CN110894487B

CN110894487B - 一种无血清无蛋白cho细胞培养基及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN110894487B
Application number: CN201911338744.3A
Authority: CN
Inventors: 米春柳; 王天云; 林艳; 赵春澎; 樊振林; 杨献军; 曹祥祥; 路江涛
Original assignee: Henan Punuoyi Biological Product Research Institute Co ltd; Xinxiang Medical University
Current assignee: Henan Punuoyi Biological Product Research Institute Co ltd; Xinxiang Medical University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN110894487A

Abstract

本发明涉及一种无血清无蛋白CHO细胞培养基及其制备方法、应用，属于CHO细胞培养技术领域。本发明的CHO细胞培养基包含氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂类、碳水化合物和添加剂，所述脂类包括：亚麻酸0.02‑0.15mg/L、孕酮0.02‑0.15mg/L、亚油酸0.04‑0.24mg/L、胆固醇1‑7.5mg/L和花生四烯酸0.001‑0.008mg/L。培养基中营养成分均衡，尤其是脂类、碳水化合物和添加剂物质充分，在该培养基中CHO细胞生长倍数可高达20.88。在利用CHO细胞表达目的蛋白时，使用前述培养基不仅CHO细胞的生长倍数高，并且CHO细胞中目的蛋白的含量仍然能够达到较高的水平。

Description

一种无血清无蛋白CHO细胞培养基及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种无血清无蛋白CHO细胞培养基及其制备方法、应用，属于CHO细胞培养技术领域。

背景技术

CHO细胞在生物制药领域具有重要的地位，由于其具有翻译后修饰功能，表达的蛋白质活性比较高，因此被广泛的应用于重组蛋白的表达。血清培养CHO细胞优点是细胞密度及蛋白产量较高，缺点是血清价格昂贵、易被支原体及病毒污染；血清中含有大量的蛋白质不利于生物制品的下游分离纯化，同时造成产物的回收率和纯度较低。此外，由于培养基添加蛋白成分，一方面增加培养基成本，另外一方面给下游蛋白纯化带来困难，用无血清无蛋白培养基培养CHO细胞成为规模化培养的趋势。

目前国内CHO细胞无血清培养基细胞生长密度比较低，并且目的蛋白表达量低，公布号为CN 109337861A的中国发明专利申请中公开了无血清培养基中需要添加胰岛素和人血清白蛋白，增加的培养基成本并且为下游的重组蛋白的纯化带来困难。公布号为CN104073463A的中国发明专利申请中公开了无血清培养基细胞生长倍数为11.59(不含水解物)和15.73(添加植物来源水解物)，该细胞培养基中细胞的生长倍数较低，无法满足生产的需求。因此，高生长倍数及下游易纯化兼顾的CHO无血清培养基的研发显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种无血清无蛋白CHO细胞培养基，该培养基中添加蛋白质，目的蛋白易纯化，并且CHO细胞的生长倍数高。

本发明还提供了上述无血清无蛋白CHO细胞培养基的制备方法。

本发明还提供了上述无血清无蛋白CHO细胞培养基的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种无血清无蛋白CHO细胞培养基，包括氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂类、碳水化合物和添加剂，所述脂类为：亚麻酸0.02-0.15mg/L、孕酮0.02-0.15mg/L、亚油酸0.04-0.24mg/L、胆固醇1-7.5mg/L和花生四烯酸0.001-0.008mg/L；所述碳水化合物和添加剂为：柠檬酸铁10-40mg/L、柠檬酸钠70-210mg/L、丙酮酸钠55-160mg/L、腐胺0.05-0.6mg/L、氯化胆碱10-40mg/L、胸腺嘧啶0.6-1.8mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁0.5-3mg/L、乙醇胺0.5-3mg/L、金精三羧酸1.0-12.5mg/L、次黄嘌呤3.5-10.5mg/L、甲基-β-环糊精25-150mg/L、海藻糖50-150mg/L、果糖800-1200mg/L、D-葡萄糖2000-6000mg/L、葡聚糖硫酸钠25-150mg/L和Kolliphor p188 1000-2500mg/L。

氨基酸是蛋白质、核酸及脂类合成的前体，氨基酸的代谢可以为细胞提供能源物质；维生素是细胞生长和代谢中许多重要酶的辅基和辅酶，在细胞代谢中起着催化作用；微量元素是细胞生长和代谢中许多重要酶的辅基；无机盐维持细胞膜的渗透压，维持细胞生长环境PH的稳定；脂类物质减少了细胞对其生物合成的需要，促进细胞的新陈代谢、分裂速率，促进转基因产物的表达；碳水化合物为细胞的生长提供能源，为氨基酸、DNA的合成提供前体物质。

其中，柠檬酸铁能有效地把铁离子传递给细胞，从而代替转铁蛋白。柠檬酸钠与丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源；腐胺具有促进蛋白质和核酸合成及调节细胞内pH的作用；氯化胆碱、肌醇是构成细胞膜磷脂的重要成分；胸腺嘧啶和次黄嘌呤是DNA补救合成途径中的主要前体物；抗坏血酸磷酸酯镁与维生素C作用相似，但比维生素C更加稳定；甲基-β-环糊精促进细胞更好的利用脂类；葡聚糖硫酸钠可以一直细胞结团现象；Kolliphorp188可以降低细胞悬浮培养过程中产生的剪切力对细胞的损伤。

特别的，金精三羧酸可以刺激胰岛素样生长因子的活化，从而代替胰岛素，促进细胞利用葡萄糖和氨基酸。

本发明的CHO细胞培养基中各个营养成分均衡，尤其是脂类、碳水化合物和添加剂物质充分，非常适合于CHO细胞的生长，在该培养基中CHO细胞生长倍数可高达20.88。在利用CHO细胞表达目的蛋白时，使用前述培养基不仅CHO细胞的生长倍数高，并且CHO细胞中目的蛋白的含量仍然能够达到较高的水平。

优选的，所述脂类为：亚麻酸0.08mg/L、孕酮0.08mg/L、亚油酸0.168mg/L、胆固醇5mg/L和花生四烯酸0.002mg/L。

优选的，所述碳水化合物和添加剂为：柠檬酸铁20mg/L、柠檬酸钠147mg/L、丙酮酸钠110mg/L、腐胺0.3mg/L、氯化胆碱30mg/L、胸腺嘧啶1.2mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁2.5mg/L、乙醇胺2.5mg/L、金精三羧酸2.5mg/L、次黄嘌呤7mg/L、甲基-β-环糊精75mg/L、海藻糖100mg/L、果糖1000mg/L、D-葡萄糖5000mg/L、葡聚糖硫酸钠100mg/L和Kolliphor p1882000mg/L。

本发明中的氨基酸可以为本领域常用的氨基酸配方，优选的，所述氨基酸可以为：L-组氨酸盐酸盐一水合物45-135mg/L、L-异亮氨酸80-250mg/L、L-亮氨酸85-270mg/L、L-赖氨酸盐酸盐135-410mg/L、L-蛋氨酸35-115mg/L、L-苯丙氨酸50-160mg/L、L-苏氨酸80-240mg/L、L-色氨酸25-80mg/L、L-缬氨酸79-240mg/L、甘氨酸28-84mg/L、L-丙氨酸6.75-27mg/L、L-谷氨酰胺800-3200mg/L、L-精氨酸盐酸盐400-885mg/L、L-天冬酰胺100-450mg/L、L-天冬氨酸20-80mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物20-75mg/L、L-胱氨酸盐酸盐45-150mg/L、L-谷氨酸4-45mg/L、L-脯氨酸33-180mg/L、L-丝氨酸50-150mg/L和L-酪氨酸二钠盐二水合物80-240mg/L。

本发明中的维生素可以为本领域常用的维生素配方，优选的，所述维生素可以为：维生素H 0.05-0.4mg/L、叶酸10-30mg/L、维生素B2 0.2-0.6mg/L、硫辛酸0.2-0.6mg/L、维生素B12 0.45-1.35mg/L、i-肌醇5-15mg/L、维生素B6 0.5-3mg/L、维生素B1 0.5-3mg/L、维生素C 1-4mg/L、维生素E 2.5-7.5mg/L、D-泛酸钙5-30mg/L、烟酰胺5-30mg/L。

本发明中的微量元素可以为本领域常用的微量元素配方，优选的，所述微量元素可以为：NH₄VO₃ 0-0.01mg/L、Na₂SeO₃ 0.02-0.08mg/L、MnCl₂·4H₂O 0.05-0.15mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.06-0.18mg/L、ZnCl₂ 0.3-1.0mg/L。

本发明中的无机盐可以为本领域常用的无机盐配方，优选的，所述无机盐可以为：Na₂HPO₄ 140-390mg/L、KCl 150-400mg/L、NaHCO₃ 1100-2800mg/L、MgSO₄ 45-120mg/L。

优选的，本发明中的CHO细胞培养基中还可以添加酵母水解物，所述酵母水解物的浓度为2000-5500mg/L。更为优选的，所述酵母水解物的浓度为4500-5500mg/L。

在添加酵母水解物后，CHO细胞的生长倍数由20.88提高至28.56，并且目的蛋白的表达量也有了大幅度的提高。

优选的，本发明中的CHO细胞培养基的pH为7.2-7.4。优选的，本发明中的CHO细胞培养基的渗透压为290-300mOsm/L。

上述的无血清无蛋白CHO细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：取配方量的组分溶解混合，调节溶液pH值至7.2-7.4，然后使用渗透压调节剂调节溶液的渗透压至290-300mOsm/L，过滤除菌即得。优选的，所述渗透压调节剂为氯化钠。

上述的无血清无蛋白CHO细胞培养基在培养CHO细胞中的应用。

附图说明

图1为本发明试验例1中不同培养基下活细胞密度比较图；

图2为本发明试验例1中不同培养基下细胞存活率比较图；

图3为本发明试验例2中不同培养基下CHO表达目的蛋白含量比较图；

图4为本发明试验例2中不同培养基下CHO表达目的蛋白含量统计结果比较图。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。以下实施例中所使用的酵母水解物购自Sigma-Aldrich公司；Kolliphor p188购自Sigma-Aldrich公司。

无血清无蛋白CHO细胞培养基及其制备方法的实施，通过实施例1-4实现。无血清无蛋白CHO细胞培养基的应用，通过试验例1-2实现。

实施例1

本实施例中的无血清无蛋白CHO细胞培养基，由以下组分组成：氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂类、碳水化合物和添加剂。

氨基酸的成分及其在每升培养基中的含量如下：

L-组氨酸盐酸盐一水合物 94mg/L

L-异亮氨酸 163mg/L

L-亮氨酸 177mg/L

L-赖氨酸盐酸盐 273mg/L

L-蛋氨酸 75mg/L

L-苯丙氨酸 106mg/L

L-苏氨酸 160mg/L

L-色氨酸 51mg/L

L-缬氨酸 158mg/L

甘氨酸 56mg/L

L-丙氨酸 13mg/L

L-谷氨酰胺 1626mg/L

L-精氨酸盐酸盐 442mg/L

L-天(门)冬酰胺 300mg/L

L-天冬氨酸 40mg/L

L-半胱氨酸盐酸盐一水合物 53mg/L

L-胱氨酸盐酸盐 94mg/L

L-谷氨酸 40mg/L

L-脯氨酸 115mg/L

L-丝氨酸 106mg/L

L-酪氨酸二钠盐二水合物 167mg/L；

维生素成分及其在每升培养基中的含量如下：

维生素H 0.2mg/L

叶酸 20mg/L

维生素B2 0.4mg/L

硫辛酸 0.42mg/L

维生素B12 0.9mg/L

i-肌醇 10mg/L

维生素B6 2mg/L

维生素B1 2mg/L

维生素C 2.5mg/L

维生素E 5mg/L

D-泛酸钙 20mg/L

烟酰胺 20mg/L；

脂类成分及其在每升培养基中的含量如下：

亚麻酸 0.08mg/L

孕酮 0.08mg/L

亚油酸 0.168mg/L

胆固醇 5mg/L

花生四烯酸 0.002mg/L；

微量元素的成分及其在每升培养基中的含量如下：

NH₄VO₃ 0.001mg/L

Na₂SeO₃ 0.054mg/L

MnCl₂·4H₂O 0.1mg/L

CuSO₄·5H₂O 0.12mg/L

ZnCl₂ 0.68mg/L；

无机盐的成分及其在每升培养基中的含量如下：

Na₂HPO₄ 284mg/L

KCl 310mg/L

NaHCO₃ 2200mg/L

MgSO₄ 90mg/L；

碳水化合物和添加剂及其在每升培养基中的含量如下：

柠檬酸铁 20mg/L

柠檬酸钠 147mg/L

丙酮酸钠 110mg/L

腐胺 0.3mg/L

氯化胆碱 30mg/L

胸腺嘧啶 1.2mg/L

抗坏血酸磷酸酯镁 2.5mg/L

乙醇胺 2.5mg/L

金精三羧酸 2.5mg/L

次黄嘌呤 7mg/L

甲基-β-环糊精 75mg/L

海藻糖 100mg/L

果糖 1000mg/L

D-葡萄糖 5000mg/L

葡聚糖硫酸钠 100mg/L

Kolliphor p188 2000mg/L。

本实施例中的无血清无蛋白CHO细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：

1、培养基的配置，将无血清培养基中不同组分配置成不同的浓缩液。

1倍的氨基酸浓缩液：L-组氨酸盐酸盐一水合物94mg/L、L-异亮氨酸163mg/L、L-亮氨酸177mg/L、L-赖氨酸盐酸盐273mg/L、L-蛋氨酸75mg/L、L-苯丙氨酸106mg/L、L-苏氨酸160mg/L、L-色氨酸51mg/L、L-缬氨酸158mg/L、甘氨酸56mg/L、L-丙氨酸13mg/L、L-谷氨酰胺1626mg/L、L-精氨酸盐酸盐442mg/L、L-天(门)冬酰胺300mg/L、L-天冬氨酸40mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物53mg/L、L-胱氨酸盐酸盐94mg/L、L-谷氨酸40mg/L、L-脯氨酸115mg/L、L-丝氨酸106mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物167mg/L。

100倍维生素浓缩液：维生素H 20mg/L、维生素B2 40mg/L、硫辛酸42mg/L、维生素B12 90mg/L。

10倍维生素浓缩液：叶酸200mg/L、i-肌醇100mg/L、维生素B6 20mg/L、维生素B120mg/L、维生素C 25mg/L、维生素E 50mg/L、D-泛酸钙200mg/L、烟酰胺200mg/L。

1000倍脂类浓缩液：亚麻酸80mg/L、孕酮80mg/L、亚油酸168mg/L。

10倍其他脂类浓缩液：胆固醇50mg/L。

10000倍脂类浓缩液：花生四烯酸20mg/L。

1000倍微量元素浓缩液：Na₂SeO₃ 54mg/L、MnCl₂·4H₂O 100mg/L、CuSO₄·5H₂O120mg/L、ZnCl₂ 680mg/L。

100000倍其他微量元素浓缩液：NH₄VO₃ 100mg/L。

1倍无机盐：Na₂HPO₄ 284mg/L、KCl 310mg/L、NaHCO₃ 2200mg/L、MgSO₄ 90mg/L。

1倍碳水化合物和其他添加剂成分：柠檬酸铁20mg/L、柠檬酸钠147mg/L、丙酮酸钠110mg/L、甲基-β-环糊精75mg/L、海藻糖100mg/L、果糖1000mg/L、D-葡萄糖5000mg/L、葡聚糖硫酸钠100mg/L、Kolliphor p188 2000mg/L。

100倍其他添加剂成分：腐胺30mg/L、胸腺嘧啶120mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁250mg/L、乙醇胺250mg/L、金精三羧酸250mg/L。

10倍其他添加剂成分：次黄嘌呤70mg/L、氯化胆碱300mg/L。

2、将上述成分按照1倍的用量加入1L的烧杯中并混匀，再加入去离子水定容至1L。

3、用5N的HCl或5N的NaOH调节pH至7.2。

4、用NaCl调节渗透压至295mOsm/L。

5、用0.22μM的过滤膜除菌。

实施例2

本实施例中的无血清无蛋白CHO细胞培养基，由以下组分组成：氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂类、碳水化合物、添加剂和酵母水解物。

其中氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂类、碳水化合物、添加剂成分同实施例1。酵母水解物含量为5000mg/L。

制备方法同实施例1，酵母水解物在步骤1中添加。

实施例3

所述脂类为：亚麻酸0.15mg/L、孕酮0.02mg/L、亚油酸24mg/L、胆固醇1mg/L和花生四烯酸0.008mg/L；所述碳水化合物和添加剂为：柠檬酸铁40mg/L、柠檬酸钠70mg/L、丙酮酸钠160mg/L、腐胺0.05mg/L、氯化胆碱40mg/L、胸腺嘧啶0.6mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁3mg/L、乙醇胺0.5mg/L、金精三羧酸12.5mg/L、次黄嘌呤3.5mg/L、甲基-β-环糊精150mg/L、海藻糖50mg/L、果糖1200mg/L、D-葡萄糖2000mg/L、葡聚糖硫酸钠150mg/L和Kolliphor p1881000mg/L。

所述氨基酸为：L-组氨酸盐酸盐一水合物45mg/L、L-异亮氨酸250mg/L、L-亮氨酸85mg/L、L-赖氨酸盐酸盐410mg/L、L-蛋氨酸35mg/L、L-苯丙氨酸160mg/L、L-苏氨酸80mg/L、L-色氨酸80mg/L、L-缬氨酸79mg/L、甘氨酸84mg/L、L-丙氨酸6.75mg/L、L-谷氨酰胺3200mg/L、L-精氨酸盐酸盐400mg/L、L-天冬酰胺450mg/L、L-天冬氨酸20mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物75mg/L、L-胱氨酸盐酸盐45mg/L、L-谷氨酸30mg/L、L-脯氨酸33mg/L、L-丝氨酸150mg/L和L-酪氨酸二钠盐二水合物80mg/L。

所述维生素为：维生素H 0.4mg/L、叶酸10mg/L、维生素B2 0.6mg/L、硫辛酸0.2mg/L、维生素B12 1.35mg/L、i-肌醇5mg/L、维生素B6 3mg/L、维生素B1 0.5mg/L、维生素C 4mg/L、维生素E 2.5mg/L、D-泛酸钙30mg/L、烟酰胺5mg/L。

所述微量元素为：NH₄VO₃ 0mg/L、Na₂SeO₃ 0.08mg/L、MnCl₂·4H₂O 0.05mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.18mg/L、ZnCl₂ 0.3mg/L。

无机盐为：Na₂HPO₄ 390mg/L、KCl 150mg/L、NaHCO₃ 2800mg/L、MgSO₄ 45mg/L。

酵母水解物的浓度为2000mg/L。

制备方法同实施例1，酵母水解物在步骤1中添加。

实施例4

实施例中的无血清无蛋白CHO细胞培养基，由以下组分组成：氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂类、碳水化合物、添加剂和酵母水解物，所述脂类为：亚麻酸0.02mg/L、孕酮0.15mg/L、亚油酸0.04mg/L、胆固醇7.5mg/L和花生四烯酸0.001mg/L；所述碳水化合物和添加剂为：柠檬酸铁10mg/L、柠檬酸钠210mg/L、丙酮酸钠55mg/L、腐胺0.6mg/L、氯化胆碱10mg/L、胸腺嘧啶1.8mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁0.5mg/L、乙醇胺3mg/L、金精三羧酸1.0mg/L、次黄嘌呤10.5mg/L、甲基-β-环糊精25mg/L、海藻糖150mg/L、果糖800mg/L、D-葡萄糖6000mg/L、葡聚糖硫酸钠25mg/L和Kolliphor p188 2500mg/L。

所述氨基酸为：L-组氨酸盐酸盐一水合物135mg/L、L-异亮氨酸80mg/L、L-亮氨酸270mg/L、L-赖氨酸盐酸盐135mg/L、L-蛋氨酸115mg/L、L-苯丙氨酸50mg/L、L-苏氨酸240mg/L、L-色氨酸25mg/L、L-缬氨酸240mg/L、甘氨酸28mg/L、L-丙氨酸27mg/L、L-谷氨酰胺800mg/L、L-精氨酸盐酸盐885mg/L、L-天冬酰胺100mg/L、L-天冬氨酸80mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物20mg/L、L-胱氨酸盐酸盐150mg/L、L-谷氨酸4mg/L、L-脯氨酸180mg/L、L-丝氨酸50mg/L和L-酪氨酸二钠盐二水合物240mg/L。

所述维生素为：维生素H 0.05mg/L、叶酸30mg/L、维生素B2 0.2mg/L、硫辛酸0.6mg/L、维生素B12 0.45mg/L、i-肌醇15mg/L、维生素B6 0.5mg/L、维生素B1 3mg/L、维生素C1g/L、维生素E 7.5mg/L、D-泛酸钙5mg/L、烟酰胺30mg/L。

所述微量元素为：NH₄VO₃ 0.01mg/L、Na₂SeO₃ 0.02mg/L、MnCl₂·4H₂O 0.15mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.06mg/L、ZnCl₂ 1.0mg/L。

无机盐为：Na₂HPO₄ 140mg/L、KCl 400mg/L、NaHCO₃ 1100mg/L、MgSO₄ 120mg/L。

酵母水解物的浓度为5500mg/L。

制备方法同实施例1，酵母水解物在步骤1中添加。

对比例1

本对比例中的培养基为Sigma Excell325PF无血清培养基。

无血清无蛋白CHO细胞培养基应用的实施，通过试验例1实现。

试验例1

分别使用实施例1、实施例2、对比例1中的培养基培养CHO细胞。具体是：在125mL的振荡培养瓶中分别加入30mL培养基，以同样的密度(4.5×10⁵cells/mL)接种CHO细胞；然后放入37℃含有5％CO₂的培养箱中，以每分钟120转摇床培养7天，每天取样用Trypan blue血球计数法记录活细胞密度(×10⁵cells/mL)和细胞存活率(％)，实验数据如表1所示。

表1 实施例及对比例活细胞密度(×10⁵cells/mL)和细胞存活率(％)

各个培养基中CHO细胞活细胞密度趋势如图1所示，细胞存活率趋势如图2所示。从图中可以看出，实施例1-2中的培养基的活细胞密度都明显高于对比例1，实施例1-2中CHO细胞的生长倍数分别为20.88、28.56，而对比例1中CHO细胞的生长倍数仅为12.22。各组的细胞存活率趋势相差不大。

注：细胞生长倍数＝最高活细胞密度/接种细胞密度。

试验例2

西妥昔蛋白表达检测：

将CHO细胞接种于24孔板，待细胞密度为80％时，用脂质体2000转染西妥昔单抗质粒(CMV-cetuximab heavy chain-IRES-Neo和CMV-cetuximab light chain-IRES-Neo)到CHO细胞中，转染48小时后，用G418(800μg/mL)筛选，获得稳定转染的CHO细胞株。

用实施例1中无血清培养基、实施例2中无血清培养基和Sigma Excell325PF无血清培养基悬浮培养，初始密度为4.5×10⁵cells/mL，7天后收集细胞。在转染质粒后的活细胞密度和细胞存活率与试验例1中结果一致，不再重复描述。

将收集到的细胞离心，收集上清液，取40μL上清液并加入10μL 5×蛋白质上样缓冲液，煮样，配制8％的SDS-PAGE，跑胶，并转印至PVDF膜。用5％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭，孵育Goat anti-human IgG-HRP二抗，用ECL发光液显像，并用天能Tanon凝胶成像系统拍照，拍照结果如图3，对于拍照颜色进行统计，结果如图4所示。

从图3-4中可以看出，在含有酵母水解物的无血清培养基中西妥昔单抗表达较高，在不含酵母水解物的无血清培养基和Sigma Excell325PF无血清培养基中西妥昔单抗表达量基本一致。实施例2与Sigma Excell325PF无血清培养基(即对比例1)相比较，p*<0.05。

Claims

1.一种无血清无蛋白CHO细胞培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂类、碳水化合物和添加剂组成，其特征在于，所述脂类为：亚麻酸0.02-0.15mg/L、孕酮0.02-0.15mg/L、亚油酸0.04-0.24mg/L、胆固醇1-7.5mg/L和花生四烯酸0.001-0.008mg/L；所述碳水化合物和添加剂为：柠檬酸铁10-40mg/L、柠檬酸钠70-210mg/L、丙酮酸钠55-160mg/L、腐胺0.05-0.6mg/L、氯化胆碱10-40mg/L、胸腺嘧啶0.6-1.8mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁0.5-3mg/L、乙醇胺0.5-3mg/L、金精三羧酸1.0-12.5mg/L、次黄嘌呤3.5-10.5mg/L、甲基-β-环糊精25-150mg/L、海藻糖50-150mg/L、果糖800-1200mg/L、D-葡萄糖2000-6000mg/L、葡聚糖硫酸钠25-150mg/L和Kolliphor p188 1000-2500mg/L；所述无血清无蛋白CHO细胞培养基中还包括酵母水解物，所述酵母水解物的浓度为2000-5500mg/L；

所述氨基酸为：L-组氨酸盐酸盐一水合物45-135mg/L、L-异亮氨酸80-250mg/L、L-亮氨酸85-270mg/L、L-赖氨酸盐酸盐135-410mg/L、L-蛋氨酸35-115mg/L、L-苯丙氨酸50-160mg/L、L-苏氨酸80-240mg/L、L-色氨酸25-80mg/L、L-缬氨酸79-240mg/L、甘氨酸28-84mg/L、L-丙氨酸6.75-27mg/L、L-谷氨酰胺800-3200mg/L、L-精氨酸盐酸盐400-885mg/L、L-天冬酰胺100-450mg/L、L-天冬氨酸20-80mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物20-75mg/L、L-胱氨酸盐酸盐45-150mg/L、L-谷氨酸4-45mg/L、L-脯氨酸33-180mg/L、L-丝氨酸50-150mg/L和L-酪氨酸二钠盐二水合物80-240mg/L；

所述维生素为：维生素H 0.05-0.4mg/L、叶酸10-30mg/L、维生素B2 0.2-0.6mg/L、硫辛酸0.2-0.6mg/L、维生素B12 0.45-1.35mg/L、i-肌醇5-15mg/L、维生素B6 0.5-3mg/L、维生素B1 0.5-3mg/L、维生素C 1-4mg/L、维生素E 2.5-7.5mg/L、D-泛酸钙5-30mg/L、烟酰胺5-30mg/L；

所述微量元素为：NH₄VO₃ 0-0.01mg/L、Na₂SeO₃ 0.02-0.08mg/L、MnCl₂·4H₂O 0.05-0.15mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.06-0.18mg/L、ZnCl₂ 0.3-1.0mg/L；

所述无机盐为：Na₂HPO₄ 140-390mg/L、KCl 150-400mg/L、NaHCO₃1100-2800mg/L、MgSO₄45-120mg/L。

2.根据权利要求1所述的无血清无蛋白CHO细胞培养基，其特征在于，所述脂类为：亚麻酸0.08mg/L、孕酮0.08mg/L、亚油酸0.168mg/L、胆固醇5mg/L和花生四烯酸0.002mg/L。

3.根据权利要求1所述的无血清无蛋白CHO细胞培养基，其特征在于，所述碳水化合物和添加剂为：柠檬酸铁20mg/L、柠檬酸钠147mg/L、丙酮酸钠110mg/L、腐胺0.3mg/L、氯化胆碱30mg/L、胸腺嘧啶1.2mg/L、抗坏血酸磷酸酯镁2.5mg/L、乙醇胺2.5mg/L、金精三羧酸2.5mg/L、次黄嘌呤7mg/L、甲基-β-环糊精75mg/L、海藻糖100mg/L、果糖1000mg/L、D-葡萄糖5000mg/L、葡聚糖硫酸钠100mg/L和Kolliphor p188 2000mg/L。

4.如权利要求1-3任一项所述的无血清无蛋白CHO细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取配方量的组分溶解混合，调节溶液pH值至7.2-7.4，然后使用渗透压调节剂调节溶液的渗透压至290-300mOsm/L，过滤除菌即得。

5.如权利要求1-3任一项所述的无血清无蛋白CHO细胞培养基在培养CHO细胞中的应用。