CN102229908B - 适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂 - Google Patents

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本发明涉及现代生物技术领域，是适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，其组分包括葡萄糖和8种氨基酸，在一升无热源超纯水中各成分的含量为：葡萄糖360～600、谷氨酰胺30～90、天冬酰胺2～8、脯氨酸10～20、苏氨酸20～50、丝氨酸2～9、组氨酸2～6、赖氨酸8～20、半胱氨酸2～5；可采用常规方法进行配制和使用。本发明的积极效果为：添加到培养基后，细胞无需适应即可正常生长，能有效促进动物细胞在培养基中的生长和产物表达，延长活细胞维持时间；组分明确，通用性强，适用于多种动物细胞培养基；成分简单，不含动物来源成分，易于产物的分离纯化；成本较低，配制及使用方便，适于抗体的大规模生产。

Description

适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂
技术领域
本发明涉及现代生物技术领域内的动物细胞培养基添加剂技术，具体地说，是适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂。
技术背景
自上世纪八十年代哺乳动物细胞基因工程和细胞融合技术取得巨大成就以来，利用哺乳动物细胞培养技术表达和生产蛋白类生物技术药物是目前为止最为高效和可行的方法。随着生物技术药物的应用领域和市场需求量的不断扩大，提高动物细胞培养过程中的细胞密度、延长维持时间以获得高浓度的目的产物，成为优化动物细胞培养过程的核心目标。
众所周知，动物细胞培养基对培养过程的经济性和效率起决定性的作用，培养基的开发和优化是建立高效的动物细胞培养过程的核心环节。因此，根据细胞在生长、代谢和产物表达过程中的营养需求，设计动物细胞培养基中营养物的成分、含量和配比是动物细胞大规模培养技术中最为基础、也最为重要的内容。
近二十年来，随着对血清替代物研究的不断深化，无血清培养基的开发与优化已经取得了可喜的进展，现已解决了传统含血清培养基所带来的诸多问题并能满足细胞稳定传代。市售的多种商业无血清培养基在血清替代方面多具有良好的表现，但在支持细胞高密度培养和高效产物表达方面仍有诸多缺陷。因此，在进行动物细胞大规模高密度培养和产物生产时，多数无血清培养基难以充分、平衡地向细胞提供所需的营养物质。为了获得较高的细胞密度和产物浓度，必须采取换液或提高流加、灌注速率的方法来解除营养限制，因此表达产物浓度和生产效率不高，且培养基利用率很低，造成极大的浪费。
用于动物细胞的培养基成分复杂，其中除了对细胞的存活起维持作用的血清替代物、维生素、无机盐和微量元素之外，葡萄糖、氨基酸等主要营养物质对细胞的生长、代谢和产物合成起着至关重要的作用。其中，葡萄糖是动物细胞最为重要的碳源和能源物质，是细胞进行糖酵解和TCA循环的重要底物。而氨基酸作为蛋白质合成的重要元件，在动物细胞生长代谢和产物表达过程中起到了不可替代的作用。氨基酸是蛋白质和多肽合成的前体，可合成细胞自身所需的结构蛋白以及生化反应中必不可少的生物酶，还直接参与抗体的生物合成，同时也是合成其他生物分子的代谢中间体，还可作为底物提供细胞生理活动所必需的能量，是细胞生长、代谢和产物生产的重要营养物质。
褚多研究发现，氨基酸对细胞的生理、代谢状态和产物表达具有显著影响。如1997年Buckland等人发现流加培养过程中一些必需氨基酸的缺乏会引起细胞凋亡；1998年Bavister 等人发现氨基酸能作为一种缓冲剂调节细胞内pH，从而缓解因氨浓度累积而造成的毒害作用；2002年deZengotita等人的研究证明甘氨酸和苏氨酸能保护细胞免受培养环境中累积的二氧化碳和渗透压的不利影响；2007年Crowell等人研究发现适当补充培养过程中快速消耗的氨基酸对抗体蛋白的唾液酸化程度产生影响；2010年Stephanie Petzolt等人发现在培养基优化过程中半胱氨酸通过干扰胰岛素作用和降低活性氧含量对细胞生长造成影响。随着对氨基酸重要性认识的深化，过程优化中氨基酸的强化越来越受到重视，通过合理添加氨基酸可成功提高CHO细胞的生产能力。例如1994年Bibila等人通过提高流加培养基中的氨基酸浓度使最终产物浓度比批培养提高了7倍；2005年 Kuwae等人通过提高培养基中谷氨酰胺的浓度使细胞的比生产速率提高了1.7倍；2010年Rustandi等人通过改变培养基中的氨基酸浓度使产物浓度提高至13克/升，细胞的比生产速率达到了45皮克/细胞·天。
综上所述，葡萄糖和氨基酸作为关键的营养物质在动物细胞培养基中起着至关重要的作用。国内外许多在研发的或商业化的无血清无蛋白培养基一般由基础培养基和血清替代物组成，一些显著影响细胞生长、代谢和产物表达的重要营养物质强化不够，导致培养过程中活细胞密度和产物表达量常受到这些关键营养物的限制，同时也造成培养基中其他较为丰富的营养物质利用率较低，造成浪费。这些培养基一般仅能确保细胞的稳定传代，并不能较好地支持细胞高密度生长和高产物表达，导致培养过程的效率和经济性不高，因而阻碍了其在大规模生产中的进一步应用。
发明内容
本发明的要解决上述存在的技术问题，提供一种适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，以强化培养基中的重要营养物质，提高细胞培养及其产物表达过程的效率和培养基的利用率，满足动物细胞高密度培养和重组蛋白、抗体类生物技术药物生产的需要。
本发明的思路为：开发一种适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，以强化和丰富动物细胞培养基中的重要营养物质。所述营养物添加剂中含有葡萄糖以作为细胞获取营养的主要碳源物质，为细胞生长和产物表达提供必要的能量供给；含有氨基酸以作为细胞合成自身蛋白和蛋白产物的重要元件，能决定细胞在培养过程中所能达到的最大活细胞密度以及细胞活性的维持时间且影响最终蛋白产物的浓度。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案为：
适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，含有葡萄糖和氨基酸，其特征是，在一升超纯水中葡萄糖和氨基酸的含量为（重量为克）：
葡萄糖 360～600 ；
谷氨酰胺 30～90 ；
天冬酰胺 2～8 ；
脯氨酸 10～20 ；
苏氨酸 20～50 ；
丝氨酸 2～9 ；
组氨酸 2～6 ；
赖氨酸 8～20 ；
半胱氨酸 2～5 。
所述的超纯水为无热源超纯水。
本发明适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂的配制可采用常规方法进行。本发明适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂用于每升培养基的添加量为10mL。
本发明的积极效果是：
（1）添加到培养基中后能有效提高细胞在培养基中的活细胞密度，延长活细胞在培养基中的维持时间，延缓细胞的死亡；
（2）添加到培养基中后能有效提高动物细胞的蛋白类产物表达量；
（3）组分明确，具有较强的通用性，能适用于多种动物细胞培养基；
（4）添加到培养基中后细胞无需适应即可正常生长；
（5）成分简单，不含动物来源成分，易于产物的分离纯化，产品品质能保证；
（6）成本较低，配制及使用方便，适于抗体的大规模生产。
附图说明
图1为CHO细胞在未添加和添加本发明营养物添加剂的商业无血清培养基EX-CELL™ 302 CHO中进行批式培养时活细胞密度变化的趋势图，图中，▲、◆分别表示未添加和添加后的活细胞密度；
图2为CHO细胞在未添加及添加本发明营养物添加剂的商业无血清培养基EX-CELL™ 302 CHO中进行批式培养时细胞活性变化的趋势图，图中，▲、◆分别表示未添加及添加后的细胞活性；
图3为CHO细胞在未添加及添加本发明营养物添加剂的商业无蛋白培养基HyQ SFM4CHO中进行批式培养时活细胞密度变化的趋势图，图中，▲、◆分别表示未添加及添加后的活细胞密度；
图4为CHO细胞在未添加及添加本发明营养物添加剂的商业无蛋白培养基HyQ SFM4CHO中进行批式培养时细胞活性变化的趋势图，图中，▲、◆分别表示未添加及添加后的细胞活性；
图5为CHO细胞在未添加及添加本发明营养物添加剂的无血清培养基（中国专利申请200910053506）中进行批式培养时细胞活性变化的趋势图，图中，▲、◆分别表示未添加及添加后的细胞活性；
图6为CHO细胞在未添加及添加本发明营养物添加剂的无血清培养基（中国专利申请号 200910053506）中进行批式培养时活细胞密度变化的趋势图，图中，▲、◆分别表示未添加及添加后的活细胞密度。
具体实施方式
以下具体介绍本发明适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂的具体实施方式，提供3个实施例，但是，但本发明的实施不限于以下的实施例。
实施例 1 应用于商业无血清培养基EX-CELL™ 302 CHO的适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂
一种适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，含有葡萄糖和氨基酸，在一升无热源超纯水中葡萄糖和氨基酸的含量为（重量为克）：
葡萄糖 360 ；
谷氨酰胺 30 ；
天冬酰胺 2 ；
脯氨酸 10 ；
苏氨酸 20 ；
丝氨酸 2 ；
组氨酸 2 ；
赖氨酸 80 ；
半胱氨酸 2 。
将所述葡萄糖和氨基酸组分充分溶解于无热源超纯水中，配制成所述的营养物添加剂。本发明适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂的配制可采用常规方法。
将所述适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂按每升培养基添加10mL的方式添加至美国SAFC Biosciences公司生产的商业无血清培养基EX-CELL™ 302 CHO中。
使用添加了上述营养物添加剂的培养基，将表达嵌合单克隆抗体的CHO细胞以3-4
Figure 2011101488269100002DEST_PATH_IMAGE001
105细胞/毫升的密度、大于95%的活性接种于瑞士TPP公司（生产的）50ml细胞培养管中，放置于瑞士Kuhner公司生产的摇床上进行批式培养。同时，使用不添加上述营养物添加剂的的EX-CELL™ 302 CHO培养基，采用上述相同方法对CHO细胞进行批式培养，作为对照组。
在不含本发明营养物添加剂的EX-CELL™ 302 CHO培养基中，最大活细胞密度为28
Figure 695497DEST_PATH_IMAGE001
105细胞/毫升，活细胞密度对时间的积分（IVCC）为20
Figure 32937DEST_PATH_IMAGE001
106细胞·天/毫升，细胞活性维持在90%以上的时间为213小时，产物浓度为150毫克/升。在添加本发明营养物添加剂的培养基中，最大活细胞密度达到50
Figure 741655DEST_PATH_IMAGE001
105细胞/毫升，比未添加时提高了78%（参见附图1）；活细胞密度对时间的积分（IVCC）达到39
Figure 139138DEST_PATH_IMAGE001
106细胞·天/毫升，比未添加时提高了95%；细胞活性维持在90%以上的时间为285小时，比未添加时提高了34%（参见附图2）；产物浓度达到380毫克/升，比未添加时提高了153%。
实施例 2 应用于商业无蛋白培养基HyQ SFM4CHO的适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂
一种适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，含有葡萄糖和氨基酸，在一升无热源超纯水中葡萄糖和氨基酸的含量为（重量为克）：
葡萄糖 500；
谷氨酰胺 53；
天冬酰胺 6；
脯氨酸 15；
苏氨酸 40；
丝氨酸 7；
组氨酸 4；
赖氨酸 10；
半胱氨酸 3。
将所述葡萄糖和氨基酸组分充分溶解于无热源超纯水中，配制成所述的营养物添加剂。本发明适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂的配制可采用常规方法。
将所述适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，按每升培养基添加10mL的方式添加至美国Hyclone公司生产的商业无蛋白培养基HyQ SFM4CHO中。
使用添加了上述营养物添加剂的培养基，将表达嵌合单克隆抗体的CHO细胞以3-4
Figure 930376DEST_PATH_IMAGE001
105细胞/毫升的密度、大于95%的活性接种于瑞士TPP公司（生产的）50ml细胞培养管中，放置于瑞士Kuhner公司生产的摇床上进行批式培养。同时，使用不添加上述营养物添加剂的HyQ SFM4CHO，采用上述相同方法对CHO细胞进行批式培养，作为对照组。
在不含本发明营养物添加剂的HyQ SFM4CHO培养基中，最大活细胞密度为60105细胞/毫升，活细胞密度对时间的积分（IVCC）为40
Figure 569485DEST_PATH_IMAGE001
106细胞·天/毫升，细胞活性维持在90%以上的时间为214小时，产物浓度为300毫克/升。在添加本发明营养物添加剂的培养基中，最大活细胞密度达到85
Figure 403449DEST_PATH_IMAGE001
105细胞/毫升，比未添加时提高了42%（参见附图3）；活细胞密度对时间的积分（IVCC）达到65106细胞·天/毫升，比未添加时提高了62%；细胞活性维持在90%以上的时间为260小时，比未添加时提高了21%（参见附图4）；产物浓度达到580毫克/升，比未添加时提高了93%。
实施例 3 应用于华东理工大学的无血清培养基（中国专利申请200910053506）的适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂
一种适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，含有葡萄糖和氨基酸，在一升无热源超纯水中葡萄糖和氨基酸的含量为（重量为克）：
葡萄糖 600；
谷氨酰胺 90；
天冬酰胺 8；
脯氨酸 20；
苏氨酸 50；
丝氨酸 9；
组氨酸 6；
赖氨酸 20；
半胱氨酸 5。
将所述葡萄糖和氨基酸组分充分溶解于无热源超纯水中，配制成所述的营养物添加剂。本发明适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂的配制可采用常规方法。
将所述适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，按每升培养基添加10mL的方式添加至华东理工大学的无血清培养基（中国专利申请200910053506）中。
使用添加了上述营养物添加剂的无血清培养基，将表达单克隆抗体的CHO细胞以1-4
Figure 361227DEST_PATH_IMAGE001
105细胞/毫升的密度、大于95%的活性接种于德国B.Braun公司（生产的）2L生物反应器进行批式培养。同时，使用不添加上述营养物添加剂的的无血清培养基，采用上述相同方法对CHO细胞进行批式培养，作为对照组。
在不含本发明营养物添加剂的无血清培养基中，最大活细胞密度为40105细胞/毫升，活细胞密度对时间的积分（IVCC）为15
Figure 718576DEST_PATH_IMAGE001
106细胞·天/毫升，细胞活性维持在90%以上的时间为90小时，产物浓度为120毫克/升。在添加本发明营养物添加剂的无血清培养基中，最大活细胞密度达到60
Figure 215897DEST_PATH_IMAGE001
105细胞/毫升，比未添加时提高了50%（参见附图5）；活细胞密度对时间的积分（IVCC）达到23
Figure 698831DEST_PATH_IMAGE001
106细胞·天/毫升，比未添加时提高了53%；细胞活性维持在90%以上的时间为171小时，比未添加时提高了90%（参见附图6）；产物浓度达到200毫克/升，比未添加时提高了67%。

Claims (2)

1.适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，含有葡萄糖和氨基酸，其特征在于，在一升超纯水中葡萄糖和氨基酸的含量为（重量为克）：
葡萄糖 360～600 ；
谷氨酰胺 30～90 ；
天冬酰胺 2～8 ；
脯氨酸 10～20 ；
苏氨酸 20～50 ；
丝氨酸 2～9 ；
组氨酸 2～6 ；
赖氨酸 8～20 ；
半胱氨酸 2～5 。
2.根据权利要求1所述的适于动物细胞高密度培养和产物表达的营养物添加剂，其特征在于，用于每升培养基的添加量为10mL。
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