CN101058800B - 用于细胞培养的无动物蛋白质培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含源自大豆水解产物和酵母水解产物的非动物来源肽组合物的无动物蛋白质细胞培养基。本发明也提供一种无动物蛋白质的培养方法，其中在不含动物来源成分的条件下培养、增殖和传代细胞。该方法对于培养细胞，如重组细胞或经病毒感染的细胞，以及对于在无动物蛋白质成分的条件下，通过细胞培养过程生产生物制品是有用的。

Description

用于细胞培养的无动物蛋白质培养基
本申请为2005年3月8日提交的03821326.5号中国专利申请的分案申请。
                      发明领域
本发明涉及包含大豆水解产物和酵母水解产物的组合物的无动物蛋白质细胞培养基。本发明也涉及无动物蛋白质培养方法，其中可在不含动物蛋白质的条件下培养、增殖和传代细胞。这些方法在培养细胞，如重组细胞或用病毒感染的细胞中是有用的，且可用于生产经过细胞培养所得的生物制品。
                      发明背景
对于细胞的培养，特别是真核细胞，更特别是哺乳动物细胞，常需要使用特殊的培养基，该培养基提供营养物质和为细胞有效生长和生产目的蛋白质或病毒所必需的生长营养物质。细胞培养基配方已经补充有大量的添加物，包括不确定的组分，如胎牛血清(FCS)、几种动物来源的蛋白质和/或牛来源的蛋白质水解产物。
一般而言，血清或血清来源的物质，如清蛋白、转铁蛋白或胰岛素，可能含有会污染培养物和由培养物获得的生物制品的多余的介质。此外，必须检测人血清来源的添加物的所有已知的病毒，包括能通过血清传递的肝炎和HIV。而且，牛血清和牛血清来源的产物，例如胰蛋白酶，有承受BSE污染的危险。另外，所有血清来源的产物可能被未知的介质污染。细胞培养中，在来源于人或其它动物源的血清或蛋白质添加物的情况下，特别是如果细胞用于生产施用于人的药剂或疫苗存在许多问题(例如，不同批次的质量和成分变化，以及存在受支原体、病毒或BSE因子污染的危险)。
因此，为提供有效的宿主系统和不需要血清或其它动物蛋白质化合物的培养条件，已经做了许多尝试。简单的无血清培养基一般包括基础培养基、维生素、氨基酸、有机和无机盐，以及使培养基变为营养复杂化的可能的附加成分。然而，这种培养基经常是营养不足的，且必须补充动物来源的蛋白质补充物或用于细胞培养的重组的蛋白质如胰岛素、胰岛素样生长因子或其它生长因子。
为避免在无血清细胞培养基中使用动物蛋白质补充物，已经做了几种尝试以提供完全没有蛋白质的细胞培养基。
Cinatl等人，Cell Biology International 17：885-895(1993)公开了一种特别用于在聚乙烯醇缩甲醛(PVF)培养表面上使VERO细胞连续增殖的培养基(PFK-1)的开发。
WO 96/15231公开了由合成的极限必需培养基和酵母提取物组成的无血清培养基用于增殖脊椎动物细胞和病毒的生产方法。
在WO 98/15614中公开了一种由包含水稻肽和酵母提取物或酶解产物的基础细胞培养基，和/或植物脂质组成的培养基配方用于动物细胞的生长。
在WO 01/23527中公开了一种包含纯化的大豆水解产物的培养基用于培养重组细胞。
WO 00/03000公开了一种包含大豆水解产物和酵母提取物的培养基，但也需要存在重组形式的动物蛋白质，如生长因子。
为有效生产生物制品，如病毒或重组蛋白质，达到最佳的细胞密度以获得最大的产物产量是重要的。
因此，目前的需求在于增加细胞的生长、代谢活性和密度，以及提供完全没有动物蛋白质的理想的细胞培养基用于生产生物制品，如用作人的药物或疫苗。此外，如果培养基中不存在动物蛋白质，则下游加工，例如来自培养基中的所需产物的纯化可以是更加经济和省时的。另外，实施本发明可避免不必要的免疫原性动物蛋白质可能诱导的有害免疫学反应。
                      发明概述
本发明的一个目的是提供无动物蛋白质的培养基。为实现该目的和其它目的，根据本发明的一个方面，提供一种包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质的细胞培养基。大豆水解产物可以至少0.05％(w/v)的浓度存在，酵母水解产物以至少0.05％(w/v)的浓度存在。可选择地，大豆水解产物可以小于1.0％(w/v)的浓度存在，而酵母水解产物可以小于0.3％(w/v)的浓度存在。可选择地，大豆水解产物能以介于约0.2％(w/v)至约0.6％(w/v)之间的浓度存在，而酵母水解产物能以介于约0.05％(w/v)至约0.2％(w/v)之间的浓度存在。可选择地，大豆水解产物能以介于约0.25％(w/v)至约0.35％(w/v)之间的浓度存在，而酵母水解产物能以介于约0.05％(w/v)至约0.15％(w/v)之间的浓度存在。可选择地，大豆水解产物能以约0.3％(w/v)的浓度存在，而酵母水解产物能以约0.1％(w/v)的浓度存在。可选择地，培养基包含相对于1重量份的酵母水解产物3重量份的大豆水解产物。酵母水解产物可以是超滤纯化的酵母水解产物，其中至少40％的所述酵母水解产物的分子量小于或等于500道尔顿。同样地，大豆水解产物可以是超滤纯化的大豆水解产物，其中至少40％的所述大豆水解产物的分子量小于或等于500道尔顿。
本发明也提供培养细胞培养物的方法，该方法包括：提供包含约0.05％(w/v)至约1％(w/v)浓度的大豆水解产物和约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)浓度的酵母水解产物的培养基；以及在培养基中增殖细胞以形成细胞培养物。如上所述，本发明中也可以使用其它浓度的水解产物。细胞可以是动物细胞，如昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞、干细胞，以及优选用于体外生产病毒的细胞。细胞也可以是重组细胞。代表性的细胞包括选自下述的细胞：BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS-细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK-细胞、TCMK-1细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK-21细胞、CHO细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、293细胞和RK-细胞。
本发明也提供一种无动物蛋白质的培养细胞的汇合的方法，该方法包括：提供包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质的培养基；使细胞在培养基中生长，来传代和移种生长在培养基中的细胞同时与非动物来源的蛋白酶接触以获得培养细胞的汇合。细胞可以是动物细胞、重组细胞和/或病毒感染的细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在这里也是适用的。
而且，本发明提供在无动物蛋白质培养基中培养的细胞培养物，其中培养基包含约0.05％(w/v)至约1％(w/v)浓度的大豆水解产物和约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)浓度的酵母水解产物。如上所述的，本发明也可以使用其它浓度的水解产物。细胞可以是动物细胞、重组细胞和/或病毒感染的细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在这里也是适用的。
另外，本发明提供生产病毒的方法，该方法包括：提供一种已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的细胞培养物；用病毒感染细胞；以及培养感染的细胞以繁殖病毒。细胞可以是动物细胞和/或重组细胞，特别是哺乳动物细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在此也是适用的。在培养的细胞上待生产的病毒可选自已知的感染培养细胞的类型。例如，当利用哺乳动物细胞培养物时，病毒可选自以下属：正粘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒、冠状病毒和腺病毒。使用的病毒可以是野生型病毒、减毒病毒、重排列病毒或重组病毒。另外，代替用于以病毒感染细胞的实际病毒颗粒，根据病毒学领域中技术人员已知的感染性克隆的转染方法，可以利用感染性的核酸克隆。
本发明进一步提供生产痘病毒(包括牛痘病毒)的方法，该方法包括：提供一种已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的细胞培养物；用痘病毒感染细胞；以及培养感染的细胞以繁殖痘病毒。细胞可以是哺乳动物细胞和/或重组细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在此也是适用的。
此外，本发明进一步提供生产冠状病毒(包括严重急性呼吸综合症体相关的的冠状病毒)的方法，该方法包括：提供一种已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的细胞培养物；用冠状病毒感染细胞；以及培养感染的细胞以繁殖冠状病毒。细胞可以是哺乳动物细胞和/或重组细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在此也是适用的。
此外，本发明提供生产正粘病毒的方法，该方法包括：提供一种已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的细胞培养物；用正粘病毒感染细胞；以及培养感染的细胞以繁殖正粘病毒。正粘病毒可以是流感A、B或C病毒。细胞可以是哺乳动物细胞和/或重组细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在此也是适用的。
本发明另外提供生产罗斯河病毒(Ross River Virus)的方法，该方法包括：提供一种已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的细胞培养物；用罗斯河病毒感染细胞；以及培养感染的细胞以繁殖罗斯河病毒。细胞可以是哺乳动物细胞和/或重组细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在此也是适用的。
本发明也提供生产黄病毒的方法，该方法包括：提供一种已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的细胞培养物；用黄病毒感染细胞；以及培养感染的细胞以繁殖黄病毒。黄病毒可以选自黄热病毒、及其衍生的嵌合病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、西尼罗河病毒(West nile Virus)和丙型肝炎病毒。细胞可以是动物细胞和/或重组细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在此也是适用的。
本发明进一步提供生产包含病毒或病毒抗原的免疫原性组合物的方法，其中该方法包括：提供一种已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的细胞培养物；用病毒感染细胞；培养感染的细胞以繁殖病毒；收获产生的病毒或病毒抗原；由收获的病毒或病毒抗原制备免疫原性组合物。细胞可以是动物细胞和/或重组细胞。此前提到的培养基特性和细胞类型在此也是适用的。收获的病毒或病毒抗原可以是经过纯化的。
本发明也提供生产包含病毒或病毒抗原的免疫原性组合物的方法，该方法包括：提供一种哺乳动物细胞的培养物，其中该细胞选自已生长在包含大豆水解产物和酵母水解产物的无动物蛋白质培养基中的猴肾细胞、牛肾细胞、狗肾细胞、猪肾细胞、小鼠肾细胞、大鼠肾细胞、羊肾细胞、仓鼠肾细胞和人细胞；用选自正粘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒、冠状病毒和腺病毒的病毒感染细胞；培养细胞培养物以繁殖病毒；收获如此产生的病毒或病毒抗原；以及由收获的病毒或病毒抗原制备免疫原性组合物。
另外，本发明提供用正粘病毒、痘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒或腺病毒感染的细胞培养物，其中将细胞培养在无动物蛋白质的培养基中，其中该培养基包含大豆水解产物和酵母水解产物。大豆水解产物可以是约0.05％(w/v)至约1％(w/v)的浓度，酵母水解产物可以是约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)的浓度。如上述举例的，根据本发明也可以使用其它浓度的水解产物。
本发明进一步提供来自培养基的没有动物蛋白质，包括重组蛋白质的正粘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒、冠状病毒或腺病毒的制剂，其中在无动物蛋白质的培养基中通过培养用流感病毒感染的细胞来获得所述制剂，其中所述培养基中包括大豆水解产物和酵母水解产物。大豆水解产物的浓度可以为约0.05％(w/v)至约1％(w/v)，酵母水解产物的浓度可以为约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)。如上所述，根据本发明也可使用其他浓度的水解产物。在进一步处理之后，这些病毒制剂适合用于生产病毒抗原和疫苗。
鉴于以下述说明和数据，本发明的这些和其它方面对于技术人员而言是显而易见的。
                        发明详述
以各种语法形式表示的术语“无动物蛋白质的培养基”是指一种没有添加来自高等的多细胞非植物真核生物(即脊椎动物)的蛋白质和蛋白质组分的培养基，该细胞具有如天然存在的蛋白质的二级、三级和四级结构特征。要避免的典型蛋白质是存在于血清和血清来源的物质如白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和其它生长因子的蛋白质。根据本发明也要避免可含有免疫原性细菌成分的重组生产的动物蛋白质，它们不存在于本发明的无动物蛋白质的培养基中。动物蛋白质和蛋白质组分不同于可获自植物，如大豆(通常长度为约10-30个氨基酸)以及获自较低等的真核生物，如酵母的非动物蛋白质，小的多肽和寡肽。当然，一旦用增殖的细胞接触或接种培养基，该培养基就会含有由那些细胞流出或分泌的动物蛋白质，包括在培养遗传修饰的细胞时由这些细胞表达的任何重组蛋白质。因此，术语无动物蛋白质的培养基，及由其生产的生物材料和制剂，不解释成要求不存在由培养基中增殖的细胞流出或分泌的蛋白质，而是指不用动物来源或重组产生的蛋白质或蛋白质成分直接添加到培养基中。
以各种语法形式表示的术语“基础培养基”，是合成的培养基，如DMEM、HAM′s F12、培养基199或RPMI，或其组合，及文献中已知的或商业上可获得的其他培养基。依照本发明，每种不含动物蛋白质的合成培养基均可与大豆水解产物和酵母水解产物组合物结合使用。基础培养基可以包含许多成分，包括氨基酸、维生素、有机和无机盐、碳源，每一成分以可维持体外细胞培养的量存在。例如，可以使用DMEM/HAM′s F12(1∶1)培养基作为基础培养基。培养基可以含有辅助物质，如缓冲物质，像碳酸氢钠、氧化稳定剂、抵消机械应力的稳定剂，或蛋白酶抑制剂。如果需要，可以加入非离子表面活性剂，如聚丙二醇(PLURONIC F-61、PLURONIC F-68、SYNPERONIC F-68、PLURONIC F-71或PLURONIC F-108)到培养基中作为消泡剂。若没有添加表面活性剂，上升并爆裂的气泡会导致破坏位于这些气泡表面的那些细胞(“飞溅”)，这些试剂通常用于保护细胞避免曝气的负效应。非离子表面活性剂的量优选介于约0.05和约10g/L之间，一般介于约0.1和约5g/L之间。另外，培养基也可以含有环糊精或其衍生物，一般介于约0.001g/L和约1g/L之间。
根据本发明，培养基包含可加入基础培养基中的大豆水解产物和酵母水解产物。术语“水解产物”包括大豆蛋白胨或酵母提取物的酶解产物。水解产物可以分别获自大量的大豆蛋白胨或酵母提取物制剂，其可以进一步通过自分解、热分解和/或质壁分离酶促消化(例如，通过木瓜蛋白酶)和/或形成。水解产物也可以以商业上获得的，如Hy-Soy、Hy-Yeast 412和Hi-Yeast 444，其可获自如QuestInternational，Norwich，纽约，OrganoTechnie，S.A.法国；或Deutsche Hefewerke股份有限公司，德国。在WO 98/15614中也公开了酵母提取物的来源。在WO 00/03000中也公开了酵母提取物和大豆水解产物的来源。
用于本发明培养基中的水解产物优选是由天然组分纯化的，因为在该纯化期间优选地除去会干扰有效培养的杂质，从而改善水解产物的一致性。纯化可以通过超滤或交联葡聚糖层析，例如使用SephadexG25或Sephadex G10或等同物、离子交换层析、亲和层析、大小排阻层析或“反相”层析。这些方法是本领域已知的。使用这些方法，可以选择含有限定分子量为优选≤1000道尔顿，更优选≤500道尔顿，还更优选≤350道尔顿的大豆或酵母水解产物组分。优选至少90％的水解产物的分子量≤1000道尔顿。大豆和酵母水解产物的平均分子量优选为介于约220到375道尔顿之间。大豆水解产物和酵母水解产物的pH值范围应在约6.5和7.5之间。总的含氮量应介于约8和11％之间，优选介于9.0和10.0％之间且灰分含量≤18％。有益的水解产物的特点在于游离氨基酸的含量介于约5和30％之间。内毒素(如果存在)含量应为＜500U/g。
根据本发明的一种培养基具有以下组分：合成的基本培养基(DMEM/HAM′s F12(1∶1)培养基(1-25g/L)、大豆水解产物(0.5-10g/L)和酵母水解产物(0.5-3g/L)、L-谷氨酰胺(0.05-1g/L)、NaHCO3(0.1-10g/L)。培养基的pH介于pH 6.8到7.6之间，优选介于pH 7.0到7.3之间。
对于技术人员而言显而易见的是，上下文的数值和范围中的术语“约”是指近似或接近所列值或范围的值或范围，以使得本发明能如预期的实施，如具有促进细胞生长的所需要的程度，如从这里含有的教导所显而易见的，且应用于所有值。因此，该术语包括除由系统错误产生的那些值以外的值。
已令人惊讶地发现，补充了本发明范围内的酵母水解产物和大豆水解产物的无动物蛋白质的基础培养基相对于现有技术中描述的培养基更有利于细胞生长的速度、细胞代谢活动和细胞终密度。相对于WO 98/15614显示较高的植物肽浓度是较为不佳的教导，这甚至是更加令人惊讶的。如这里描述的，相对于单独包含大豆水解产物或酵母水解产物的培养基，甚或单独加入培养基中的酵母水解产物或大豆水解产物的终浓度等同于组合的水解产物浓度的总和用包含酵母水解产物和大豆水解产物的本发明的无动物蛋白质培养基，细胞显示了更高的生长速度、更高的生物量的终细胞密度和增加的代谢活动(用％每分钟氧消耗表示)。例如，培养基中单独的终浓度约为0.4％(w/v)的酵母水解产物，对细胞生长和细胞密度具有抑制作用。包含0.4％(w/v)或更高浓度的大豆水解产物的培养基与包含0.3％(w/v)的培养基相比并不能达到更高的细胞密度。然而，包含最后总水解产物浓度为0.4％(w/v)的大豆水解产物和酵母水解产物组合的培养基显示了显著增加的细胞代谢活动、细胞生长和终细胞密度。
依照本发明，培养基中大豆和酵母水解产物的总量应介于约0.2％(w/v)和约0.6％(w/v)之间，其中培养基中大豆水解产物的比率相对于酵母水解产物更高。大豆和酵母水解产物之间的最佳比率应分别为约3∶1(大豆/酵母)。
如这里描述的本发明的培养基对于培养细胞是特别有用的。在本发明的范围内，术语“细胞”指普通术语且包含培养单个细胞、组织、器官、昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞、原代细胞、传代细胞系、干细胞和/或遗传工程化的细胞，如表达异源多肽或蛋白质的重组细胞。重组细胞包括，例如表达异源多肽或蛋白质，如生长因子或血液因子的CHO细胞或BHK细胞。经常用于增殖病毒的细胞包括VERO细胞和CV-1细胞。
适合在本发明的细胞培养基中培养的哺乳动物细胞，包括人源的细胞，其可以是源自组织样品的原代细胞、二倍体细胞株、转化的细胞或已建立的细胞系。哺乳动物细胞可以包括人和类似的非人细胞。非人源的哺乳动物细胞可以是猴肾细胞、牛肾细胞、狗肾细胞、猪肾细胞、兔肾细胞、小鼠肾细胞、大鼠肾细胞、羊肾细胞、仓鼠肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞或源自任何组织的动物细胞。特别地，能培养在培养基中的哺乳动物细胞可以是BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS-细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK-细胞、TCMK-1细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK-21细胞、CHO细胞、293细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、W1-38细胞、BHK细胞、293细胞和RK细胞。实例或重组细胞包括表达因子VIII、FII、FIX、FX、vWF例如，本领域技术人员已知的所有因子的CHO细胞。
以其各种语法形式表示的术语“传代细胞”或“传代细胞系”(CCL)，意为无限制复制且能在悬浮培养物中生长或在生物反应器中大规模培养的培养细胞。CCLs的非限制性生长允许从标准化的细胞培养基、低成本地进行长期培养。哺乳动物细胞系可以选自CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、LLK-MK2细胞、NS-1细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、CV-1细胞、兔肾(RK)细胞，和如由Butler等人BIOS Scientific Publisher第1-24页(1992)公开的其它细胞系，其在此引入作为参考。优选检测CCLs没有外来因子，如细菌、真菌、支原体、原生动物和病毒。
以其各种语法形式表示的术语“细胞培养物”，是指细胞在悬液、摇瓶、培养瓶等中生长。大规模的方法，如包括在搅拌发酵罐中附着于微载体生长的贴壁细胞的生物反应器也包括在内。此外，可能不仅培养表面依赖性细胞，还可使用含本发明培养基的悬浮培养技术。如果细胞在微载体上生长，则该微载体选自基于葡聚糖、胶原、塑料、明胶和纤维素的微载体，及如Butler，Spier和Griffiths，Animalcell Biotechnology 3：283-303(1988)中描述的其它微载体。多孔载体，例如Cytoline
Figure 10003_0
或Cytopore
Figure 10003_1
，以及基于葡聚糖的载体，如DEAE-葡聚糖(Cytodex 1
Figure 10003_2
)、季胺包被的葡聚糖(Cytodex 2
Figure 10003_3
)或基于明胶的载体，如明胶包被的葡聚糖(Cytodex 3
Figure 10003_4
)是合适的。这些载体可从Pharmacia获得。
在细胞培养生长和产物生产过程中，细胞优选生在无动物蛋白质培养基中在培养基条件下由的安瓿到生物量。优选使用已适应于培养基的细胞。已发现，使用这样预适应的细胞不但获得增加的产量，而且通过使用本发明的培养基，它们的培养稳定性也明显地得到改善。
以其各种语法形式表示的术语“培养”，是指在允许生长和延续的生存力的条件下体外维持细胞。哺乳动物细胞一般培养在约37℃的细胞培养箱中，培养基的最佳pH范围约为6.8至7.6，优选介于7.0和7.3之间。如果需要，分批培养的细胞可每隔约2至3天，或更多或更少频度地更换完全培养基。灌流培养的细胞(例如在生物反应器或发酵罐中)可以连续再循环为基础而更换新鲜的培养基。依据上下文和需要，培养方法可以包括细胞的移种、传代和增殖。
因此本发明提供培养细胞的方法，该方法包括细胞在包含酵母水解产物和大豆水解产物的基础培养基中生长的步骤。优选地，细胞生长在包含浓度为0.05％(w/v)至1.0％(w/v)的大豆水解产物和浓度为0.05％(w/v)至0.3％(w/v)的酵母水解产物的培养基中。根据本发明的这个方面，细胞在本发明的无动物蛋白质培养基中从小规模生长到大规模的生物量。为获得细胞培养生物量，细胞的传代和移种优选用非动物来源的蛋白酶，如链霉蛋白酶或其纯化的组分进行。一种蛋白酶是如美国申请系列号10/006,223中描述的灰色链霉菌属(SGT)的纯化胰蛋白酶样组分，其在此全部引入作为参考。在细胞培养期间，特别是在附着于载体生长的贴壁细胞的培养期间，为避免动物来源的物质，载体优选为合成载体，或用非动物来源物质包被的微载体。例如DEAE-葡聚糖或包被季胺的葡聚糖微载体。
本发明也提供无动物蛋白质的细胞培养方法，其中细胞在缺乏动物蛋白质的条件下培养、移种和传代。该方法包括以下步骤：提供包含酵母水解产物和大豆水解产物的无动物蛋白质培养基，使细胞在所述的培养基中生长，使用非动物来源的蛋白酶传代和移种所述的生长在该培养基中的细胞，进一步生长移种的细胞以达到汇合的细胞密度，以及重复细胞的移种和生长步骤直到达到所需要的最终细胞培养生物量。该方法包括在无动物蛋白质培养基中的细胞生长，使用非动物来源的蛋白酶，优选纯化的灰色链霉菌属(SGT)的胰蛋白酶样组分，来移种和传代细胞。在附着于载体生长的贴壁细胞的培养过程中，载体优选为合成载体，或非动物来源物质包被的微载体。通过组合这些步骤，可以避免使用动物蛋白质。
适合在本发明的无动物蛋白质培养基中生长的细胞包括，但不限于BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK-1细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、RK-细胞、BHK-21细胞、WI-38细胞、293细胞和/或MRC-5细胞。这些细胞可以用病毒，如正粘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒、冠状病毒、腺病毒和技术人员已知的其它病毒感染。更特别地，用于感染细胞培养物的病毒可以是流感病毒、牛痘病毒和天花、禽痘病毒、牛痘病毒、蜱传脑炎病毒(TBE)、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、罗斯河病毒、黄热病毒及其衍生的嵌合病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、风疹病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、腮腺炎病毒、麻疹病毒measles virus、呼吸道合胞体病毒(RSV)、疱疹单纯病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、轮状病毒、口蹄疫病毒(FMDV)。在本领域技术人员认知的范围内选择病毒和用于繁殖病毒的细胞。在用各种病毒分别感染之前，细胞可以培养在本发明的培养基中且生长达到最佳的细胞密度。令人惊讶地，在本发明的无动物蛋白质培养基中生长和增殖的细胞培养物显示了病毒产率的显著增加。繁殖病毒的实施例已经显示与单独包含酵母提取物的培养基相比在用本发明的培养基培养和生长的细胞上繁殖的不同病毒有2至5倍增加的病毒产量。这使该系统比现有技术中描述的系统更有利于细胞的生长和病毒的生产。
根据本发明的一个实施方案，细胞是VERO细胞且病毒是选自流感病毒、TBE-病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、罗斯河病毒、黄热病及其衍生的嵌合病毒、西尼罗河病毒、日本脑炎病毒、风疹病毒、HCV、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒、HSV、CMV、EBV、轮状病毒。也可以使用已知生长在VERO细胞中的其它病毒。
本发明也提供牛痘病毒的生产，通过提供在包含酵母水解产物和大豆水解产物的无动物蛋白质培养基中生长和培养的细胞培养物，用牛痘病毒感染所述细胞，以及培养细胞培养物以繁殖牛痘病毒。优选地，细胞生长在包含浓度为约0.05％(w/v)至约1.0％(w/v)的大豆水解产物和浓度为约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)的酵母水解产物的培养基中。根据本发明的这方面，细胞可以是VERO细胞、CV-1细胞、RK-细胞、BHK-21细胞、MRC-5细胞，或牛痘病毒能生长的任何细胞。牛痘病毒可以是天然存在的牛痘病毒、天花病毒疫苗株、有毒牛痘株、减毒牛痘株和重组牛痘病毒。
本发明也提供正粘病毒的生产，其是通过下述方式进行的，即提供在由包含酵母水解产物和大豆水解产物的基础培养基制成的无动物蛋白质培养基中培养和生长的细胞培养物，用正粘病毒感染细胞，以及培养细胞培养物以繁殖正粘病毒。优选地，细胞生长在包含浓度为约0.05％(w/v)至约1.0％(w/v)的大豆水解产物和浓度为约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)的酵母水解产物的培养基中。细胞可以是BSC-1细胞、CV-1细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MDOK细胞、BHK-21细胞、WI-38细胞、MRC-5细胞，或能使正粘病毒繁殖的任何细胞。正粘病毒可以是流感病毒，如流感A、B或C。
本发明也提供罗斯河病毒的生产，其是通过下述方式进行的，即提供在由包含酵母水解产物和大豆水解产物的基础培养基制成的无动物蛋白质培养基中生长和培养的细胞培养物，用罗斯河病毒感染所述细胞，以及培养细胞培养物以繁殖罗斯河病毒。优选地，细胞生长在包含浓度为约0.05％(w/v)至1.0％(w/v)的大豆水解产物和浓度为约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)的酵母水解产物的培养基中。细胞可以是BSC-1细胞、CV-1细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、BHK-21细胞、WI-38细胞、MRC-5细胞或能使罗斯河病毒繁殖的任何细胞。
另外，本发明提供黄病毒的生产，其是通过下述方式进行的，即提供在由包含酵母水解产物和大豆水解产物的基础培养基制成的无动物蛋白质培养基中生长和培养的细胞培养物，用黄病毒感染细胞，以及培养细胞培养物以繁殖黄病毒。优选地，细胞生长在包含浓度为约0.05％(w/v)至约1.0％(w/v)的大豆水解产物和浓度为约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)的酵母水解产物的培养基中。黄病毒可以是黄热病毒，或其嵌合衍生物的重组体、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、西尼罗河病毒和丙型肝炎病毒。这里鉴定的细胞类型可以用于繁殖黄病毒。
本发明还提供细小核糖核酸病毒的生产，其是下述方式进行的通过提供在由包含酵母水解产物和大豆水解产物的基础培养基制成的无动物蛋白质培养基中生长和培养的细胞培养物，用细小核糖核酸病毒感染细胞，以及培养细胞培养物以繁殖细小核糖核酸病毒。优选地，细胞生长在包含浓度为约0.05％(w/v)至约1.0％(w/v)的大豆水解产物和浓度为约0.05％(w/v)至约0.3％(w/v)的酵母水解产物的培养基中。细小核糖核酸病毒可以是脊髓灰质炎病毒或甲型肝炎病毒。这里鉴定的细胞类型可以用于繁殖细小核糖核酸病毒。
本发明也提供生产包含病毒或病毒抗原的免疫原性组合物的方法，该方法包括以下步骤：提供动物细胞的培养物，其中细胞是选自已在本发明的培养基中生长的猴肾细胞、牛肾细胞、狗肾细胞、猪肾细胞、小鼠肾细胞、大鼠肾细胞、羊肾细胞、兔肾细胞、仓鼠肾细胞和人细胞；用选自正粘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒、冠状病毒和腺病毒的病毒感染细胞，培养细胞培养物以繁殖病毒，收获产生的病毒且由收获的病毒制备免疫原性组合物。生产和收获的病毒可以用本领域中已知的方法纯化，如离子交换或凝胶过滤。
现在已概括地描述了本发明，通过参考以下实施例同样会得到进一步理解，这里提供的实施例是用于阐明目的而不以任何方式加以限制。
实施例：
实施例1
培养基的配制
用添加有无机盐、氨基酸、维生素和其它成分的基础DMEM/HAM′sF12(1∶1)培养基制备无动物蛋白质的培养基。也加入碳酸氢钠(1-3g/L)、L-谷氨酰胺(0.1-1g/L)和不同浓度的大豆水解产物(QuestTechnologies，纽约)或酵母水解产物(Deutsche Hefewerke，德国)或其组合物。
实施例2
在无动物蛋白质培养基中的细胞增殖
无动物蛋白质培养基中的VERO细胞
VERO细胞(非洲绿猴，Cercopthecus aethiops，肾)用作细胞系。细胞获自美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，登记号为ATCC CCL 81，传代数为124。使细胞生长在如这里所述的各种培养基中。
将工作细胞库的细胞以分离比为1∶6-1∶8在T-培养瓶、摇瓶和微载体系统中扩增。细胞在37℃下生长6-8天。氧饱和度为20％+/-10％和pH为7.1+/-0.35的培养条件保持恒定。当细胞已经达到汇合生长生物量生产结束时，测定细胞密度和耗氧率。
在生物量生产结束时，测定细胞培养物的生物量的细胞数，如Sch
Figure 10003_5
rfe等人Biotechnologie in LaborPraxis 10：1096-1103(1988)描述的，通过胰蛋白酶消化细胞和用CASY
Figure 10003_6
细胞计数器来计数(方法A)，或如Sanford等人，J.Nat′l Cancer Inst.11：773-795(1951)描述的，通过柠檬酸和结晶紫处理后用血细胞计数器来计数(方法B)。
将VERO细胞培养和生长在无动物蛋白质的培养基中，该培养基包含浓度为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％或0.4％、0.5％(w/v)的酵母水解产物，或浓度为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％或0.4％、0.5％(w/v)的大豆水解产物，或酵母与大豆的浓度比(酵母/大豆)为0.05％/0.05％(w/v)、0.1％/0.2％(w/v)、0.1％/0.3％(w/v)、0.2％/0.2％(w/v)、0.3％/0.2％(w/v)或0.2％/1.0％(w/v)的大豆水解产物和酵母水解产物。通过方法A和B计算在包含不同浓度的大豆水解产物、酵母水解产物或其组合的无动物蛋白质培养基中生物量生产结束时细胞培养物的细胞密度。
结果证明单独的酵母和大豆水解产物支持细胞生长。在酵母水解产物浓度为0.1％时，细胞密度达到约11.8×105个细胞/ml，然而增加酵母水解产物的浓度至高于0.3％(w/v)时，其对细胞生长和随后的细胞密度具有负效应。单独的大豆水解产物的浓度介于0.1％(w/v)至0.2％(w/v)，显示了比0.3％(w/v)和0.4％(w/v)的大豆浓度有更少的细胞生长和细胞密度。不过，培养在包含0.3％(w/v)或0.4％(w/v)大豆水解产物的培养基中的细胞密度和细胞的耗氧没有显著不同，且约1％w/v高浓度的大豆水解产物对细胞生长不具有正效应。单独的大豆水解产物的最佳浓度确定为介于0.2％w/v和1.0％w/v之间。相对于包含单独的大豆或酵母水解产物的培养基，将用大豆水解产物和酵母水解产物的组合添加至基础培养基，达到的最终细胞密度显著地增加。用浓度为0.05％(w/v)的大豆和0.05％(w/v)的酵母时，达到的细胞密度约为12.1×105个细胞/ml，且相对于生长在单独包含0.1％(w/v)大豆水解产物(10×105个细胞/ml)或0.1％(w/v)酵母水解产物(11.8×105个细胞/ml)的培养基中的细胞，具有更高的细胞培养物的细胞密度。生长在包含浓度为0.2％(w/v)酵母和1.0％(w/v)大豆的培养基中的细胞培养物的细胞密度，与在包含0.05％(w/v)大豆和0.05％酵母(w/v)的培养基中获得的密度相似。
对细胞生长最显著的作用是在大豆水解产物浓度相对于酵母水解产物高约2-3倍的培养基中。生长在包含浓度约为0.3％(w/v)的大豆水解产物和约为0.1％(w/v)的酵母水解产物的培养基中的细胞，达到约为21.0×105个细胞/ml的细胞密度，因此显示相对于单独生长在约0.4％(w/v)大豆水解产物中的细胞高约2倍的细胞密度，而相对于培养在单独包含约0.4％(w/v)酵母水解产物的培养基中的细胞高约2.5倍的细胞密度。培养在包含酵母和大豆水解产物的培养基中的细胞的代谢活动也高于生长在单独包含酵母或大豆水解产物的培养基中的细胞。包含0.1％(w/v)酵母水解产物的培养基中耗氧率为1.5(％每分钟)，单独包含0.4％(w/v)的酵母水解产物或大豆水解产物的培养基中的小于1.0(％每分钟)。在包含0.1％(w/v)酵母水解产物和0.3％(w/v)大豆水解产物的培养基中，耗氧约为2.9(％每分钟)，其比培养在单独包含大豆或酵母水解产物的培养基中的细胞高出约2倍。
另外细胞周期，其在补充有单独的酵母或大豆水解产物的无动物蛋白质培养基中为7天，在水解产物组合(大豆和酵母)的培养基中减至6天。
实施例3
重组细胞的增殖
重组哺乳动物细胞，如rFVIII-CHO细胞的细胞培养物在10L的搅拌罐中灌流培养。使用实施例1中的培养基作为培养和生长培养基。将细胞固定在多孔微载体上(Cytopore
Figure 10003_7
，Pharmacia)且培养至少6周。灌流速度为每天变化4体积；pH为6.9至7.2；O2浓度约为20-50％且温度为37℃。测定细胞密度。
实施例4
生长在添加有酵母水解产物和大豆水解产物的培养基中的VERO细胞上病毒抗原生产的比较
a.细胞培养生物量的生产
限定传代数的VERO细胞从液氮中解冻且在roux和摇瓶中传代以生产足够的细胞接种在1.5升的生物反应器中。如实施例1和2中描述的，使细胞生长在添加有酵母水解产物或酵母水解产物和大豆水解产物组合的基础培养基中。在以最终细胞密度1.5×106个细胞/ml达到汇合之后，用纯化的链霉蛋白酶组分，如美国申请系列号10/006,223中描述的灰色链霉菌属胰蛋白酶(SGT)，从微载体中释放细胞，并转移到10升的生物反应器中。这依次用作具有3.0g/l微载体浓度的100升生物反应器的接种物。从含有107个细胞的工作细胞库安瓿开始，需要约30代以在最后的发酵容器中达到最终汇合的VERO细胞生物量。细胞在37℃下生长。在病毒繁殖过程期间，氧饱和度为20％+/-10％和pH为7.1+/-0.35的培养条件保持恒定。
将VERO细胞的工作细胞库的细胞在T-培养瓶和摇瓶中以1∶6的分离比进行扩增。在作为生物反应器的1.5、10和501搅拌发酵罐中，使用Cytodexl
Figure 10003_8
微载体作为附着基底，进行进一步的细胞增殖。细胞在37℃下生长。在病毒繁殖过程期间，氧饱和度为20％+/-10％和pH为7.1+/-0.35的培养条件保持恒定。
b.流感病毒的增殖
用两种不同的流感毒株New Caledonia A/H1N1和Panama A/H3N2感染VERO细胞，并在各自的培养基中繁殖。在病毒繁殖过程结束时，通过超速离心法纯化含有病毒的澄清的上清液。根据容量抗原产率(总SRD，单向放射免疫扩散)和操作结束时上清液的抗原含量(密度梯度纯化的抗原)，对用单独含酵母水解产物或含酵母和大豆水解产物的VERO细胞培养物的收获物进行比较。比较两种培养基配方的产量并总结于表1中。
表1.
在不同的培养基组合物中VERO流感病毒产率的比较
酵母水解产物和大豆水解产物的组合显示比单独的酵母水解产物有显著的改善。
c.痘病毒的生产
用适合在无动物蛋白质的VERO细胞中继续传代生长的天花疫苗生产株(Dryvax，Wyeth疫苗，获自Acambis，Inc.，适合在永久细胞系中生长的小牛淋巴疫苗株)，以0.1-0.3的感染复数(m.o.i)，感染VERO细胞。在37℃下培养2-4天时间后，收获细胞并从细胞回收病毒。
表2显示了在添加有单独的酵母水解产物或酵母和大豆水解产物的基础培养基中生长的细胞中获得的病毒产量的结果。
表2：
生物反应器系统中在生产周期结束时牛痘病毒效价的测定
  培养基添加物   moi   最终效价(pfu)   Pfu/细胞
  1g/l酵母水解产物   0.1-0.3   1.42×107/ml   14
  1g/l酵母水解产物+3g/l大豆水解产物   0.1-0.3   16.00×107/ml   69
酵母水解产物和大豆水解产物的组合显示比单独的酵母水解产物有显著的改善。
d.罗斯河病毒的生产
用罗斯河病毒以感染复数(m.o.i)为0.1-0.3感染此处所述的VERO细胞培养物。在37℃下培养2-4天时间后，收获细胞并从细胞回收病毒。表3显示了在补充有单独的酵母水解产物或酵母和大豆水解产物的基础培养基中生长的细胞中获得的病毒产量的结果。
表3
生物反应器系统中在生产周期结束时罗斯河病毒效价的测定
  培养基补充物   最终效价(pfu/ml)   相对产率(％)
  1g/l酵母水解产物   1.5×107   100
  1g/l酵母水解产物+3g/l大豆水解产物   2.5×107   167
酵母水解产物和大豆水解产物的组合显示比单独的酵母水解产物有显著的改善。
可以理解的是，在示例性的实施方案中，给出的描述、特定的实例和数据，只是说明性的而不作为对本发明的限制。根据本申请论述、公开的内容和数据，在本发明范围内的各种变化和改进对于本领域的技术人员而言是显而易见的，因此被认为是本发明的一部分。

Claims (3)

1.一种培养哺乳动物细胞的细胞培养物的方法，该方法包括：提供包括浓度为0.05％w/v至1％w/v的大豆水解产物和浓度为0.05％w/v至0.3％w/v的酵母水解产物的无动物蛋白质培养基；以及
在该培养基中增殖细胞以形成细胞培养物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述细胞是重组细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中所述细胞选自BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS-细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK-细胞、TCMK-1细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK-21细胞、CHO细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞和RK-细胞。
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