CN108925137A - 细胞培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及无血清细胞培养基，其中所述培养基含有麦芽糖作为唯一的碳水化合物来源，或含有麦芽糖和至少一种其他糖作为碳水化合物来源。在一个优选的实施方案中，所述另外的糖是单糖，优选地是葡萄糖，并且所述培养基包含DMEM‑F12。在一个优选的实施方案中，所述待培养的细胞可以是CHO细胞或HEK293细胞。还公开了使用如本文所述的细胞培养基使细胞生长和/或培养细胞的方法、使用如本文所述的细胞培养基提高蛋白质收率的方法、以及其试剂盒。

Description

细胞培养基

对相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月22日提交的新加坡专利申请号10201601284Y的优先权益，该新加坡专利申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明涉及用于繁殖、保存、或维持细胞的组合物。具体来说，本发明涉及培养基。本发明还涉及用于支持培养细胞的蛋白质产生的组合物。

背景技术

从细胞培养基诞生的第一天起，它就根据培养的意图被逐渐地改进和研究。最初的几种细胞培养溶液提供了灌注、供水、细胞代谢所需的无机阴离子、渗透平衡、缓冲系统、以及用于生长的碳水化合物来源。

随着对细胞功能如何改善的研究，细胞培养基已经演变成包括多种组分，它们可以根据培养基的目的被包括在内。然而，对细胞(如哺乳动物细胞)保持恒定的是提供葡萄糖作为碳水化合物来源。

因而，需要提供细胞培养基，所述细胞培养基提供替代碳水化合物来源。替代碳水化合物来源作为能量源的可能用途可能在生物药物制造中具有实际意义。具体来说，替代碳水化合物来源的可能用途可以引起分批培养基中碳水化合物负载的改进，并且可能引起乳酸盐积累减少，所述乳酸盐积累可能对细胞有毒。

因此，需要提供具有替代碳水化合物来源的细胞培养基。

发明内容

在第一个方面，提供了无血清细胞培养基。所述细胞培养基包含麦芽糖作为唯一的碳水化合物来源。

在第二个方面，提供了无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基包含麦芽糖和至少一种、至少两种、至少三种或更多种糖作为碳水化合物来源。

在第三个方面，提供了使细胞生长和/或培养细胞的方法，其中所述方法包括在第一个方面或第二个方面的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。

在第四个方面，提供了使细胞生长和/或培养细胞的方法，其中所述方法包括在如本文所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。

在第五个方面，提供了增加蛋白质收率的方法，其中所述方法包括在如本文所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。

在第六个方面，提供了试剂盒，所述试剂盒包括如本文所述的无血清细胞培养基的组分。

附图说明

在结合非限制性实施例和附图考虑时，通过参考详细说明将更好地理解本发明，其中：

图1示出了在各种二糖培养基中中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的适应性测试的结果。在(A)中，将CHO-K1细胞培养在无血清无蛋白质的细胞培养基HyQ PF-CHO中，所述细胞培养基具有3.6g/l的不同的糖(麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、或葡萄糖)作为碳水化合物来源。对在74天的时间内在每一次传代开始和结束时这些培养物的活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)进行绘图。在第31天由于培养物活力降低和活细胞密度降低而终止具有蔗糖、乳糖或海藻糖的培养物。使用1.0×10⁶个细胞/毫升的接种细胞密度重复实验以获得类似的结果。在(B)中，以1.0×10⁶个细胞/毫升的接种细胞密度将CHO-DG44细胞培养在无血清无蛋白质的细胞培养基HyQ PF-CHO中，所述细胞培养基具有10g/l的不同糖(麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或葡萄糖)作为碳水化合物来源。对在22天的时间内在每一次传代开始和结束时这些培养物的活细胞密度(带线标记)和细胞活力(仅标记)进行绘图。在(C)中，以1.0×10⁶个细胞/毫升的接种细胞密度将HEK293细胞培养在无蛋白质的化学成分确定的细胞培养基PFCDM中，所述细胞培养基具有10g/l的不同糖(麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或葡萄糖)作为碳水化合物来源。对在22天的时间内在每一次传代开始和结束时这些培养物的活细胞密度(带线标记)和细胞活力(仅标记)进行绘图。在第14天由于培养物活力降低和活细胞密度降低而终止具有蔗糖、乳糖或海藻糖的培养物。因此，图1显示CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞以及HEK293细胞可以在无血清培养基中利用麦芽糖作为糖源来增殖，但是不能利用蔗糖、乳糖或海藻糖作为糖源来增殖。

图2示出了与在葡萄糖培养基中培养的非适应性CHO-K1细胞相比，适应于麦芽糖培养基并且培养在麦芽糖培养基中的CHO-K1细胞的生长曲线和生物化学曲线。在14天内监测预先适应于具有3.6g/l麦芽糖作为碳水化合物来源的无血清无蛋白质的细胞培养基HyQPF-CHO的CHO-K1细胞(正方形标记)和培养在相同的但是具有葡萄糖作为碳水化合物来源的培养基中的正常非适应性CHO-K1细胞(十字形)以获得它们的(A)活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)以及(B)葡萄糖曲线、(C)乳酸盐曲线、(D)谷氨酰胺曲线和(E)铵曲线。为了图释说明(F)谷氨酰胺和(G)铵的比消耗率和产生速率，还绘制了这些组分的浓度与积分活细胞密度(IVCD)的关系图。对来自三(3)个平行测定摇瓶的平均值和标准偏差进行绘图。因此，图2显示麦芽糖可以用作葡萄糖替代物。

图3示出了在具有葡萄糖和麦芽糖作为糖源的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中培养的产生重组单克隆抗体的CHO-K1细胞系(SH87)的生长曲线和生物化学曲线。将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有4g/l葡萄糖、4g/l葡萄糖+0.5g/l麦芽糖、4g/l葡萄糖+1g/l麦芽糖、4g/l葡萄糖+3g/l麦芽糖、或6g/l葡萄糖的PFCDM中。监测培养物直到培养物活力低于50％为止，以获得它们的(A)活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)、以及培养基中的(B)葡萄糖浓度、(C)乳酸盐浓度、(D)麦芽糖浓度、(E)IgG滴度、(F)谷氨酰胺浓度、和(G)铵浓度。(H)从第0天到第5天收获在具有4g/l葡萄糖、或4g/l葡萄糖+3g/l麦芽糖的PFCDM中传代培养的SH87细胞以对细胞内麦芽糖浓度进行LC-MS定量。发现在从4g/l葡萄糖培养物中获得的所有样品和4g/l葡萄糖+3g/l麦芽糖培养物的来自第0天的样品中细胞内麦芽糖是不存在的(低于检测限度)。针对(D)对来自一组摇瓶的两(2)个技术平行测定的平均值和标准偏差进行绘图。对于其他曲线，对来自两(2)个平行测定摇瓶的平均值和标准偏差进行绘图。因此，图3显示细胞可以在葡萄糖耗尽时转换成麦芽糖代谢以维持细胞生长和蛋白质产生。

图4示出了无细胞条件培养基(CM)中的麦芽糖曲线和葡萄糖曲线。在(A)中，将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有4g/l葡萄糖、或4g/l葡萄糖+3g/l麦芽糖的PFCDM中。在第2天、第4天、第6天以及第8天，从这两种培养物中收获无细胞条件培养基(CM)。还监测活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)。在(B)中，在37℃将来自补充有麦芽糖的培养物的CM再孵育3天。从收获当天开始每天从这些CM收获样品，以确定葡萄糖浓度和麦芽糖浓度。在(C)中，向从葡萄糖培养物收获的CM掺入麦芽糖达到3g/l的最终浓度，之后在37℃进一步孵育。每天收获来自这些CM的样品，再持续三(3)天以确定葡萄糖浓度和麦芽糖浓度。对来自两(2)个平行测定摇瓶的平均值和标准偏差进行绘图。因此，图4显示培养的细胞利用麦芽糖，并且在条件培养基中麦芽糖水解不会自发地发生，即使是在培养物活力低的时候也不会。

图5示出了在具有高浓度的葡萄糖和麦芽糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中培养的SH87的生长曲线和生物化学曲线。将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有14g/l葡萄糖、24g/l葡萄糖、4g/l葡萄糖+10g/l麦芽糖、或4g/l葡萄糖+20g/l麦芽糖的PFCDM中。监测培养物直到培养物活力低于50％为止，以获得它们的(A)活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)、以及(B)葡萄糖曲线、(C)乳酸盐曲线、(D)麦芽糖曲线、(E)谷氨酰胺曲线、(F)重量克分子渗透压浓度曲线、和(G)IgG滴度曲线。对于麦芽糖曲线，对来自一组摇瓶的两(2)个技术平行测定的平均值和标准偏差进行绘图。对于其他曲线，对来自两(2)个平行测定摇瓶的平均值和标准偏差进行绘图。因此，图5示出了与14g/l葡萄糖相比，在具有10g/l麦芽糖补充剂或20g/l麦芽糖补充剂的培养物中相似的细胞生长，因此显示在更高的麦芽糖补充剂浓度麦芽糖代谢率为细胞生长提供了充分的支持。这允许与具有14g/l葡萄糖的培养物相比，培养物中更低的初始葡萄糖浓度，导致具有麦芽糖补充剂的细胞培养物中乳酸盐的消耗。此外，重量克分子渗透压浓度比具有20g/l葡萄糖的培养物低得多，这去除了对细胞培养基中碳水化合物负载的重量克分子渗透压浓度限制。此外，图5还显示补充有麦芽糖的培养物中最大重组蛋白产量(即IgG滴度)的提高。

图6示出了比麦芽糖消耗率的莫诺模型(Monod model)。在(A)中，根据方程式4，来自不同实验的具有不同初始麦芽糖浓度的培养物的比麦芽糖消耗率被确定为麦芽糖浓度与累积积分活细胞密度(IVCD)的关系图的斜率。在(B)中，根据方程式5，通过非线性回归确定最大比麦芽糖消耗率(qs_max)和亲和常数(Ks)。然后对使用这些参数计算的比麦芽糖消耗率的莫诺模型和用于所述模型的实验数据进行绘图。因此，图6示出了哺乳动物细胞麦芽糖代谢动力学的新的估计值。

图7示出了在仅含葡萄糖或葡萄糖+麦芽糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)基础培养基中SH87补料分批生物反应器培养物的生长曲线和生物化学曲线。在2升搅拌罐式生物反应器中，将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有4g/l葡萄糖或4g/l葡萄糖+20g/l麦芽糖的PFCDM中。每天向具有仅含葡萄糖的基础培养基的培养物补加它的计算葡萄糖需求的100％，而每天向具有葡萄糖和麦芽糖基础培养基的培养物补加它的计算葡萄糖需求的50％。使用谷氨酰胺作为参考营养素，其他营养素类似地在单独的补料中补加。监测培养物直到培养物活力低于50％为止以获得它们的(A)活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)、以及(B)葡萄糖曲线、(C)乳酸盐曲线、(D)麦芽糖曲线、(E)谷氨酰胺曲线、(F)重量克分子渗透压浓度曲线、和(G)IgG滴度曲线。针对每一种补料分批条件进行一式两份的生物反应器培养并且对来自所有4个培养物的数据进行绘图。因此，图7显示麦芽糖的存在使得能够使用更少的葡萄糖补料，这可以产生更高的最大重组蛋白产量(即IgG滴度)。

图8示出了在仅含葡萄糖或葡萄糖+麦芽糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)基础培养基中由SH87补料分批生物反应器培养物产生的抗Her2抗体的糖基化谱。从具有4g/l葡萄糖或4g/l葡萄糖+20g/l麦芽糖的PFCDM中SH87补料分批培养物(图7)的来自第10天和第15天的样品中纯化抗Her2单克隆抗体，并且进行糖基化谱分析。(A)是具有所选择的结构的符号表示的四个第10天样品的代表性荧光色谱图。(B)示出了聚糖结构的相对丰度。示出了两(2)个生物学平行测定的平均值和标准偏差。还计算了葡萄糖+麦芽糖样品与仅葡萄糖样品之间的平均差异以及第15天样品与第10天样品之间的平均差异。麦芽糖补充和后期第15天收获对聚糖结构的相对丰度的影响是粗体和加下划线的。使用成对单尾司图顿氏t检验(Student's t-Test)对来自单个样品的数据计算p值。因此，图8显示麦芽糖补充可以用作微调蛋白质共翻译或翻译后修饰过程的手段(如在单克隆抗体糖基化谱中，特别是在略微降低唾液酸化水平方面，这已知会提高治疗性抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC))。

图9示出了在使用仅葡萄糖补料或葡萄糖+麦芽糖补料的情况下在葡萄糖+麦芽糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)基础培养基中SH87补料分批生物反应器培养物的生长曲线和生物化学曲线。在2L搅拌罐式生物反应器中，将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有4g/l葡萄糖+20g/l麦芽糖的PFCDM中。使用仅由葡萄糖组成或由1:1比率的葡萄糖和麦芽糖组成的糖补料，每天向培养物补加它的计算葡萄糖需求的50％。使用谷氨酰胺作为参考营养素，其他营养素类似地在单独的补料中补加。监测培养物直到培养物活力低于50％为止以获得它们的(A)活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)、以及(B)葡萄糖曲线、(C)乳酸盐曲线、(D)麦芽糖曲线、(E)谷氨酰胺曲线、(F)重量克分子渗透压浓度曲线、和(G)IgG滴度曲线。针对每一种补料分批条件进行一式两份的生物反应器培养，并且对来自平行测定培养物的平均值和标准偏差进行绘图。因此，图9显示当与具有仅葡萄糖补料的培养物相比时，在补料培养基中补充麦芽糖可以略微降低乳酸盐浓度。这种特征在培养物中将是有利的，其中乳酸盐积聚会导致培养物崩溃。图9还显示在补料培养基中添加麦芽糖可以在培养物中维持更高的麦芽糖浓度而对细胞生长和重组蛋白产生没有不利影响。

图10示出了随着麦芽糖浓度的增加，无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中CHO-K1细胞的生长曲线和生物化学曲线。在分批摇瓶培养中将适应于具有10g/L麦芽糖的PFCDM的CHO-K1细胞培养在具有10g/L、20g/L、30g/L以及40g/L麦芽糖的PFCDM中。监测培养物直到培养物活力低于50％为止，以获得它们的(A)活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)、以及(B)重量克分子渗透压浓度曲线、(C)葡萄糖曲线、(D)乳酸盐曲线、(E)谷氨酰胺曲线和(F)铵曲线。因此，图10显示CHO-K1细胞可以在培养基中具有20g/l或更多的麦芽糖作为唯一碳水化合物的PFCDM中更快生长。即使是在更高的麦芽糖浓度，乳酸盐浓度也保持在低水平直到在第6天活力开始下降为止。这支持了图2中所述的发现，其证实在细胞(如哺乳动物细胞)的常规培养中在不存在血清和水解产物的情况下麦芽糖可以用作葡萄糖替代物，另外的优势是低乳酸盐积累。

图11示出了在具有高浓度的葡萄糖和麦芽糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中培养的SH87的比IgG生产率。将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有14g/l葡萄糖、24g/l葡萄糖、4g/l葡萄糖+10g/l麦芽糖、或4g/l葡萄糖+20g/l麦芽糖的PFCDM中。根据方程式3绘制IgG滴度与IVCD的关系图。所述图表的斜率给出了在所述时间段内培养物的比IgG生产率。因此，图11支持了图5中的数据，其中在一些实例中，麦芽糖可以在谷氨酰胺耗尽之后提高蛋白质的产量(即IgG生产率)。

图12示出了在无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中培养的SH87的比麦芽糖消耗率。将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到含有4g/l葡萄糖并且补充有0.5g/l、1g/l、2g/l、3g/l、10g/l以及20g/l麦芽糖的PFCDM中。根据方程式4绘制麦芽糖浓度与IVCD的关系图。所述图表的斜率给出了在所述时间段内培养物的比麦芽糖消耗率。0.5g/l、1g/l以及3g/l麦芽糖培养物描述于图3中；10g/l麦芽糖(1)培养物和20g/l麦芽糖(1)培养物描述于图5中；2g/l麦芽糖、10g/l麦芽糖(2)以及20g/l麦芽糖(2)的详细培养物数据在本报告中没有描述。因此，图12支持了图6中的数据，其证实了可以使用莫诺方程式对比麦芽糖消耗率进行建模。

图13示出了在以计算葡萄糖需求的100％或50％补加葡萄糖的情况下在仅含葡萄糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)基础培养基中SH87补料分批生物反应器培养物的生长曲线和生物化学曲线。在2升搅拌罐式生物反应器中，将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有4g/l葡萄糖的PFCDM中。每天向培养物补加它的计算葡萄糖需求的100％或它的计算葡萄糖需求的50％。使用谷氨酰胺作为参考营养素，其他营养素类似地在单独的补料中补加。监测培养物直到培养物活力低于50％为止，以获得它们的(A)活细胞密度(带线标记)和培养物活力(仅标记)、以及(B)葡萄糖曲线、(C)乳酸盐曲线、(D)IgG滴度曲线、(E)谷氨酰胺曲线、以及(F)铵曲线。对每一种补料分批条件进行一式两份的生物反应器培养，并且对来自平行测定生物反应器培养物的平均值和标准偏差进行绘图。重量克分子渗透压浓度维持在低于381mOsm/kg(数据未示)。因此，图13显示在不补充麦芽糖的情况下单独使用更低的葡萄糖补料导致更低的细胞生长曲线和重组蛋白产量(即IgG滴度)。这支持了图7中的结果，并且确认了麦芽糖的存在使得能够使用更低葡萄糖补料，这可以产生所观测到的更高的细胞生产收率(即更高的最大IgG滴度)。

具体实施方式

大部分的培养细胞(如哺乳动物细胞)是化能异养的并且通常需要碳水化合物来源以在培养物中生长。由于碳水化合物具有低的通过构成大部分的细胞膜的磷脂双层的渗透性(Bresseleers等,1984；Wood等,1968)，因此糖向细胞中的转运由转运蛋白来促进(Jones和Nickson,1982；Thorens,1996；Wright等,1994)。因此，对于细胞(如哺乳动物细胞)的培养，葡萄糖是唯一最常用的碳水化合物，这是因为它可以经由两个主要的单糖转运蛋白家族，即钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)(Wright等,1994)和葡萄糖转运蛋白(GLUT)来有效地转运到细胞中。

除了葡萄糖之外，还已经测试了其他碳水化合物来源支持动物细胞培养物生长的能力(Altamirano等,2000；Morgan和Faik,1981)。在这些报道中，单糖半乳糖、果糖以及甘露糖被证实在血清培养基和无血清培养基这两者中由大部分的细胞类型利用，这与内化这些糖的转运蛋白的可用性一致(Mueckler和Thorens,2013；Wright,2013)。多糖也已经被证实在补充有血清的细胞培养物中支持细胞生长，这是因为血清含有对于分解培养基中的复合碳水化合物来说必要的糖酶(Morgan和Faik,1981)。在另一项研究中，使用缺乏淀粉酶和/或麦芽糖酶活性的热灭活血清和包被有含血清培养基的培养皿来分离可以利用麦芽糖或淀粉的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞变体(Scannell和Morgan,1982)。作者证实了包被有含血清培养基的培养皿没有促进糖酶活性，并且因此他们假设仅另外在小肠中表达的内源性碳水化合物水解酶在这些分离株中被诱导以允许它们在含有麦芽糖和淀粉的培养基中生长(Scannell和Morgan,1982)。然而，在该研究中使用含糖酶的血清来包被培养皿，并且没有评价这如何促进细胞对麦芽糖和淀粉的利用。

在本研究中，在无血清无蛋白质的培养物中对使用二糖来支持哺乳动物中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CHO-K1的生长进行了评价。发现CHO-K1细胞能够在不存在葡萄糖的情况下利用麦芽糖来生长。使用产生重组单克隆抗体的生产CHO-K1细胞系，证实当使用具有葡萄糖和麦芽糖这两者的培养基时，这些细胞能够以双相方式在葡萄糖耗尽之后利用麦芽糖。此外，证实了在条件培养基中麦芽糖被细胞内化并且不自发水解。补充麦芽糖还引起细胞蛋白质产量(即来自分批培养物的重组单克隆抗体滴度)提高15％。然后确定比麦芽糖消耗率并且拟合成莫诺模型以获得0.257纳克/细胞/天的最大比麦芽糖消耗率(qs_max)和7.03g/l的亲和常数(Ks)。然后证实，当与仅含葡萄糖的补料分批培养物相比时，在补料分批生物反应器培养物中应用麦芽糖补充使得最大单克隆抗体滴度和比单克隆抗体生产率分别提高了23％和55％。因此，麦芽糖补充可以作为简单的生物反应器工艺改进方案应用以在当前的制造工艺中提高细胞蛋白质生产(如单克隆抗体)收率。

本公开的发明人惊人地发现，尽管哺乳动物细胞的无血清和无蛋白质培养分别自20世纪70年代和20世纪80年代以来已经被报道(Hayashi和Sato,1976；Okabe等,1984)，迄今为止没有关于在细胞(如哺乳动物细胞)的无血清培养中使用多糖支持细胞生长的报道。这并不令人惊奇，这是因为只有一种已知的动物二糖蔗糖转运蛋白，其最近被报道(Meyer等,2011)。多糖是否可以在无血清培养物中支持哺乳动物细胞生长是基础科学和应用科学二者都关注的。为了基本了解多糖的哺乳动物细胞代谢，使用无血清培养物可以完全排除来自血清的糖酶有助于仅利用多糖的细胞的存活的作用，这在先前的报道(Scannell和Morgan,1982)中不能被排除。如果获得利用多糖的无血清哺乳动物细胞培养物，那么所述培养物可以是解释哺乳动物细胞中多糖转运和代谢的尚未知的机制的模型，如最近在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中发现了第一种已知的动物蔗糖转运蛋白(Meyer等,2011)。

对于实际应用，使用多糖进行哺乳动物细胞培养可以为通常使用的转化细胞系的无血清悬浮细胞培养或重组蛋白治疗剂的生物制造提供优势。这样的细胞培养通常会遇到两个葡萄糖相关的问题：首先，葡萄糖通常是无血清悬浮细胞分批培养物中的限制性底物，这是因为它具有高消耗率以及在悬浮细胞培养物中达到的高细胞密度。尽管培养基中的初始葡萄糖浓度较高亦是如此，该较高的初始葡萄糖浓度是因为葡萄糖通常是用于哺乳动物细胞分批培养物的大部分的培养基配方中最丰富的营养素(Sinacore等,2000)，其浓度是在细胞生长期间由细胞利用的第二最丰富的营养素的2倍至10倍。向细胞培养基中进一步加入葡萄糖受到培养基的总重量克分子渗透压浓度(osmolality)的限制，这是因为高渗培养基已经被证实对细胞生长有害(Kurano等,1990；Ozturk和Palsson,1991)。其次，已知葡萄糖会导致培养物中的高乳酸盐水平，这是因为这些转化的细胞系具有高速率的糖酵解和乳酸盐产生，该表型被描述为瓦博格效应(Warburg effect)(Warburg,1956)。这成为分批培养和补料分批培养这两者的生产率限制，这是因为乳酸盐对细胞有毒并且生物反应器中的乳酸盐浓度增加将导致细胞生长速率降低(Hassell等,1991；Lao和Toth,1997)。

本公开的发明人因此假设在无血清悬浮细胞培养物中使用多糖有可能解决这两个问题：由于多糖有助于降低每单位质量浓度的重量克分子渗透压浓度，因此这些糖可能增加分批培养基中糖对细胞的可用性，这是因为可以使用更高的质量浓度。根据多糖向单糖的转化率，它还可以通过提供不容易由细胞使用的糖源，从而限制糖酵解和乳酸盐产生来减轻生物反应器中的乳酸盐积累。在理论上，这将有点类似于在生物反应器中维持低葡萄糖浓度，如通过动态在线补料策略(Wong等,2005)所实现的那样，尽管这实际上对于设置和实施来说是更简单的。

鉴于上述，在本公开中，描述了使用二糖(最简单的多糖)来支持哺乳动物细胞系在无血清无蛋白质的培养物中的生长。因此，在第一个方面，本发明涉及一种无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基包含麦芽糖作为唯一的碳水化合物来源。在另一个方面，本发明涉及无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基包含麦芽糖和至少一种另外的、至少两种另外的、至少三种另外的或更多种另外的糖作为碳水化合物来源。

如以下实验部分中所示，本公开的发明人惊人地证实了在哺乳动物细胞培养中成功使用麦芽糖作为碳水化合物来源。惊人地证实了动物细胞能够利用二糖。所述结果是惊人的，这是因为并不知道哺乳动物细胞表达二糖转运蛋白，并且只有所选择的哺乳动物细胞(如肠细胞)在它的细胞膜上表达麦芽糖酶以允许消化麦芽糖。

如本文所用的术语“无血清”指的是不含胎牛血清(fetal calf serum，FCS)或胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)或新生小牛血清(NBS)或来自任何其他人类或动物来源的血清的细胞培养基。如以下实验部分中所说明或证实，本发明的发明人能够在无血清培养物中使用麦芽糖作为碳水化合物来源。在本公开中使用麦芽糖作为碳水化合物来源与本领域已知的用途形成对比，其中麦芽糖一般用作在含血清的培养基中进行细胞(哺乳动物细胞)培养的碳水化合物来源。在含血清的培养基中使用麦芽糖进行细胞(哺乳动物细胞)培养的原因是因为血清已经被证实含有麦芽糖酶，其将在体外将麦芽糖分解成葡萄糖，之后被细胞代谢。本公开的发明人开发了二糖作为碳水化合物的来源用于无血清细胞培养物(如动物细胞培养物)的惊人的用途。此外，还惊人地证实了，可以在不存在葡萄糖的情况下在含有麦芽糖的培养基中常规地培养细胞(如哺乳动物细胞)，如同它们可以在含有葡萄糖的培养基中培养那样。

在无血清细胞培养物(如哺乳动物细胞培养物)中使用麦芽糖的优势在于它可以被添加到具有更小的重量克分子渗透压浓度负荷的细胞培养基中，这是因为它是二糖。因此，与诸如葡萄糖的单糖相比，可以将更多的碳水化合物负载到培养基中。此外，如本文所证实，在分批培养基中使用麦芽糖可以引起乳酸盐积累降低，所述乳酸盐积累也已知对细胞培养有害。在本公开中还已经证实，在分批培养物和补料分批培养物中使用麦芽糖可以提高蛋白质(如重组蛋白或重组单克隆抗体)产量。

在一些实例中，如本文所述的细胞培养物可以提供可仅为麦芽糖的碳水化合物来源。在一些实例中，如本文所述的细胞培养物可以提供可以具有至少一种另外的(即麦芽糖加上至少另外一种)、或至少两种、或至少三种、或至少四种、或至少五种、或至少六种、或至少七种、或至少八种、或更多种糖的碳水化合物来源。如以下实验部分中所述，分批培养基负载糖，以使得碳水化合物不再是限制性的。因此，在一些实例中，糖可以独立地或彼此组合以如下浓度存在：0.5克/升至40克/升、10克/升至15克/升、15克/升至20克/升、20克/升至25克/升、25克/升至30克/升、30克/升至35克/升、35克/升至40克/升、至少约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约8克/升、至少约10克/升、至少约15克/升、至少约20克/升、至少约25克/升、至少约30克/升、至少约35克/升、约1.5克/升、约3.5克/升、约3.6克/升、约5.5克/升、约8克/升、约11克/升、约14克/升、约18克/升、约23克/升、约28克/升、约33克/升、或约38克/升。

在一些实例中，如本文所述的糖可以是多糖。如本文所述的多糖可以是葡聚糖或二糖。

如本文所用的术语“葡聚糖”指的是多糖，其是由通过糖苷键连接在一起的D-葡萄糖单体构成的聚合物。在一些实例中，如本文所述的葡聚糖可以包括但不限于纤维二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、右旋糖酐、糖原、支链淀粉、淀粉、纤维素、金藻昆布糖、凝胶多糖、昆布多糖、香菇多糖、地衣多糖、燕麦β-葡聚糖、平菇β-葡聚糖(pleuran)、酵母聚糖以及其组合。

在一些实例中，如本文所述的“二糖”可以包括但不限于纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖(gentiobiulose)、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香二糖、芦丁酮糖、木二糖以及其组合。

在一些实例中，如本文所述的糖可以是不明确的细胞培养补充剂的组分，包括但不限于大豆水解产物、酵母自溶液、乳清蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、明胶水解产物、麸质水解产物、肝脏水解产物、蔬菜水解产物、小麦水解产物、来自动物组织的蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白质蛋白胨以及其组合。

在一些实例中，如本文所述的糖可以是单糖。如本文所用的术语“单糖”指的是不能通过水解分解成更简单的糖并且构成低聚糖和多糖的构建嵌段的一类碳水化合物中的任一种。单糖可以具有至少三个碳原子，其中一个与氧原子连接以形成醛基(CHO)或酮，并且其中其他碳原子各自与羟基(OH)连接。每分子包含三个碳的单糖被称为丙糖。每分子包含四个碳的单糖被称为丁糖。每分子包含五个碳的单糖被称为戊糖。每分子含有六个碳的单糖被称为己糖。单糖可以作为链或环存在。单糖可以包括但不限于塔格糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、果糖以及木糖。如实验部分中所示，当使用麦芽糖时，观测到蛋白质滴度的提高。因此，在一些实例中，单糖可以是葡萄糖。如本公开的实验部分中所示，在一些实例中，如本文所述的培养基可以包含葡萄糖和另外的麦芽糖补充剂。因此，在一些实例中，如本文所述的细胞培养基可以包含麦芽糖和葡萄糖作为仅有的碳水化合物来源。如以下实验部分中所证实，在细胞培养物中使用麦芽糖(如补料分批工艺)允许将葡萄糖控制在更低的水平以提高重组蛋白产量。不希望受理论所束缚，麦芽糖和葡萄糖的组合作为仅有的碳水化合物来源可以降低完全碳水化合物耗尽的风险，这可能会导致培养物死光(崩溃)。

如以下实验部分中所述，分批培养基负载有麦芽糖，以使得碳水化合物不再是限制性的。因此，在一些实例中，麦芽糖可以如下浓度存在于如本文所述的培养基中：0.5克/升至40克/升、10克/升至15克/升、15克/升至20克/升、20克/升至25克/升、25克/升至30克/升、30克/升至35克/升、35克/升至40克/升、至少约1克/升、至少约2克/升、至少约3克/升、至少约4克/升、至少约5克/升、至少约8克/升、至少约10克/升、至少约15克/升、至少约20克/升、至少约25克/升、至少约30克/升、至少约35克/升、约1.5克/升、约3.5克/升、约3.6克/升、约5.5克/升、约8克/升、约11克/升、约14克/升、约18克/升、约23克/升、约28克/升、约33克/升、或约38克/升。

在一些实例中，如本文所述的无血清细胞培养基可以是无蛋白质的。如本文所用的术语“无蛋白质”指的是不含胰岛素或转铁蛋白或生长因子或从任何生物体纯化的任何蛋白质或任何重组蛋白的细胞培养基。为清楚起见，水解产物或水解蛋白可以存在于无蛋白质的细胞培养基中。由于血清含有蛋白质，因此所有无蛋白质的培养基也是无血清的。

在一些实例中，如本文所述的无血清细胞培养基可以是化学成分确定的培养基。如本文所用的术语“化学成分确定的”指的是适用于细胞的体外细胞培养的生长培养基，其中所有化学组分被鉴定并且它们的精确浓度是已知的。化学成分确定的培养基还必须完全不含任何不明确的组分，如胎牛血清或来自任何其他人类或动物来源的血清、或大豆水解产物、酵母水解产物或任何水解产物，其中组分的确切身份和浓度是未知的。这意味着化学成分确定的培养基可以含有蛋白质的重组形式，诸如但不限于白蛋白和生长因子，其通常源自于水稻或大肠杆菌。由于血清含有不明确的组分，因此所有化学成分确定的培养基也是无血清的。

在一些实例中，如本文所述的无血清细胞培养基可以是无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)。如本文所用的术语“无蛋白质的化学成分确定的”指的是适用于细胞的体外细胞培养的生长培养基，其中所有化学组分是已知的，并且不含胰岛素或转铁蛋白或生长因子或从任何生物体纯化的任何蛋白质或任何重组蛋白。

如在整个以下实验部分中所示，如本文所述的细胞培养基可以进一步包括但不限于选自由以下各项组成的组的基础细胞培养基：伊格尔氏基础培养基(basal mediumeagle，BME)、伊格尔氏最低必需培养基(MEM或伊格尔氏MEM)、厄尔氏平衡盐溶液(Earle'sbalanced salt solution，EBSS)、杜氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's modifiedEagle's medium，DMEM)、汉姆氏F-10培养基(HAM's F-10medium)、汉姆氏F-12培养基、DMEM-F12培养基、罗斯韦尔帕克纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)1640(RPMI 1640或RPMI)、莱博维茨氏培养基(Leiboitz's medium)(L-15培养基)、其组合或其改良型式。在一些实例中，如本文所述的细胞培养基可以包括伊思考夫氏改良杜氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)；含有HEPES和L-谷氨酰胺的IMDM；含有HEPES并且不含L-谷氨酰胺的IMDM；含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640；含有HEPES、L-谷氨酰胺和/或青霉素-链霉素的RPMI 1640；最低必需培养基-α(MEM-α)；含有L-谷氨酰胺的DMEM:F12 1:1；DME/F12；含有厄尔氏BSS的伊格尔氏基础培养基；GMEM(格拉斯哥氏MEM(Glasgow's MEM))；含有L-谷氨酰胺的GMEM；F-10；F-12；含有L-谷氨酰胺的汉姆氏F-10；含有L-谷氨酰胺的汉姆氏F-12；不含L-谷氨酰胺或酚红的L-15(莱博维茨)(2×)；不含L-谷氨酰胺的L-15(莱博维茨)；麦考伊氏5A改良培养基(McCoy's 5A Modified Medium)；培养基199；不含L-谷氨酰胺或酚红的伊格尔氏MEM(2×)；含有L-谷氨酰胺的伊格尔氏MEM-厄尔氏BSS；不含L-谷氨酰胺的伊格尔氏MEM-厄尔氏BSS；不含L-谷氨酰胺的伊格尔氏MEM-汉克斯BSS(HanksBSS)；含有L-谷氨酰胺的NCTC-109；含有L-谷氨酰胺的黎克特氏CM培养基(Richter's CMMedium)；以及含有水解产物的培养基。

此外，根据待培养的细胞，认为如果如本文所述的细胞培养基可以进一步包含至少一种另外的成分是有利的，则所述成分包括但不限于至少一种氨基酸、至少一种维生素、至少一种无机盐、至少一种痕量元素、硫酸腺嘌呤、ATP、脱氧核糖、乙醇胺、乙醇胺·HCl、谷胱甘肽、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、次黄嘌呤、亚油酸、硫辛酸、酚红、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸钠、胆固醇、硫酸右旋糖酐、β-巯基乙醇、甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)、甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤、其组合等。

在一些实例中，氨基酸成分可以包括但不限于一种或多种氨基酸，诸如但不限于L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等或其组合。

如本文所述的维生素成分可以包括但不限于一种或多种维生素，如抗坏血酸、生物素、氯化胆碱、D-Ca++-泛酸盐、叶酸、i-肌醇、甲萘醌、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸(PABA)、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素A醋酸酯、维生素B12、维生素D2等或其组合。

如本文所述的无机盐成分可以包括但不限于一种或多种无机盐，如CaCl₂、KCl、MgCl₂、MgSO₄、NaCl、NaHCO₃、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、KH₂PO₄、Ba(C₂H₃O₂)₂、KBr、CoCl₂、KI、MnCl₂、Cr(SO₄)₃、CuSO₄、NiSO₄、H₂SeO₃、NaVO₃、TiCl₄、GeO₂、(NH₄)₆Mo₇O₂₄、Na₂SiO₃、FeSO₄、NaF、AgNO₃、RbCl、SnCl₂、ZrOCl₂、CdSO₂、ZnSO₄、Fe(NO₃)₃、AlCl₃、柠檬酸铁螯合物等或其组合。

如本文所述的痕量元素成分可以包括但不限于一种或多种痕量元素的离子，如钡、溴、钴、碘、锰、铬、铜、镍、硒、钒、钛、锗、钼、硅、铁、氟、银、铷、锡、锆、镉、锌、铝等或其组合。

还设想的是，如本文所述的细胞培养基可以进一步与至少一种、或至少两种、或至少所有成分组合，如水解产物、或酶消化产物、或酵母细胞提取物。

在一些实例中，如本文所述的细胞培养基可以进一步与两性离子表面活性剂、离子表面活性剂或非离子表面活性剂中的任何一种或多种组合。合适的表面活性剂可以是离子表面活性剂，其可以是阴离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。阴离子表面活性剂具有负离子基，其基于永久阴离子，如硫酸根、磺酸根或磷酸根或基于pH值依赖性阴离子，如羧酸根。阴离子表面活性剂的实例包括但不限于烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、多库酯、磺酸盐含氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐、烷基羧酸盐、烷基聚氧乙烯硫酸盐、羧酸盐含氟表面活性剂、十二烷基硫酸铵、十二烷基硫酸钠(SDS)、磺基丁二酸二辛酯钠、脱氧胆酸钠、藻酸钠、正十二烷基苯磺酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基醚硫酸钠(SLES)、肉豆蔻醇聚醚硫酸钠、磺基丁二酸二辛酯钠、磷脂酰甘油、月桂酸钾、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、全氟丁烷磺酸盐、硬脂酸钠、三乙醇胺硬脂酸酯、二磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸和它们的盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)和其盐(例如脱氧胆酸钠)、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐、以及全氟辛酸盐(PFOA或PFO)等。

在一些实例中，非离子表面活性剂可以包括但不限于甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨酸酯)、聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、硬脂醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖，包括淀粉和淀粉衍生物，如羟乙基淀粉(HES)；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。

阳离子表面活性剂包含正离子基团并且pH值依赖性阳离子表面活性剂基于伯胺、仲胺或叔胺，而永久带电荷的阳离子表面活性剂基于季铵阳离子。阳离子表面活性剂的实例可以包括但不限于天然磷脂、合成磷脂、季铵化合物、苯扎氯铵、十六烷基三甲溴化铵、壳聚糖、月桂基二甲基苯甲基氯化铵、盐酸酰基肉碱、二甲基二-十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二酰基甘油基-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶卤化物、或长链烷基胺，例如像正辛胺、油胺等。

在一些实例中，所述表面活性剂可以是两性离子表面活性剂，其是在同一分子内具有局部正电荷和负电荷的电中性表面活性剂。合适的两性离子表面活性剂的实例包括但不限于两性离子磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油基-磷酸乙醇胺(如二肉豆蔻酰基-甘油基-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油基-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油基-磷酸乙醇胺(DSPE)、二油酰基-甘油基-磷酸乙醇胺(DOPE))等。在一些实例中，如本文所述的培养基可以包括磷脂的混合物，所述磷脂包括阴离子磷脂和两性离子磷脂。这样的混合物包括但不限于溶血磷脂、卵磷脂或大豆磷脂、或其任何组合。磷脂，无论是阴离子、两性离子还是磷脂的混合物，可以是盐化的或脱盐的、氢化的或部分氢化的或者天然的、半合成的或合成的。

在一些实例中，所述表面活性剂可以包括但不限于脂肪醇；聚氧乙二醇辛基酚醚；以及聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯。在其他实例中，所述表面活性剂可以是非离子表面活性剂。在一些实例中，所述表面活性剂可以包括但不限于聚山梨酸酯80(PS80)、聚山梨酸酯20(PS20)、以及泊洛沙姆188(P188)。

为了防止不期望的生长，对于如本文所述的细胞培养基来说可能有利的是，包含防止污染物的不期望的生长的试剂。因此，在一些实例中，如本文所述的细胞培养基可以进一步包含抗生素剂。所述抗生素剂可以包括但不限于潮霉素B(hygromycin B)、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻瘟菌素(blasticidin)、硫酸博莱霉素(bleomycin sulfate)、遗传霉素(geneticin)(G418)、希奥辛(zeocin)、两性霉素B(amphotericin B)、氨苄西林(ampicillin)、青霉素、氯霉素(chloramphenicol)、庆大霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、链霉素、四环素(tetracycline)、多粘菌素B(polymyxinB)、放线菌素D(actinomycin D)、阿米卡星(amikacin)、杆菌肽(bacitracin)、羧苄西林(carbenicillin)、头孢他啶(ceftazidime)、香豆霉素A1(coumermycin A1)、D-环丝氨酸(D-cycloserine)、放线菌酮(cyclohexamide)、倍半硫酸二氢链霉素(dihydrostreptomycin sesquisulfate)、春雷霉素(kasugamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、萘啶酮酸(nalidixic acid)、硫酸诺尔丝菌素(nourseothricin sulfate)、土霉素(oxytetraclycline)、硫酸巴龙霉素(paromomycin sulfate)、腐草霉素(phleomycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、核糖霉素(ribostamycin)、利福平(rifampicin)、利福霉素(rifamycin)、大观霉素(spectinomycin)、他唑巴坦(tazobactam)、硫链丝菌肽(thiostrepton)、替卡西林(ticarcillin)、以及其组合。

本领域技术人员应当了解的是，如本文所述的每一种成分将以适于体外培养所期望的细胞的量存在。因此，在一个实例中，如本文所述的培养基的每一种成分可以支持体外培养细胞的量存在。如所将了解的那样，设想的是，增加分批培养基中其他营养素的浓度可以进一步提高蛋白质(如重组蛋白)生产率。

为了帮助如本文所述的细胞培养基的运输和/或储存，如本文所述的细胞培养基可以作为细胞培养基浓缩物提供。因此，在一些实例中，如本文所述的细胞培养基可以是1×至100×培养基配方、或1×、或2×、或5×、或10×、或50×、或100×培养基配方。如本文所述的培养基可以粉末形式或液体形式提供。

在一些实例中，所述细胞培养基可以包括但不限于杜氏最低必需培养基(DMEM)、F-12基础培养基(DMEM-F12)、L-谷氨酰胺、非离子表面活性剂、遗传霉素以及麦芽糖、或其改良型式。

如以下实验部分中所示，细胞培养基可以进一步包括葡萄糖。因此，在一些实例中，细胞培养基可以包括但不限于杜氏最低必需培养基(DMEM)、F-12基础培养基(DMEM-F12)、L-谷氨酰胺、非离子表面活性剂、遗传霉素、麦芽糖以及葡萄糖、或其改良型式。

根据细胞培养的目的，待在如本文所述的培养基中培养的细胞可以包括但不限于脊椎动物细胞、节肢动物细胞、环节动物细胞、软体动物细胞、海绵动物细胞、水母细胞、昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞、鱼类细胞等。

当待培养的细胞是昆虫细胞时，所述昆虫细胞可以源自于灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)或粉纹夜蛾属物种(Trichoplusa spp)。

在一些实例中，待在如本文所述的培养基中培养的细胞可以是哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可以包括但不限于人类细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、兔细胞、狗细胞、猴细胞、杂交瘤细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-GS细胞、SH87细胞、BHK细胞、COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、M1细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、CAP细胞、AGE1.HN细胞、或其衍生物。在一些实例中，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞、或CHO-DG44细胞、或其蛋白质(如重组蛋白)产生衍生物，如SH87。

有利的是，如以下实验部分中所证实，如本文所述的培养基可以用于培养任何细胞，而无需任何修饰以使得能够代谢替代碳水化合物来源(如麦芽糖)。因此，在一些实例中，可以用于如本文所述的细胞培养基的细胞可能能够代谢仅有的一种或多种碳水化合物来源而无需事先适应所述一种或多种来源。如本文所用的术语“适应”指的是调节或改变生物体的生理学以更适合于环境。该调节或改变可以例如通过所述生物体的遗传修饰来进行，但是也可以经由自然选择和环境选择压力自发地发生。

在另一个方面，提供了一种使细胞生长和/或培养细胞的方法，其中所述方法包括在如本文所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。在一些实例中，所述方法可以包括在所述无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞，所述无血清细胞培养基可以包含麦芽糖作为唯一的碳水化合物来源或可以包含麦芽糖和至少一种、或至少两种、或至少三种、或至少四种、或更多种糖作为碳水化合物来源。在一些实例中，所述方法可以包括如本文所述使细胞生长和/或培养细胞，其中所述培养基可以包含麦芽糖和葡萄糖作为仅有的碳水化合物来源或所述培养基可以包含杜氏最低必需培养基(DMEM)、F-12基础培养基(DMEM-F12)、L-谷氨酰胺、非离子表面活性剂、遗传霉素、以及麦芽糖、或其改良型式。如以下实验部分中所示，如本文所述的使细胞生长和/或培养细胞的方法提高了蛋白质产量。因此，在一些实例中，如本文所述的方法提高了蛋白质收率。

如本文所述的使细胞生长和/或培养细胞的方法可以使用其他人已知的细胞培养方法来使细胞生长。在一些实例中，如本文所述的细胞可以在培养物中生长和/或培养，所述培养物包括但不限于贴壁培养物、悬浮培养物、T型瓶培养物、旋转瓶培养物、摇瓶培养物、旋管培养物、微型生物反应器培养物、生物反应器培养物、分批培养物、补料分批培养物、连续培养物、灌注培养物等。在一些实例中，所述细胞的生长和/或培养可以在适用于支持所述细胞的生长和/或培养的条件下进行。

如实验部分中所示，如本文所公开的方法可以提高蛋白质收率。因此，在另一个方面，提供了一种提高蛋白质收率的方法。所述方法包括在如本文所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。在一些实例中，所述方法可以包括在所述无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞，所述无血清细胞培养基可以包含麦芽糖作为唯一的碳水化合物来源或可以包含麦芽糖和至少一种、或至少两种、或至少三种、或至少四种、或更多种糖作为碳水化合物来源。在一些实例中，所述方法可以包括如本文所述使细胞生长和/或培养细胞，其中所述培养基可以包含麦芽糖和葡萄糖作为仅有的碳水化合物来源或所述培养基可以包含杜氏最低必需培养基(DMEM)、F-12基础培养基(DMEM-F12)、L-谷氨酰胺、非离子表面活性剂、遗传霉素、以及麦芽糖、或其改良型式。

在一些实例中，所述增加的蛋白质收率可以增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％。在一些实例中，蛋白质收率的增加可以是抗体产量的增加，其中抗体滴度可以增加约2％至约300％、或约2％、或约4％、或约6％、或约8％、或约10％、或约12％、或约14％、或约16％、或约18％、或约20％、或约22％、或约24％、或约26％、或约28％、或约30％、或约32％、或约34％、或约36％、或约38％、或约40％、或约43％、或约45％、或约48％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约90％、或约100％、或约125％、或约150％、或约175％、或约200％、或约230％、或约250％、或约300％。

在一些实例中，如本文所述的方法可以将细胞比生产率提高约2％至约300％、或约2％、或约4％、或约6％、或约8％、或约10％、或约12％、或约14％、或约16％、或约18％、或约20％、或约22％、或约24％、或约26％、或约28％、或约30％、或约32％、或约34％、或约36％、或约38％、或约40％、或约43％、或约45％、或约48％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约90％、或约100％、或约125％、或约150％、或约175％、或约200％、或约230％、或约250％、或约300％。

在一些实例中，如本文所述的细胞培养基和/或方法可以将最大活细胞密度/数量增加约2％至约300％、或约2％、或约4％、或约6％、或约8％、或约10％、或约12％、或约14％、或约16％、或约18％、或约20％、或约22％、或约24％、或约26％、或约28％、或约30％、或约32％、或约34％、或约36％、或约38％、或约40％、或约43％、或约45％、或约48％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约90％、或约100％、或约125％、或约150％、或约175％、或约200％、或约230％、或约250％、或约300％，如在例如14天的过程中所测量。

如图8和表3中所述，如本文所述的细胞培养基和/或如本文所述的方法可以用于微调蛋白质产物(例如重组糖蛋白产物)的糖基化谱。在一个方面，提供了一种调节蛋白质的糖基化谱的方法，其中所述方法包括在如本文所述的细胞培养基中培养表达所述蛋白质的细胞，从而产生表达具有调节的糖基化谱的蛋白质的细胞。在一些实例中，调节蛋白质的糖基化谱可以是调节糖基化，诸如但不限于分支(antennae)、岩藻糖基化、甘露糖基化、唾液酸化、或其组合等。

如本文所用的术语“调节”指的是与对照相比增加或减少蛋白质的特定类型的糖基化。如本文所用的“对照”培养基可以是除了所述对照不含麦芽糖之外与如本文所述的培养基相同的细胞培养基。也就是说，所述对照可以是不含麦芽糖的如本文所述的细胞培养基的等同细胞培养基。对照细胞培养基与如本文所述的细胞培养基之间的唯一区别是在如本文所述的细胞培养基中存在二糖(如麦芽糖)。

在一些实例中，调节的糖基化谱包括但不限于岩藻糖基化聚糖的水平降低、二分支型聚糖的水平降低、甘露糖基化聚糖的水平增加、单分支型聚糖的水平增加、唾液酸化聚糖减少、或其组合。因此，在一个实例中，提供了一种产生具有调节的糖基化中的至少一种、至少两种、至少三种、或全部的蛋白质的方法，所述调节的糖基化包括但不限于岩藻糖基化聚糖的水平降低、二分支型聚糖的水平降低、甘露糖基化的聚糖增加、单分支型聚糖增加、以及唾液酸化的聚糖减少。在一些实例中，如表3中所示，所述蛋白质可以是抗体、或免疫球蛋白、或其片段。

在一些实例中，调节岩藻糖基化水平可以是所述蛋白质中岩藻糖基化水平降低。在一些实例中，岩藻糖基化聚糖的水平降低可以是降低约0.1％、1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。

在一些实例中，调节甘露糖基化聚糖水平可以是蛋白质的甘露糖基化水平增加。在一些实例中，甘露糖基化水平可以增加约0.1％、1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

在一些实例中，调节唾液酸化水平可以是所述蛋白质中唾液酸化水平降低。在一些实例中，唾液酸化聚糖的水平降低可以是降低约0.1％、1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。

在一些实例中，调节单分支型聚糖水平可以是所述蛋白质的单分支型聚糖水平增加。在一些实例中，所述单分支型聚糖水平可以增加约0.1％、1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

在一些实例中，调节二分支型聚糖水平可以是所述蛋白质中二分支型聚糖水平降低。在一些实例中，二分支型聚糖的水平降低可以是降低约0.1％、1％、1.2％、1.5％、2％、2.2％、2.5％、3％、3.2％、3.5％、4％、4.2％、4.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％。

如本文所用的术语“分支(antennae)”指的是将GlcNAc序列添加到杂合型聚糖和复杂型聚糖中的聚糖核心中。因此，“单分支型聚糖”指的是与核心聚糖连接的一个GlcNAc分支，“二分支型聚糖”指的是与核心聚糖连接的两个GlcNAc分支，诸如此类。

在一个实例中，提供了一种产生包含具有调节的糖基化谱的抗体或其抗原结合片段的组合物的方法。所述方法可以包括在如本文所述的细胞培养基中培养表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，从而产生包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物，所述抗体或其抗原结合片段具有选自由以下各项组成的组的至少一种(至少两种或全部)：与对照相比，岩藻糖基化聚糖的水平降低0.1％-50％、唾液酸化聚糖的水平降低0.1％-50％、以及甘露糖基化聚糖的水平增加0.1％-50％。在一些实例中，所述对照是包含抗体或其抗原结合片段的组合物，所述组合物是通过在细胞培养基中培养表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞而产生的，所述宿主细胞不是在如本文所述的培养基中培养的。在一个实例中，所述抗体是抗Her2抗体或其抗原结合片段。在一个实例中，所述培养基包含葡萄糖和/或麦芽糖。

如图8A中所示，补充麦芽糖还可能降低表达的抗体中的唾液酸化水平。已知的是，降低抗体的唾液酸化水平可以提高治疗性抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。因而，在一些实例中，本公开还提供了产生包含具有调节的糖基化谱的抗体或其抗原结合片段的组合物的方法，所述方法是通过在如本文所述的细胞培养基中培养表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，从而产生包含所述抗体或其抗原结合片段的组合物而实现的，与对照相比，所述抗体或其抗原结合片段的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)响应增加了0.1％-30％，其中所述对照是包含抗体或其抗原结合片段的组合物，所述组合物是通过在不是如本文所述的细胞培养基的细胞培养基中培养表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞而产生的。在一个实例中，所述抗体是抗Her2抗体或其抗原结合片段。在一个实例中，所述培养基包含葡萄糖和/或麦芽糖。

如本文所述的细胞培养基和如本文所述的方法可以用于培养细胞和/或使细胞生长和/或增加细胞的蛋白质收率，所述细胞如脊椎动物细胞、节肢动物细胞、环节动物细胞、软体动物细胞、海绵动物细胞、水母细胞、昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞、鱼类细胞等。在一些实例中，如本文所述的细胞培养基和如本文所述的方法可以用于培养真核细胞或组织和/或使真核细胞或组织生长和/或增加真核细胞或组织的蛋白质收率，包括动物细胞、人类细胞、昆虫细胞、植物细胞、禽类细胞、鱼类细胞、哺乳动物细胞等。

在一些实例中，所述哺乳动物细胞可以包括但不限于人类细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、兔细胞、狗细胞、猴细胞、杂交瘤细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-GS细胞、SH87细胞、BHK细胞、COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、M1细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、CAP细胞、AGE1.HN细胞、或其衍生物。

如本文所述的培养基增加了细胞的免疫球蛋白产生。因此，在一些实例中，待在如本文所述的细胞培养物和方法中培养的细胞可以是抗体产生细胞。在一些实例中，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞、或CHO-DG44细胞、或其重组蛋白产生衍生物，如SH87。

为了方便起见，所述培养基可以作为试剂盒提供。因此，在一个方面，提供了试剂盒，所述试剂盒包括如本文所述的细胞培养基的组分和/或用于执行如本文所述的方法的组分。在一些实例中，所述试剂盒可以进一步包括细胞。举例来说，所述细胞可以是待培养的细胞。所述细胞可以包括但不限于脊椎动物细胞、节肢动物细胞、环节动物细胞、软体动物细胞、海绵动物细胞、水母细胞、昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞、鱼类细胞等。在一些实例中，所述哺乳动物细胞可以包括但不限于人类细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、兔细胞、狗细胞、猴细胞、杂交瘤细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-GS细胞、SH87细胞、BHK细胞、COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、M1细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、CAP细胞、AGE1.HN细胞等、或其衍生物。

如实验部分中所举例说明，所述哺乳动物细胞可以是CHO-K1细胞、或CHO-DG44细胞、或其蛋白质(如重组蛋白)产生衍生物，如SH87。

在一些实例中，待在如本文所述的培养基和/或如本文所述的方法中培养的细胞可以是产生蛋白质的细胞，所述蛋白质诸如但不限于重组蛋白、抗体等。如以下实验部分中所示，所述蛋白质可以是单克隆抗体。

本文说明性描述的公开内容可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，举例来说，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和措辞时排除所示的以及所述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了本发明，但是本文所公开的其中所体现的发明的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。

本发明已经在本文中被广泛地并且一般地描述。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明本发明，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。

其他实施方案落入以下权利要求书和非限制性实施例内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。

实验部分

材料和方法

细胞系和细胞培养

使CHO-K1细胞系预先适应于在补充有2g/l碳酸氢钠(密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))、3.6g/l的D-(+)-葡萄糖(西格玛-奥德里奇公司)、6mM L-谷氨酰胺(西格玛-奥德里奇公司)以及0.1％F-68(加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命技术公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))的无血清无蛋白质培养基HyQ PF-CHOMPS(犹他州洛根的Hyclone公司(Hyclone,Logan,UT))中的悬浮培养。SH87是产生抗Her2单克隆抗体的悬浮CHO-K1细胞系(Ho等,2012)，使其预先适应于补充有6g/l D-(+)-葡萄糖(西格玛-奥德里奇公司)、8mM L-谷氨酰胺(西格玛-奥德里奇公司)、0.1％Pluronic F-68(生命技术公司)、以及600μg/ml G418焦硫酸盐(西格玛-奥德里奇公司)的基于DMEM/F12的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)。将CHO-K1细胞和SH87细胞常规地每3天至4天传代一次。

除非另外说明，否则在一次性锥形瓶(马萨诸塞州阿克顿的康宁公司(Corning,Acton,MA))中进行本公开中的细胞培养，将所述锥形瓶在加湿孵育箱(Climo-Shaker ISF-1-W，瑞士的科耐公司(Kuhner,Switzerland))中在37℃、8％CO₂以及110rpm的转速孵育。

分析细胞培养物样品

通过台盼蓝染料排除法，使用Vi-Cell XR细胞活力分析仪(加利福尼亚州布雷亚的贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Brea,CA))，根据制造商的说明书来确定活细胞密度和培养物活力。对于生物化学和其他细胞培养物参数分析，将1ml的培养物样品以8000g离心10分钟以获得澄清的上清液。

通过BioProfile 100Plus(马萨诸塞州沃尔瑟姆的诺瓦生物医学公司(NovaBiomedical,Waltham,MA))分析铵、谷氨酰胺、葡萄糖以及乳酸盐的浓度。使用蒸气压渗透压计(Vapro 5520，犹他州洛根的Wescor公司(Wescor,Logan,UT))，根据制造商的说明书来测量重量克分子渗透压浓度。使用麦芽糖比色/荧光测定试剂盒(加利福尼亚州米尔皮塔斯的Biovision公司(Biovision,Milpitas,CA))，根据制造商的说明书来定量麦芽糖浓度。通过浊度测定法，使用IMMAGE 800(贝克曼库尔特公司)，根据制造商的说明书来确定单克隆IgG抗体滴度。

使CHO细胞系适应于具有不同二糖的培养基

通过在培养基制备期间用相同质量浓度的麦芽糖、蔗糖、乳糖、或海藻糖替换通常添加到培养基中的3.6g/l葡萄糖来制备HyQ PF-CHO二糖培养基。然后将CHO-K1细胞以0.3×10⁶个细胞/毫升和1.0×10⁶个细胞/毫升的细胞接种密度接种到这些二糖培养基中，并且每3天至4天传代一次。在适应过程期间的每一次传代时，确定在传代之前和在接种到新鲜培养基中之后的活细胞密度和培养物活力。

摇瓶分批培养物取样和表征

对于CHO-K1细胞在麦芽糖和葡萄糖培养基中的生长曲线比较，将适应于麦芽糖培养基的CHO-K1细胞和非适应性CHO-K1细胞分别接种到具有3.6g/l麦芽糖的HyQ PFCHO二糖培养基和具有3.6g/l葡萄糖的正常HyQ PF-CHO培养基中。为了使用非适应性SH87评价麦芽糖利用率，将细胞接种到具有4g/l、6g/l、14g/l或24g/l葡萄糖、或具有4g/l葡萄糖并且补充有0.5g/l、1g/l、2g/l、3g/l、10g/l或20g/l麦芽糖的PFCDM中。按一式两份将细胞以0.3×10⁶个细胞/毫升的细胞接种密度培养在一次性锥形瓶(康宁公司)中。在整个生长曲线实验的持续时间内每天收集并且分析细胞培养物样品直到培养物活力降到低于50％为止。必要时，将培养上清液样品储存在-20℃以用于进一步分析。

定量细胞内麦芽糖

通过首先用冰冷的150mM NaCl(默克公司(Merck)，ACS试剂级)溶液淬灭10⁷个细胞来制备用于细胞内麦芽糖定量的样品。在通过离心使细胞沉淀之后，通过抽吸去除上清液并且添加10μl的0.4mM 13C-麦芽糖(UL-¹³C₁₂一水合麦芽糖，印第安纳州南本德的Omicron Biochemicals公司(Omicron Biochemicals,South Bend,IN))作为参考标准。利用两相液体提取方案来提取细胞内麦芽糖，所述方案涉及使用甲醇(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，最优级)、氯仿(默克公司)和三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)(默克公司)溶液(40:35:25v/v)(Selvarasu等,2012)。将提取物储存在-80℃，在真空下在4℃的温度干燥(CentriVap，美国的Labconco公司(Labconco,US))并且在水-甲醇混合物(95:5v/v)中复原，之后经由液相色谱-质谱(LC-MS)(Acquity UPLC-Xevo TQ-S MS，马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters,Milford,MA))分析。使用C18反相柱(沃特世公司，HSS T3柱，2.1mm×50mm，1.8μm粒度)使用以下溶剂进行分离：A：含有0.1％甲酸(西格玛-奥德里奇公司，98％)的水；B：甲醇，以0.4毫升/分钟的流速。经由多次反应监测实验进行细胞内麦芽糖的定量，其中获得每一个样品中麦芽糖和13C-麦芽糖的积分峰面积。通过直接比较麦芽糖的相对积分峰面积与13C-麦芽糖参考标准的相对积分峰面积来定量每一个样品中麦芽糖的实际浓度。观测到麦芽糖的检测下限是每次进样7.5ng。基于检测限度内麦芽糖的量、所使用的细胞数量以及从Vi-Cell XR细胞活力分析仪获得的平均细胞直径来计算细胞内麦芽糖浓度。在LC-MS上按一式三份分析样品并且观测到对于每一个样品所获得的积分峰面积具有小于15％的相对标准偏差。

生物反应器补料分批培养物取样和表征

对于待测试的每一种培养条件，将SH87在PFCDM中按比例放大并且以3×10⁵个细胞/毫升的活细胞密度接种到一式两份的两(2)升玻璃生物反应器(德国的赛多利斯公司(Sartorius,Germany))中。将培养温度、pH值、溶解氧以及搅拌速率分别维持在37℃、7.1、50％以及120rpm。葡萄糖和谷氨酰胺的培养设定点分别是0.5g/l和0.5mM，并且使用预测补料以通过添加浓缩的基于DMEM的无蛋白质的补料和150g/l葡萄糖溶液来维持这些浓度水平。在整个生长曲线实验的持续时间内每天收集并且分析细胞培养物样品直到培养物活力降到低于50％为止。必要时，将培养上清液样品储存在-20℃以用于进一步分析。

抗体糖基化分析

在作出修改的情况下根据先前公开的方案(Chan等,2015)进行抗体糖基化分析。简单地说，首先使用PD 10柱(宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗公司(GE Healthcare,Pittsburgh,PA))，遵循制造商的方案将蛋白A纯化的IgG样品脱盐。然后，释放聚糖并且用RapiFluor MS(RFMS)(Lauber等,2015)，根据制造商的方案(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司)标记。在标记之后，通过使标记混合物通过MiniTrap G-10脱盐柱(通用电气医疗公司)来去除过量的RFMS，然后在真空下干燥纯化的RFMS标记的聚糖。将样品在含有42.8μl水、50μl二甲基甲酰胺以及107.2μl乙腈的200μl复原缓冲液中复原，并且通过UNIFI生物制药平台(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司)分析。通过拟合到通过RFMS标记的右旋糖酐标准梯(沃特世公司)建立的校准曲线中来将所获得的每一个色谱峰的原始保留时间转换成葡萄糖单位(GU)。然后使用每一个色谱峰的观测到的GU值和相关质量来搜索嵌入UNIFI生物制药平台中的N-聚糖的实验数据库，所述数据库含有有关超过300种N-聚糖种类的预期GU值和质量的信息。然后基于两个正交标准将结构归属于每一个色谱峰：1)所观测到的GU值在0.2GU偏差内匹配预期的GU值；以及2)观测到的质量在5ppm质量误差内匹配聚糖的预期质量。此外，应用关于CHO糖基化特征的知识作为生物过滤器以去除无关的候选结构，如具有二等分GlcNAc和α2,6-连接的唾液酸的聚糖。

计算

根据方程式1，通过绘制ln(VCD)与t的关系图来确定比生长速率(μ)，其中VCD是活细胞密度，VCD₀是初始活细胞密度并且t是培养时间。

VCD＝VCD₀e^μt

ln(VCD/VCD₀)＝μt---方程式1

根据方程式2，通过梯形法则来计算累积积分活细胞密度(IVCD)。

IVCD_t＝IVCD_t-1+0.5×(VCD_t+VCD_t-1)×Δt---方程式2

根据方程式3，通过绘制IgG滴度(P)与IVCD的关系图来确定培养时间t1与t2之间的比IgG生产率(qp)。

q_p＝(P_t2-P_t1)/IVCD

P_t2＝q_p×IVCD+P_t1---方程式3

根据方程式4，通过绘制底物浓度(S)与IVCD的关系图来确定培养时间t1与t2之间的比底物消耗率(qs)。

-q_s＝(S_t2-S_t1)/IVCD

S_t2＝-q_s×IVCD+S_t1---方程式4

根据方程式5将比底物消耗率(qs)拟合到莫诺模型中，其中qs_max是最大比底物消耗率，S是底物浓度，并且Ks是亲和常数。

q_s＝(q_{s_max}×S)/(K_s+S)---方程式5

结果与讨论

评价二糖支持CHO-K1细胞生长

为了对使用二糖支持哺乳动物细胞生长进行评价，使用0.3×10⁶个细胞/毫升的接种细胞密度将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CHO-K1培养在无血清无蛋白质的细胞培养基HyQ PF-CHO中，其中使用3.6g/l的麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或葡萄糖作为能量源。确定这些培养基的重量克分子渗透压浓度是308mOsm/kg至324mOsm/kg，完全在最佳哺乳动物细胞培养的范围内。在74天的时间内在每一次传代开始和结束时这些培养物的活细胞密度和培养物活力示于图1中。虽然在含有葡萄糖的培养基中细胞在每一次传代时生长到高培养物活力和活细胞密度，但是在二糖培养基中细胞的那些参数分别降低和保持停滞。然而，麦芽糖培养物的培养物活力和活细胞密度在第14天开始增加。在麦芽糖培养物中细胞的增殖然后在所研究的时间段内维持，而在其他二糖中的那些在第31天由于缺乏细胞生长和培养物活力降低而终止。使用1.0×10⁶个细胞/毫升的更高的接种细胞密度重复的相同实验给出了相似的结果(数据未示)。因此，本公开证实了CHO-K1细胞可以在无血清无蛋白质的培养基中利用麦芽糖作为糖源来增殖，但是不能利用蔗糖、乳糖或海藻糖作为糖源来增殖。

为了验证所述观测结果，然后使用分别是0.3×10⁶个细胞/毫升和3.6g/l的相似的初始细胞密度和糖浓度，将在麦芽糖无蛋白质培养基中适应性CHO-K1细胞系的生长曲线与在葡萄糖无蛋白质培养基中培养的CHO-K1细胞相比较(图2)。与使用葡萄糖作为能量源培养的细胞(其在第6天达到5.9×10⁶个细胞/毫升)相比，使用麦芽糖作为能量源培养的细胞在第7天生长到1.4×10⁶个细胞/毫升的低得多的最大活细胞密度(图2A)。由于初始糖浓度是相同的，因此本公开的发明人假定该差异可能是因为诸如谷氨酰胺的其他营养素的耗尽，这是因为对于葡萄糖培养物和麦芽糖培养物，谷氨酰胺以相似的速率被消耗直到分别在第4天和第5天被完全利用为止(图2D)。使用直到第4天为止的活细胞密度数据，麦芽糖培养物的倍增时间是53.7小时，相比之下，葡萄糖培养物的倍增时间是22.3小时，这表明能量代谢的速率可能限制了麦芽糖培养物中的细胞生长速率。有趣的是，与在葡萄糖中培养的细胞相比，麦芽糖培养物在更长的时间段内维持在大于80％的高培养物活力(图2A)。这可能部分是因为麦芽糖培养物达到的最大细胞密度更低，这进而可能使得在培养的随后时间点未代谢的营养素的量更高并且毒性代谢产物的积累更低。另一个原因可能是麦芽糖培养物中的细胞由于限制性能量摄取速率而具有更低的代谢，并且这引起更少的细胞应激和更慢的细胞死亡。

检查培养基中的关键生物化学物质，葡萄糖在麦芽糖培养物中是不可检测的(图2B)，这确认了从培养开始时在培养基中缺乏葡萄糖。由于葡萄糖浓度在整个培养期间维持在不可检测的水平，因此这表明麦芽糖在培养基中没有被分泌的麦芽糖酶水解成葡萄糖，而是被细胞消耗。该消耗可能经由三(3)种可能机制之一发生：(1)麦芽糖可能被转运到细胞中，之后被细胞内麦芽糖酶，如酸性α葡糖苷酶(GAA)水解；或(2)麦芽糖可能被质膜结合的麦芽糖酶，如肠麦芽糖酶-葡糖淀粉酶(MGAM)和蔗糖酶-异麦芽糖酶(SI)水解，并且立即被也存在于质膜上的葡萄糖转运蛋白摄取。能量代谢的这些另外的步骤可能是限速的以导致麦芽糖培养物的缓慢生长速率，如上文所述。在麦芽糖培养物中缺乏乳酸盐产生(图2C)支持了这一假设，这是因为它证实了麦芽糖培养物中的细胞利用更节能的克雷布斯循环(Krebscycle)，而非以产生乳酸盐来结束糖酵解途径，如葡萄糖培养物中的乳酸盐产生所体现(图2C)。

研究谷氨酰胺消耗，虽然这在麦芽糖培养物中慢于葡萄糖培养物(图2D)，但是这可能是因为麦芽糖培养物的生长更慢。这是通过比较葡萄糖培养物和麦芽糖培养物的比谷氨酰胺消耗率来验证的：通过绘制培养物的谷氨酰胺特征与IVCD的关系图，观测到由曲线斜率给出的比谷氨酰胺消耗率在两种培养物之间是相似的(图2F)。这证实了每一种细胞的谷氨酰胺消耗率不受麦芽糖的使用的影响。当与葡萄糖培养物相比时，鉴于麦芽糖培养物的更慢的生长速率和更低的最大细胞密度，相似的比谷氨酰胺消耗率表明麦芽糖培养物中更多的谷氨酰胺正被引导到能量代谢中而非细胞复制中。该假设得到了铵产生曲线的支持：虽然这两种培养物的比铵产生速率最初是相似的，但是葡萄糖培养物的比铵产生速率从第2天起显著减慢(图2G)以达到0.14g/l的最终铵浓度(图2E)，而麦芽糖培养物的比铵产生速率以相似的速率持续直到第5天为止以达到0.20g/l的更高的最终铵浓度。葡萄糖培养物从第2天起更慢的比铵产生速率可以归因于更高的细胞生长速率(图2A)和相似的铵产生速率，这表明与麦芽糖培养物相比，更多的氨基酸被用于细胞复制。最终铵浓度的差异进一步支持了这一点，这是因为它证实，当与葡萄糖培养物相比时，在麦芽糖培养物中更多的氨基酸进行脱酰胺以补充细胞的能量消耗，这是因为这两种培养物具有相同起始浓度的谷氨酰胺和其他氨基酸。还注意到，铵产生达到稳定水平的时间(对于葡萄糖培养物和麦芽糖培养物分别是在第4天和第6天)与对应培养物的谷氨酰胺耗尽时间相对应，这表明了氨积累可能部分是因为自发的谷氨酰胺脱酰胺。当使这些麦芽糖适应性CHO-K1细胞进一步适应基于DMEM/F12的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)并且用从10g/l到40g/l的增加浓度的麦芽糖测试时，细胞更快增殖，这表明在哺乳动物细胞的常规培养中在不存在水解产物的情况下麦芽糖可以用作葡萄糖替代物(图10)。

综上所述，该数据确认了在不存在血清或蛋白质补充剂的情况下，细胞确实在麦芽糖培养基中增殖，尽管细胞以更慢的速率生长，这可能是因为限速性能量代谢。当与葡萄糖培养物相比时，麦芽糖培养物的谷氨酰胺的比消耗率保持相似，这表明必需营养素可能被耗尽以限制可由麦芽糖培养物实现的最大活细胞密度。当与葡萄糖培养物相比时，麦芽糖培养物中相似的比谷氨酰胺消耗率和增加的铵产生进一步证实了更多的氨基酸可能在麦芽糖培养物中被脱酰胺以补充能量代谢。

在含有麦芽糖的无蛋白质的培养基中CHO-K1细胞的存活和增殖是惊人的，这是因为不存在已知的哺乳动物麦芽糖转运蛋白并且哺乳动物细胞通常已知不能代谢二糖，除非例如在肠细胞中表达分泌或跨膜麦芽糖酶。尽管CHO细胞已经被证实能使用多糖作为能量源来存活，但是这些实验是在含有血清的培养基中进行的(Morgan和Faik,1981)，并且已证实，血清中的酶会分解这些多糖以用于细胞代谢(Scannell和Morgan,1982)。因此，本公开惊人地证实如本文所公开的无血清无蛋白质的哺乳动物细胞培养物在包含二糖时可以为细胞生长提供足够的能量源。

应用麦芽糖以在葡萄糖耗尽时维持培养物活力

由于在不存在葡萄糖的情况下在含有麦芽糖的无蛋白质培养基中CHO-K1细胞可以利用麦芽糖作为能量源并且在较长的时间内维持高细胞培养物活力(图2)，因此本公开的发明人继续评价麦芽糖是否可以被利用以在葡萄糖耗尽时维持非适应性CHO-K1生产细胞系的培养物活力。在含有葡萄糖和麦芽糖这两者的培养基中培养细胞，以研究所述细胞是否可以在培养基中使用葡萄糖生长以进行正常的细胞生长，继而转换成麦芽糖代谢以维持培养物活力和蛋白质产生。这将潜在地将麦芽糖补充的应用延伸到非适应性细胞系，并且也是在分批培养物中延长细胞培养物活力以实现更高的重组蛋白生产率的简单方法。

为了进行该评价，使用产生抗Her2单克隆抗体的CHO-K1细胞系(SH87)(Ho等,2012)。监测这些细胞在含有4g/l葡萄糖、6g/l葡萄糖、或4g/l葡萄糖并且补充有不同浓度的麦芽糖的基于DMEM/F12的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中的分批摇瓶培养物直到培养物活力下降到低于50％为止(图3)。选择4g/l葡萄糖作为基础葡萄糖浓度，这是因为这将允许过早但是受控的细胞生长限制，所述限制主要是因为该PFCDM的分批培养物中的葡萄糖耗尽。在图3A中观测到该受控生长限制，其中4g/l葡萄糖培养物在第5天达到8.5×10⁶个细胞/毫升的最大活细胞密度(VCD)，这比6g/l葡萄糖培养物早一天，所述6g/l葡萄糖培养物在第6天达到11.9×10⁶个细胞/毫升的最大VCD。这对应于这两种培养物的葡萄糖耗尽，这在达到最大VCD之前一天发生(图3B)。因而，通过将4g/l葡萄糖培养基补充以麦芽糖，可以在没有其他营养素耗尽的附加复杂因素的情况下确定另外的麦芽糖对这种非适应性CHO-K1生产细胞系的影响。

从图3A中，观测到与仅含4g/l葡萄糖的培养物相比，有麦芽糖补充的所有培养物都具有更高的最大VCD和更长时间的培养物活力，尽管这些培养基中的葡萄糖是同时被耗尽的(图3B)。

与仅含4g/l葡萄糖的培养物相比，在补充麦芽糖的培养物中也维持了重组蛋白产生以产生更高的IgG滴度(图3E)。当与仅含6g/l葡萄糖的培养物相比时，补充麦芽糖的培养物的最大VCD和IgG滴度是更低的(图3A和图3G)，除了补充3g/l麦芽糖的培养物的IgG滴度之外，该IgG滴度匹配6g/l葡萄糖培养物的IgG滴度。这证实了虽然在6g/l葡萄糖培养物之前葡萄糖耗尽时麦芽糖可以支持细胞生长(图3B)，但是在补充麦芽糖的培养物中代谢是更慢的以导致更慢的生长速率。这进一步得到了以下观测结果的支持：由于麦芽糖所引起的生长提高是浓度依赖性的(图3A)，这表明麦芽糖代谢速率在这些浓度可能是限制性的。这也与铵产生曲线相对应(图3G)，其显示当与含有6g/l葡萄糖或含有3g/l麦芽糖补充剂的培养物相比时，含有0g/l、0.5g/l以及1g/l麦芽糖补充剂的4g/l葡萄糖培养物的铵产生更高，尽管谷氨酰胺消耗曲线是相似的(图3F)。这表明在不含麦芽糖或含有低浓度的麦芽糖的培养物中更多的氨基酸进行脱酰胺以补充能量消耗。另一方面，补充3g/l麦芽糖的培养物具有更低的氨产生，这与6g/l葡萄糖培养物相似(图3G)。这表明在分批培养的后期阶段期间，在该麦芽糖浓度，麦芽糖代谢速率对于细胞的降低的能量需求是足够的。

当研究乳酸盐曲线时，注意到对于所有培养物，在葡萄糖耗尽的情况下发生乳酸盐消耗(图3C)。与仅含葡萄糖的培养物(其中乳酸盐消耗是部分的)相反，在第6天在补充麦芽糖的培养物中所有乳酸盐都被消耗。据推测，完全乳酸盐消耗可能是通过麦芽糖代谢促进的，所述麦芽糖代谢在低葡萄糖环境中在更长时间内保持培养物存活和进行代谢以利用乳酸盐。补充麦芽糖的培养物的这种特性可能可用于生物制药生产，这是因为在补料分批生物反应器生产过程中乳酸盐积累通常会导致细胞毒性(Hassell等,1991；Lao和Toth,1997)。有趣的是，从第6天开始对于补充有3g/l麦芽糖的培养物再次观测到乳酸盐产生，这支持了以下假设，即在该麦芽糖浓度，麦芽糖代谢速率足以使细胞依靠糖酵解存活。

当分析培养上清液麦芽糖浓度时，观测到麦芽糖实际上是被细胞消耗，并且大部分的消耗在葡萄糖耗尽时发生(图3D)。这表明这些细胞优先利用葡萄糖进行生长，并且当葡萄糖耗尽时，培养物转换成麦芽糖代谢，这有助于维持培养物活力(图3A)。有趣的是，麦芽糖是在大约同一天被耗尽的，尽管初始麦芽糖浓度变化高达6倍的差异。这可能部分归因于各种补充麦芽糖的培养物中VCD的差异，但是它也表明麦芽糖代谢在这些麦芽糖浓度可能是浓度依赖性的，从而使得在更高的麦芽糖浓度麦芽糖利用率更高。

为了确定麦芽糖是否可以由细胞内化，获得来自仅含4g/l葡萄糖的培养物和补充3g/l麦芽糖的培养物这两者的SH87细胞样品以进行LC-MS分析(图3H)。虽然在接种到补充麦芽糖的培养基中后1天检测到细胞内麦芽糖，但是发现在仅含葡萄糖的培养基中培养的细胞中或在刚接种到补充麦芽糖的培养基中后它是不存在的(低于检测限度)。这确认了在补充有3g/l麦芽糖的培养物中细胞内麦芽糖池的存在，并且证实了尽管缺乏已知的转运机制，但是麦芽糖的确进入了这些细胞，这增添了进一步的证据表明麦芽糖确实被补充麦芽糖的培养物中的细胞利用。此外，从细胞内麦芽糖浓度注意到关于麦芽糖转运的进一步提示，在所监测的5天内，细胞内麦芽糖浓度维持的水平是培养基中的水平的约1/100：这表明尽管存在浓度梯度，但是麦芽糖的转运可能被主动调节以防止它在细胞内积累，这是因为细胞只有在葡萄糖耗尽时才转换成麦芽糖代谢(图3D)。

为了进一步验证麦芽糖确实被细胞利用而非在培养基中水解，从补充3g/l麦芽糖的培养物以及4g/l葡萄糖培养物中获得来自第2天、第4天、第6天以及第8天的无细胞条件培养基(CM)。将3g/l麦芽糖掺入来自葡萄糖培养物的CM中，并且在3天内在37℃监测这两组CM的葡萄糖和麦芽糖浓度的变化(图4)。培养物的生长曲线类似于图3A中的那些，其中当与葡萄糖培养物相比时，补充麦芽糖的培养物在第6天和第8天具有更高的活细胞密度和延长的培养物活力(图4A)。补充麦芽糖的培养物的葡萄糖曲线和麦芽糖曲线也是相似的，葡萄糖在第6天耗尽并且麦芽糖在第4天与第8天之间耗尽(图4B)。另一方面，尽管在相同的温度下孵育3天，但是从补充麦芽糖的培养物中收获的CM维持与它们被收获时相同的葡萄糖和麦芽糖浓度(图4B)。类似地，尽管在第6天和第8天具有低的培养物活力，但是掺入有3g/l麦芽糖的来自葡萄糖培养物的CM维持在一致的葡萄糖和麦芽糖浓度(图4C)。这证实了细胞的存在是为利用麦芽糖所必需的，并且在条件培养基中麦芽糖水解不会自发地发生，即使当培养物活力低的时候也不会。由于麦芽糖可以被为分泌蛋白的胰腺和唾液α-淀粉酶水解、为跨膜蛋白的肠麦芽糖酶-葡糖淀粉酶和蔗糖-异麦芽糖酶水解、并且为细胞内蛋白质的溶酶体α-葡糖苷酶和中性α-葡糖苷酶C水解，因此该数据确认了分泌的麦芽糖酶没有参与这些CHO细胞中的麦芽糖代谢。

由于如本文所述的培养基不含血清、水解产物以及蛋白质，因此本公开排除了不明确的培养基组分在这些观测结果中的作用，并且最终证明哺乳动物细胞系CHO-K1可以利用麦芽糖进行生长和产生重组蛋白。此外，该数据显示所述细胞不需要事先适应以便以双相方式利用麦芽糖并且维持培养物活力。

比较具有高葡萄糖和麦芽糖浓度的分批培养物

由于观测到麦芽糖代谢在3g/l或更低的浓度可能是限制性的，因此将在补充有4g/l葡萄糖和10g/l或20g/l麦芽糖的培养基中SH87的培养物曲线与相同细胞在含有14g/l和24g/l葡萄糖的培养基中的培养物相比较(图5)。与其他3种培养物相比，24g/l葡萄糖培养物更慢地生长，达到更低的10.6×10⁶个细胞/毫升的最大VCD，并且更快地达到低于50％的低活力(图5A)。24g/l葡萄糖培养物的更慢生长可以归因于培养基的重量克分子渗透压浓度(360mOsm/kg)更高(图5F)，而其他3种培养物的培养基具有318mOsm/kg至331mOsm/kg的相似的重量克分子渗透压浓度，这在最佳哺乳动物细胞培养的范围内。这确认了分批培养基中高葡萄糖负载的限制，这是因为葡萄糖显著地增加重量克分子渗透压浓度并且可以在高浓度影响细胞生长。相反，相同质量浓度的麦芽糖促使重量克分子渗透压浓度的增加较少，并且因此对细胞生长没有负面影响。

比较10g/l麦芽糖培养物、20g/l麦芽糖培养物以及14g/l葡萄糖培养物的生长曲线(图5A)，它们是相似的，即使是在补充麦芽糖的培养物在第5天时葡萄糖浓度达到它的最小值之后也是这样(图5B)。这表明了在这些浓度麦芽糖代谢速率没有限制细胞生长，与在低于3g/l的麦芽糖浓度在葡萄糖耗尽之后观测到的更慢生长(图3A和图3B)相反。在补充10g/l和20g/l麦芽糖的培养物中观测到葡萄糖积累(图5B)，这是先前没有观测到的现象(图3B)，支持了在这些浓度麦芽糖代谢更高的假设。这表明在相应的培养时间期间，麦芽糖水解的速度比细胞的代谢需求更快：在第5天之后，当细胞仍在以与14g/l葡萄糖培养物相似的速率生长时，在补充20g/l麦芽糖的培养物中观测到葡萄糖积累，这证实了在该麦芽糖浓度，麦芽糖代谢没有限制细胞生长。在10g/l的更低的麦芽糖浓度，只是在第8天后，当细胞正进入死亡期时，观测到葡萄糖积累。细胞与14g/l葡萄糖培养物类似地生长，这表明在10g/l麦芽糖下麦芽糖代谢速率刚好足以支持细胞生长而没有过量的葡萄糖在培养基中积累。

在此还值得注意的是，仅含葡萄糖的培养物的乳酸盐浓度在整个培养持续时间内积累，与之相反，补充麦芽糖的培养物从第5天到第8天消耗了大部分的乳酸盐(图5C)。虽然分别在第9天和第10天之后针对补充10g/l和20g/l麦芽糖的培养物观测到第二乳酸盐产生阶段，但是与葡萄糖培养物相比，在这些培养物中乳酸盐浓度达到显著更低的水平。这验证了分批培养基中葡萄糖负载的另一个限制：由于乳酸盐积累可能导致细胞毒性(Hassell等,1991；Lao和Toth,1997)，因此在高葡萄糖负载下缺乏它的消耗可能限制细胞培养物的生长。在这种情况下，该乳酸盐毒性可能导致针对24g/l葡萄糖培养物所观测到的更快的死亡期。

研究补充麦芽糖的培养物的麦芽糖曲线，在第5天在葡萄糖耗尽之后大部分的麦芽糖被消耗(图5D)，这类似于先前的数据(图3D)，并且对于这两种补充麦芽糖的培养物，麦芽糖没有被耗尽直到在第14天运行结束为止。类似地，对于这两种葡萄糖培养物，葡萄糖没有被耗尽(图5B)。虽然糖以过量存在，但是其他营养素可能限制这些细胞的生长，例如，针对所有4种培养物，谷氨酰胺以相似的速率在第6天被耗尽(图5E)。这些其他限制可能类似地影响生长以使得补充麦芽糖的培养物和14g/l葡萄糖培养物的生长曲线相似。

在具有相似的生长曲线的情况下，有趣的是，注意到补充20g/l麦芽糖的培养物产生298mg/l的最大IgG滴度，比从14g/l葡萄糖培养物和补充10g/l麦芽糖的培养物(分别提供259mg/l和263mg/l的最大滴度)获得的最大IgG滴度高了15％(图5G)。为了研究这一点，根据方程式3确定培养物的比IgG生产率(表1和图11)。注意到，所有4种培养物的比IgG生产率在第7天之后当谷氨酰胺浓度达到它们的最小值时降低，这表明谷氨酰胺可能从第7天起限制IgG生产率。无论谷氨酰胺限制如何，观测到，在含有更多的葡萄糖或含有更多的麦芽糖的培养物中比IgG生产率高了21％至29％，这表明更高的糖浓度可以提高比IgG生产率。当将补充麦芽糖的培养物的比IgG生产率与它们具有相同总糖浓度的相应葡萄糖培养物相比较时，补充麦芽糖的培养物直到第6天为止具有低13％至17％的比IgG生产率，尽管这些从第7天起变成比它们相应的葡萄糖培养物的比IgG生产率高25％至26％。因此，麦芽糖的存在在谷氨酰胺耗尽之前负面影响比IgG生产率，但是在谷氨酰胺耗尽之后有助于提高比IgG生产率。因而，当与14g/l葡萄糖培养物和补充10g/l麦芽糖的培养物相比时，补充20g/l麦芽糖的培养物的更高糖含量使得比IgG生产率分别高了7％至53％，并且这使得补充20g/l麦芽糖的培养物的最大IgG滴度更高，尽管具有相似的生长曲线。

表1：在具有高浓度的葡萄糖和麦芽糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中培养的SH87的比IgG生产率。将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养到具有14g/l葡萄糖、24g/l葡萄糖、4g/l葡萄糖+10g/l麦芽糖、或4g/l葡萄糖+20g/l麦芽糖的PFCDM中。然后根据方程式3，绘制IgG滴度与IVCD的关系图以获得作为图表的斜率的比IgG生产率。

麦芽糖代谢动力学的表征

为了表征在补充麦芽糖的培养物中的麦芽糖代谢，根据方程式4，从麦芽糖浓度与累积积分活细胞密度(IVCD)的关系图中获得比麦芽糖消耗率。当使用葡萄糖耗尽之后的3个至5个数据点时，这些图以0.853至0.999的R2值给出了直线趋势线(图12)，这表明在代谢麦芽糖时比麦芽糖消耗率是相当恒定的。这些趋势线的斜率给出了这些培养物的平均比麦芽糖消耗率并且在图6A中列成表格。比麦芽糖消耗率随初始麦芽糖浓度增加而增加，这验证了在这些麦芽糖浓度的麦芽糖代谢确实是浓度依赖性的。此外，观测到，比消耗率增加的幅度在更高的初始麦芽糖浓度降低，这表明在该关系中可能存在最大值。因而，根据方程式5，通过非线性回归将数据拟合成莫诺模型。所述数据拟合成所述模型(图6B)以获得0.257纳克/细胞/天的最大比麦芽糖消耗率(qs_max)和7.03g/l的亲和常数(Ks)。虽然注意到对麦芽糖浓度对比生长速率的影响进行建模可能是有意义的，但是使用该数据是不可行的，这是因为在葡萄糖耗尽之后细胞生长大多是最小化的。与所公开的使用3.6g/l单糖的比单糖消耗率(Altamirano等,2000)相比，在此确定的最大比麦芽糖消耗率类似于果糖(0.21纳克/细胞/天)和半乳糖(0.21纳克/细胞/天)的比消耗率，而低于葡萄糖(0.76纳克/细胞/天)和甘露糖(0.88纳克/细胞/天)的测量比消耗率。这表明麦芽糖可以类似于果糖和半乳糖的速率被代谢，而麦芽糖代谢将慢于葡萄糖和甘露糖。虽然本申请的发明人注意到这些参数可以在连续培养中更准确地测定，但是在低麦芽糖浓度这实际上可能具有挑战性，这是因为生长速率将为低的。因此，当前的数据提供了惊人的证据表明哺乳动物细胞可能具有麦芽糖代谢动力学。

在补料分批培养中应用麦芽糖

由于补料分批培养是用于制造单克隆抗体的通用模式，因此对在补料分批培养中使用麦芽糖进行评价。与分批培养相反，其中初始葡萄糖浓度受到由于所引起的重量克分子渗透压浓度增加超过一定限度所导致的对细胞生长的不利影响的限制，补料分批培养没有这种限制，这是因为葡萄糖可以连续地补加到培养物中。因而，评价麦芽糖是否可以用于在补料分批培养物中补充葡萄糖以驱动细胞朝向更慢但是更有效的代谢：使用0.5g/l的常见葡萄糖浓度设定点，每天向补充有4g/l葡萄糖和20g/l麦芽糖的培养基中的SH87补加它的计算葡萄糖需求的50％，而每天向相同细胞于含有4g/l葡萄糖的培养基中的培养物补加它的计算葡萄糖需求的100％。对于每一种条件进行一式两份的生物反应器培养并且这些培养物的生长曲线、生物化学曲线以及IgG滴度曲线绘制于图7中。

与在分批培养物中观测到的乳酸盐消耗(图3和图5)相反，在补料分批培养物中不存在乳酸盐消耗，即使是在具有50％葡萄糖补料的补充麦芽糖的培养物中也是这样(图7C)。据推测，这可能是因为在补料分批培养物中一致的营养素补料，而在分批培养物中葡萄糖、谷氨酰胺或其他营养素可能被耗尽而引起所观测到的乳酸盐消耗。尽管如此，补料分批培养物的IgG滴度(图7G)是从分批培养物获得的IgG滴度的超过5倍(图5G)，这表明了补料策略在提高补料分批培养物的如所预期的IgG产量方面是成功的。

在补料分批培养物之间进行比较，补充麦芽糖的培养物的活细胞密度、培养物活力以及乳酸盐曲线类似于仅含葡萄糖的2号培养物，而仅含葡萄糖的1号培养物具有更高的最大活细胞密度、更快的培养物活力降低以及更快的乳酸盐积累(图7A和图7C)。仅含葡萄糖的培养物1号的重量克分子渗透压浓度更快增加(图7F)可能是因为由于更快的乳酸盐积累所引起的pH值纠正。这些说明了SH87补料分批培养物中的这些参数的可能变化。另一方面，补充麦芽糖的培养物和仅含葡萄糖的培养物的葡萄糖曲线和谷氨酰胺曲线是相似的。此外，IgG滴度在平行测定培养物之间是相当一致的，尽管在仅含葡萄糖的一式两份培养物中观测到活细胞密度、乳酸盐以及重量克分子渗透压浓度的变化。

比较葡萄糖曲线，有趣的是，注意到尽管仅以它的计算葡萄糖需求的50％进行补料，但是补充麦芽糖的培养物维持与仅含葡萄糖的补料分批培养物相似的培养物葡萄糖浓度。尽管如此，由于该降低的葡萄糖补料，因此补充麦芽糖的培养物的比葡萄糖消耗率是0.115±0.007纳克/细胞/天，这是仅含葡萄糖的培养物的比葡萄糖消耗率(0.254±0.013纳克/细胞/天)的45％(表2)。这些表明补充麦芽糖的培养物最可能除了葡萄糖之外还使用二次能量源以实现与仅含葡萄糖的2号培养物相当的生长曲线和培养物活力曲线。这种二次能量源可能是麦芽糖，这是因为比谷氨酰胺消耗率在补充麦芽糖的培养物与仅含葡萄糖的培养物之间是相似的(表2)，并且从第7天(这是在补充麦芽糖的补料分批培养物中开始葡萄糖补料后一天)起在补充麦芽糖的培养物中观测到麦芽糖消耗(图7D)。

表2：在补料分批生物反应器培养物中在含有和不含麦芽糖补充剂的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)中培养的SH87的最大IgG滴度、比生产率和比消耗率。将常规维持在仅含葡萄糖的PFCDM中的SH87细胞传代培养在一式两份的补料分批生物反应器培养物(由1号和2号表示)中，如图7中所述。根据方程式1确定比生长速率。绘制由所述细胞产生的生物化学物质的累积量与累积积分活细胞(IVC)数的关系图以获得作为图表的斜率的比生产率。

在麦芽糖补充代谢的情况下，观测到相对于在仅含葡萄糖的补料分批培养物中所观测到的1.483±0.067g/l的最大IgG滴度和18.6±4.1pcd的比IgG生产率，最大IgG滴度(1.833±0.124g/l)和比IgG生产率(28.8±3.5pcd)分别有23％和55％的提高(表2)。当与具有更具可比性的生长曲线的仅含葡萄糖的2号培养物(它的最大IgG滴度和比IgG生产率分别是1.53g/l和21.5pcd)相比时，最大IgG滴度和比IgG生产率的提高分别是20％和34％。

观测到IgG产量提高的一种可能机制可能是由于另外的20g/l麦芽糖，因此补充麦芽糖的培养物的初始重量克分子渗透压浓度更高：这可能使得补充麦芽糖的培养物的比生长速率比仅含葡萄糖的培养物低了22％至40％(表2)，从而可能允许更慢和更多产的补充麦芽糖的培养物。尽管如此，当将补充麦芽糖的分批培养物与具有相似的初始重量克分子渗透压浓度的仅含葡萄糖的分批培养物相比时(图5G)，惊人地类似地观测到IgG滴度的提高。这表明在补充麦芽糖的补料分批培养物中观测到的最大IgG滴度的提高不仅仅是因为重量克分子渗透压浓度效应：不希望受理论所束缚，假定通过麦芽糖的存在而实现的更低的葡萄糖可用性可能在补充麦芽糖的培养物中引起更有效的细胞代谢，从而也促成所观测到的更高的最大IgG滴度。

为了验证该更低的葡萄糖可用性是否可以在不存在麦芽糖的情况下具有相同的作用，在单独的实验中比较以它们的计算葡萄糖需求的100％补料或50％补料的SH87仅含葡萄糖的补料分批培养物(图13)。虽然在这两种条件下在开始葡萄糖补料之前达到相似的最大活细胞密度，但是具有50％计算葡萄糖补料的仅含葡萄糖的培养物的培养物活力比具有100％计算葡萄糖补料的培养物提前4天下降到低于50％。50％补料培养物的最大IgG滴度也仅是100％补料培养物的46.4％。这些确认了麦芽糖的存在使得能够使用更低的葡萄糖补料来引起图7G中所观测到的更高的最大IgG滴度。

由于糖基化是治疗性IgG产品的关键属性，因此对来自第10天和第15天的仅含葡萄糖的培养物和补充麦芽糖的培养物的纯化的IgG进行糖基化谱分析(图8)。第10天样品的代表性荧光色谱图(图8A)显示来自仅含葡萄糖的培养物和补充麦芽糖的培养物这两者的IgG的糖基化谱是相似的，这表明补充麦芽糖大体上不会影响所产生的单克隆抗体的聚糖谱。当将来自补充麦芽糖的培养物的IgG的聚糖结构的相对丰度与来自仅含葡萄糖的培养物的IgG相比较时(图8B)，注意到岩藻糖基化、唾液酸化、G1F、G2F以及双分支型聚糖略微更少并且G0F和单分支型聚糖更多。当将来自第15天样品的聚糖与来自第10天样品的聚糖相比较时，也观测到这些差异中的大部分，这表明补充麦芽糖以十分类似于更晚收获的方式影响聚糖谱。所述相似性的例外情况是唾液酸化和高甘露糖聚糖的相对丰度：虽然更晚的第15天收获物与第10天收获物相比提供了更高水平的高甘露糖聚糖和类似水平的唾液酸化的聚糖，但是与仅含葡萄糖的培养物相比，补充麦芽糖提供了更低水平的唾液酸化的聚糖和类似水平的高甘露糖聚糖。该数据显示麦芽糖补充还可以用作微调单克隆抗体糖基化谱、特别是略微降低唾液酸化水平的手段，已知降低唾液酸化水平会改善治疗性抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，这在生物仿制药制造领域中也可能是重要的，其中生物仿制药聚糖谱与创新药物的匹配是重要的标准。

在补料分批培养物中在基础培养基和补料培养基这两者中补充麦芽糖的影响

此外，本公开研究了在补料培养基中补充麦芽糖是否可以对具有补充麦芽糖的基础培养基的补料分批培养物具有进一步的影响。使用0.5g/l的常见葡萄糖浓度设定点，每天使用仅由葡萄糖组成或由1:1比率的葡萄糖和麦芽糖组成的糖补料向补充有4g/l葡萄糖和20g/l麦芽糖的培养基中的SH87补加它的计算葡萄糖需求的50％。

对于每一种条件进行一式两份的生物反应器培养并且这些培养物的生长曲线、生物化学曲线以及IgG滴度曲线绘制于图9中。观测到在补料培养基中另外的麦芽糖补充对细胞生长曲线、活力曲线、谷氨酰胺曲线、重量克分子渗透压浓度曲线以及IgG滴度曲线没有额外的影响。这可能是因为初始麦芽糖补充在具有仅葡萄糖补料的补充麦芽糖的培养物中没有被用尽。将预期的是，如果初始麦芽糖在更长的补料分批运行中被用尽(如果实施温度和/或pH值变化，那么这可以实现)，那么在补料培养基中添加麦芽糖可能具有作用。注意到，当与具有仅葡萄糖补料的培养物相比时，在补料培养基中另外的麦芽糖补充增加了葡萄糖浓度并且略微降低了乳酸盐浓度。这在培养物中可能是有利的，其中乳酸盐积聚会导致培养物崩溃。

类似地对来自这些培养物的样品进行糖基化分析。糖基化谱的差异示于表3中。

表3：补料培养基中的麦芽糖补充对糖基化谱的影响。在使用仅葡萄糖补料(葡萄糖+麦芽糖)或葡萄糖+麦芽糖补料(葡萄糖+麦芽糖_BF)的情况下仅含葡萄糖、或葡萄糖+麦芽糖的无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)基础培养基中的SH87补料分批生物反应器培养物产生的抗Her2抗体的糖基化谱的差异。从SH87补料分批培养物的来自第10天和第15天的样品中纯化抗Her2单克隆抗体并且进行糖基化谱分析。使用来自两个生物学平行测定的数据计算聚糖结构的相对丰度的差异。与具有仅葡萄糖补料的麦芽糖培养物相比，补充麦芽糖的补料对聚糖结构的相对丰度的影响的差异以粗体显示。

尽管在补料培养基中补充麦芽糖对所产生的抗体的滴度没有影响，但是当与具有仅葡萄糖补料的麦芽糖培养物相比时，它提供了略微更少的岩藻糖基化聚糖和二分支型聚糖以及更多的高甘露糖聚糖和单分支型聚糖。比较表3中的第3栏与第4栏，注意到在补料中具有麦芽糖促使补充麦芽糖的培养物的糖基化谱更类似于更晚收获物的糖基化谱。这些证实了在补料培养基中补充麦芽糖可以用于补助补充有麦芽糖的基础培养基以微调重组糖蛋白产物的糖基化谱。

评价二糖支持CHO-DG44细胞的生长

为了确定相同的方法是否可以应用于其他CHO细胞系，对使用二糖支持CHO-DG44细胞的生长进行评价。使用10g/l的麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或葡萄糖作为能量源，在无血清无蛋白质的细胞培养基HyQPF-CHO中培养这些细胞。在22天的时间内在每一次传代开始和结束时这些培养物的活细胞密度和培养物活力示于图1B中。虽然在含有葡萄糖和麦芽糖的培养基中细胞在每一次传代时生长到高培养物活力和活细胞密度，但是在其他二糖培养基中细胞的那些参数分别降低和保持停滞。因此，证实了CHO-DG44细胞也可以在无血清无蛋白质的培养基中利用麦芽糖作为糖源来增殖，但是不能利用蔗糖、乳糖或海藻糖作为糖源来增殖。将预期的是，在补充麦芽糖的情况下，CHO-DG44生产细胞的生长和产物滴度将具有类似的提高，如本公开已经使用CHO-K1细胞所证实的那样。

在本公开中，惊人地证实了CHO-K1细胞可以在不存在血清或蛋白质补充剂的情况下利用麦芽糖进行生长，尽管所述细胞以更慢的速率生长。此外，当使用含有葡萄糖和麦芽糖这两者的培养基时，事先的细胞适应不是为利用麦芽糖所必需的，所述麦芽糖的利用以双相方式在葡萄糖耗尽后进行。麦芽糖的利用取决于培养物中细胞的存在，这是因为麦芽糖被细胞内化，并且在条件培养基中，麦芽糖水解不会自发地发生。还显示了补充麦芽糖以增加细胞培养基的碳水化合物含量的实际应用，这是因为葡萄糖浓度增加受到重量克分子渗透压浓度的相应增加的限制。在分批细胞培养中利用麦芽糖具有促进乳酸盐消耗的附加优势，否则所述乳酸盐将积累并且变得对细胞有毒。这些因素使得来自分批培养物的重组单克隆抗体滴度提高了15％。将从分批培养物获得的比麦芽糖消耗率拟合成莫诺模型以获得0.257纳克/细胞/天的最大比麦芽糖消耗率(qs_max)和7.03g/l的亲和常数(Ks)。

进一步证实了，麦芽糖补充也可以应用于补料分批生物反应器培养物以使得当与仅含葡萄糖的补料分批培养物相比时最大单克隆抗体滴度和比单克隆抗体生产率分别提高了23％和55％。这表明麦芽糖补充可以作为简单的生物反应器工艺改进应用以在当前的单克隆抗体制造补料分批工艺中提高单克隆抗体收率。由补料分批培养物产生的抗体的糖基化谱分析显示麦芽糖补充略微影响聚糖谱，这类似于更晚的收获，有略微降低唾液酸化水平而不伴随高甘露糖聚糖增加的额外作用。这表明麦芽糖补充还可以应用于略微影响单克隆抗体糖基化谱，这对于影响抗体治疗剂的ADCC和生物仿制药聚糖谱与创新药物的物理匹配是重要的。

除了麦芽糖补充对生物制药生产的实际意义之外，CHO-K1细胞在无蛋白质培养基中利用麦芽糖的能力本身也是惊人的，鉴于不存在已知的哺乳动物麦芽糖转运蛋白并且通常已知哺乳动物细胞不能代谢二糖。因此，本公开提供了使用二糖作为能量源的无血清无蛋白质的哺乳动物细胞培养物的令人惊奇的证据。还公开了哺乳动物细胞中麦芽糖代谢动力学的估计值。

此外，本公开已经证实了在补料培养基中补充麦芽糖对糖蛋白产物的糖基化谱可能具有微不足道的影响，并且CHODG44细胞也可以利用麦芽糖作为碳水化合物来源。

参考文献

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Claims (35)

1.一种无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基包含麦芽糖作为唯一的碳水化合物来源。

2.一种无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基包含麦芽糖和至少一种另外的糖作为碳水化合物来源。

3.如权利要求2所述的无血清细胞培养基，其中所述糖是单糖。

4.如权利要求3所述的无血清细胞培养基，其中所述单糖选自由以下各项组成的组：塔格糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、果糖以及木糖。

5.如权利要求2至4中任一项所述的无血清细胞培养基，所述无血清细胞培养基包含麦芽糖和葡萄糖作为仅有的碳水化合物来源。

6.如权利要求2所述的无血清细胞培养基，其中所述糖是多糖。

7.如权利要求6所述的无血清细胞培养基，其中所述多糖是葡聚糖或二糖。

8.如权利要求7所述的无血清细胞培养基，其中所述葡聚糖选自由以下各项组成的组：纤维二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α藻糖-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、右旋糖酐、糖原、支链淀粉、淀粉、纤维素、金藻昆布糖、凝胶多糖、昆布多糖、香菇多糖、地衣多糖、燕麦β-葡聚糖、平菇β-葡聚糖、酵母多糖以及其组合。

9.如权利要求7所述的无血清细胞培养基，其中所述二糖选自由以下各项组成的组：纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β下各-海藻糖、α藻糖-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、车前二糖、芸香二糖、芦丁酮糖、木二糖以及其组合。

10.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述无血清细胞培养基是无蛋白质的。

11.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述无血清细胞培养基是化学成分确定的培养基。

12.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述无血清细胞培养基是无蛋白质的化学成分确定的培养基(PFCDM)。

13.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述细胞培养基进一步与水解产物、酶消化产物或酵母细胞提取物组合。

14.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述细胞培养基进一步与离子表面活性剂或非离子表面活性剂组合。

15.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述细胞培养基进一步包含抗生素剂。

16.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中每一种成分以支持体外培养细胞的量存在。

17.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述至少一种糖以0.5克/升至40克/升的浓度存在。

18.如权利要求1所述的无血清细胞培养基，其中麦芽糖以0.5克/升至40克/升的浓度存在。

19.如权利要求1和18所述的无血清细胞培养基，其中所述无血清细胞培养基包含杜氏最低必需培养基(DMEM)、F-12基础培养基(DMEM-F12)、L-谷氨酰胺、非离子表面活性剂、遗传霉素以及麦芽糖、或其改良型式。

20.如权利要求2至18中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述无血清细胞培养基包含杜氏最低必需培养基(DMEM)、F-12基础培养基(DMEM-F12)、L-谷氨酰胺、非离子表面活性剂、遗传霉素、麦芽糖以及葡萄糖、或其改良型式。

21.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述无血清细胞培养基呈粉末或液体形式。

22.如前述权利要求中任一项所述的无血清细胞培养基，其中所述细胞选自由以下各项组成的组：脊椎动物细胞、节肢动物细胞、环节动物细胞、软体动物细胞、海绵动物细胞、水母细胞、昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞以及鱼类细胞。

23.如权利要求22所述的无血清细胞培养基，其中所述细胞能够代谢所述仅有的一种碳水化合物来源或多种碳水化合物来源而不需要事先适应所述一种来源/多种来源。

24.如权利要求22所述的无血清细胞培养基，其中所述昆虫细胞源自于灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)或粉纹夜蛾属物种(Trichoplusa spp)。

25.如权利要求22所述的无血清细胞培养基，其中所述哺乳动物细胞选自由以下各项组成的组：人类细胞、鼠类细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞、兔细胞、狗细胞、猴细胞、杂交瘤细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO-DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-GS细胞、SH87细胞、BHK细胞、COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、293细胞、PER-C6细胞、K562细胞、MOLT-4细胞、M1细胞、NS-1细胞、COS-7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、CAP细胞、AGE1.HN细胞、或其衍生物。

26.一种使细胞生长和/或培养细胞的方法，其中所述方法包括在如权利要求1至25中任一项所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。

27.一种使细胞生长和/或培养细胞的方法，其中所述方法包括在如权利要求1或2所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述方法包括在如权利要求6或19所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述方法提高蛋白质收率。

30.一种提高蛋白质收率的方法，其中所述方法包括在如权利要求1至25中任一项所述的无血清细胞培养基中使细胞生长和/或培养细胞。

31.一种调节蛋白质的糖基化谱的方法，其中所述方法包括在如权利要求1至25中任一项所述的无血清细胞培养基中培养表达所述蛋白质的细胞，从而产生表达所述具有经调节的糖基化谱的所述蛋白质的细胞。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述调节糖基化谱是调节所述蛋白质的选自由以下各项组成的组的至少一种：分支、岩藻糖基化、甘露糖基化、以及唾液酸化。

33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述无血清细胞培养基是如权利要求6或19所述的。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞是抗体产生细胞。

35.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1至25中任一项所述的组分。