒性，并且与各自的对照相比，细胞活力实际上增加了。
根据本发明的组合物包含至少一种由两个氨基酸组成的二肽和至少一种微量金属离子，所述氨基酸是天然氨基酸并且所述氨基酸中的至少一种是半胱氨酸(Cys)，其中二肽与微量金属离子的摩尔比在10000至20之间。
根据本发明的组合物还可以是化妆品、营养补充剂、用于临床营养的营养液、或细胞或组织培养基(基础培养基、补料培养基或灌注培养基)的组成部分。
本发明进一步涉及本发明的培养基用于培养细胞，优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。
本发明的另一方面涉及一种制造细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明的培养基接触；(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。
在下面的发明详述中进一步详细描述本发明的优选实施方案。
发明详述
在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括上面列出的20种氨基酸的L-型和D-型。然而，L-型是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
根据本发明，“游离氨基酸”，例如“游离”半胱氨酸，应被理解为一种其氨基及其(α-)羧基官能团呈游离形式的氨基酸，即不与其他分子共价结合，例如，不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以盐或水合物形式存在。当提及作为二肽的一部分或在二肽中的氨基酸时，这应理解为是指根据生物化学和肽生物合成的已知机制衍生自相应氨基酸的各二肽结构的部分。
本发明一般涉及一种组合物，其包含至少一种由两个氨基酸组成的二肽和至少一种微量金属离子，所述氨基酸是天然氨基酸并且所述氨基酸中的至少一个是半胱氨酸(Cys)，其中二肽与微量金属离子的摩尔比在10000至20之间。
“肽”应理解为包含通过α-肽键(R1-CO-NH-R2)彼此共价偶联的至少两个氨基酸的分子。
“二肽”应被理解为包含通过α-肽键(R1-CO-NH-R2)彼此共价偶联的两个氨基酸的分子。
当在本文中与氨基酸结合使用时，表述“Xxx”应理解为指如下所定义的任何天然氨基酸。
在本发明的上下文中，“氨基酸”应被理解为包含氨基官能团(-NH2)和羧酸官能团(-COOH)以及各氨基酸特有的侧链的分子。在本发明的上下文中，包括α-和β-氨基酸。本发明优选的氨基酸是α-氨基酸，特别是如下20种“天然氨基酸”，包括胱氨酸：
丙氨酸(Ala/A)
精氨酸(Arg/R)
天冬酰胺(Asn/N)
天冬氨酸(Asp/D)
半胱氨酸(Cys/C)
胱氨酸(Cyss/C2)
谷氨酸(Glu/E)
谷氨酰胺(Gln/Q)
甘氨酸(Gly/G)
组氨酸(His/H)
异亮氨酸(Ile/I)
亮氨酸(Leu/L)
赖氨酸(Lys/K)
甲硫氨酸(Met/M)
苯丙氨酸(Phe/F)
脯氨酸(Pro/P)
丝氨酸(Ser/S)
苏氨酸(Thr/T)
色氨酸(Trp/W)
酪氨酸(Tyr/Y)
缬氨酸(Val/V)
在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括上面列出的20种氨基酸的L-型和D-型。然而，L-型是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
根据本发明，“游离氨基酸”(例如“游离半胱氨酸”)应被理解为其氨基及其(α-)羧基官能团呈游离形式(即不与其他分子共价结合)的氨基酸，例如，不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以盐或水合物形式存在。当提及作为二肽的一部分或在二肽中的氨基酸时，这应理解为是指根据生物化学和肽生物合成的已知机制衍生自相应氨基酸的各二肽结构的部分。
就化学化合物而言，例如氨基酸，表述“N-酰化的”应被理解为意指通过将酰基添加至所述化合物的氮官能团而修饰的N-酰化化合物。优选地，将酰基添加到氨基酸的α-氨基上。
优选的是，二肽与微量金属离子的摩尔比为5000至20，优选1000至20。
在优选的配置中，微量金属选自铁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰，微量金属离子优选为铜离子。特别优选使用(Cu2+)离子。
在另一个优选的配置中，二肽浓度为0.1至200mM，优选为0.2至20mM，最优选为0.5至10mM，并且微量金属离子浓度为0.1至400μM，优选为0.2至100μM，最优选为0.5至20μM。
在另一个优选的配置中，存在于培养基中的二肽的浓度为至少1mM、优选为至少10mM、更优选为至少50mM、更优选为至少100mM。在如此高的浓度下，根据本发明的组合物提供的优点是含半胱氨酸的二肽稳定半胱氨酸以防止氧化沉淀。
优选地，当二肽是Xxx-Cys Cys-Xxx，其中Xxx是天然氨基酸时，二肽优选是Ala-Cys、Cys-Ala、Lys-Cys或Cys-Lys。
特别优选的是，当二肽是Xxx-Cys或Cys-Xxx并且是氧化和二聚化形式时，由此二聚化二肽通过二硫键偶联。
在另一个优选的配置中，组合物还包含游离半胱氨酸。
可以通过将确定摩尔比的二肽与各微量金属以适当的比例混合来制备组合物，以制备可以添加到细胞培养基中的粉末产品或液体储备溶液。或者，可以将二肽添加到已经含有各微量金属的细胞培养基中。任选地，可以将适量的半胱氨酸添加到组合物中或直接添加到细胞培养基中来制备另外含有半胱氨酸的组合物。
如果二肽是Cys-二肽，则二肽结合的半胱氨酸(通过二硫键)与游离半胱氨酸的优选摩尔比为10或更低，优选摩尔比为4或更低，更优选摩尔比为2或更低，更优选摩尔比为1或更低，更优选摩尔比为0.5或更低，最优选摩尔比为0.2或更低。混合物可以是固体(结晶粉末、附聚物等)或水溶液的形式。在水溶液的情况下，半胱氨酸以至少1mM、优选至少10mM、更优选至少50mM并且最优选至少100mM的浓度添加，并且二肽以上述适当的摩尔比添加。
该组合物可以通过混合至少一种二肽(其中一个氨基酸是半胱氨酸(Cys))和选自游离半胱氨酸和任选地胱氨酸(Cys-Cys)的半胱氨酸源来制备。因此，本发明涉及包含该组合物的培养基。
在本发明的上下文中，通过氧化的半胱氨酸残基形成二硫键的Cys-肽应由(Xxx-Cys)2描述。肽还可以盐或水合物形式存在。这种二硫键介导的Cys-二肽二聚体，例如(Xxx-Cys)2，仍然被认为是本发明意义上的二肽。
优选地，该组合物在25℃下具有至少5或优选至少6的pH值。
在本发明的一个有利的配置中，肽结合的半胱氨酸与游离半胱氨酸的摩尔比为0.1至10，优选为0.2至4或更低，最优选为0.5至2。在一个优选的实施方案中，二肽或者处于还原态(＝游离巯基)或氧化态(＝二硫键键合的)，优选处于氧化态。
在备选实施方案中，组合物包含二肽和半胱氨酸源的混合二硫化物。
在本发明的一个优选实施方案中，二肽还包含一种以上天然氨基酸，其在pH 6至pH 9之间的pH范围内溶解度为至少>10g/l，并且优选选自甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)。
在优选的实施方案中，二肽未被N-酰化。N-酰化已知可提高某些二肽的热稳定性；然而，已发现N-酰化二肽也可导致较差的活细胞密度和活力。
本发明还涉及包含根据本发明的组合物的化妆品、用于临床营养的营养补充剂或营养液。
化妆品可以是洗发水、护发素、乳液、霜剂或用于处理皮肤或头发的其他制剂。营养补充剂可以是液体形式，例如糖浆或浓缩咖啡(shots)，或固体形式，例如胶囊、软胶囊、软糖。该组合物还可以是用于临床肠内或肠胃外营养的营养液的一部分，例如，氨基酸溶液如Aminoven(Fresenius Kabi)的一部分。
此外，本发明还涉及细胞或组织培养基。
本发明的另一主题涉及包含根据本发明的组合物的细胞或组织培养基，其进一步包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。在特别优选的实施方案中，培养基包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和至少一种维生素中的全部。
在本发明的一个实施方案中，培养基不含生长因子。根据该实施方案，可以使用本发明的二肽代替生长因子来促进培养基中细胞的生长和/或增殖。在本发明的另一个实施方案中，培养基不含任何脂质。
根据本发明的另一个实施方案，培养基是液体形式、凝胶、粉末、颗粒、丸粒的形式或片剂的形式。
在优选的实施方案中，本发明的培养基是确定成分培养基或无血清培养基。例如，本发明的组合物可以补充至Miltenyi Biotech(Bergisch Gladbach，Germany)的CHOMACSCD培养基、可从LONZA (Basel，Switzerland)获得的PowerCHO-2CD培养基、PAA(PAALaboratories,Pasching,Austria)的Acti-CHO P培养基、可从SAFC获得的Ex-Cell CD CHO培养基、ThermoFisher(Waltham,USA)的SFM4CHO培养基和CDM4CHO培养基。本发明的二肽还可以补充到DMEM培养基(Life Technologies Corp.，Carlsbad，USA)中。然而，本发明不限于上述培养基的补充。
在其他优选的实施方案中，相对于使用中的所述培养基的浓度，所述培养基是2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式(体积/体积)的液体培养基。这允许通过用相应体积的无菌水对浓缩培养基进行简单稀释来制备“即用型”培养基。本发明的培养基的这种浓缩形式还可以通过将其添加到培养物中来使用，例如在补料分批培养或灌注过程中。
本发明的细胞培养基(细胞或组织培养基础、补料或灌注培养基)可优选含有持续生长和产物形成所需的所有营养物。用于制备培养基、特别是细胞培养基的配方是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Cell Culture Technology for Pharmaceutical andCell-Based Therapies,and Wei-Shou Hu eds.,Taylor and Francis Group2006)。各种培养基可在商业上从各种来源获得。
本发明的培养基可优选包含碳水化合物源。细胞培养基中使用的主要碳水化合物是葡萄糖，通常补充量为5至25mM。另外，可以使用任何己糖，例如半乳糖、果糖或甘露糖或其组合。
培养基通常还可以至少包含必需氨基酸(即，His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Try、Val)以及非必需氨基酸。如果细胞系不能合成氨基酸或者如果细胞系不能产生足够量的氨基酸以支持最大生长，则细胞培养基中通常包含非必需氨基酸。此外，哺乳动物细胞还可以利用谷氨酰胺作为主要能量来源。包含的谷氨酰胺的浓度通常高于其他氨基酸(2-8mM)。然而，如上所述，谷氨酰胺可以自发分解形成氨，并且某些细胞系更快地产生氨，这是有毒的。
本发明的培养基可优选包含盐。将盐添加到细胞培养基中以维持等渗条件并防止渗透失衡。本发明的培养基的重量摩尔渗透压浓度为约300mOsm/kg，尽管许多细胞系可以耐受该值的约10％的变动或更高。一些昆虫细胞培养物的重量摩尔渗透压浓度往往高于300mOsm/kg，这可能是比300mOsm/kg高0.5％、1％、2-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％，25-30％的。细胞培养基中最常用的盐包括Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO4 2-、PO4 3-、和HCO3 -(例如，CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)。
培养基中可以存在其他无机元素(包括另外的微量元素)。它们包括Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si和Ni。许多这些元素都参与酶活性。它们可以以盐，例如CaCl2、Fe(NO3)3、MgCl2、MgSO4、MnCl2、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4，以及微量元素离子，例如硒、钒和锌，的形式提供。这些无机盐和微量元素可以从商业上获得，例如从Sigma(Saint Louis,Missouri)获得。
本发明的培养基优选包含维生素。维生素通常被细胞用作辅因子。每种细胞系的维生素需求差异很大，但如果细胞培养基含有很少或不含血清或者细胞以高密度生长，通常需要额外的维生素。优选存在于本发明培养基中的示例性维生素包括生物素、氯化胆碱、叶酸、异肌醇、烟酰胺、D-泛酸钙、吡哆醛、核黄素、硫胺素、吡哆醇、烟酰胺、A、B6、B12、C、D3、E、K和对氨基苯甲酸(PABA)。
本发明的培养基还可以包含血清。血清是凝固血液的上清液。血清成分包括附着因子、微量营养素(例如微量元素)、生长因子(例如激素、蛋白酶)和保护性元素(例如抗毒素、抗氧化剂、抗蛋白酶)。血清可从多种动物来源获得，包括人、牛或马血清。当包含在根据本发明的细胞培养基中时，血清通常以5-10％(体积)的浓度添加。优选的细胞培养基是无血清的。
为了在无血清或在血清减少的培养基中促进细胞生长，可以将一种或多种以下多肽添加至本发明的细胞培养基中：例如，成纤维细胞生长因子(FGF)，包括酸性FGF和碱性FGF、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)，包括TGFα和TGFβ、任何细胞因子，如白细胞介素1、2、6、粒细胞刺激因子、白细胞抑制因子(LIF)等。
在其他实施方案中，细胞培养基不包含多肽(即，具有多于20个氨基酸的肽)。
还可以将一种或多种脂质添加至本发明的细胞培养基中，例如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、棕榈油酸、油酸、多烯酸和/或12、14、16、18、20或24个碳原子的脂肪酸，每个碳原子为支链或非支链的、磷脂、卵磷脂(磷脂酰胆碱)和胆固醇。这些脂质中的一种或多种可以作为补充物包含在无血清培养基中。磷脂酸和溶血磷脂酸刺激某些贴壁依赖性细胞例如MDCK、小鼠上皮细胞和其他肾细胞系的生长，而磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇刺激无血清培养基中人成纤维细胞的生长。乙醇胺和胆固醇也被证明可以促进某些细胞系的生长。在某些实施方案中，细胞培养基不含脂质。
还可以将一种或多种载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或转铁蛋白添加到细胞培养基中。载体蛋白可以帮助运输某些营养素或微量元素。BSA通常用作不溶于水溶液的脂质(例如亚油酸和油酸)的载体。此外，BSA还可以作为某些金属，例如Fe、Cu和Ni的载体。在无蛋白质制剂中，BSA的非动物源性替代品(例如环糊精)可用作脂质载体。
一种或多种附着蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白和pronectin，也可以添加到细胞培养基中，以帮助促进贴壁依赖性细胞附着到基质上。
细胞培养基可以任选地包含一种或多种缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于N-[2-羟乙基]-哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸盐、碳酸氢盐和其他适用于细胞培养应用的缓冲剂。合适的缓冲剂是提供缓冲能力而对培养的细胞没有显著细胞毒性的缓冲剂。合适缓冲剂的选择在细胞培养领域中普通技术人员的范围内。
可以将聚阴离子或聚阳离子化合物添加到培养基中以防止细胞聚集并促进悬浮细胞的生长。
在一个优选的实施方案中，培养基是液体形式。然而，培养基也可以是固体培养基，例如凝胶状培养基，例如含有琼脂、角叉菜胶或明胶的培养基(粉末、聚集粉末、速溶粉末等)。优选地，培养基是无菌形式的。
本发明的培养基可以是浓缩形式。它可以是例如2倍至100倍浓缩形式，优选2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍(相对于支持细胞生长和产物形成的浓度)浓缩形式。这种浓缩的培养基有助于通过用水性溶剂(例如水)稀释浓缩的培养基来制备供使用的培养基。此类浓缩培养基可用于分批培养，但也有利地用于补料分批或连续培养，其中将浓缩营养组合物添加到正在进行的细胞培养中，例如以补充培养期间细胞消耗的营养物。
在本发明的其他实施方案中，培养基是干燥形式，例如干粉形式、或颗粒形式、或丸粒形式、或片剂形式。
本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞的用途。本发明的另一个方面涉及本发明的培养基用于生产细胞培养产品的用途。
本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的培养基用于培养动物细胞或植物细胞、最优选哺乳动物细胞的用途。在具体实施方案中，待培养的细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、NS0细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。本发明优选的细胞是CHO细胞和杂交瘤细胞。本发明最优选的细胞是CHO细胞。本发明特别优选的CHO细胞是CHO DG44和CHODP12细胞。
本发明的范围还包括培养细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的细胞培养基接触。在本发明的一个实施方案中，培养细胞的方法包括在支持细胞培养的条件下使细胞与基础培养基接触，并用根据本发明的浓缩培养基补充基础细胞培养基。在优选的实施方案中，用浓缩补料或培养基在超过一天补充基础培养基。
本发明的另一方面涉及生产根据本发明的培养基的方法，其中所述培养基包含根据本发明的组合物。生产根据本发明的培养基的方法包括至少一个将本发明的组合物添加到培养基中的步骤。同样，本发明的一个方面涉及本发明的组合物用于生产细胞培养基的用途。
本发明的另一方面涉及改良培养基的方法，其中所述培养基的所述改良包括将本发明的组合物添加至所述培养基中。
本发明的另一个方面涉及生产液体培养基的方法，所述方法包括提供根据本发明的固体培养基，例如以干粉形式、颗粒形式、丸粒形式、或片剂形式提供；并将所述固体培养基溶解在水性介质，例如水中。
本发明的另一方面涉及根据本发明的组合物在用于培养细胞的培养基中的用途。本发明的另一个方面涉及根据本发明的组合物用于细胞培养的用途。
本发明还涉及制造细胞培养产物的方法，包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与本发明的培养基接触；(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。同样，本发明涉及根据本发明的组合物用于制造细胞培养产物的用途。
在优选的方法中，细胞培养产物是治疗蛋白、诊断蛋白、多糖例如肝素、抗体、单克隆抗体、生长因子、白细胞介素、病毒、病毒样颗粒或酶。
根据本发明，细胞的培养可以分批培养、补料分批培养或连续培养进行。
实施例
材料：
表1：用于体外细胞毒性测定的材料
表2：用于体外细胞毒性测定的装置。
方法：
体外细胞毒性测定
人间充质干细胞(MSC)在MesenCultTM-ACF Plus培养试剂盒(StemcellTechnologies)中培养。根据制造商的说明制备培养基，添加30mg/mL庆大霉素和2mM L-谷氨酰胺。Agarabi CHO细胞在补充有6mM L-谷氨酰胺的ActiPro培养基中培养。“完全生长培养基”是指用于培养相应细胞类型的添加补充剂的培养基。
Cu(II)、L-半胱氨酸、N,N'-二-L-丙氨酰-L-胱氨酸((Ala Cys)2)和N,N'-二-L-赖氨酰-L-胱氨酸((Lys-Cys)2)的储备溶液在使用前立即溶解在相应的完全生长培养基中。对于在MSC上使用Cu(II)和L-半胱氨酸、(Ala-Cys)2或(Lys-Cys)2组合进行的测定，将溶解的单一化合物以2x处理浓度混合在一起。在MSC上，以0.5mM、1mM和5mM测试L-半胱氨酸和二肽；以0.2μM、1μM和5μM测试Cu(II)。对于Agarabi CHO细胞的处理，用完全生长培养基对L-半胱氨酸、(Ala-Cys)2和(Lys-Cys)2储备溶液进行系列稀释，每个稀释步骤使用2x处理浓度。在Agarabi CHO细胞上，以2.5mM、5mM和10mM测试L-半胱氨酸和二肽；以2.5μM、10μM和40μM测试Cu(II)。
在白色96孔细胞培养板中以5000个细胞/孔培养的MSC和Agarabi CHO细胞上测定测试化合物及其组合的细胞毒性。将MSC(50μL/孔)在CO2培养箱(37℃,5％ CO2,95％湿度)中培养24小时，以确保细胞贴壁。随后添加制备好的2x浓缩测试化合物和混合物(50μL/孔)。将板温育24小时(37℃,5％ CO2,95％湿度)。使用单一化合物以及在完全生长培养基中培养且不含任何额外化合物的MSC作为对照。每个条件一式三份进行测试。使用完全生长培养基以及含有2x浓缩Cu(II)测试浓度的完全生长培养基接种Agarabi CHO细胞(50μL/孔)。随后立即添加50μL准备好的L-半胱氨酸、(Ala-Cys)2和(Lys-Cys)2系列稀释液。Agarabi CHO细胞孵育96小时(37℃,5％ CO2,95％湿度)。Agarabi CHO细胞上的所有单一组分(“单一组分对照”)、不添加任何测试化合物的完全生长培养基中的Agarabi CHO细胞(“未处理的细胞”)以及含有和不含有Cu(II)与L-半胱氨酸、(Ala-Cys)2或(Lys-Cys)2组合(“培养基空白”)的完全生长培养基用作对照。对于对照，以测试的最高浓度使用化合物。对每种条件进行四次重复测试。
孵育后，根据制造商的说明，使用CellTiter-发光细胞活力测定(Promega)根据三磷酸腺苷(ATP)定量来确定处理细胞的活力。
为了计算细胞活力，对所得发光值进行平均并针对未处理细胞发出的信号归一化。
实施例1：用二肽替代半胱氨酸消除了微量金属的负面影响，甚至有助于提高活力
在细胞培养基中添加不同浓度的L-半胱氨酸和Cu(II)导致了浓度依赖性的细胞活力的显著降低(图1A和B)。用等摩尔量的二肽(Ala-Cys)2和(Lys-Cys)2替代L-半胱氨酸，没有观察到毒性作用。相反，二肽与Cu(II)结合甚至增加了活力，提供了有益效果(图2A和B、图3A和B)。这为使用二肽代替L-半胱氨酸来增加细胞培养基中Cu(II)浓度以及L-半胱氨酸源浓度提供了可能性。研究了以各自浓度添加单个化合物作为对照。用L-半胱氨酸仅观察到最高测试浓度下的毒性(图4)。
图1-A和1-B显示了不同浓度和比例的Cu(II)和L-半胱氨酸添加分别对MSC和CHO细胞活力的影响。随着Cu和L-半胱氨酸浓度的增加，观察到毒性强烈增加。
图2-A和2-B显示了不同浓度和比例的Cu(II)和(Ala-Cys)2添加分别对MSC和CHO细胞活力的影响。与图1-A和1-B相比，没有观察到毒性作用。对于(Ala-Cys)2和Cu(II)的选定组合，观察到对活力的显著的积极影响。
图3-A和3-B显示了不同浓度和比例的Cu(II)和(Ala-Cys)2添加分别对MSC和CHO细胞活力的影响。与图1-A和1-B相比，没有观察到毒性作用。对于选定的(Lys-Cys)2和Cu(II)组合，观察到对活力有显著的积极影响。
图4显示了对照实验，描述了添加不同浓度的单一组分(L-半胱氨酸、(Ala-Cys)2、(Lys-Cys)2、Cu(II))对MSC活力的影响。只有L-半胱氨酸对活力产生负面影响。高达5μM(MSC)或40μM(CHO细胞)的Cu(II)对活力没有负面影响。
总之，令人惊奇地发现，通过添加肽以及当L-半胱氨酸被Cys-肽替代时，可以降低Cu(II)催化的L-半胱氨酸毒性。因此可以安全地向细胞提供更高浓度的微量金属，甚至可以提高活力。

Claims (15)

1.一种组合物，所述组合物包含
-至少一种由两个氨基酸组成的二肽，所述氨基酸是天然氨基酸并且至少一个所述氨基酸是半胱氨酸(Cys)，和
-至少一种微量金属离子，
其中所述二肽与所述微量金属离子的摩尔比为10000至20。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述二肽与所述微量金属离子的摩尔比为5000至20，优选为1000至20。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述微量金属选自铁、锂、锌、铜、铬、镍、钴、钒、钼、锰，所述微量金属离子优选为铜离子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽浓度为0.1至200mM，优选0.2至20mM，最优选0.5至10mM，并且所述微量金属离子浓度为0.1至400μM，优选0.2至100μM，最优选0.5至20μM。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽是Xxx-Cys或Cys-Xxx，其中Xxx是天然氨基酸，所述二肽优选是Ala-Cys、Cys-Ala、Lys-Cys或Cys-Lys。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述二肽是Xxx-Cys或Cys-Xxx并且是氧化和二聚化形式。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其进一步包含游离半胱氨酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述二肽结合的半胱氨酸与所述游离半胱氨酸的摩尔比为约0.1至10，优选为约0.2至4，最优选为约0.5至2。
9.一种化妆品、营养补充剂、用于临床营养的营养液，其包含根据前述权利要求中任一项所述的组合物。
10.一种细胞培养基，所述细胞培养基包含根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，所述培养基还包含至少一种碳水化合物，和/或至少一种另外的游离氨基酸，和/或至少一种无机盐，和/或缓冲剂和/或至少一种维生素。
11.根据权利要求10所述的培养基，其中所述培养基为液体形式、凝胶、粉末、颗粒、丸粒形式或片剂形式。
12.根据权利要求10或11中任一项所述的培养基，其中相对于使用中的培养基的浓度，所述培养基是2至100倍浓缩的形式，优选2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的培养基用于培养细胞的用途，优选作为水性储备溶液或补料溶液用于培养细胞的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述细胞选自由CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、NS0细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞、免疫细胞如NK细胞或T细胞，和杂交瘤细胞组成的组。
15.一种制造细胞培养产品的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供能够产生所述细胞培养产品的细胞；
-使所述细胞与权利要求10至12中任一项所述的培养基接触；和
-从所述培养基或从所述细胞中获得所述细胞培养产物。
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