KR20190126844A - 올리고펩티드를 포함하는 배양 배지 - Google Patents

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KR20190126844A
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에보니크 데구사 게엠베하
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Abstract

본 발명은 2 내지 10개 아미노산 길이의 적어도 하나의 올리고펩티드를 포함하는 배양 배지, 바람직하게는 세포 배양 배지에 관한 것으로, 상기 아미노산은 천연 아미노산이고, 상기 아미노산 중 적어도 하나는 리신 (Lys)이고 하나의 추가의 아미노산은 시스테인 (Cys), 시스틴 (Cyss), 류신 (Leu), 티로신 (Tyr), 발린 (Val) 및 이소류신 (Ile)으로부터 선택되고 올리고펩티드는 적어도 0.1 mM의 양으로 존재한다. 본 발명은 추가로, 세포, 바람직하게는 식물 세포, 동물 세포 또는 포유동물 세포를 배양하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 (i) 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 세포를 본 발명에 따른 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 배양 배지 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

올리고펩티드를 포함하는 배양 배지
본 발명은 생명공학 생산 프로세스에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 생명공학 생산 프로세스에 사용하기 위한 개선된 배양 배지, 이러한 개선된 배지를 이용하는 프로세스, 및 개선된 배양 배지를 사용하여 상기 프로세스로부터 수득된 산물에 관한 것이다.
생명공학 프로세스는 생물학적 산물의 생산에 널리 사용된다. 이들 프로세스는 전형적으로, 배양된 세포에 의한 성장 및 산물 형성이 허용되는 조건 하에 배양 배지에서 세포의 배양을 수반한다. 생명공학 생산에 유용한 세포는 박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포, 및 동물 또는 식물 기원의 세포이다.
동물 세포 배양은 생물학적 산물, 예컨대 치료용 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 다른 생물학적 분자, 예컨대 치료용 폴리사카라이드의 생산에 오랫동안 사용되어 왔다. 이러한 세포 배양 프로세스에서, 원하는 산물을 생산하도록 정상적으로 유전적으로 변형된 동물 세포는 세포 증식 및 산물 형성을 위해 액체, 고체 또는 반고체 배양 배지에서 배양된다. 세포 배양의 한 가지 중요한 이점은 동물 세포 및 식물 세포가 1차 산물의 번역 후 변형, 예컨대 폴리펩티드의 폴딩 및 번역 후 변형을 수행할 수 있다는 사실이다.
생명공학 생산 프로세스, 특히 동물 세포 배양에서, 세포 배양 조건의 제어 및 최적화는 세포 증식 및 산물 형성에 매우 중요하다. 한 가지 결정적인 요인은 배지 조성이다. 최종 세포 배양 산물의 농도 및 품질은 배지 조성에 따라 아주 많이 좌우된다. 동물 및 식물 세포 배양은 특히, 필요한 영양소 조성물 및 배양 조건의 관점에서 요구된다. 필요한 영양소는 탄소, 질소 및 에너지에 대한 기본 공급원, 예컨대 당 및 암모니아 뿐만 아니라 더 복잡한 영양소, 예컨대 필수 아미노산, 성장 인자 및 비타민을 포함한다. 이러한 이유로, 동물 세포 배양 배지를 혈청과 같은 복합 영양소 조성물로 보충하는 것은 동물 세포에 광범위한 영양소를 제공하기 위해 사용되어 왔다. 그러나, 규제 및 안전성 문제 뿐만 아니라 이용가능한 혈청 공급원의 이질성 문제로 인해 산업계는 산업 세포 배양 프로세스로부터 혈청 및 다른 비-규정된 배지를 제거하기 위해 노력하여 왔다. 그러나, 무혈청 배지에서 성장된 세포 배양물은 종종, 영양 결핍을 나타낸다. 이러한 이유로, 복합 배지의 영양 성분 뿐만 아니라 세포 배양물에서 만족스러운 성장 및 단백질 형성에 필요한 그의 최적의 농도를 확인하기 위해 많은 노력이 이루어졌다.
세포 배양물에 아미노산을 공급하는 것은 성장 속도 및 생산에 상당한 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 글루타민은 배양된 세포에 대한 중요한 탄소, 질소 및 에너지 공급원이기 때문에, 세포 배양 배지에서 일상적으로 사용된다. 동물 세포 배양물의 최적 성장에 필요한 글루타민의 양은 다른 아미노산의 양보다 3 내지 10배 더 많은 것으로 입증되었다 (Eagle et al., Science 130:432-37). 그러나, 열 멸균 조건과 같이 고온에서 물에 용해되는 경우 영양소로서의 글루타민은 불안정한데, 이는 피로글루타메이트 및 암모니아가 열에 의해 형성되기 때문이다 (Roth et al. 1988, In Vitro Cellular & Developmental Biology 24(7): 696-98). 이러한 이유로, 글루타메이트는 종종, 글루타민 대신 세포 배양 배지에 사용된다 (Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-based Therapies, 52, Sadettin et al., Eds., Taylor and Francis Group, 2006). 다른 군은 글루타민-함유 디펩티드, 예컨대 알라닐-글루타민 또는 글리실-글루타민을 세포 배양 배지에 부가함으로써 원치 않는 물질, 예컨대 피로글루타메이트 및 암모니아의 형성을 피하려고 노력하였다 (Roth et al. (1988), In Vitro Cellular & Developmental Biology 24(7): 696-98). 또 다른 군은 열 멸균 조건 하에 보다 안정하게 하기 위해 디펩티드를 아실화하는 것을 제안하였다. US 5,534,538에는 N-아실 디펩티드 및 열 멸균된 장내 또는 비경구 영양 산물 뿐만 아니라 세포 배양 배지에서의 그의 용도가 기재되어 있다.
문헌 [Franek et al. (2002, Biotechnol. Prog. 18, 155-158; US 2004/0072341)]에서는 다양한 합성 올리고펩티드 (올리고-Gly, 올리고-Ala 포함)를 대상으로, 무혈청 배지에서 마우스 세포주에 대한 그의 효과에 관하여 스크리닝하였다. 상기 문헌의 저자들은 단일 아미노산과 시험된 디펩티드가 배양 성능을 상당히 변경시키지는 못하였지만, 트리-, 테트라- 및 펜타-글리신 뿐만 아니라 트리- 및 테트라-알라닌은 생육성 세포 밀도 및 세포 생육력을 증강시켰다고 보고하였다.
문헌 [Franek et al. (2003, Biotechnol. Prog. 19, 169-174)]에서는 무작위로 선택된 각종 리신 함유 펩티드를 대상으로, 무혈청 기초 배지를 사용하여 하이브리도마 세포에 대한 그의 효과에 관하여 시험하였다. 이들은 Gly-Lys, Gly-Lys-Gly, Gly-His-Lys, Lys-Lys-Lys, Gly-Phe-Gly 및 Gly-Gly-Lys-Ala-Ala였다. 상기 문헌의 저자들은 세포 성장의 억제, 및 트리-, 테트라 및 펜타-펩티드에 대한 증가된 역가를 발견하였다. 그러나, 기초 배지가 또한 펩티드 구성성분을 함유하였기 때문에 결론을 도출하기가 어렵다. 또한, 상기 저자들은 0.2% (w/v)의 농도를 사용하였고 용해도에 대한 잠재적인 영향력에 관해서는 논의하지 않았다.
WO 2011/133902는 디펩티드를 포함하는 세포 배양 배지를 개시하며, 여기서 디펩티드는 수중 용해도가 낮은 아미노산, 이러한 경우 티로신 및 시스테인을 포함한다. 시스테인은 수중 용해도가 낮을 뿐만 아니라 반응성 티올 기의 존재로 인해 불안정하다. 상기 문헌의 저자들은 디펩티드에 티로신과 시스테인을 혼입함으로써, 아미노산의 용해도 및 안정성 문제가 완화될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 상기 저자들은 또한, 그로써 생성된 세포 배양 배지의 개선된 저장 수명을 밝혀내었다. 한 실시양태에서, 디펩티드의 나머지 아미노산 (시스테인 또는 티로신이 아님)은 아스파라긴이다.
WO 2012/019160은 동물 세포 배양을 개시하며, 여기서 생산 단계 동안 무혈청 배지에 Tyr- 및 His-함유 디펩티드가 보충된다. 성장 및 산물 형성에 대한 Tyr- 및 His-함유 디펩티드의 부가의 긍정적인 효과가 기재되어 있다. 이는 또한 Tyr-Lys를 포함한다.
상이한 디펩티드가 WO 2011/133902 및 WO 2012/019160에 언급되어 있지만, 효과는 디펩티드 L-알라닐-L-티로신 및 L-알라닐-L-시스틴에 대해서만 기재되어 있다. 이들 알라닐-디펩티드의 용해도는 각각 8.7 g/ltr 및 15.3 g/ltr이며, 이는 상응하는 아미노산 (시스틴: 0.1 g/ltr, 티로신: 0.4 g/ltr)에 대해서 보다 더 높다. 그러나, 이들 값은 다른 아미노산과 비교할 때 낮으며, 이에 따라 피드 프로세스에서 사용되는 것과 같은 고 농도 배지에서의 적용이 제한된다. 추가의 단점으로서, 알라닐-디펩티드를 사용할 때, L-알라닌이 방출되는데, 이는 통상적인 세포 배양 배지, 예를 들어, DMEM 및 RPMI 1640 [시그마(Sigma)]에 함유되지 않고 세포에 의해서도 요구되지 않는 것으로 보인다. 사실상, 세포 배양 배지에서 L-글루타민 대신 L-알라닐-L-글루타민을 사용할 때, 세포 배양 배지에서 4배 더 높은 농도의 알라닌이 발견되었다 (M. Christie, J. Butler, Biotechnol. 37 (1994) 277). 세포가 문헌 [DeBerardinis et al. (2007, Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 19345-50)]에 보고된 바와 같이 L-알라닌을 축적하는 경향이 있기 때문에, 알라닌을 수반하지 않는 생체이용가능한 올리고펩티드가 필요하다.
EP 0220379 및 DE3538310은 세포 배양 배지에서의 글루타민-함유 디펩티드 및 트리펩티드의 용도를 개시한다. 글루타민은 고온 하에서의 글루타민의 불안정성으로 인한 문제를 피하기 위해 디펩티드의 형태로 부가된다. 글루타민-함유 디펩티드는 온도 비감수성 글루타민 공급원으로서 사용된다.
상기 선행 기술분야에 기재된 세포 배양 배지는 특정 세포 배양 프로세스에 대해 만족스러운 성능 및 특성을 제공하지만, 선행 기술분야의 배양 배지는 여전히 최적이 아니다. 생명공학 생산 프로세스에서 더 나은 성장 및 산물 형성을 촉진시켜 주는 추가의 개선된 배양 배지에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
특히, 올리고펩티드를 보다 높은 농도로 포함하는 세포 배양 배지, 특히 표준 배지, 예컨대 예를 들어, DMEM 및 RPMI-1640에 함유된 아미노산으로부터 제조된 올리고펩티드를 포함하는 세포 배양 배지가 필요하다. 추가로, 이러한 올리고펩티드는 특이적 보호 기를 사용할 필요 없이 제조하기가 용이해야 한다.
공지된 배양 배지의 상기 단점은 본 발명에 의해 해결된다. 본 발명은 첨부된 독립 청구항의 관점에 의해 규정된다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 종속 청구항에 의해 규정된다.
따라서, 본 발명은 2 내지 10개 아미노산 길이의 적어도 하나의 올리고펩티드를 포함하는 배양 배지, 바람직하게는 세포 배양 배지에 관한 것으로, 상기 아미노산은 천연 아미노산이고, 상기 아미노산 중 적어도 하나는 리신 (Lys)이고 하나의 추가의 아미노산은 시스테인 (Cys), 시스틴 (Cyss), 류신 (Leu), 티로신 (Tyr), 발린 (Val) 및 이소류신 (Ile)으로부터 선택되고, 올리고펩티드는 적어도 0.1 mM의 양으로 존재한다.
본 발명은 추가로, 세포, 바람직하게는 식물 세포, 동물 세포 또는 포유동물 세포를 배양하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 (i) 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 세포를 본 발명에 따른 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 배양 배지 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 본 발명의 하기 상세한 설명에서 추가로 상세히 기재된다.
도 1은 본 발명에 따른 올리고펩티드로 수득된 TC-42 배지를 사용한 경우의 최대 생육성 세포 밀도를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 올리고펩티드로 수득된 TC-42 배지를 사용한 경우의 최대 생육성 세포 밀도를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 올리고펩티드로 수득된 TC-42 배지를 사용한 경우의 최대 생육성 세포 밀도를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 올리고펩티드로 수득된 TC-42 배지를 사용한 경우의 최종 항체 역가를 도시한 것이다.
본 발명에 따른 "배양 배지"는 영양소를 함유하는 액체 또는 고체 배지인 것으로서 이해될 것이며, 이러한 배지는 배양물 중의 세포에 영양소를 제공하고 세포의 수명 및/또는 산물 형성을 지원하는데 적합하다. 본 발명에 따라서 배양된 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 곤충 세포, 및/또는 식물 세포, 예를 들어 조류일 수 있다. 전형적으로, 배양 배지는 필수 및 비-필수 아미노산, 비타민, 적어도 하나의 에너지 공급원, 지질, 및 미량 원소를 제공하는데, 이는 모두 수명, 성장 및/또는 산물 형성을 유지하기 위해 세포에 의해 요구된다. 배양 배지는 또한, 호르몬 및 성장 인자를 포함하여, 최소 속도 초과로 성장 및/또는 생존을 증강시키는 성분을 함유할 수 있다. 배양 배지는 바람직하게는, 세포의 수명, 성장 및/또는 산물 형성을 지원하는 pH 및 염 농도를 갖는다. 본 발명에 따른 배양 배지는 바람직하게는, 세포 배양물의 수명 및 증식을 유지하는데 필요한 모든 영양소를 포함한다. 바람직한 배양 배지는 규정된 배지이다.
본 발명에 따른 "규정된 배지"는 세포 추출물, 세포 가수분해물, 또는 단백질 가수분해물을 함유하지 않는 배지이다. 바람직한 규정된 배지는 공지되지 않은 조성의 성분을 포함하지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같이, 규정된 배지는 통상적으로, 동물 유래 성분을 함유하지 않는다. 바람직하게는, 규정된 배지의 모든 성분은 공지된 화학 구조를 가지고 있다. 바람직한 규정된 배지는 무혈청 배지이다. 다른 바람직한 규정된 배지는 합성 배지이다. 규정된 배양 배지 이외의 배양 배지는 "복합" 배양 배지로서 지칭된다.
"세포 배양 배지"는 동물 세포 및/또는 식물 세포의 수명, 증식 및/또는 산물 형성을 유지하는데 적합한 배양 배지인 것으로서 이해될 것이다. 특정 실시양태에서, 기초 배지와 피드 배지 간을 구별할 수 있다.
"기초 배지"는 세포의 배양이 개시되는 영양소를 함유하는 용액 또는 물질인 것으로서 이해될 것이다. "피드 배지"는 배양 프로세스의 시작 후 세포에 공급되는 용액 또는 물질인 것으로서 이해될 것이다. 특정 실시양태에서, 피드 배지는 기초 배지에 존재하지 않는 하나 이상의 성분을 함유한다. 피드 배지는 또한, 기초 배지에 존재하는 하나 이상의 성분이 결여될 수 있다. 바람직하게는, 피드 배지 중의 영양소의 농도는 기초 배지 중의 농도를 초과하여 희석에 의한 생산성의 손실을 피한다.
본 발명에 따른 "영양소"는 세포가 생존하고 성장하는데 필요한 화학적 화합물 또는 물질이다. 영양소는 바람직하게는, 환경으로부터 세포에 의해 흡수된다. 영양소는 "유기 영양소" 및 "무기 영양소"일 수 있다. 유기 영양소는 탄수화물, 지방, 단백질 (또는 그의 빌딩 블록, 예를 들어 아미노산), 및 비타민을 포함한다. 무기 영양소는 무기 화합물, 예컨대, 예를 들어 식이 미네랄 및 미량 원소이다. "필수 영양소"는 세포가 스스로 합성할 수 없는 영양소이며, 따라서 배양 배지에 의해 세포에 제공되어야만 한다.
본 발명에 따른 "세포 배양 산물"은 세포 배양물 중의 세포에 의해 생산된 임의의 유용한 생물학적 화합물인 것으로서 이해될 것이다. 본 발명의 바람직한 세포 배양 산물은 치료용 단백질, 진단용 단백질, 치료용 폴리사카라이드, 예컨대 헤파린, 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체, 성장 인자, 인터류킨, 펩티드 호르몬, 효소, 및 바이러스이다. 치료 용도를 위한 줄기 세포의 배양을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 실시양태에서, 세포 자체는 세포 배양 산물로서 이해될 것이다.
본 발명의 맥락에서, "아미노산"은 아미노 작용기 (-NH2) 및 카르복실산 작용기 (-COOH)를, 각각의 아미노산에 특이적인 측쇄와 함께 포함하는 분자인 것으로서 이해될 것이다. 본 발명의 맥락에서, 알파-아미노산과 베타-아미노산 둘 다가 포함된다. 본 발명의 바람직한 아미노산은 알파-아미노산, 특히 하기와 같이 시스틴을 포함한 20개의 "천연 아미노산"이다:
알라닌 (Ala / A)
아르기닌 (Arg / R)
아스파라긴 (Asn / N)
아스파르트산 (Asp / D)
시스테인 (Cys / C)
시스틴 (Cyss / C2)
글루탐산 (Glu / E)
글루타민 (Gln / Q)
글리신 (Gly / G)
히스티딘 (His / H)
이소류신 (Ile / I)
류신 (Leu / L)
리신 (Lys / K)
메티오닌 (Met / M)
페닐알라닌 (Phe / F)
프롤린 (Pro / P)
세린 (Ser / S)
트레오닌 (Thr / T)
트립토판 (Trp / W)
티로신 (Tyr / Y)
발린 (Val/V)
본 발명의 맥락에서, 디술피드 결합을 형성하므로 시스테인을 함유하는 Cys-펩티드는 X2-Cyss로써 기재될 것이다.
본 발명의 맥락에서, 표현 "천연 아미노산"은 상기 열거된 20개 아미노산의 L-형과 D-형 둘 다를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, L-형이 바람직하다. 한 실시양태에서, 용어 "아미노산"은 또한, 이들 아미노산의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
본 발명에 따른 "유리 아미노산"은 그의 아미노 및 그의 (알파-) 카르복실 작용기를 유리 형태로 갖는, 즉 다른 분자와 공유적으로 결합되지 않은 아미노산, 예를 들어, 펩티드 결합을 형성하지 않는 아미노산인 것으로서 이해된다. 유리 아미노산은 또한, 염 또는 수화물 형태로 존재할 수 있다. 올리고펩티드의 일부로서 또는 올리고펩티드에서 아미노산을 지칭할 때, 이는 생화학 및 펩티드 생합성의 공지된 메커니즘에 따라서, 각각의 아미노산으로부터 유래된 각각의 올리고펩티드 구조의 일부를 지칭하는 것으로서 이해될 것이다.
본 발명에 따른 "성장 인자"는 세포 성장, 증식 및 세포 분화를 자극할 수 있는 임의의 자연적으로 발생하는 물질인 것으로서 이해될 것이다. 바람직한 성장 인자는 단백질 또는 스테로이드 호르몬의 형태이다. 본 발명의 한 실시양태에 따르면, 표현 "성장 인자"는 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 염기성 FGF를 포함한 FGF, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 상피 성장 인자 (EGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 전환 성장 인자 (TGF)알파 및 TGF베타를 포함한 TGF, 시토카인, 예컨대 인터류킨 1, 2, 6, 과립구 자극 인자, 및 백혈구 억제 인자 (LIF)로 이루어진 목록으로부터 선택된 성장 인자와 관련이 있는 것으로서 해석될 것이다.
본 발명에 따른 "올리고펩티드"는 2 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 화합물인 것으로서 이해될 것이다. 본 발명의 보다 바람직한 올리고펩티드는 2 내지 10개의 아미노산, 2 내지 6개의 아미노산, 2 내지 5개의 아미노산, 2 내지 4개의 아미노산, 또는 2 내지 3개의 아미노산으로 이루어진 올리고펩티드이다. 본 발명에 따른 가장 바람직한 올리고펩티드는 디펩티드이다.
"펩티드"는 펩티드 결합에 의해 서로 공유적으로 커플링된 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 분자 (R1-CO-NH-R2)인 것으로서 이해될 것이다.
아미노산과 연계해서 본원에 사용될 때 "Xxx"라는 표현은 상기 열거된 바와 같은 임의의 천연 아미노산을 지칭하는 것으로서 이해될 것이다.
화학적 화합물, 예컨대 아미노산과 관련하여 표현 "N-아실화된"은 N-아실화된 화합물의 질소 작용기에 아실 기를 부가함으로써 N-아실화된 화합물이 변형되는 것을 의미하는 것으로서 이해될 것이다. 바람직하게는, 아실 기가 아미노산의 알파-아미노 기에 부가된다.
영양소 조성물, 배양 배지, 세포 배양 배지 등의 "멸균 형태"는 상기 조성물, 배양 배지, 세포 배양 배지 등에 임의의 살아있는 물질의 부재를 규정하는 것으로서 이해될 것이다.
본 발명의 맥락에서 "고체 배양 배지"는 임의의 비-액체 또는 비-기체 배양 배지인 것으로서 이해될 것이다. 본 발명의 바람직한 고체 배양 배지는 겔 유사 배양 배지, 예컨대 한천-한천, 카라긴 또는 젤라틴이다.
본 발명의 맥락에서, "세포의 계대 접종" (세포의 계대 배양 또는 분할로서 공지되기도 함)은 적은 수의 세포를 새로운 배양 용기로 옮기는 것을 의미하는 것으로서 이해된다. 세포는 장기간 높은 세포 밀도와 연관된 노화를 피하기 때문에, 이들이 규칙적으로 분할되는 경우에 더 오랜 시간 동안 배양될 수 있다. 현탁 배양은 더 큰 부피의 신선한 배지에 희석된 몇 개의 세포를 함유하는 소량의 배양물로 용이하게 계대 접종된다.
본 발명은 일반적으로 배양 배지, 바람직하게는 세포 배양 배지에 관한 것으로, 상기 배양 배지는 2 내지 10개 아미노산 길이의 적어도 하나의 올리고펩티드를 포함하고, 상기 아미노산은 천연 아미노산이며 상기 아미노산 중 적어도 하나는 리신 (Lys)이고 하나의 추가의 아미노산은 시스테인 (Cys), 시스틴 (Cyss), 류신 (Leu), 티로신 (Tyr), 발린 (Val) 및 이소류신 (Ile)으로부터 선택되며 올리고펩티드는 적어도 0.1 mM의 양으로 존재한다. 리신의 사용은 세포 배양 적용을 위해 가장 상업적으로 이용가능한 펩티드의 주요 구성성분인 알라닌과 같은 낭비적인 아미노산의 축적을 피한다.
디펩티드 Tyr-Lys는 바람직하게는 배제된다.
바람직한 실시양태에서 C- 또는 N-말단 아미노산 중 하나가 리신 유닛이다. C- 및 N-말단 서열은 상이한 CAS 번호에 의해 입증되는 바와 같이 세포 배양에 영향을 미칠 수 있다는 것에 유의해야 한다.
놀랍게도, 리신 펩티드는 공개된 데이터 [쉬핀더(Scifinder) 및 어드밴스드 케미스트리 디벨롭먼트 (ACD/Labs) 소프트웨어 V11.02 (ⓒ 1994-2016 ACD/Labs)를 사용하여 계산됨]에 근거하여 예상되어야 하는 것보다 더 높은 용해도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 비스-L-리실-L-시스틴 히드로클로라이드의 경우, > 50% (w/w)의 용해도로 밝혀졌으며, 이는 계산된 용해도 4.2% (w/w)를 상당히 초과한다.
표 1에는 상이한 아미노산 및 디펩티드의 용해도가 요약되어 있다. 또한, 리신 펩티드의 바람직한 실시양태는, 세포 성장을 유도하지 않은 다른 리신-펩티드와는 달리, 세포를 성장시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 문헌 [A. Nagamatsu und T. Hayashida (Chemical & Pharmaceutical Bulletin 22, 2680 (1974))]에서는 플라스민 및 트립신으로 Lys-Leu, Lys-Tyr 및 Lys-Lys의 가수분해를 분석한 결과, 이들 펩티드 중 어느 것도 절단되지 않은 것으로 밝혀졌기 때문에, 상기 결과는 놀라운 것이다. 높은 용해도와 생체 이용률을 조합함으로써, lys-펩티드는 높은 아미노산 농도를 수반한 세포 배양 배지 및 피드를 제조하는 문제를 해결하는 새로운 방식을 제공한다.
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1) 문헌 [CRC Handbook of Chemistry and Physics, 58th Ed., 1977, page C-769]
2) 문헌 [WO 2011/133902, Life Techn., page 40]
3) 쉬핀더; 어드밴스드 케미스트리 디벨롭먼트 (ACD/Labs) 소프트웨어 V11.02 (ⓒ 1994-2016 ACD/Labs)를 사용하여 계산됨
4) MSDS 바켐 아게(MSDS Bachem AG)
5) 문헌 [Product Brochure Peptides, Degussa AD, GB Industrie- und Feinchemikalien, 1988]
6) 히드로클로라이드로서
7) 아세테이트로서
표 1: 아미노산 및 디펩티드의 용해도 (g/1000 g 용액)
다른 바람직한 실시양태에서, 올리고펩티드는 2 내지 6개의 아미노산, 2 내지 5개의 아미노산, 2 내지 4개의 아미노산, 또는 2 내지 3개의 아미노산 길이이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 올리고펩티드는 디펩티드이다.
본 발명자들은 이러한 종류의 배양 배지가 선행 기술분야의 세포 배양 배지보다 우월한 특성을 갖는다는 것을 밝혀내었다.
펩티드, 특히 디펩티드 Lys-Xxx는 이중으로 N-보호된 리신을 하나 이상의 아미노산과 단순히 커플링함으로써 합성될 수 있다. 이는 N-보호된 아미노산 Xxx가 필요할 뿐만 아니라 선택적으로 ε-보호된 리신이 필요한 합성을 위해, 역 서열 Xxx-Lys의 합성보다 수행하기가 상당히 더 용이하다. 디펩티드 Lys-Xxx의 합성을 위한 리신의 통상의 유도체는, 예를 들어, 비스-N,N-카르복시벤질-L-리신 (Z-Lys(Z)-OH) 및 비스-N,N-tert.-부틸옥시카르보닐-L-리신 (Boc-Lys(Boc)-OH)이다.
세포 배양 배지가 사용되는 pH 범위 (통상적으로 pH 7.2 내지 7.4)에서, 리실 디펩티드는 아미노기 중 하나의 양성자화로부터 생성되는 그의 염의 형태이다. 염의 형성을 위해, 세포 배양물과 화합성인 모든 산이 사용될 수 있다. 가장 흔한 염은 클로라이드, 황산염, 질산염, 인산염 및 탄산염이다. 그러나, 유기 산, 예를 들어 포름산, 아세트산, 락트산, 글루탐산 또는 아스파르트산이 또한 사용될 수 있다.
리실 디펩티드는 상응하는 알라닐 디펩티드보다 상당히 더 쉽게 물에 용해된다.
한 실시양태에서, 올리고펩티드는 Lys-Xxx 또는 Xxx-Lys이며, 여기서 Xxx는 Cys, Cyss, Leu, Tyr, Val 및 Ile로부터 선택된 천연 아미노산이다. 또 다른 특히 바람직한 실시양태에서, 올리고펩티드는 Lys-Xxx이며, 여기서 Xxx는 Cys, Cyss, Leu, Tyr, Val 및 Ile로부터 선택된 천연 아미노산 및 그의 임의의 조합이다.
하나의 추가로 유리한 입체 배치에서, 올리고펩티드는 Lys-Cys, Lys2-Cyss, Lys-Leu, Lys-Tyr, Lys-Val 및 Lys-Ile로부터 선택된다.
한 실시양태에서, Tyr, Cys, Leu, Ile, Val을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 낮은 용해도를 갖는 아미노산은 Lys-Xxx 또는 Xxx-Lys 펩티드에 의해 완전히 또는 부분적으로 대체된다. 이와 동시에, 리신 (염 또는 무염 형태)의 양은 동일한 양 만큼 감소된다. 리신에 대한 세포의 높은 수요로 인해, 원래의 제형에서 리신 양을 초과하지 않고서도 낮은 용해도를 수반한 아미노산을 Lys-Xxx 또는 Xxx-Lys 펩티드로 대체하는 것이 실현될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 올리고펩티드는 N-아실화되지 않는다. N-아실화는 특정의 올리고펩티드의 열 안정성을 개선시키는 것으로 공지되어 있으며; 그러나, N-아실화된 올리고펩티드는 또한, 열악한 생육성 세포 밀도 및 생육력을 초래할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
한 실시양태에서, 배양 배지는 적어도 하나의 탄수화물, 적어도 하나의 유리 아미노산, 적어도 하나의 무기 염, 완충제 및/또는 적어도 하나의 비타민을 추가로 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 적어도 하나의 탄수화물, 적어도 하나의 유리 아미노산, 적어도 하나의 무기 염, 완충제 및 적어도 하나의 비타민을 모두 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 배양 배지는 성장 인자를 함유하지 않는다. 이러한 실시양태에 따르면, 본 발명의 올리고펩티드는 배양물 중의 세포의 성장 및/또는 증식을 촉진하기 위하여 성장 인자 대신 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 배양 배지는 임의의 지질을 함유하지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에 따르면, 배양 배지는 액체 형태, 겔 형태, 분말 형태, 과립 형태, 펠릿 형태 또는 정제 형태이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 배양 배지는 규정된 배지, 또는 무혈청 배지이다. 예를 들어, 본 발명의 올리고펩티드는 밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotech; 독일 베르기슈 글라트바흐)의 CHOMACS CD 배지, 론자 (LONZA; 스위스 바젤)로부터 입수가능한 파워CHO-2 CD 배지, PAA [PAA 래보러토리즈 (PAA Laboratories; 오스트리아 파싱)]의 악티-CHO P 배지, SAFC로부터 입수가능한 엑스-셀(Ex-Cell) CD CHO 배지, 써모피셔 (ThermoFisher; 미국 월섬)의 SFM4CHO 배지 및 CDM4CHO 배지에 보충될 수 있다. 본 발명의 올리고펩티드는 또한, DMEM 배지 [라이프 테크놀로지스 코포레이션 (Life Technologies Corp.; 미국 칼즈배드)]에 보충될 수 있다. 그러나, 본 발명은 상기 배지의 보충으로 제한되지 않는다.
다른 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는, 사용 중인 상기 배지의 농도에 비해, 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배 또는 10배 농축된 형태 (부피/부피)의 액체 배지이다. 이는 상기 농축된 배지를 각각의 부피의 멸균 수로 간단히 희석시킴으로써 "즉시 사용가능한" 배양 배지의 제조를 가능하게 한다. 이러한 본 발명의 배지의 농축된 형태는 또한, 예를 들어 공급 배치식 배양 프로세스에서 배양물에 이를 부가함으로써 사용될 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는, 지속적인 성장 및 산물 형성에 필요한 모든 영양소를 함유한다. 배양 배지, 특히 세포 배양 배지를 제조하기 위한 레시피는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Oeztuerk and Wei-Shou Hu eds., Taylor and Francis Group 2006] 참조). 다양한 배양 배지는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는 탄수화물 공급원을 포함한다. 세포 배양 배지에 사용되는 주요 탄수화물은 글루코스이며, 일상적으로 5 내지 25 nM로 보충된다. 또한, 임의의 헥소스, 예컨대 갈락토스, 프룩토스, 또는 만노스 또는 조합이 사용될 수 있다.
배양 배지는 전형적으로 또한, 적어도 필수 아미노산 (즉, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Tyr, Val) 뿐만 아니라 특정의 비-필수 아미노산을 포함한다. 비-필수 아미노산은 전형적으로, 세포주가 아미노산을 합성할 수 없는 경우 또는 세포주가 최대 성장을 지원하기에 충분한 양의 아미노산을 생산할 수 없는 경우에 세포 배양 배지에 포함된다. 또한, 포유동물 세포는 또한, 주요 에너지 공급원으로서 글루타민을 사용할 수 있다. 글루타민은 종종, 다른 아미노산보다 더 높은 농도 (2-8 mM)로 포함된다. 그러나, 전술한 바와 같이, 글루타민은 자발적으로 분해되어 암모니아를 형성할 수 있으며, 특정의 세포주는 암모니아를 더 빨리 생산하여 독성이 있다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는, 염을 포함한다. 염은 등장 조건을 유지하고 삼투 불균형을 방지하기 위해 세포 배양 배지에 부가된다. 본 발명의 배양 배지의 삼투압은 약 300 mOsm/kg이지만, 많은 세포주가 이러한 값의 대략 10 퍼센트 이상의 변동을 견딜 수 있다. 일부 곤충 세포 배양물의 삼투압은 300 mOsm/kg 보다 더 높은 경향이 있으며, 이는 300 mOsm/kg 보다 0.5 퍼센트, 1 퍼센트, 2 내지 5 퍼센트, 5 내지 10 퍼센트, 10 내지 15 퍼센트, 15 내지 20 퍼센트, 20 내지 25 퍼센트, 25 내지 30 퍼센트 더 높을 수 있다. 세포 배양 배지에서 가장 흔히 사용되는 염은 Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4 2-, PO4 3-, 및 HCO3 -을 포함한다 (예를 들어, CaCl2, KCl, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4).
다른 무기 원소가 배양 배지에 존재할 수 있다. 이는 Mn, Cu, Zn, Mo, Va, Se, Fe, Ca, Mg, Si, 및 Ni를 포함한다. 이들 원소 중 다수가 효소 활성에 관여한다. 이들은 염, 예컨대 CaCl2, Fe(NO3)3, MgCl2, MgSO4, MnCl2, NaCl, NaHCO3, Na2HPO4, 및 미량 원소, 예컨대 셀레늄, 바나듐 및 아연의 이온 형태로 제공될 수 있다. 이들 무기 염 및 미량 원소는, 예를 들어 시그마 (Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 상업적으로 수득될 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 바람직하게는, 비타민을 포함한다. 비타민은 전형적으로, 보조인자로서 세포에 의해 사용된다. 세포 배양 배지가 혈청을 거의 또는 전혀 함유하지 않는 경우 또는 세포가 높은 밀도로 성장하는 경우에 일반적으로 여분의 비타민이 필요하지만, 각각의 세포주의 비타민 요구량은 크게 다양하다. 본 발명의 배양 배지에 바람직하게는 존재하는 예시적인 비타민은 비오틴, 염화콜린, 엽산, i-이노시톨, 니코틴아미드, D-Ca++-판토테네이트, 피리독살, 리보플라빈, 티아민, 피리독신, 니아신아미드, A, B6, B12, C, D3, E, K, 및 p-아미노벤조산 (PABA)을 포함한다.
본 발명의 배양 배지는 또한 혈청을 포함할 수 있다. 혈청은 응고된 혈액의 상등액이다. 혈청 성분은 부착 인자, 미량 영양소 (예를 들어, 미량 원소), 성장 인자 (예를 들어, 호르몬, 프로테아제), 및 보호 요소 (예를 들어, 항독소, 항산화제, 항프로테아제)를 포함한다. 혈청은 사람, 소 또는 말 혈청을 포함하여 각종 동물 공급원으로부터 입수가능하다. 본 발명에 따른 세포 배양 배지에 포함될 때, 혈청은 전형적으로, 5 내지 10% (부피)의 농도로 부가된다. 바람직한 세포 배양 배지는 무혈청이다.
혈청의 부재하에 또는 혈청 감소된 배지에서 세포 성장을 촉진시키기 위해, 하기 폴리펩티드 중 하나 이상이 본 발명의 세포 배양 배지에 부가될 수 있다: 예를 들어, 산성 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 및 염기성 FGF를 포함한 FGF, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 상피 성장 인자 (EGF), 신경 성장 인자 (NGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 및 전환 성장 인자 (TGF)알파 및 TGF베타를 포함한 TGF, 임의의 시토카인, 예컨대 인터류킨 1, 2, 6, 과립구 자극 인자, 백혈구 억제 인자 (LIF) 등.
그러나, 본 발명의 배양 배지는 또한, 상기 열거된 성장 인자 중 어느 것도 포함하지 않을 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 본 발명의 올리고펩티드는 세포의 증식을 촉진하기 위하여 임의의 성장 인자 대신 사용된다. 다시 말해서, 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 본 발명의 올리고펩티드의 존재는 성장 인자의 존재를 불필요한 것으로 만든다.
다른 실시양태에서, 세포 배양 배지는 폴리펩티드 (즉, 20개 초과의 아미노산을 수반한 펩티드)를 포함하지 않는다.
하나 이상의 지질, 예컨대 리놀레산, 리놀렌산, 아라키돈산, 팔미톨레산, 올레산, 폴리엔산, 및/또는 12, 14, 16, 18, 20 또는 24개의 탄소 원자의 지방산 (각각의 탄소 원자는 분지되거나 또는 분지되지 않음), 인지질, 레시틴 (포스파티딜콜린) 및 콜레스테롤이 또한, 본 발명의 세포 배양 배지에 부가될 수 있다. 이들 지질 중 하나 이상이 무혈청 배지에 보충물로서 포함될 수 있다. 포스파티드산 및 리소포스파티드산은 특정의 고정 의존성 세포, 예컨대 MDCK, 마우스 상피, 및 다른 신장 세포주의 성장을 자극하는 반면, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨은 무혈청 배지에서 인간 섬유모세포의 성장을 자극한다. 에탄올아민 및 콜레스테롤은 또한, 특정 세포주의 성장을 촉진시키는 것으로 나타났다. 특정 실시양태에서, 세포 배양 배지는 지질을 함유하지 않는다.
하나 이상의 운반체 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 트랜스페린이 또한, 세포 배양 배지에 부가될 수 있다. 운반체 단백질은 특정 영양소 또는 미량 원소의 수송을 도와줄 수 있다. BSA는 전형적으로, 수용액에 불용성인 지질, 예컨대 리놀레산 및 올레산의 운반체로서 사용된다. 또한, BSA는 특정 금속, 예컨대 Fe, Cu 및 Ni에 대한 운반체로서 제공될 수도 있다. 단백질-무함유 제형에서, BSA에 대한 비-동물 유래 대체물, 예컨대 시클로덱스트린이 지질 운반체로서 사용될 수 있다.
하나 이상의 부착 단백질, 예컨대 피브로넥틴, 라미닌 및 프로넥틴이 또한, 세포 배양 배지에 부가되어, 기질에 대한 고정-의존성 세포의 부착을 촉진시키는데 도움을 줄 수 있다.
세포 배양 배지는 임의로, 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 적합한 완충제는 N-[2-히드록시에틸]-피페라진-N'-[2-에탄술폰산] (HEPES), MOPS, MES, 포스페이트, 중탄산염, 및 세포 배양 적용에 사용하기 적합한 다른 완충제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 완충제는 배양된 세포에 실질적인 세포 독성 없이 완충 능력을 제공하는 것이다. 적합한 완충제의 선택은 세포 배양 분야의 통상의 기술자의 영역 내에 있다.
폴리음이온성 또는 폴리양이온성 화합물은 세포가 응집되는 것을 방지하고 현탁액 중에서의 세포의 성장을 촉진시키기 위해 배양 배지에 부가될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 액체 형태이다. 그러나, 배양 배지는 또한, 고체 배지, 예컨대 겔 유사 배지, 예를 들어 한천-한천-, 카라긴- 또는 젤라틴-함유 배지일 수 있다.
바람직하게는, 배양 배지는 멸균 형태이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, Lys-함유 올리고펩티드는 0.01 내지 20 g/l, 또는 0.1 내지 10 g/l, 또는 0.5 내지 5 g/l의 농도로 상기 배양 배지에 존재한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, Lys-함유 올리고펩티드는 0.1, 0.2, 0.4, 또는 1 mM 초과의 농도로 존재한다. Lys-함유 올리고펩티드가 50, 20, 10, 5, 또는 2 mM 미만의 농도로 존재하는 배양 배지가 또한 바람직하다. 바람직하게는, Lys-함유 올리고펩티드는 0.1 mM 내지 20 mM, 또는 0.1 mM 내지 10 mM, 또는 0.5 mM 내지 10 mM, 또는 1 mM 내지 10 mM, 또는 1 mM 내지 8 mM, 또는 1 mM 내지 6 mM의 농도로 배지에 존재한다.
상기 농도는 비-농축된 배지 중의 농도, 즉 실제 배양물에 존재하는 바와 같은 농도로서 제공된다. 농축된 배지는 X배 더 높은 농도를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 Lys-함유 올리고펩티드와 유리 Lys 둘 다를 포함한다. 하나의 바람직한 실시양태에서, Lys-함유 올리고펩티드는 상업적으로 이용가능한 배양 배지, 예를 들어 규정된 세포 배양 배지 또는 복합 세포 배양 배지에 부가된다.
본 발명의 배양 배지는 농축된 형태일 수 있다. 이는, 예를 들어, 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 농축된 형태일 수 있다 (세포의 성장 및 산물 형성을 지원하는 농도와 비교함). 이러한 농축된 배양 배지는 농축된 배양 배지를 수성 용매, 예컨대 물로 희석함으로써 사용하기 위한 배양 배지를 제조하는데 도움이 된다. 이러한 농축된 배양 배지는 배치식 배양에 사용될 수 있지만, 공급 배치식 또는 연속식 배양에 또한 유리하게 사용되며, 여기서 농축된 영양소 조성물은 세포의 지속적인 배양에 부가되어, 예를 들어, 배양 동안 세포에 의해 소비되는 영양소를 보충시켜 준다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 배양 배지는 건조 형태, 예를 들어 건조 분말 형태, 또는 과립 형태, 또는 펠릿 형태, 또는 정제 형태이다.
본 발명은 또한, 세포를 배양하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 세포 배양 산물을 생산하기 위한 본 발명의 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시양태는 동물 세포 또는 식물 세포, 가장 바람직한 포유동물 세포를 배양하기 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서 배양될 세포는 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HEK 세포, HELA 세포, AE-1 세포, 곤충 세포, 섬유모 세포, 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 피부 세포, 내피 세포 및 하이브리도마 세포이다. 본 발명의 바람직한 세포는 CHO 세포 및 하이브리도마 세포이다. 본 발명의 가장 바람직한 세포는 CHO 세포이다. 본 발명의 특히 바람직한 CHO 세포는 CHO DG44 및 CHO DP12 세포이다.
본 발명의 범위에는 또한, 세포를 배양하는 방법이 포함되며, 이러한 방법은 상기 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포를 배양하는 방법은 세포의 배양을 지원하는 조건 하에 세포를 기초 배양 배지와 접촉시키고, 이러한 기초 세포 배양 배지를 본 발명에 따른 농축된 배지로 보충하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 기초 배양 배지에는 농축된 피드 또는 배지가 하루 초과로 보충된다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명에 따른 배양 배지를 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 배양 배지는 본 발명에 따른 적어도 하나의 올리고펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 배양 배지를 생산하는 방법은 본 발명의 올리고펩티드를 배양 배지에 부가하는 적어도 하나의 단계를 포함한다. 마찬가지로, 본 발명의 한 측면은 세포 배양 배지를 생산하기 위한 본 발명의 Lys-함유 올리고펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 배양 배지를 변형시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 배양 배지를 변형시키는 것은 본 발명의 적어도 하나의 올리고펩티드를 상기 배양 배지에 부가하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 액체 배양 배지를 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명에 따른 고체 배지를, 예를 들어, 건조 분말 형태, 또는 과립 형태, 또는 펠릿 형태, 또는 정제 형태로 제공하고; 상기 고체 배양 배지를 수성 배지, 예컨대 물에 용해시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포를 배양하기 위한 배양 배지 중 본 발명에 따른 올리고펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면은 세포 배양을 위한 본 발명에 따른 올리고펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (i) 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계; (ii) 상기 세포를 본 발명의 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 배양 배지 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 세포 배양 산물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 올리고펩티드의 용도에 관한 것이다.
바람직한 방법에서, 세포 배양 산물은 치료용 단백질, 진단용 단백질, 폴리사카라이드, 예컨대 헤파린, 항체, 모노클로날 항체, 성장 인자, 인터류킨, 바이러스, 바이러스-유사 입자 또는 효소이다.
본 발명에 따른 세포의 배양은 배치식 배양, 공급 배치식 배양 또는 연속식 배양으로 수행될 수 있다.
실시예
일반적인 절차
상응하는 유리 아미노산 또는 상응하는 L-알라닌 디펩티드 중 하나를 함유하는 배지와 비교해서 L-리신 디펩티드가 항체 생산 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (서브클론 DG44; 라이프 테크놀로지스 코포레이션; 미국 칼즈배드)의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 이를 위해, 세포를 디펩티드에 의한 실험 내에서 제공된 아미노산이 결여된 엑셀 아게 (Xell AG; 독일 빌레펠트)에 의해 생산된 TC-42 배지에서 배양하였다. 이들 아미노산의 농도는 디펩티드의 아미노산으로의 완전한 가수 분해를 고려하여, 모든 아미노산의 농도가 본 실험 내에서 시험된 모든 배지에서 동일하게 되는 방식으로 조정되었다.
예비 배양으로부터 출발하여, 시험 배지를 부가함으로써 진탕 플라스크에서 0.3·106개 세포/ml의 초기 생육성 세포 밀도 (VCD)를 조정하였다. 2 내지 4일 후, 세포 배양물의 일부를 새로운 진탕 플라스크로 옮기고, 새로운 시험 배지를 부가함으로써 0.3·106개 세포/ml의 초기 생육성 세포 밀도 (VCD)를 조정하였다. 이를 2회 수행한 다음, 세포 성장에 이어 24일 이하 동안 생육성 세포 밀도 (VCD)를 측정하였다.
실험 1 : L-시스테인/L-시스틴을 비스-L-알라닐-L-시스틴, 비스-L-프롤릴-L-시스틴 또는 비스-L-리실-L-시스틴으로 대체시키고 L-류신을 L-리실-L-류신으로 대체시킨 TC-42 배지로 수득된 세포 성장의 비교
본 실험을 위해, L-알라닌, L-리신, L-프롤린, L-시스테인, L-시스틴 및 L-류신을 의도적으로 초기 제형에서 누락시킨, 엑셀 아게 (독일 빌레펠트)에 의해 생산된 TC-42 배지를 사용하였다. 이어서, 이들 아미노산 및 디펩티드 비스-L-알라닐-L-시스틴, 비스-L-프롤릴-L-시스틴, 비스-L-리실-L-시스틴 테트라히드로클로라이드 및 L-리실-L-류신을 각각, 표 2에 열거된 농도로 시험 배지에 부가하였다.
표 2: 실험 1의 시험 배지에 사용된 아미노산 및 디펩티드의 농도.
Figure pct00002
상이한 시간에 표 2로부터의 배지로 수득된 생육성 세포 밀도 (VCD)가 표 3에 열거된다.
표 3: 표 2에 열거된 배지로 수득된 생육성 세포 밀도 (VCD) 및 최대 세포 밀도 (max VCD).
Figure pct00003
실험 2 : L-티로신을 L-알라닐-L-티로신 또는 L-리실-L-티로신으로 대체시킨 TC-42 배지로 수득된 세포 성장의 비교
본 실험을 위해, L-알라닌, L-리신 및 L-티로신이 결여된, 엑셀 아게 (독일 빌레펠트)에 의해 생산된 TC-42 배지를 사용하였다. 이어서, 이들 아미노산 및 디펩티드 L-알라닐-L-티로신 2 수화물 및 L-리실-L-티로신 아세테이트를 각각, 표 4에 열거된 농도로 시험 배지에 부가하였다.
표 4: 실험 2의 시험 배지에 사용된 아미노산 및 디펩티드의 농도.
Figure pct00004
상이한 시간에 표 4로부터의 배지로 수득된 생육성 세포 밀도 (VCD)가 표 5에 열거된다.
표 5: 표 4에 열거된 배지로 수득된 생육성 세포 밀도 (VCD) 및 최대 세포 밀도 (max VCD).
Figure pct00005
실험 3 : L-발린 및 L-이소류신을 각각 L-리실-L-발린 및 L-리실-L-이소류신으로 대체시킨 TC-42 배지로 수득된 세포 성장의 비교
본 실험을 위해, L-리신, L-발린 및 L-이소류신이 결여된, 엑셀 아게 (독일 빌레펠트)에 의해 생산된 TC-42 배지를 사용하였다. 이어서, 이들 아미노산 및 디펩티드 L-리실-L-발린 및 L-리실-L-이소류신를 각각, 표 6에 열거된 농도로 시험 배지에 부가하였다.
표 6: 실험 3의 시험 배지에 사용된 아미노산 및 디펩티드의 농도.
Figure pct00006
상이한 시간에 표 6으로부터의 배지로 수득된 생육성 세포 밀도 (VCD)가 표 7에 열거된다.
표 7: 표 6에 열거된 배지로 수득된 생육성 세포 밀도 (VCD) 및 최대 세포 밀도 (max VCD).
Figure pct00007
디펩티드 형태의 동일한 몰 량의 시스테인과 시스틴을 함유하는 다른 배지와 참조 배지의 비교는 비스-리실-L-시스테인이 비스-알라닐-L-시스틴과 거의 동등한 성능을 초래한다는 것을 보여주었다 (도 1). 두 경우 모두에서, 세포는 성장을 위해 펩티드를 활용할 수 있었다. 동일한 조건 하에서 비스-프롤릴-시스틴을 이용한 경우에는 성장이 거의 관찰되지 않았는데, 이는 세포가 이러한 디펩티드를 활용할 수 없다는 것을 시사한다. 이는 비스-리실-L-시스테인이 유리 아미노산에 대한 대체물로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 비스-알라닐-L-시스틴과 비교하여, 비스-리실-L-시스테인은 놀랍게도 높은 용해도 (표 1)와 생체 이용률을 조합한 것이다.
부가적으로, 항체 생산에 대한 효과는 24일 동안 참조 배지에서 배양된 세포와 디펩티드 비스-알라닐-L-시스틴 또는 비스-리실-L-시스테인을 함유하는 배지에서 성장하는 세포를 비교하여 분석되었다 (도 4). 둘 다 항체 생산이 적어도 30% 만큼 증가하였고; 비스-리실-L-시스테인의 경우에는 항체 생산이 거의 50% 만큼 증가하였다.
제2 시험 시리즈에서는, 디펩티드 L-알라닐-L-티로신 및 L-리실-L-티로신을 함유하는 배지를 등몰 량의 티로신을 함유하는 참조 배지와 비교하였다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 상이한 배지의 성장 곡선은 유의미한 차이를 보여주지 않았다. 최대 세포 밀도와 관련하여, 디펩티드 둘 다는 심지어, 약간 더 높은 값을 생성하는 것으로 보인다. 이는 L-리실-L-티로신이 유리 아미노산에 대한 대체물로서 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 이전에 보고된 L-알라닐-L-티로신과 비교하여, 리실-L-티로신은 놀랍게도 높은 용해도 (표 1)와 생체 이용률을 조합한 것이다.
추가의 시험 시리즈에서는, L-리실-L-발린 및 L-리실-L-이소류신을 함유하는 배지를 등몰 량의 L-리신 또는 L-발린을 함유하는 참조 배지와 비교하였다. L-리실-L-발린이 참조 배지의 그것과 거의 일치하는 성장 곡선 및 최대 세포 밀도를 생성하는 동안, L-리실-L-이소류신은 더 느린 성장과 더 낮은 최대 세포 밀도를 생성하였다 (도 3). 두 경우 모두에서, 유리 아미노산은 리실-펩티드로 대체될 수 있었다.
비교 시험은 시스틴 및 티로신의 리실 디펩티드가 낮은 용해도의 아미노산에 대한 적합한 대체물이라는 것을 명백하게 입증해 준다. 리실 디펩티드의 이용은 적어도 상업적으로 사용되는 L-알라닐 디펩티드 만큼 우수하다. 리실 디펩티드의 사용은 리실 디펩티드로부터 방출되는 리신이 알라닌보다 상당히 더 높은 농도로 통상적인 세포 배양물에 존재하기 때문에 배지에서 아미노산의 바람직하지 않은 증가를 초래하지 않는다.
리실 디펩티드는 상당히 더 높은 용해도를 나타내기 때문에, 아미노산 또는 알라닐 디펩티드보다 훨씬 더 용이하고 신속하게 용해될 수 있으며, 이들의 적용은 사용 직전에 제조되는 탈수된 배양 배지에 유리한 것으로 보인다.
이들의 증가된 용해도는 또한, 사용 전에 원하는 농도로 희석될 수 있는 농도의 생성을 용이하게 한다. 특히, 리실 디펩티드는 현재까지 사용되어 온 유리 아미노산 또는 알라닐 디펩티드보다 더 높은 농도 및 이에 따라 더 높은 농도 인자를 가능하게 한다. 예를 들어, 약리학적 단백질의 생산에 사용된 바와 같은 대규모 세포 배양물은 종종 수 주 동안 배양된다. 이러한 기간 동안 소비된 영양소는 자주 교체된다. 배지의 부피가 증가되는 것을 피하기 위해, 가능한 한 고 용량의 피드 배지를 사용한다. 이러한 피드 배지는 작업 배지보다 5 내지 1,000배 더 큰 농도로 영양소를 함유할 수 있다. 이를 위해 리실 디펩티드가 특히 적합하다.

Claims (12)

  1. 2 내지 10개 아미노산 길이의 적어도 하나의 올리고펩티드를 포함하는 배양 배지, 예컨대 세포 배양 배지로서, 상기 아미노산은 천연 아미노산이고, 상기 아미노산 중 적어도 하나는 리신 (Lys)이고, 하나의 추가의 아미노산은 시스테인 (Cys), 시스틴 (Cyss), 류신 (Leu), 티로신 (Tyr), 발린 (Val) 및 이소류신 (Ile)으로부터 선택되고, 올리고펩티드는 적어도 0.1 mM의 양으로 존재하며,
    여기서 상기 올리고펩티드는 Lys-Cys, Lys2-Cyss, Lys-Leu, Lys-Tyr, Lys-Val, Lys-Ile로부터 선택되는 것인
    배양 배지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 적어도 하나의 탄수화물, 적어도 하나의 유리 아미노산, 적어도 하나의 무기 염, 완충제 및/또는 적어도 하나의 비타민을 추가로 포함하는 것인 배양 배지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지가 성장 인자를 함유하지 않는 것인 배양 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가 액체 형태, 겔 형태, 분말 형태, 과립 형태, 펠릿 형태 또는 정제 형태인 배양 배지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 배지가 무혈청 배지, 또는 규정된 배지인 배양 배지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 배지가, 사용 중인 상기 배지의 농도에 비해, 2배, 3배, 3.33배, 4배, 5배 또는 10배 농축된 형태인 배양 배지.
  7. 세포를 배양하기 위한 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배양 배지의 용도.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포가 동물 세포 또는 식물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포인 용도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포가 CHO 세포, COS 세포, VERO 세포, BHK 세포, HEK 세포, HELA 세포, AE-1 세포, 곤충 세포, 섬유모 세포, 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 피부 세포, 내피 세포 및 하이브리도마 세포로 이루어진 목록으로부터 선택되는 것인 용도.
  10. 세포를 배양하기 위한 배양 배지 중 Lys-Cys, Lys2-Cyss, Lys-Leu, Lys-Tyr, Lys-Val, Lys-Ile로부터 선택된 올리고펩티드의 용도.
  11. 하기 단계를 포함하는, 세포 배양 산물을 제조하는 방법:
    상기 세포 배양 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계;
    상기 세포를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및
    상기 배양 배지 또는 상기 세포로부터 상기 세포 배양 산물을 수득하는 단계.
  12. 제11항에 있어서, 상기 세포 배양 산물이 치료용 단백질, 진단용 단백질, 폴리사카라이드, 예컨대 헤파린, 항체, 모노클로날 항체, 성장 인자, 인터류킨, 바이러스, 바이러스-유사 입자 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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