WO2005103235A1

WO2005103235A1 - ウイルスの生産方法

Info

Publication number: WO2005103235A1
Application number: PCT/JP2005/007459
Authority: WO
Inventors: Hikaru Kai; Masayuki Tsubaki; Masato Kurokawa
Original assignee: Denka Seiken Co., Ltd.; Sanyo Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 2004-04-19
Filing date: 2005-04-19
Publication date: 2005-11-03
Also published as: EP1739167B1; JP4650798B2; EP1739167A1; JPWO2005103235A1; CN1914314B; US8221969B2; US20080233148A1; EP1739167A4; CN1914314A

Abstract

　接着性細胞の培養とその細胞培養によるウイルスの工業的生産までの工程において、動物由来成分を全く含有せず、安全で効率の良いウイルスの生産方法を提供する。細胞接着性最小アミノ酸配列（Ｘ）を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド（Ｐ）を有しかつ動物由来成分を含有しない支持体に、接着性細胞を接着させ、この接着性細胞を動物由来成分を含有しない培地で培養し、培養した接着性細胞を動物由来成分を含有しない細胞分散剤を用いて継代培養した後、接着性細胞の培養細胞にウイルスを接種して増殖させることを特徴とするウイルスの生産方法を用いる。

Description

明細書

ウィルスの生産方法

技術分野

[0001] 本発明は、ウィルスの生産方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、 BSE (ゥシ海綿状脳症)感染やトリインフルエンザウイルス感染等の人獣共通感染症に対する危険性が懸念され始めている。そして、主に動物に由来する原料又は材料を用いた製品（例えば、ワクチン，血液製剤，細胞培養 Z遺伝子組換え製剤 ,細胞組織医療品など）には、感染因子が混入する危険性が高ぐ未知の感染性因子を含有している可能性が否定できない他、感染因子の不活ィヒ処理等に限界があるなどの問題があった。このような問題に関する対策として、平成 15年度の薬事法の改正により「生物由来製品」という枠組みが新たに設けられるなど法的な安全性対策が強化されており、動物由来成分を全く含まない医薬製品の開発が望まれていた。

[0003] 各培地メーカーより動物由来成分を含有しない無血清培地が市販されるなど血清を必要としない培養条件を得るための多くの試みがなされているものの、無血清培地と、接着性細胞の培養の支持体として担体表面に適正な電荷を帯びさせて細胞を付着させるマイクロキャリアーとを使用した培養方法では、マイクロキャリアーへの付着率が低下し細胞を効率よく大量に培養することが困難であるといった問題があった。そのため、従来このような培養条件下では、例えば非特許文献 1に記載されているようなブタ変性コラーゲンが被覆されたマイクロキャリアーなどの動物由来成分を含有するものが用いられていた。

[0004] また、細胞の接着'増殖性が高ぐ無血清培地を用いても血清含有培地と同等以上の接触'増殖性を与える動物細胞培養用ビーズが特許文献 1に開示されている。し力しながら、特許文献 1には、細胞培養において無血清条件下で細胞の効率的な培養が可能なことが示されて、るものの、ウィルスの接種や増殖方法などウィルスの生産条件につ、ては開示されて、な、。

[0005] また、特許文献 2には、 Vero細胞のような脊椎動物細胞培養を得、（血清および非血清タンパクを含まない）無タンパク培地中のみで細胞を増殖させ、この培養にウイルスを感染させ、ウィルスを感染させた細胞培養をインキュベーションして、培地中でウィルスを増殖させ、ウィルス含有培地を生産する工程を含むウィルスの生産方法が開示され、さらに、ウィルスの活性を増強する物質として原核生物供給源由来のプロテアーゼを用いることが開示されている。特許文献 2には、この方法によれば得られるウィルスがヒト供給源、または動物供給源由来のあらゆる夾雑ィ匕合物、または病原性物質であるタンパクを含まないと記載されている力実施例には、ウィルスの活性を増強する物質として動物由来成分のトリプシンが使用されている。

[0006] さらに、特許文献 3には、天然由来のタンパク質を使用せず細胞接着性の高い細胞接着支持体を用いたウィルス感染昆虫細胞の生産方法が開示されている。この生産方法は、細胞接着性人工ペプチド及び Z又は細胞接着補助人工ペプチドを用いて、変温動物由来細胞及び基材を接着させ、この細胞接着基材を用いて細胞培養することを特徴とするウィルス感染昆虫細胞の生産方法である。特許文献 3には、基材に天然由来のタンパク質を用いな、ためにヒト感染性のウィルス等の感染物質を含有する危険性がなく安全性が高いと記載されているものの、動物由来成分を含有しな、細胞分散剤及び恒温動物由来の接着性細胞にっ、ての開示はな、。一方、非特許文献 1の細胞の継代には細胞分散剤として、動物由来のプロテアーゼ (例えば、ブタ由来トリプシンなど）が使用されている。

特許文献 1 :特開 2003— 189848号公報

特許文献 2 :特許 3158157号公報（W096Z15231号パンフレツ卜）

特許文献 3 :特開 2003— 210166号公報

非特干文献 1： Otfried Kistner et al. 'Development of a Novel

MammalianCell (Vero) Derived influenza Vaccine" Poster Presented at： Options for ControlOf Influenza V, Okinawa, Japan, October 7—11, 2003

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] そこで、本発明は、接着性細胞の培養とその細胞培養によるウィルスの工業的生産までの工程において、動物由来成分を全く含有せず、安全で効率の良いウィルスの生産方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、動物由来成分を含有しな!ヽ培養材料を用いることによって、安全で効率の良いウィルスの生産方法を見出し、本発明に想到した。

[0009] 本発明のウィルスの生産方法の特徴は、細胞接着性最小アミノ酸配列 (X)を 1分子中に少なくとも 1個有するポリペプチド (P)を有しかつ動物由来成分を含有しな!、支持体に、接着性細胞を接着させ、この接着性細胞を動物由来成分を含有しない培地で培養し、培養した接着性細胞を動物由来成分を含有しな!ヽ細胞分散剤を用ヽて継代培養した後、接着性細胞の培養細胞にウィルスを接種して増殖させる点を要旨とする。

発明の効果

[0010] 本発明のウィルスの生産方法は、安全で効率良くウィルスを生産することができる。

よって、本発明の方法は、ワクチンの生産に好適である。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]実施例 1及び比較例 1〜3における細胞密度の経時的変化を示すグラフである

[図 2]実施例 1及び比較例 1〜3における ELISAによるウィルス産生量の経時的変化を示すグラフである。

[図 3]実施例 1及び比較例 1〜3における HAによるウィルス産生量の経時的変化を示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明において「動物由来成分を含有しない」とは、恒温動物、特に哺乳類 (例えば、ヒト，ゥシ，ブタ，ィヌ，ゥサギ，ネコなど），鳥類、魚類などの動物由来の成分を含有しないことを意味する。

[0013] また、本発明にお、て接着性細胞とは、固体表面に接着して増殖し、ウィルスを増殖可能な恒温動物由来の細胞であれば特に限定されないが、例えば、上皮細胞 (V ero細胞， MDCK細胞， CHO細胞， HEK293細胞、 COS細胞など），腫瘍細胞（H ela細胞， VACO細胞など）、内皮細胞（HUVEC細胞， DBAE細胞など），白血球（ HIT— T15細胞など），線維芽細胞（WI38細胞， BHK21細胞， SFME細胞など），筋肉細胞 (HL1細胞， C2C12細胞など），神経 Z内分泌腺細胞 (ROC— 1細胞， I MR— 32細胞など)及び初代細胞 (鶏胚初代細胞、ゥズラ胚初代細胞及びゥサギ腎初代細胞等)などが挙げられる。これらのうち好ましくは、上皮細胞及び初代細胞、さらに好ましくは、 Vero細胞、 MDCK細胞及び初代細胞、特に好ましく Vero細胞及び MDCK細胞、最も好ましくは Vero細胞である。

また、本発明で接着性細胞に接種されるウィルスとしては、例えば、フラビウィルス科 (Flaviviridae){例えば、黄熱病ウィルス (Yellow fever virus), 日本脳炎ウィルス (Japanese encephalitis virus入 C型月干炎ゥイノレス (hepatitis C virus)及びテング熱ゥィルス (Dengue fever virus)等 }、オルソミクソウィルス科 (Orthomyxoviridae){インフルェンザウィルス (Influenza virus)等 }、アデノウイルス科 (Adenoviridae) {ヒトアデノウィルス 1〜34型（Human adenovirus 1- 34)等 }、ヘルぺスウィルス科 (Herpesviridae){ 単純へルぺスウィルス 1型、（Herpes simplex 1)、単純へルぺスウィルス 2型 (Herpes simplex Π)、仮'性狂犬病ウイノレス (Pseudorabies virus)、水痘帯状抱疼ウイノレス (Varicella— zoster virus)及びヒトサイトメ刀ロウィノレス (Human cytomegalovirus)等 }、ピコルナウィルス科 (Pi_cornaviridae){ァフトウィルス O型 (Aphthovirus 0)、ロ蹄疫ウイノレス (Foot— and— mouth disease virus)ゝポリオウイノレス (Poliovirus) 及び A型月干炎ウイルス (Hepatitis A virus)等 }、パラミクソウィルス科 (Paramyxoviridae){麻疹ウィルス (Measles virus),おたふくかぜウィルス (Mumps virus)及びセンダイウィルス (Sendai virus)等）、トガウィルス科 (Togaviridae){風疹ウィルス (Rubella virus)及び脳炎ウィルス (Encephalitis virus)等 }、ボックスウィルス科 (Poxviridae) { [ワクシニアウィルス (Vaccinia virus入痘瘡ウイノレス (Variola virus)、牛；!豆ゥノレス (Cowpox virus)及びサノレ痘ゥイノレス (Monkeypox virus)等]、レトロウイノレス科（Retroviridae) {ヒト免疫不全ウィルス (Human immunodeficiency virus, HIV)及び成人 T細胞白血病ウィルス (Human T-lymphotropic virus)等 }、及びコロナウイノレス科 (Coronaviridae){ -ヮトリ伝染性気管支炎ウィルス (Avian infections bronchitis virus)等 }等が含まれる {生化学辞典 (第 2版)、東京化学同人 1997年 9月 11日発行 }。これらのうち、フラビウィルス科、オルソミクソウィルス科、アデノウイルス科、ヘルぺスウィルス科、ピコルナウィルス科、パラミクソウィルス科、トガウィルス科又はボックスウィルス科に属するウィルスが好ましぐさらに好ましくはフラビウィルス科、オルソミクソウィルス科、ノラミクソウィルス科又はトガウィルス科に属するウィルス、特に好ましくはオルソミクソウィルス科、パラミクソウィルス科又はトガウィルス科に属するウィルス、最も好ましくはオルソミクソゥィルス科に属するウィルスである。

[0015] さらに、本発明で使用した動物由来成分を含有しない培養材料 (例えば、培地，細胞分散剤，接着性細胞を接着させるための支持体など）は、動物由来成分を含有していないため、外来性物質による汚染の可能性を最低限に抑えることができ、未知の感染性因子を含有していることがなぐさらに感染因子混入の危険性が低ぐそのため感染因子を不活化させる処理を行う必要がないなどの利点を有する。以下、動物由来成分を含有しない培養材料について具体的に説明する。

[0016] 接着性細胞の培養およびウィルス生産に用いる培地は、動物由来成分である血清やタンパク質などを含有しな、培地 (以下、無血清培地)であれば特に限定されず、例えば、市販の無血清培地 {OPTIPRO™SFM培地 (インビトロジェン社製）、 VP— SFM (インビトロジェン社製）及び EX— CELL525 (JRH Bioscience社製等） }、基礎培地 {イーグル MEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地、イスコフ培地、 RPMI1 640培地、ハム F10培地、ハム F12培地、 MCDB105培地、 MCDB107培地、 MC DB110培地、 MCDB131培地、 MCDB151培地、 MCDB152培地、 MCDB153 培地、 MCDB201培地、 MCDB302培地及び MEDIUM199等 }及びこれらの混合培地等が挙げられる。これらのうち、培地の調製の観点等から、市販の無血清培地が好ましぐさらに好ましくは OPTIPRO™SFM培地、 VP— SFM及びEX—CEL L525、特に好ましくは VP— SFM及びEX—CELL525、特に好ましくは VP— SF Mである。この VP— SFMは、ウィルスの増殖に利用される Vero, COS— 7, MDC Κ, ΒΗΚ- 21, ΗΕρ— 2等の細胞系の培養に適している。無血清培地中には、動物由来ではない添加物として、遺伝子組換え微生物由来等のホルモン (インシュリン及びヒドロコルチゾン等）、細胞増殖因子 (上皮増殖因子 (EGF)、血小板由来増殖因子 (PDGF)及び線維芽細胞増殖因子 (FGF)等)及び抗菌剤 (カナマイシン等）等を適宜添加して、細胞の増殖性を安定的に向上させることができる。

[0017] 支持体の材質としては、接着性細胞が接着できる材質であれば特に限定されな！、力細胞毒性の観点等力以下の物質を主成分とすることが好ましい。

(1)合成高分子:ビュル榭脂、ポリエステル、ポリウレタン、エポキシ榭脂、ナイロン及びポリカーボネート等。

(2)天然高分子：セルロース、セルロース誘導体（セルロースジアセテート及びセル口一ストリアセテート等）、及びデキストラン等。

(3)無機物：酸ィ匕アルミニウム、ハイドロキシアパタイト、酸化チタン、シリカ及びガラス等。

[0018] これらのうち、合成高分子、天然高分子及びハイドロキシアパタイトが好ましぐさらに好ましくは合成高分子及び天然高分子、特に好ましくは合成高分子、最も好ましくはビュル榭脂及びナイロンである。

[0019] ビュル榭脂としては、ビュルモノマー {アクリルモノマー、アルケン及びスチレン等 } 及び必要により多官能性モノマー等を構成単位としてなるポリマー {ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリメチル (メタ）アタリレート、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリアクリルアミド架橋体 (アクリルアミドとエチレングリコールジアタリレートとの共重合体等)及びポリ（メタ)アクリロニトリル等 }等が挙げられる。これらのうち、スチレンを必須構成単位としてなる榭脂が好ましぐさらに好ましくは架橋ポリスチレンである。

[0020] 多官能性モノマーとしては、ジビュルベンゼン、エチレングリコールジ (メタ）アタリレート、トリビュルベンゼン及びトリメチロールプロパントリ（メタ）アタリレート等が含まれる

[0021] 支持体の形状としては、接着性細胞が接着できる形状であれば特に限定されず、プレート、シャーレ、 T フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアー、ホローファイノく一、シート（フィルム、フォーム（スポンジ）及び布等）及びゲル等のいずれでもよい。これらのうち、培養量の観点等から、シャーレ、 T—フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリア一及びホロ一ファイバーが好ましぐさらに好ましくはローラーボトル、マイクロキャリア一及びホロ一ファイバー、特に好ましくはマイクロキャリアー及びホロ一ファイバ一、最も好ましくはマイクロキャリアーである。

[0022] マイクロキャリアーの形態には中実型と多孔質型とがあるがいずれも使用できるが、細胞への栄養や酸素の供給効率や細胞の回収率の観点等から、中実型が好ましい。また、マイクロキャリアーの形状としては、球状及び扁平 (楕円）等のいずれも使用できる。

[0023] マイクロキャリアーの粒子径 m)は、中実型の場合、 20〜2000力好ましく、さらに好ましくは 40〜： LOOO、特に好ましくは 80〜500である。一方、多孔質型の場合、粒子径 m)は、 30〜25000力 S好ましく、さらに好ましくは 60〜12000、特に好ましくは 120〜6000である。この範囲内であると、細胞の増殖量がさらに高くなる。

[0024] マイクロキャリアーの真比重は特に制限ないが、マイクロキャリアーを培地とともに撹拌しながら培養する一般的な方法において、撹拌中はビーズは浮遊し、撹拌を止めると沈降することが好ましい。このような観点から、マイクロキャリアーの真比重 (gZc m³)は、 1.00〜： L 10が好ましぐさらに好ましくは 1.01〜： L08、特に好ましくは 1. 01 〜1. 05である。

[0025] マイクロキャリア一は巿場カも容易に入手でき、以下のような商品等が使用できる。

(1)ポリスチレン製：ナルジェヌンク社製バイオシロン（Biosilon)、ソロヒル社製プラスチックビーズ（Plastic beads)及びラックス社製サイトスフエア（Cytosphere)等。

(2)ポリアクリルアミド製：バイオラッド (株)製バイオキャリア（Biocarrier)等。

(3)ポリウレタン製:イノアツク (株)製 PUF等。

(4)セルロース製：バイオマテリアル (株)製セルスノウ（Cellsnow)等。

(5)デキストラン製：アムシャムフアルマシア社製サイトデッタス（Cytodex)等。

(6)ガラス製:スコット社製シラン (SIRAN)等。

[0026] 支持体は、細胞接着性最小アミノ酸配列 (X)を 1分子中に少なくとも 1個有するポリペプチドに）が含有している。ポリペプチド (P)を含有することにより、動物由来の材料を使用しなくても効率の高いウィルス生産が実現できるのである。

[0027] 「細胞接着性最小アミノ酸配列」とは、細胞のインテグリンレセプターに認識され細胞が基材に接着しやすくなる性質を有する最小アミノ酸配列を意味する。

[0028] ポリペプチド (P)中の細胞接着性最小アミノ酸配列 (X)の含有個数 (個）は、細胞接着性の観点等から、（P) l分子中、 1〜50が好ましぐさらに好ましくは 3〜30、特に好ましくは 4〜 20である。

[0029] 細胞接着性最小アミノ酸配列 (X)としては、接着シグナルとして働くものであれば!/、ずれも使用でき、株式会社永井出版発行「病態生理」 Vol. 9、 No. 7、 1990年、 52 7頁に記載されているもの等が使用できる。これらのうち、接着しやすい細胞の種類が多いという観点等から、 Arg Gly Asp配列、 Leu Asp Val配列、 Leu Arg Glu酉己列、 His Ala Val配列、及び配列番号（1)〜（8)で表される配列が好ましぐさらに好ましくは Arg Gly Asp配列、 His Ala Val配列及び配列番号（7)で表される配列であり、特に好ましくは Arg Gly Asp配列である。

[0030] ポリペプチド (P)は、細胞接着性最小アミノ酸配列 (X)以外に、（P)の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列 (Y)を有することが好ま、。

[0031] 補助アミノ酸配列 (Y)としては、最小アミノ酸配列 (X)以外のアミノ酸配列が使用でき、ポリペプチド (P)の耐熱性向上の観点等から、 Gly 及び Z又は Alaを有する配列が好ましい。

[0032] 補助アミノ酸配列（Y)としては、 (Gly Ala) a 配列、 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b 配列、 (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c配列、 (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d配列、 (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e配列、 {Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala} g配列、 (Gly Val Pro Gly Val) h配列、（Gly) i配列、（Ala) j配列、 (Gly Gly Ala) k配列、 ( Gly Val Gly Val Pro) m配列、（Gly Pro Pro) n配列、（Gly Ala Gin Gly Pro Ala Gly Pro Gly) o酉己列、（Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gin Gly Ala Pro Gly Leu Gin) p配列及び/又は（Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gin

Gly Leu Pro Gly Ser Pro) q配列を有する配列等が含まれる。これらのうち、（ Gly Ala) a配列、 (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b配列、 (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c配列、 (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d配列、 (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e 、 {Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala} g配列、 (Gly Val Pro Gly Val) h配列、 ( Gly Val Gly Val Pro) m配列及び Z又は（Gly Pro Pro) n配列を有するものが好ましぐさらに好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b配列、 (Gly Val Pro Gly Val) h配列、 (Gly Val Gly Val Pro) m配列及び Z又は（Gly Pro Pro) n配列を有するもの、特に好ましくは（Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b配列を有するものである。

[0033] なお、 aは 5〜100の整数、 b、 c、 d及び eは 2〜33の整数、 fは 1〜194の整数、 gは

{ l }〜{200Z (6+f) }の小数点以下を切り捨てした整数、 hは 2〜40の整数、 i及び j は 10〜200の整数、 kは 3〜66の整数、 mは 2〜40の整数、 nは 3〜66の整数、。は

1〜22の整数、 p及び qは 1〜13の整数である。

[0034] 補助アミノ酸配列 (Y)は、グリシン (Gly)及び Z又はァラニン (Ala)を含むことが好ましい。グリシン (Gly)及びァラニン (Ala)を含む場合、これらの合計含有割合 (％)は、補助アミノ酸配列 (Y)の全アミノ酸個数に基づいて、 10〜： LOOが好ましぐさらに好ましくは 20〜95、特に好ましくは 30〜90、最も好ましくは 40〜85である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。

[0035] グリシン (Gly)及びァラニン (Ala)の両方を含む場合、これらの含有個数割合 (Gly

/Ala)は、 0. 03〜40力子ましく、さらに好ましくは 0. 08〜13、特に好ましくは 0. 2

〜5である。この範囲であると、耐熱性がさらに良好となる。

[0036] ポリペプチド (P)中の補助アミノ酸配列 (Y)の含有個数は、耐熱性向上の観点等から、（P) l分子中、 2〜51が好ましぐさらに好ましくは 3〜35、特に好ましくは 4〜20 である。また、ポリペプチド (P)は、 2種以上の補助アミノ酸配列 (Y)を含んでもよい。

[0037] (Gly Ala) a配列を有する補助与アミノ酸配列としては、配列番号（9)〜（11)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0038] (Gly Ala Gly Ala Gly Ser) b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号

(12)〜（14)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0039] (Gly Ala Gly Ala Gly Tyr) c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号

( 15)〜（ 17)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0040] (Gly Ala Gly Val Gly Tyr) d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号

(18)〜（20)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0041] (Gly Ala Gly Tyr Gly Val) e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号

(21)〜（23)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0042] {Asp Gly Gly (Ala)f Gly Gly Ala} g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（24)〜（26)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。 [0043] (Gly Val Pro Gly Val) h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（27)

〜（30)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0044] (Gly) i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（31)〜（33)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0045] (Ala) j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（34)〜（36)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0046] (Gly Gly Ala) k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（37)〜（39) で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0047] (Gly Val Gly Val Pro) m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（40

)〜 (42)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0048] (Gly Pro Pro) n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号 (43)〜（45) で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0049] (Gly Ala Gin Gly Pro Ala Gly Pro Gly) o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号 (46)〜 (48)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0050] (Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ser Gin Gly Ala Pro Gly Leu Gin) p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号 (49)〜（51)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0051] (Gly Ala Pro Gly Thr Pro Gly Pro Gin Gly Leu Pro Gly Ser Pro) q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号（52)〜（54)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。

[0052] これらのアミノ酸配列のうち、配列番号（9)、（10)、（12)、（13)、（14)、（15)、 (1 6)、 (18)、（19)、（21)、（22)、（24)、（25)、（26)、（27)、（28)、（30)、（31)、 (3 2)、（34)、（35)、（37)、（38)、（40)、（41)、（43)、（44)、（46)、（47)、（49)、 (5 0)、（52)又は（53)で表されるアミノ酸配列が好ましぐさらに好ましくは配列番号（1 0)、（12)、（13)、（14)、（16)、（19)、（22)、（26)、（27)、（28)、（29)、（30)、 (3 2)、（35)、（38)、（41)、（44)、（47)、（50)又は（53)で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号（ 12)、（ 13)又は（30)で表されるアミノ酸配列である。

[0053] ポリペプチド (P)は、分岐鎖を含んでいてもよぐ一部が架橋されていてもよぐ環状構造を含んでいてもよい。しかし、ポリペプチド (P)は、架橋されていないことが好ましぐさらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、）8構造 (直鎖状ペプチドが折れ曲がつてこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。

[0054] ポリペプチド (P)は、細胞接着性及び耐熱性の観点等から、最小アミノ酸配列 (X) と補助アミノ酸配列 (Y)とが交互に化学結合してなる構造であることが好まし、。この場合、最小アミノ酸配列 (X)と補助アミノ酸配列 (Y)との繰り返し単位 (X-Y)の数（個）は、細胞接着性の観点等から、 1〜50が好ましぐさらに好ましくは 2〜40、特に好ましくは 3〜30、最も好ましくは 4〜20である。

[0055] また、最小アミノ酸配列 (X)と補助アミノ酸配列 (Y)との含有個数は同じでも異なつていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より 1個少な、ことが好ましいにの場合、補助アミノ酸配列 (Y)が少な!/、ことが好ましい }。ポリペプチド (P)中の最小アミノ酸配列 (X)と補助アミノ酸配列 (Y)との含有個数割合（ X/Y)は、 0. 66-1. 5力好ましく、さらに好ましくは 0. 9〜1. 4、特に好ましくは 1〜 1. 3である。

[0056] また、ポリペプチド (P)の末端部分 (最小アミノ酸配列 (X)又は補助アミノ酸配列 (Y )からペプチド末端まで）に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有量は、ポリペプチド 1個当たり、 1〜： LOOO個が好ましぐさらに好ましくは 3〜3 00、特に好ましくは 10〜： L 00である。

[0057] ポリペプチド（P)の数平均分子量（Mn)は、 1, 000〜1, 000, 000力子ましく、さら【こ好ましく ίま 2, 000〜700, 000、特【こ好ましく ίま 3, 000〜400, 000、最ち好ましくは 4, 000〜200, 000である。なお、ポリペプチドの数平均分子量（Mn)は、 SDS— PAGE (SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動）法により、測定サンプル {ポリペプチド等 }を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる（以下、同じ)。

[0058] ポリペプチド (P)の好適な例を以下に示す。

(1)最小アミノ酸配列 (X)が Arg Gly Asp配列 (xl)の場合 ((xxll))のの 1133個個とと（（GGllyy AAllaa GGllyy AAllaa GGllyy SSeerr))配配列列（（1133)) ((yyll))のの 1133個個ととをを有有しし、、ここれれ

99

ららがが交交互互にに化化学学結結合合ししててななるる構構造造をを有有すするる MMnn約約 1111万万ののポポリリペペププチチドド（（「「ププロロネネククチチンン FF」」、、ププロロネネククチチンン::登登録録商商標標（（日日本本及及びび米米国国））、、三三洋洋化化成成工工業業 ((株株))製製くく以以下下同同じじ >> ))

((xxll))のの 55個個とと（（GGllyy AAllaa GGllyy AAllaa GGllyy SSeerr))配配列列（（1122)) ((yy22))のの 55個個ととをを有有ししここれれららがが

33

交交互互にに化化学学結結合合ししててななるる構構造造をを有有すするる MMnn約約 22万万ののポポリリペペププチチドド（（「「ププロロネネククチチンン FF22」」 )) ((xxll))のの 33個個とと（（GGllyy VVaall PPrroo GGllyy VVaall)) GGllyy GGllyy ((GGllyy AAllaa GGllyy AAllaa GGllyy SSeerr))

22 33 配配列列（（3300)) ((yy33))のの 33個個ととをを有有ししここれれららがが交交互互にに化化学学結結合合ししててななるる構構造造をを有有すするる MMnn約約

(2)最小アミノ酸配列 (X)が lie Lys Val Ala Val配列（x2)の場合

プロネクチン F、プロネクチン F2又はプロネクチン F3の Arg Gly Asp配列（xl)を He Lys Val Ala Val配列（7) (x2)に変更した「プロネクチン L」、「プロネクチン L2」、又は「プロネクチン L3」等。

(3)最小アミノ酸配列 (X)が Tyr lie Gly Ser Arg配列（x3)の場合

プロネクチン F、プロネクチン F2又はプロネクチン F3の Arg Gly Asp配列（xl)を Tyr He Gly Ser Arg配列（x3)に変更した「プロネクチン Y」、「プロネクチン Y2」、又は「プロネクチン Υ3」等。

[0059] また、（1)〜（3)のポリペプチドの他、宝酒造 (株）製 RetroNectin (リコンビナントヒトフイブロネクチン CH— 296) {最小アミノ酸配列（X)として Arg Gly Asp配列（xl) 及び Leu Asp Val配列を含有する Mn約 6万のポリペプチド }、同 RGDS— Protein A{最小アミノ酸配列（X)として Arg Gly Asp配列（xl)を含有する Mn約 3万のポリペプチド }も好ましく使用できる {ただし、これらのポリペプチドは補助アミノ酸配列 (Y )が含まれていない。よって、耐熱性等が上記の（1)〜（3)よりも劣る。また、これらのポリペプチドのアミノ酸配列は特開平 2— 311498号 (US5198423Aの開示内容を参照により本出願に取り込む）に開示されている。 }。

[0060] ポリペプチド (P)の製造方法は特に制限されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にして製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成法、液相合成法等)及び生化学的合成法 [遺伝子組換え微生物 (酵母、細菌、大腸菌等) ]等によつて合成することができる。有機合成法に関しては、例えば、日本生化学学会編「続生化学実験講座 2、タンパク質の化学（下）」第 641〜694頁（昭和 62年 5月 20日；株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平 3— 502935号公報（US5243038A、 US5496712A 、 US5514581A, US5606019A, US5641648A, US5723588A, US57706 97A、 US5773249A, US5808012A, US5830713A, US6018030A, US61 40072A, US6184348B1, US6355776B1, US6380154B1, US20030834 64A1及び US2003176355A1の開示内容を参照により本出願に取り込む）に記載されて!ヽる方法等が用いられる。高分子量のポリペプチド (P)を容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましぐ特に好ましくは遺伝子組換大腸菌を用いて合成する方法である。

[0061] 支持体にポリペプチド (P)を含有する場合、 (P)は、支持体の表面に含有して!/、ればよぐ（P)は化学結合 (イオン結合、水素結合及び Z又は共有結合等)及び Z又は物理吸着 (ファンデルワールス力による吸着）によって、支持体の表面に結合されている。これらのうち、化学結合が好ましぐさらに好ましくは共有結合である。

[0062] 支持体にポリペプチド (P)を共有結合させる反応は公知の方法で行うことができる。

例えば、「ペプチド合成の基礎と実験、平成 9年 10月 5日、丸善株式会社発行」に記載の方法が挙げられ、具体的には、以下の（1)〜（3)の通りである。

[0063] (1)ポリペプチドのうち 1級ァミノ基又は 2級アミノ基を有するものとポリペプチド (P) を含有しなヽ支持体 (以下、 P未含有支持体)のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、 P未含有支持体のカルボキシル基を予めカルポジイミドィヒ合物と反応させ、ァシルイソ尿素 {R'— N = C (OCOR) -NH-R' (― OCORが支持体に由来する部分） }を得た後、ポリペプチドのうち 1級ァミノ基又は 2級アミノ基を有するものをこのァシルイソ尿素にカ卩えることによって、 P未含有支持体とポリペプチドとをアミド結合できる。

[0064] カルボジイミド化合物としては、 N, N ' ジシクロへキシルカルボジイミド及び 1 ェチル— 3— (3—ジメチルァミノプロピル)カルポジイミド塩酸塩等が挙げられる。 [0065] (2)ポリペプチドのうち 1級ァミノ基又は 2級アミノ基を有するものと P未含有支持体のうちヒドロキシル基を有するものとを反応させる場合、 P未含有支持体のヒドロキシル基を予めカルボ-ルジイミダゾール化合物と反応させ、イミダゾール誘導体 {R— I m、 Imはイミダゾリン環、 Rが支持体に由来 }を得た後、ポリペプチドのうち 1級ァミノ基又は 2級アミノ基を有するものをこのイミダゾール誘導体に加えることによって、 P未含有支持体とポリペプチドとを N— C結合できる。

[0066] カルボ-ルジイミダゾール化合物としては、 N, N，—カルボ-ルジイミダゾール等が挙げられる。

[0067] (3)ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものと P未含有支持体のうちカルボキシル基を有するものとを反応させる場合、 P未含有支持体のカルボキシル基を予め力ルボジイミドィ匕合物と反応させ、ァシルイソ尿素を得た後、ポリペプチドのうちヒドロキシル基を有するものをこのァシルイソ尿素にカ卩えることによって、 P未含有支持体とポリペプチドとをエステル結合できる。

[0068] ポリペプチドを P未含有支持体に、物理吸着、イオン結合及び Z又は水素結合させる方法としては、溶媒等にポリペプチドと P未含有支持体とを投入し、混合して作製する方法等が挙げられる。溶媒としては特に制限はないが、水 (水道水、イオン交換水、蒸留水及びイオン交換した蒸留水等)の他に、無機塩、有機酸塩、酸及び Z又は塩基を含有する水溶液 (例えば特開 2003— 189848)等が使用できる。無機塩、有機酸塩、酸及び塩基の含有量 (重量％)は、水溶液の重量に基づいて、 0. 001〜 50力子ましく、さらに好ましくは 0. 005〜30、特に好ましくは 0. 01〜10である。

[0069] これらの溶媒の中で、無機塩、酸及び Z又は塩基を含有する水溶液、並びに水が好ましぐさらに好ましくは無機塩、酸及び Z又は塩基を含有する水溶液、並びにィオン交換した蒸留水、特に好ましくは無機塩、酸及び Z又は塩基を含有する水溶液である。

[0070] 支持体にポリペプチド (P)を含有する場合、ポリペプチド (P)の含有量（ μ g/cm²) は、支持体の平均表面積 lcm²当り、 0. 0001〜100000力好ましく、さらに好ましくは 0. 001〜10000、特に好ましくは 0. 01〜： LOOOである。この範囲であると、糸田胞培養の効率がさらに高くなる。 [0071] ポリペプチド（P)の含有量は、次のようにして求められる。

(1)支持体の単位重量当たりのポリペプチド (P)の含有量 gZg)を、例えば免疫学的測定法 (特開 2004— 049921等に記載）により定量する。すなわち、支持体と、ポリペプチド (P)と結合する抗体に酵素を標識したもの (以下、酵素標識抗体 1)とを反応させ、この反応した酵素標識抗体 1の酵素量を測定することにより、単位重量あたりのポリペプチド (P)の含有量を測定する。

(2)次に、表面形状測定顕微鏡 {共焦点原理を利用した 3D形状測定顕微鏡、たとえばキーエンス (株)製 VK— 9500}を用いて、支持体をスライドガラスに接着剤等で固定ィ匕したもの（以下、固定化支持体)の上部の表面 (例えば、 20 ^ πι Χ 20 ^ ιη)について、表面形状の 3次元データ得る。そして、この 3次元データ力細孔（直径 1 μ m 未満)部分を一律に除外して (平坦な表面として補正して)、リブ (畝)等を有する支持体の部分表面積 (A)を求める。また、表面形状の 3次元データから、細孔（直径 1 m未満)及びリブ (畝)等を一律に除外して (平坦な表面として補正して）、表面がフラットな支持体の部分表面積 (B)を求める。さらに支持体の 9個について 3次元データを同様にして測定し、支持体の部分表面積 (A)及び支持体の部分表面積 (B)を求める。そして、支持体 10個について、リブ等を有する支持体の部分表面積 (A)の平均部分表面積 (HA)及び表面がフラットな支持体の部分表面積 (B)の平均部分表面積 (HB)を算出する。

[0072] 支持体が球状の場合は、式 {単位重量当たりの平均表面積 (cm²Zg) = [4 X π X

(ra/2/10000) ²] / [4/3 X π X (ra/2/10000) ³ X d] X [ (HA) Z (HB) ] W ら、支持体の単位重量当たりの平均表面積を算出する。なお、 mは支持体の粒子径であり、 dは支持体の真比重である。

[0073] なお、球状でな!、支持体 (棒状、直方体及び板状等)や多孔質の支持体であって、上記の方法では計算できない場合、支持体の単位重量当たりの平均表面積は、以下のようにして算出される。

[0074] 比表面積計 (例えば、 QUANTASORB (ュアサアイォニタス製）を用いて支持体の表面積を測定 (測定ガス; HeZKr= 99. 9/0. 1体積比、検出ガス；窒素）し、式 { 支持体の表面積 Z支持体の重量 }から、支持体の単位重量当たりの平均表面積 (c m²Zg)を算出する。

(3)単位重量当たりのポリペプチド (P)の含有量 g/g)を、単位重量当たりの平均表面積 (cm²Zg)で除して、支持体の平均表面積 lcm²当たりの含有量（ gZcm 2)を算出する。

[0075] 細胞分散剤とは、継代培養の際に使用される動物由来成分を含有しない細胞分散剤であって、支持体から細胞を剥離する目的で使用するものを意味する。細胞分散剤としては、キレート剤 (EDTA等）、 2〜30°Cの無血清培地、植物由来の蛋白質分解酵素 (パパイン等)、遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素（トリプシン様酵素（インビトロジン社製 rProtease等））及びこれらの組合せ等が挙げられる。これらのうち、支持体力細胞の剥離性の観点等から、植物由来の蛋白質分解酵素、遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素及びこれらの組合せが好ましぐさらに好ましくは遺伝子組換え微生物由来の蛋白質分解酵素である。

[0076] 本発明のウィルスの生産方法は、接着性細胞を動物由来成分を含有しない支持体に接着させ、この接着性細胞を動物由来成分を含有しない培地で培養し、培養した接着性細胞を動物由来成分を含有しない細胞分散剤を用いて継代培養した後、接着性細胞の培養細胞にウィルスを接種して増殖させることによりウィルスを大量に生産することができる。

[0077] 細胞播種に用いる接着性細胞を得るための培養（以下、プレ培養）には特に制限が無ぐ動物由来成分を含有する材料 (支持体、培地及び細胞分散剤等)及び動物由来成分を含有しなヽ材料 (支持体、培地及び細胞分散剤等)のヽずれを用いてもよい。しかし、プレ培養においても、動物由来成分を含有しない材料 (支持体、培地及び細胞分散剤等)だけを用いることが好ま、。

[0078] プレ培養で得られた接着性細胞を支持体に接着させる方法は、通常の方法でよく、培地及び支持体に細胞播種すること等が適用できる。

[0079] 接着性細胞の播種量（万個 Zcm²)は、接着性細胞の種類等によって決定されるが、支持体の平均表面積 lcm²当り、 0. 001〜1000力子ましく、さらに好ましくは 0. 01 〜100、特に好ましくは 0. 1〜10である。接着性細胞の個数の測定方法には特に制限がないが、例えば、細胞核数をゥイーゼル (Wezel)によるクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる。また、培地の細胞密度（万個 ZmL)は、培地 lmL当たり、 0. 01〜： L0000力好ましく、さらに好ましくは 0. 1-1000,特に好ましくは 1〜100、特に好ましくは 5〜50、最も好ましくは 10〜30である。

[0080] 接着性細胞の培養の期間（日）は、 3〜30が好ましぐさらに好ましくは 4〜21、特に好ましくは 5〜15、次に好ましくは 6〜10、最も好ましくは 7又は 8である。接着性細胞の種類等によって異なる力 8日間培養すると、培地の細胞密度は、培養開始時に比べて 3〜30倍程度に増加する。

[0081] 培地の交換は、 1〜5日毎に、 1Z3量〜全量の培地を交換することが好まし!/、。

[0082] 培養中の二酸化炭素濃度 (体積％)は、培養雰囲気の体積に基づいて、 2〜10が好ましぐさらに好ましくは 4〜6、特に好ましくは 5である。

[0083] 培養温度 (°C)は、 25〜42力好ましく、さらに好ましくは 30〜40、特に好ましくは 35

〜39、最も好ましくは 37である。

[0084] 支持体としてマイクロキャリアー（粒子径； 20〜500 /ζ πι、表面積； 100cm²〜 100m

²等）を用いるとき、培養容器としては、（1)スピンナーフラスコ又はベッセルと、（2)ラジアルフロー型リアクター等が使用できる。

[0085] (1)スピンナーフラスコ又はベッセル等を使用する場合、例えば、培養容器 (容量； lOOmL〜： LOOL等）中に、接着性細胞、マイクロキャリアー及び培地を入れて、撹拌しながら培養する方法が適用できる。

[0086] (2)ラジアルフロー型リアクター等を使用する場合、例えば、培養容器 (全容量； 10

OmL〜： LOOL等）にマイクロキャリアーをセットした後、接着性細胞を含む培地を循環しながら培養する方法等が適用できる。

[0087] 一方、支持体としてホロ一ファイバー（内径 10〜500 m等）を用いるとき、カートリッジ (全容量； 10mL〜： LOL等)等に、接着性細胞を含む培地を加えた後、ホローファィバー内に培地を循環しながら培養する方法等が適用できる。

[0088] また、支持体としてローラーボトル (全容量; 0. 1〜20L等)等を用いるとき、接着性細胞を含む培地を培養容器に加えた後、撹拌させながら培養する方法等が適用できる。

[0089] 細胞分散剤を用いた継代培養とは、上記のようにして培養により得た接着性細胞を細胞分散剤によって細胞分散液にした後、この細胞分散液を用いて再び接着性細胞の培養を行うことを意味する。

[0090] 接着性細胞の培養細胞にウィルスを接種するタイミングとしては、接着性細胞の培養を開始後、 3〜30日目が好ましく、さらに好ましくは 4〜21日目、特に好ましくは 5 〜15日目、次に好ましくは 6〜： LO日目、最も好ましくは 7又は 8日目である。

[0091] またウィルスを接種する際の培養細胞の細胞密度（万個 ZmL)は、 0. 2〜20000 0力好ましく、さらに好ましくは 2〜20000、特に好ましくは 20〜2000、次に好ましくは 100〜1000、最も好まし <は 200〜500である。

[0092] ウィルスを接種する前に、無血清培地で培地交換を行うことが好ましぐさらに好ましくは細胞培養の培地を除去し、 PBS (0. 02Mリン酸緩衝液等)及び Z又は無血清培地を加えて 1分〜 1時間攪拌した後、加えた PBS及び Z又は無血清培地を除去し、無血清培地を加えることである。

[0093] この無血清培地は、細胞培養で使用したものと同じものが好ましい。

[0094] この無血清培地には細胞分散剤が含有されていてもよぐ含有されていなくてもよい。インフルエンザウイルス等の場合、無血清培地に細胞分散剤が含有されていることが好ましい。無血清培地に細胞分散剤が含有される場合、この含有量 (体積％)は、無血清培地の体積に基づいて、 0. 5〜40力子ましく、さらに好ましくは 1〜20、特に好ましくは 2〜 10である。

[0095] ウィルスを接種する時の M.O.I (感染多重度）は、細胞やウィルスの種類によって異なる力 1〜0. 0000001力子ましく、さらに好ましくは 0. 1〜0. 00001、特に好ましくは 0. 05〜0. 0001である。

[0096] ウィルスの培養期間（増殖期間；日）は、 2〜14が好ましぐさらに好ましくは 3〜10 である。

[0097] ウィルスの培養温度（増殖温度; °C)は、 30〜39力子ましく、さらに好ましくは 32〜

38、特に好ましくは 33〜37である。

[0098] 培地の pHは、一定の範囲に制御することが好ましぐその範囲は、 6〜9が好ましく

、さらに好ましくは 6. 5〜8. 5、特に好ましくは 7〜8である。

[0099] 本発明のウィルスの生産方法を用いて製造され得るワクチンとしては特に制限がないが、日本脳炎ワクチン、デング熱ワクチン、西ナイル熱ワクチン、インフルエンザワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン、ポリオワクチン、 A型肝炎ワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン及びおたふくかぜワクチンが好ましぐさらに好ましくは日本脳炎ワクチン、デング熱ワクチン、西ナイル熱ワクチン、インフルエンザワクチン、ポリオヮクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン及びおたふくかぜワクチン、特に好ましくはインフルェンザワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン及びおたふくかぜワクチン、最も好ましくはインフルエンザワクチンである。

[0100] 本発明の方法によれば、細胞培養およびウィルスの生産の工程において、全く動物由来成分を含有しない培養材料を用いているため、安全で且つ品質が一定した接着性細胞が大量に培養できる。さらに、外来性物質による汚染の可能性を最低限に抑えることができ、さらに未知の感染性因子を含有していることがないため感染因子を不活ィ匕させる処理を行う必要がないなどの利点を有する。

[0101] 本発明は上記の記載内容に限定されるものではなぐ本発明の要旨の範囲内にお V、て種々の変形実施が可能である。

[0102] 以下、本発明について、実施例及び図面を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

<細胞播種に用いる接着性細胞を得るための培養 >

ダルベッコ minimum essential medium (DMEM)培地 + 5体積⁰ /₀ゥシ胎児血清（ FBS) (インビトロジェン社製）にてプレ培養中の Vero細胞を、細胞分散剤 (インビトロジェン社製、 rProtease (登録商標） )を必要に応じて PBSで希釈した希釈液にて 37°C 条件下で細胞分散を行い、遠心操作により上清を除去して、細胞播種用 Vero細胞（ S)を得た。

実施例 1

[0103] <無血清培地及びプロネクチン F結合ナイロンビーズを用いた日本脳炎ウィルスの生産 > (1)プロネクチン Fをリン酸バッファー液（PBS)でプロネクチン Fの濃度が 300 /z g/mlとなるように希釈し、プロネクチン F溶液を作製した。水溶性カルポジイミド溶液 { 1—ェチル 3— (3 ジメチルァミノプロピル）カルボジイミドノヽイド口クロリド、ドジンド (株）製、 300mM水溶液） 100mlに、 12ナィロンビーズ(粒子径150〜250 m、トライアル株式会社製） 50gを加え、撹拌子で 2時間撹拌した後、これにリン酸緩衝液 (pH = 7. 2) 100mlを添加し溶液を吸引除去する操作を 5回行うことにより（洗浄)カルポジイミド結合ナイロンビーズ（1)を得た。弓 Iき続きこのカルポジイミド結合ナィロンビーズ（1)をプロネクチン F溶液 100mlに浸積して 2時間撹拌し、リン酸緩衝液 (pH = 7. 2) 100mlを添加し溶液を吸引除去する操作を 3回行った (洗浄)後、アンモ-ァ水溶液（300mM、 100ml)中で 2時間撹拌した。その後、イオン交換水 100m 1を添加し溶液を吸引除去する操作を 3回行、（洗浄）、次、で 100°Cの熱風を吹きつけながら、 60分間乾燥しプロネクチン F結合ナイロンビーズ {プロネクチン F結合量 : 0. 3 μ gZ cmを得た。

(2)動物由来成分を含有しな!ヽ無血清培地 (インビトロジン社製、 VP- SFM)と動物由来成分を含有しなヽプロネクチン F結合ナイロンビーズからなるサンプル 4をスピンナーフラスコ（テクネ社製、 F7689)に入れた。

[0104] 次に、細胞播種用 Vero細胞（S)が細胞密度 2 X 10⁵cells/mLとなるように上記サンプル 4の入ったスピンナーフラスコに播種し、作動容量（M) lOOmLとした。その後、細胞，培地およびマイクロキャリアーの入った培養液を 25rpmで攪拌し、細胞をマイクロキャリアーに接着させた後、細胞を 24日間、 37°Cの恒温室にてマグネチックスタ一ラー（テクネ社製、 MCS-104L)を用いて 25rpm〜35rpmの攪拌回転数により培養した。

[0105] 細胞継代は 8日毎に行、、細胞播種 3日目より毎日 50体積％の培地交換を行った。なお、動物由来成分を含有しない細胞分散剤 (インビトロジェン社製、 rProtease (登録商標)）を PBSで 5倍希釈した希釈液にて 37°C条件下で細胞分散を行、、遠心操作により上清を除去後、必要量を予め用意されたスピンナーフラスコに播種して、継代操作を行った。

[0106] サンプル 4の経時変化における細胞密度を、一般的な血球計数法や顕微鏡観察法などの方法により求め、縦軸に細胞密度 (cellsZmL)を横軸に時間を表すグラフを図 1に示した。

[0107] 細胞培養開始 24日目にスピンナーフラスコ内の培養液を除去し、 PBSによる洗浄を 2回行った後、日本脳炎ウィルス (JEV)を M.O.I=0. 01で接種し、 37°C恒温室で攪拌回転数 35rpmにて培養した。 JEV培養 2日目に 7. 5体積％炭酸水素ナトリウム溶液をスピンナーフラスコにそれぞれ 1. 5mL添カロし、 pHを 7. 2とした。

[0108] サンプリングは、 JEV培養 2〜8日目まで行、、細胞数につ!ヽてはクェン酸処理後の核数を測定した。 JEV増殖の指標は（1) HA (赤血球凝集反応、 Hemagglutination)価については定法に従い測定し、（2) ELISA (酵素抗体法、 Enzyme-linked

immunosorbent assay)については、抗 JEV抗血清をプロテイン Aカラムによる抗体精製を実施し、ウェスタンブロッテイング法により特異反応性を確認後、精製抗体のぺルォキシダーゼ標識を行い、サンドイッチ ELISAを構築した。なお、 ELISA値は参照日本脳炎ワクチン北京株 Lot. 197— Pより自家値を付し、不活性精製 JEV液を標準抗原として使用した。 ELISAによる JEV産生量の経時変化を表すグラフを図 2に示し、 HAによる JEV産生量の経時変化を表すグラフを図 3に示した。また、 ELISA及び HA の測定値の最高値を表 1に示した。

[0109] [表 1]

比較例 1

[0110] <血清培地とデキストランビーズ (アマシャム製、商品名 Cytodexl) )を用いた日本脳炎ウイノレスの生産 >

実施例 1に記載のサンプル 4の代わりに、サンプル 1 {血清培地（DMEM培地 + 5体積°/^83)と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ }を使用すること以外、実施例 1と同様にしてウィルスの生産を行った。

比較例 2

[0111] <無血清培地とデキストランビーズ (アマシャム製、商品名 Cytodexl) )を用いた日本脳炎ウィルスの生産 >

実施例 1に記載のサンプル 4の代わりに、サンプル 2 {動物由来成分を含有しな!ヽ無血清培地 (インビトロジェン社製、 VP-SFM)と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ }を使用すること以外、実施例 1と同様にしてウィルスの生産を行った。比較例 3

[0112] <無血清培地とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ (アマシャム製、商品名 Cytodex3) )を用いた日本脳炎ウィルスの生産 >

実施例 1に記載のサンプル 4の代わりに、サンプル 3 {動物由来成分を含有しな!ヽ無血清培地 (インビトロジェン社製、 VP-SFM)とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ }を使用すること以外、実施例 1と同様にしてウィルスの生産を行った

[0113] 比較例 1〜3について、実施例 1と同様にして、ウィルス接種時細胞数及び ELISA 及び HAの測定値の最高値を表 1に示し、細胞密度一時間グラフを図 1に、 ELISA Titer-日数グラフを図 2に、 HA Titer-日数グラフを図 3に示した。

[0114] 図 1及び表 1より、実施例 1 (サンプル 4)では、培養開始 8日目、 16日目及び 24日目の細胞密度が最高位であり、比較例 1 (サンプル 1)、比較例 2 (サンプル 2)及び比較例 3 (サンプル 3)に比べて、安定的に且つ効率よく増殖していることが判った。

[0115] また、図 2、図 3及び表 1より、実施例 1 (サンプル 4)は、 ELISA及び HAとも、比較例 1 (サンプル 1)、比較例 2 (サンプル 2)及び比較例 3 (サンプル 3)に比べて、高、数値を示しており、日本脳炎ウィルスが効率よく増殖していることが判った。

実施例 2

[0116] <無血清培地とプロネクチン F結合ナイロンビーズを用いたインフルエンザウイルスの生産 >

VP— SFM培地とプロネクチン F結合ナイロンビーズからなるサンプル 8をスピンナーフラスコ（テクネ社製、 F7689)に入れた。

[0117] 次に、細胞播種用 Vero細胞（S)が細胞密度 2 X 10⁵cellsZmLとなるように上記サンプル 8の入ったスピンナーフラスコに播種し、作動容量（M) lOOmLとした。その後、細胞，培地およびマイクロキャリアーの入った培養液を 35rpmで攪拌し、細胞をマイクロキャリアーに接着させた後、細胞を 24日間、 37°Cの恒温室にてマグネチックスタ一ラー（和研薬社製、 MODEL1104M)を用いて 35rpmの攪拌回転数により培養した。

[0118] 細胞継代は 8日毎に行、、細胞播種 3日目より毎日 50体積％の培地交換を行った。細胞継代時に用いた rProteaseを 37°C条件下で細胞分散を行い、遠心操作により上清を除去後、必要量を予め用意されたスピンナーフラスコに播種して、継代操作を行った。

[0119] 細胞洗浄操作は細胞培養開始 24日目にスピンナーフラスコの攪拌を止め、培養液を除去し、 PBSを 50mLカ卩え、 33°C恒温室にて 20分間攪拌した。続いて、同様の条件で細胞洗浄操作を VP-SFM培地にて行った。その後、 VP-SFM培地を除去し、新たに VP-SFM培地を容量 95mLになるようにスピンナーフラスコに加えた。このスピンナーフラスコに rProteaseを 5mL加え、 M.O.I = 0. 001になるようにインフルエンザウィルス (B/Johannesburg/5/99)を接種した。インフルエンザウイルス培養は 33°C恒温室にて、 35rpmの攪拌回転数で行い、スピンナーフラスコのキャップを緩めて培養を行った。なお、インフルエンザウイルスを接種後、培地の _PHは 7. 5体積％炭酸水素ナトリウム溶液にて pH7. 2〜pH7. 8に維持した (インフルエンザウイルス培養 18 時間後に、 7. 5体積％炭酸水素ナトリウム溶液を 0. 4mL、同様に 42時間後に 0. 6 mL加えた。 ) oサンプリングはインフルエンザウイルス培養 67時間後に行い、 -ヮトリ赤血球を用いた HA法をインフルエンザウイルス増殖の指標としたところ、 HAは 128 倍となった。

実施例 3

[0120] <無血清培地とプロネクチン F2結合ナイロンビーズを用いたインフルエンザウイルスの生産 >

実施例 2に記載のプロネクチン F結合ナイロンビーズの代わりに、プロネクチン F2結合ナイロンビーズ {プロネクチン F2結合量： 0. 3 μ

プロネクチン Fの代わりにプロネクチン F2を使う以外はプロネクチン F結合ナイロンビーズと同様にして製造した。）}を使用すること以外、実施例 2と同様にしてウィルスの生産を行った。実施例 2 と同様にして得た HAは 128倍であった。

実施例 4 [0121] <無血清培地とプロネクチン F3結合ナイロンビーズを用いたインフルエンザウイルスの生産 >

実施例 2に記載のプロネクチン F結合ナイロンビーズの代わりに、プロネクチン F3結合ナイロンビーズ {プロネクチン F3結合量： 0. 2 μ

プロネクチン Fの代わりにプロネクチン F3を使う以外はプロネクチン F結合ナイロンビーズと同様にして製造した。）}を使用すること以外、実施例 2と同様にしてウィルスの生産を行った。実施例 2 と同様にして得た HAは 128倍であった。

比較例 4

[0122] く血清培地とデキストランビーズ (アマシャム製、商品名 Cytodexl) )を用いたインフルェンザウィルスの生産 >

実施例 2に記載のサンプル 8の代わりに、サンプル 5 {血清培地（DMEM培地 + 5体積°/^83)と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ }を使用すること以外、実施例 2と同様にしてウィルスの生産を行った。実施例 2と同様にして得た HAは 32倍であった。

比較例 5

[0123] く無血清培地とデキストランビーズ (アマシャム製、商品名 Cytodexl) )を用いたインフルェンザウィルスの生産 >

実施例 2に記載のサンプル 8の代わりに、サンプル 6 {動物由来成分を含有しない無血清培地 (インビトロジェン社製、 VP- SFM)と動物由来成分を含有しないデキストランビーズ }を使用すること以外、実施例 2と同様にしてウィルスの生産を行った。実施例 2と同様にして得た HAは 4倍であつた。

比較例 6

[0124] <無血清培地とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ (アマシャム製、商品名 Cytodex3) )を用いたインフルエンザウイルスの生産 >

実施例 2に記載のサンプル 8の代わりに、サンプル 7 {動物由来成分を含有しない無血清培地 (インビトロジェン社製、 VP- SFM)とブタ変性コラーゲンが被覆されたデキストランビーズ }を使用すること以外、実施例 2と同様にしてウィルスの生産を行った。実施例 2と同様にして得た HAは 4倍であった。実施例 2、実施例 3及び実施例 4では、比較例 4、比較例 5及び比較例 6と比較して、 HAの値が極めて高ぐインフルエンザウイルスが極めて効率よく増殖していることが判った。

Claims

請求の範囲

[1] 細胞接着性最小アミノ酸配列 (X)を 1分子中に少なくとも 1個有するポリペプチド (P

)を有しかつ動物由来成分を含有しない支持体に、接着性細胞を接着させ、この接着性細胞を動物由来成分を含有しな!ヽ培地で培養し、培養した接着性細胞を動物由来成分を含有しない細胞分散剤を用いて継代培養した後、接着性細胞の培養細胞にウィルスを接種して増殖させることを特徴とするウィルスの生産方法。

[2] 前記ウィルス力フラビウィルス科、オルソミクソウィルス科、アデノウイルス科、ヘルぺスウィルス科、ピコルナウィルス科、パラミクソウィルス科、トガウィルス科及びボックスウィルス科力なる群より選ばれる少なくとも 1種に属するウィルスである請求項 1記載の生産方法。

[3] 前記支持体が、マイクロキャリアーである請求項 1又は 2記載の生産方法。

[4] 請求項 1〜3のいずれかに記載のウィルスの生産方法を用いて製造され得るワクチン。