CN101988047A - 一种低成本的昆虫细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种昆虫无血清培养基，所述无血清培养基包含5～10g/L碳水化合物、40～60g/L氨基酸、50～100g/L无机盐、0.01～0.1g/L维生素、12-20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化学限定脂质混合物，本发明的培养基较目前的商用无血清培养基具有更低的成本。实验表明，本发明的培养基与商用无血清培养基可达到相近的细胞密度和蛋白表达产量。

Description

一种低成本的昆虫细胞无血清培养基
技术领域
本发明涉及无血清培养基。具体而言，本发明涉及昆虫细胞无血清培养基。
背景技术
细胞培养是将细胞在体外进行繁殖和培养，该工作始于20世纪初，现在已经成为生物学和医学研究领域中不可缺少的工具，并发展成为重要的基础科学之一。细胞培养在基础研究和应用生物医学领域如细胞生物学、生理学、药理学和毒理学上的应用日益广泛，减少了试验动物的使用数目，正符合3Rs理论，即对待动物要有人性(refinement)，减少实验动物的使用量(reduction)和尽量找到使用动物的替代方法(replacement)的要求。
另外，在最近10年里无脊椎动物细胞和组织培养在细胞和分子生物学基础研究中发挥了越来越重要的作用，应用杆状病毒表达载体，昆虫培养细胞作为宿主的真核表达系统已被广泛应用于生产外源蛋白质，特别是成功表达了大量的具有很高医药价值的活性蛋白质之后，备受人们青睐。
要让细胞很好地生长和繁殖，必须努力创造合适的条件，最好模拟细胞原来生长的体内环境，包括温度、pH值、渗透压和氧气供应情况。细胞体外培养需要合适的培养瓶或者特定的培养界面，但是细胞培养中最关键的因素是培养基。
大多数商业上可获得的培养基的主要问题是需要向培养基提供大量的血清成分(一般5-20％)，由于血清的高价格和有限制的可获得性，这就造成了一个显著的限制因子。此外，在培养基中动物血清或血清白蛋白的使用从生产的观点上看也是有问题的，这是因为血清中未鉴定的蛋白质的存在可使得下游产品纯化的努力复杂化，并且其中污染的动物病毒可造成严重的安全问题。类似的，在这些材料中发现的未鉴定的蛋白质也向较小规模的实验努力中引入了多余的变量。更进一步地，血清本身的质量在每一批都有变化，这就引入了污染的危险，这些危险必须由科学家或生产工程师针对血清的每一变化来研究和解决。
目前已经开发出用于培养昆虫细胞的无血清培养基，例如2006年7月4日提交的JP20060185008中所述的无血清培养基。但这些培养基普遍存在的问题是成本过高，如前述培养基中含有多种小分子添加物，一些重组蛋白。再比如，2004年公开的公开号CN1498267A所述培养基含有高浓度维生素和酵母提取物，提高了成本。不利于大规模的昆虫细胞培养。
发明内容
本发明的一个目的在于提供低成本的昆虫细胞无血清培养基。该目的可通过下文所述的技术方案实现。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于培养昆虫细胞的无血清培养基，所述无血清培养基包含5～10g/L碳水化合物、40～60g/L氨基酸、50～100g/L无机盐、0.01～0.1g/L维生素、12-20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化学限定脂质混合物。
在另一实施方式中，本发明的无血清培养基不含半胱氨酸。
在另一实施方式中，本发明的无血清培养基含有0.45-0.6g/L的谷氨酰胺。
在另一实施方式中，本发明的无血清培养基中所述的碳水化合物不包含蔗糖。
附图说明
图1：High Five细胞在SFMB培养基和Express Five培养基中的生长曲线。
图2：High Five细胞在SFMB培养基和Express Five培养基中蛋白表达情况的柱形图。
发明详述
培养基组成
大部分昆虫细胞都利用葡萄糖、果糖或麦芽糖作为主要碳源和能源，在多数培养基中，葡萄糖作为碳源能被迅速利用，虽然在杆状病毒感染后昆虫细胞的生长也会消耗部分蔗糖，但它在培养基中所起主要作用是调节渗透压。本发明的培养基中所含碳水化合物含量在8～10g/L，且不含蔗糖，有利于发酵过程中对渗透压的控制。可用于本发明的碳水化合物包括，但不限于，2000-3000mg/L的麦芽糖，8000-10000mg/L的无水葡萄糖。
不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求，其中有14种是必需氨基酸，细胞本身不能合成，必须由培养基提供。Sf9细胞被认为是甘氨酸和半胱氨酸营养缺陷型的。不过最近的文章表明，如果细胞是在上一代的早期(47～53h)继代，sf9细胞可以在无胱氨酸培养基中生长，在这种情况下，细胞会消耗更多的蛋氨酸来合成半胱氨酸。另有研究表明，在铵离子存在的条件下，Sf9细胞和Sf21细胞也可以在无谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的培养基中生长。然而，Mendonqa等(Laura A.Palomares and Octavio T.Ramirez.Theeffect of dissolved oxygen tension and the utility of oxygen uptake ratein insect cell culture.Cytotechnology.1996，(22)225-237)指出缺少谷氨酰胺会影响到细胞的生长速度，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，几乎所有的昆虫细胞对谷氨酰胺都有较高的要求。因此，昆虫细胞自身合成谷氨酰胺不如直接在培养基中摄取有效，所以各类培养基中都含有较高浓度的谷氨酰胺。然而，本发明发现，将培养基中的谷氨酰胺浓度控制在较低浓度，例如0.45-0.6g/L时，也能达到良好的培养效果。本培养基含有40～60g/L氨基酸，且不含有半胱氨酸，同时含有1-2g/L谷氨酰胺，有效降低了成本。可用于本发明的氨基酸包括，但不限于，300-500mg/L的天门冬氨酸，200-600mg/L的苏氨酸，100-300mg/L的丝氨酸，200-300mg/L的谷氨酸，100-150mg/L的甘氨酸，400-600mg/L的丙氨酸，1000-1500mg/L的缬氨酸，300-600mg/L的蛋氨酸，300-500mg/L的异亮氨酸，700-1000mg/L的亮氨酸，2500-3000mg/L的苯丙氨酸，1200-1800mg/L的赖氨酸，400-700mg/L的组氨酸，1200-1800mg/L的精氨酸，900-1200mg/L的脯氨酸，1800-3200mg/L的天门冬氨酸，450-600mg/L的谷氨酰胺，180-220mg/L的羟脯氨酸，160-260mg/L的胱氨酸以及300-400mg/L的酪氨酸。
维生素对促进昆虫细胞生长、促进细胞贴附有积极作用。一般认为，泛酸、异己酸、乙酸及核黄素等对细胞的存活是有利的，而胆碱、吡哆醇、硫胺素、尼克酰胺等可促进细胞增殖。本培养基含有0.01～0.1g/L维生素。可用于本发明的维生素包括，但不限于0.001-0.006mg/L生物素，0.080-0.120mg/L D-泛酸钙，0.160-0.200mg/L烟酸，0.0040-0.010mg/L对氨基苯甲酸，0.002-0.010mg/L盐酸吡哆醇，0.0003-0.0010mg/L维生素B1，0.1-0.06mg/L维生素B12，0.2-0.4mg/L核黄素；以及含于10000X浓缩液的200.0-400mg/L氯化胆碱。
在昆虫细胞培养基中无机盐浓度略高，这是因为昆虫细胞要在高于哺乳动物细胞生长的渗透压中生长，并且各无机盐离子之间需要平衡，其中Na+/K+比例在某些细胞系中有严格的要求。某些微量元素如Fe2+、Mn2+、Cn2+、Zn2+等能促进细胞贴附和增加产量，其中Al3+和Zn2+还可以促进病毒的感染和复制。本培养基含有50～100g/L无机盐。可用于本发明的无机盐包括，但不限于，2000-3000mg/L的CaCl2，3000-4000mg/L的MgSO4，500-800mg/L的KCl，150-200mg/L的NaHCO3，1500-2000mg/L的NaCl，400-600mg/L的NaH2PO4；含于10000X浓缩液的0.01-0.03mg/L CoCl2-6H2O，0.10-0.20mg/L CuCl2-2H2O，0.01-0.02mg/L MnCl2-4H2O，0.02-0.20mg/L ZnCl2，以及0.08-0.30mg/L((NH4)6Mo7O24-4H2O)。
酵母提取物(yeastolate，YL)是昆虫细胞培养基的基本成分，YL是维生素和嘌呤的主要来源，本发明中可包含，例如，12-20g/L的酵母提取物。
本发明的无血清完全培养基任选地包含蛋白胨成分，该蛋白胨也补偿了基本培养基中游离氨基酸的减少，还提供了对血清或白蛋白的替代物。使用前，蛋白胨部分经本领域公知的超滤或类似步骤预先纯化，去除任何残留的蛋白酶、内毒素或其他可潜在地干涉培养基上生长的昆虫细胞表达高分子量成分。
本发明的无血清完全培养基还包含其它成分，例如，20-40ml/L的化学限定脂质混合物(100X，invetrogen)。
昆虫细胞工业化培养过程中，无血清培养基成本因素突出。若采用商业化培养基，往往超过一般企业负荷。故开发低成本高效能昆虫细胞培养基具有广泛前景。以往开发的昆虫细胞培养基或者成本较高，或者效果无法达到商业化培养基的水平。
本培养基所含成分种类少，含量低，配制简单，且能够达到和商业化培养基同样的效果。本培养基所含成分均为简单易得试剂，购买方便，成本低廉。对比成分组成类似的另一种动物细胞培养基(公开号：CN 1498267A)，氨基酸成分有所增加，维生素成分明显减少，其他成分有所简化，脂质体采用商业化产品，培养基生产配制更加方便，如果所有成分均采用Invitrogen及Sigma公司产品，则成本大约降低约50％。具有良好的商业化前景。
培养基制备
制备培养基的方法并不是关键性的。例如，培养基可以通过下面所述方法制得，即将所有成分及附加物先以各自的合适浓度溶解于水，然后加压使溶液通过一个薄膜滤器过滤而制得无菌的培养基。如上文提到的，当为了表达重组蛋白或病毒产物而培养昆虫细胞时，培养基中的蛋白胨成分将优选地预先纯化以使以后的纯化更容易，例如通过预过滤，随后用具有比需收集的任何重组体或病毒产物小的分于量界限的膜进行超滤。
细胞培养
用本发明的培养基培养细胞的方法也不是关健性的.以与常规培养基大约相同的条件用本发明的培养基培养细胞。通常，在本发明无血清培养基中生长的细胞是在一定温度范围并在对所选择的特定细胞系合适的条件下培养的。
实施例
本发明培养基命名为SFMB。下列实施例用于阐明本发明的某些优选实施方案和方面，不应该解释为限制了它的范围。实施例中所用成分中氨基酸购自JRH，无机盐、维生素购自百灵威公司和Sigma，其它成分购自Invitrogen和Sigma。其中所用商业化培养基为Express Five，购自Invitrogen公司。细胞株Sf9和High Five购自ATCC。细胞培养实验中，细胞密度通过血球计数板计数，细胞活性通过台盼蓝拒染法确定。蛋白表达量通过ELISA或者纯化后确定。
实施例1
无血清培养基的制备
利用在表1中所列的成分和量制备了本发明无血清培养基的特定实施方案，标记为SFMB。
1.称量
按照下表(1-9)称取原料，部分溶解后制成浓缩液。
表1氨基酸(1)
  名称   mg/L
  天门冬氨酸   642.8
  苏氨酸   500.0
  丝氨酸   230.0
  谷氨酸   205.0
  甘氨酸   130.0
  丙氨酸   611.0
  缬氨酸   1472.2
  蛋氨酸   558.0
  异亮氨酸   469.4
  亮氨酸   845.0
  苯丙氨酸   2620.0
  赖氨酸   1600.0
  组氨酸   609.0
  精氨酸   1600.0
  脯氨酸   1086.5
  天门冬酰胺   3000.0
  谷氨酰胺   500.0
  羟脯氨酸   1600.0
表2氨基酸(2)
  名称   mg/L
  胱氨酸   192.0
  酪氨酸   366.0
表3无机盐(1)
  名称   mg/L
  CaCl2   2500
  MgSO4   3600
  KCl   600
  NaHCO3   180
  NaCl   1850
  NaH2PO4   560
表4无机盐(2)(10000X浓缩液)
  名称   mg/L
  CoCl2-6H2O   0.02
  CuCl2-2H2O   0.10
  MnCl2-4H2O   0.01
  ZnCl2   0.02
表5无机盐(3)(10000X浓缩液)
  名称   Mg/L
  ((NH4)6Mo7O24-4H2O)   0.08
表6维生素(1)(2000X浓缩液)
  名称   mg/L
  叶酸生物素D-泛酸钙烟酸对氨基苯甲酸盐酸吡哆醇维生素B1维生素B12   0.0800.0010.0800.1600.00400.0020.00030.1
表7维生素(2)(2000X浓缩液)
  名称   mg/L
  核黄素   0.2
表8维生素(3)(10000X浓缩液)
  名称   mg/L
  氯化胆碱   200.0
表9其他成分
  名称   mg/L
  麦芽糖   2000
  无水葡萄糖   8000
  酵母提取物   12000
  化学限定脂质混合物   20ml
2.浓缩液的配置
Figure GSA00000120524900101
取800毫升去离子水放入到合适的烧杯里；
Figure GSA00000120524900102
将原料(表4)添加到上述的烧杯中，并且搅拌直至溶解；
添加去离子水使总体积达到1000毫升；
Figure GSA00000120524900104
按如上方法分别将原料表(5)原料表(6)原料表(8)配置完成；
Figure GSA00000120524900105
取800毫升去离子水放入合适的烧杯中；
Figure GSA00000120524900106
将原料(表7)倒入其中溶解并加以搅拌，加入适量(能使液体澄清即可)10N的氢氧化钠使液体充分的溶解；
Figure GSA00000120524900107
添加去离子水使总体积达到1000毫升。
3.溶解(1000ml)
Figure GSA00000120524900108
取800毫升去离子水放入到合适的烧杯里；
Figure GSA00000120524900109
将原料(表1)添加到上述的烧杯中，并且搅拌直至溶解；
另量出20毫升去离子水放入合适的离心管中，将原料(表2)倒入其中溶解并加以搅拌，之后加入适量(能使液体澄清即可)1N的稀盐酸使液体充分的溶解；
将完全溶解的离心管中的液体倒入烧杯中，并且搅拌使其混匀；
Figure GSA00000120524900111
液体搅拌均匀后，将原料(表3)添加到烧杯中，并且搅拌直至溶解；
Figure GSA00000120524900112
将原料(表9)添加到烧杯中，并且搅拌直至溶解；
Figure GSA00000120524900113
按比例取原料(表4)、原料(表5)、原料(表6)、原料(表7)、原料(表8)的浓缩液加入烧杯中，并且搅拌使其混匀；
Figure GSA00000120524900114
添加适量的去离子水，使总体积达到980毫升；
Figure GSA00000120524900115
用10N的氢氧化钠调节培养基PH值为6.2；
Figure GSA00000120524900116
添加去离子水使总体积达到1000毫升。
实施例2
用SFMB培养基与Express Five培养基培养High Five细胞对比
细胞均培养于27摄氏度生化培养箱中。
蛋白检测方法通过ELISA定量检测。
从上述结果很明显得知生长在本发明的低成本的无血清培养基中的细胞可以得到优于现有技术中描述的无血清培养基配方(图1)的细胞密度。本发明的培养基也支持杆状病毒以低成本在高密度细胞培养中繁殖性的复制。
通过ELISA测定蛋白表达量(图2)可见，利用本培养基培养Sf9细胞表达多种蛋白均达到了3mg/L左右的水平。与标准商业化培养基的效果相当。
本说明书中提及的出版物和专利申请表明了本发明所属领域的熟练地技术人员的技术水品。所有出版物和专利申请在此处以相同的程度被引入作为参考，就如同每一单独的出版物或专利申请是特定地和单独地被引用作为参考。
尽管前述的发明通过说明和实施例为阐明和理解目的已经相当详细地作了描述，但是很显然在所附的权利要求书的范围内仍然会有某些改变和更改。例如，在实施例一中提出的单独成分的相对量可由本领域的技术人员依照感兴趣的特定细胞系的特定需要而作修改，该需要对本领域的技术人员而言是熟知且易于利用的。通常，在实施例一中列举的特定的量可以在高约50％的范围内变动，更优选地，是在高约20％的范围内。

Claims (4)

1.一种用于培养昆虫细胞的无血清培养基，所述无血清培养基包含5～10g/L碳水化合物、40～60g/L氨基酸、50～100g/L无机盐、0.01～0.1g/L维生素、12-20g/L的酵母提取物以及20-40ml/L的化学限定脂质混合物。
2.权利要求1的无血清培养基，其中所述的培养基不含半胱氨酸。
3.权利要求1或2的无血清培养基，其中所述的培养基含有0.45-0.6g/L的谷氨酰胺。
4.权利要求3的无血清培养基，其中所述的碳水化合物不包含蔗糖。
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