JP2003304868A

JP2003304868A - ポリペプチド含有基材

Info

Publication number: JP2003304868A
Application number: JP2002114241A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Osumi; 辰也大隅
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2003-10-28

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞の接着性及び増殖性が高く、特に無血清
培地でも効率的に培養できる基材を提供すること。【解決手段】細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配
列を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド
（Ｐ）を含んでなり、かつ２級アミノ基（Ａ１）、３級
アミノ基（Ａ２）、アンモニオ基（Ａ３）、ホスファチ
ジル基（Ａ４）及びリゾホスファチジル基（Ａ５）から
なる群より選ばれる少なくとも１つの官能基（Ａ）、並
びに／又は糖（Ｂ１）及びステロイド環（Ｂ２）から選
ばれる少なくとも１つの構造（Ｂ）を有してなることを
特徴とするポリペプチド含有基材を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリペプチド含有
基材に関する。さらに詳しくは、細胞の接着・増殖性が
高く、特に、無血清培地を用いても、血清含有培地と同
等以上の接着・増殖性を与える動物細胞培養用のポリペ
プチド含有基材に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】Arg Gly Asp配列を有する遺伝子組換え
ペプチドであるプロネクチンＦ（以下、ＰｎＦと略す
る。）やポリ−Ｌ−リジンをコートした樹脂微粒子に対
する細胞接着性を、０．５％の血清を含有した培地を使
用して研究発表されている｛バラニ（J.Varani），イン
マン（D.R.Inman），フリギール（S.E.G.Fligiel），ヒ
リガス（W.J.Hillegas）、サイトテクノロジー（Cytote
chnology）13,1993年、89-98頁）｝。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】この研究発表におい
て、ＰｎＦを０.００５μｇ／ｃｍ²あるいは０．０２５
μｇ／ｃｍ²コートした場合、コートしない場合のそれ
ぞれ３倍又は５倍の細胞接着性を示すが、接着・増殖性
がさらに高いものが強く要望されている。一方、同研究
発表で、ポリ−Ｌ−リジンを０.５μｇ／ｃｍ²コートし
た場合に、コートしない場合の約４１倍の細胞接着性を
示すが、この場合、細胞の伸展が遅いという問題があ
る。すなわち、本発明の目的は、動物細胞の接着性及び
増殖性が高く、特に無血清培地でも動物細胞の接着性及
び増殖性が高く、細胞を効率的に培養できる動物細胞培
養用基材を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究を
重ね、特定のポリペプチドと特定の官能基及び／又は特
定の構造をその表面に配した基材を用いることにより、
初期の細胞付着性が高まり、かつ、増殖性が高くなるこ
とを見いだし本発明に到達した。すなわち、本発明のポ
リペプチド含有基材の特徴は、細胞接着シグナルを現す
最小アミノ酸配列を１分子中に少なくとも１個有するポ
リペプチド（Ｐ）を含んでなり、かつ２級アミノ基（Ａ
１）、３級アミノ基（Ａ２）、アンモニオ基（Ａ３）、
ホスファチジル基（Ａ４）及びリゾホスファチジル基
（Ａ５）からなる群より選ばれる少なくとも１つの官能
基（Ａ）、並びに／又は糖（Ｂ１）及びステロイド環
（Ｂ２）から選ばれる少なくとも１つの構造（Ｂ）を有
してなる点を要旨とする。

【０００５】

【発明の実施の形態】細胞接着シグナルを現わす最小ア
ミノ酸配列としては、接着シグナルとして働くものであ
ればいずれも使用でき、例えば、株式会社永井出版発行
「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０）５２７
頁に記載されているもの等が使用できる。

【０００６】これらのうち、接着する細胞の種類が多い
という点で、Arg Gly Asp配列、LeuAsp Val配列、Arg G
lu Asp Val配列（１）、Tyr Ile Gly Ser Arg配列
（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Arg Tyr Val
Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr Ile Pro Gl
y配列（５）、Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp I
le配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列（７）、Leu A
rg Glu配列、Asp Gly GluAla配列（８）及びHis Ala Va
l配列が好ましく、さらに好ましくはArg Gly Asp配列、
Ile Lys Val Ala Val配列（７）及びHis Ala Val配列で
ある。これらの配列は１種又は２種以上を組み合わせて
使用することができる。なお、アミノ酸配列はアミノ酸
３文字表記で現わし、（）内にアミノ酸配列表に対応
する配列番号を付記した。

【０００７】ポリペプチド（Ｐ）中には前記最小アミノ
酸配列が１分子中に少なくとも１個含有される必要があ
る。前記最小アミノ酸配列を含有すると、細胞接着活性
が高まり、本来の機能を維持した状態で動物細胞の増殖
をさらに促進することが可能となる。一方、前記最小ア
ミノ酸配列が含有されない場合、細胞接着性が低下す
る。この結果、特に無血清培地を用いる場合に細胞の増
殖が不十分になる。

【０００８】この最小アミノ酸配列の（Ｐ）１分子中の
含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、１分子中３〜
５０個が好ましく、さらに好ましくは５〜４０個、特に
好ましくは１０〜３０個である。含有量がこの範囲であ
ると、細胞接着活性がさらに高まり、本来の機能を維持
した状態で動物細胞の増殖を促進することが容易となり
やすい傾向にある。

【０００９】ポリペプチド（Ｐ）の数平均分子量（以
下、Ｍｎと略する）は、細胞に対する毒性が低く、接着
性能が高いという点で、５，０００以上が好ましく、さ
らに好ましくは１０，０００以上、特に好ましくは５
０，０００以上である。また５，０００，０００以下が
好ましく、さらに好ましくは１，０００，０００以下、
特に好ましくは５００，０００以下である。なお、ポリ
ペプチド（Ｐ）の（Ｍｎ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（Ｎ
ａドデシルスルフェイト−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法）で、（Ｐ）を水中で展開し、泳動距離を標準物
質と比較することによって求められる。

【００１０】ポリペプチド（Ｐ）は、細胞接着シグナル
を現わす最小アミノ酸配列以外に、（Ｐ）の熱安定性が
高まるアミノ酸配列、例えばシルクフィブロイン由来の
GlyAla Gly Ala Gly Ser配列（９）を少なくとも２個、
分子中に有することが好ましく、このアミノ酸配列を５
個以上有することがさらに好ましく、３〜３０個有する
ことが特に好ましい。

【００１１】ポリペプチド（Ｐ）としては、例えば、
（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１０）とArg Gly
Asp配列とを有するポリペプチド、（Gly Ala Gly Ala G
ly Ser）₉配列（１０）とTyr Ile Gly Ser Arg配列
（２）とを有するポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly P
ro Pro)₄）₂配列（１１）とArg Gly Asp配列とを有する
ポリペプチド、（Gly Ala Pro (Gly Pro Pro)₄）₂配列
（１１）とTyr Ile Gly Ser Arg配列（２）とを有する
ポリペプチド、及び（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列
（１０）とIle Lys Val Ala Val配列（７）とを有する
ポリペプチド（特表平３−５０２９３５号公報）等が挙
げられる。

【００１２】ポリペプチド（Ｐ）として市場から入手で
きるものとしては、例えば、三洋化成工業（株）製プロ
ネクチンＦ（遺伝子組替大腸菌により製造され、１分子
中にArg Gly Asp配列と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉
配列（１０）とを各々約１３個有する（Ｍｎ）約１１万
のポリペプチド）、同プロネクチンＦプラス（プロネク
チンＦをジメルアミノエチルクロライドと反応させて水
溶性にしたもの）、同プロネクチンＬ（遺伝子組替大腸
菌により製造され、１分子中にIle Lys Val Ala Val配
列（７）と（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配列（１０）
とを各々約７個有する（Ｍｎ）約９万のポリペプチド）
等が挙げられる。

【００１３】また、宝酒造（株）製ＲｅｔｒｏＮｅｃｔ
ｉｎ（リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ−２９
６）｛ヒトフィブロネクチン細胞接着シグナルであるＣ
Ｓ１シグナルと細胞接着ドメインＴｙｐｅＩＩＩ及びヘ
パリン結合ドメインＩＩを１つずつ有する（Ｍｎ）約6
万のポリペプチド｝、同ＲＧＤＳ−ＰｒｏｔｅｉｎＡ
｛Arg Gly Asp配列をＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＩｇＧ結合ド
メイン）に挿入した（Ｍｎ）約３万のポリペプチド｝も
ポリペプチド（Ｐ）として使用可能である。

【００１４】ポリペプチド（Ｐ）の製造方法は特に制限
されず、ペプチドを合成する従来既知の方法と同様にし
て製造することができ、例えば、有機合成法（固相合成
法、液相合成法等）及び生化学的合成法［遺伝子組換微
生物（酵母、細菌、大腸菌等）］等によって合成するこ
とができる。

【００１５】有機合成法に関しては、例えば、日本生化
学学会編「続生化学実験講座２、タンパク質の化学
（下）」第６４１〜６９４頁（昭和６２年５月２０日；
株式会社東京化学同人発行）に記載されている方法等が
用いられる。

【００１６】生化学的合成法に関しては、例えば、特表
平３−５０２９３５号公報に記載されている方法等が用
いられる。高分子量のポリペプチド（Ｐ）を容易に合成
できる点で、遺伝子組換微生物による生化学的合成法が
好ましく、特に好ましくは遺伝子組換大腸菌を用いて合
成する方法である。

【００１７】ポリペプチド（Ｐ）は、その全て又は一部
が基材表面に存在していることが好ましく、さらに好ま
しくは（Ｐ）の全てが基材表面に存在していることであ
る。なお、基材表面とは、基材が容器状の場合、容器内
に培養液を入れた場合に培養液が接し得る面を意味し、
基材が粒子状の場合、基材を培養液中に入れた場合に培
養液が接触し得る面を意味する。

【００１８】基材表面のポリペプチド（Ｐ）の量（μｇ
／ｃｍ²）としては、細胞の接着・増殖性の観点から、
基材の表面積１ｃｍ²当り０．1以上が好ましく、さらに
好ましくは０．２以上、特に好ましくは０．３以上であ
る。また経済性の観点から、１００以下が好ましく、さ
らに好ましくは５０以下、特に好ましくは１０以下であ
る。なお、基材表面のポリペプチド（Ｐ）の量は、通常
のタンパク量測定試薬（例えば、ピアスケミカル社製Ｂ
ＣＡ蛋白試薬等）で測定することができる。また、基材
の表面積は、基材が容器状の場合は、この基材表面の形
状から算出でき、基材が球状粒子の場合は、その平均粒
子径及び密度から計算でき［粒子径；２ｒ（μｍ）、密
度；ｄ（ｇ／ｃｍ³）のとき、表面積（ｃｍ²／ｇ）は、
4πｒ²／（4/3πｒ³・ｄ）＝3/（ｒｄ）］、多孔質の粒
子状の場合、ＢＥＴ値比表面積計（例えば、商品名：Ｑ
ＵＡＮＴＡＳＯＲＢ、ユアサアイオニクス社製、測定ガ
ス：Ｈｅ／Ｋｒ＝９９．９／０．１体積％、検量ガス：
窒素）で定量できる。

【００１９】２級アミノ基（Ａ１）としては、脂肪族ア
ミノ基、芳香族アミノ基、−ＮＨＣＨ₂−で表される基
及び−Ｃ（＝ＮＨ）−で表される基等が使用できる。こ
れらの炭素数は１〜１６が好ましく、さらに好ましくは
１〜１２、特に好ましくは１〜６である。

【００２０】脂肪族アミノ基としては、メチルアミノ
基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、ブチルアミノ
基、シクロヘキシルアミノ基、２−エチルヘキシルアミ
ノ基、ドデシルアミノ基、ヘキサデシルアミノ基、ベン
ジルアミノ基及び２−フェニルエチルアミノ基等が挙げ
られる。

【００２１】芳香族アミノ基としては、フェニルアミノ
基（アニリノ基）、４−メチルフェニルアミノ基（４−
メチルアニリノ基）及びナフチルアミノ基等が挙げられ
る。これらのうち、脂肪族アミノ基、−ＮＨＣＨ₂−で
表される基及び−Ｃ（＝ＮＨ）−で表される基が好まし
く、さらに好ましくはメチルアミノ基、エチルアミノ
基、プロピルアミノ基、−ＮＨＣＨ₂−で表される基及
び−Ｃ（＝ＮＨ）−で表される基、特に好ましくは−Ｎ
ＨＣＨ₂−で表される基及び−Ｃ（＝ＮＨ）−で表され
る基である。

【００２２】３級アミノ基（Ａ２）としては、脂肪族ア
ミノ基、芳香族アミノ基、−Ｎ（ＣＨ₂−ＯＨ）ＣＨ₂−
又は−Ｎ（ＣＨ₃）ＣＨ₂−で表される基等が使用でき
る。これらの炭素数は２〜３２が好ましく、さらに好ま
しくは２〜２４、特に好ましくは２〜１２である。

【００２３】脂肪族アミノ基としては、ジメチルアミノ
基、ジエチルアミノ基、メチルプロピルアミノ基、ジイ
ソプロピルアミノ基、ジブチルアミノ基、ジシクロヘキ
シルアミノ基、ジドデシルアミノ基、ジヘキサデシルア
ミノ基及びジベンジルアミノ基等が挙げられる。

【００２４】芳香族アミノ基としては、ジフェニルアミ
ノ基及びジナフチルアミノ基等が挙げられる。これら
のうち、脂肪族アミノ基、−Ｎ（ＣＨ₂−ＯＨ）ＣＨ₂−
又は−Ｎ（ＣＨ₃）ＣＨ₂−で表される基が好ましく、さ
らに好ましくは、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ
基、ジプロピルアミノ基及び−Ｎ（ＣＨ₂−ＯＨ）ＣＨ₂
−又は−Ｎ（ＣＨ₃）ＣＨ₂−で表される基、特に好まし
くはジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基及び−Ｎ（Ｃ
Ｈ₂−ＯＨ）ＣＨ₂−又は−Ｎ（ＣＨ₃）ＣＨ₂−で表され
る基である。

【００２５】アンモニオ基（Ａ３）としては、脂肪族ア
ンモニオ基、芳香族アンモニオ基、＞Ｃ＝Ｎ⁺＝Ｃ＜で
表される基及び−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）₂ＣＨ₂−で表される
基等が使用できる。これらの炭素数は１〜４８が好まし
く、さらに好ましくは２〜３６、特に好ましくは２〜１
８である。

【００２６】脂肪族アンモニオ基としては、メチルアン
モニオ基、エチルアンモニオ基、プロピルアンモニオ
基、ブチルアンモニオ基、シクロヘキシルアンモニオ
基、２−エチルヘキシルアンモニオ基、ドデシルアンモ
ニオ基、ヘキサデシルアンモニオ基、ベンジルアンモニ
オ基、２−フェニルエチルアンモニオ基、ジメチルアン
モニオ基、ジエチルアンモニオ基、メチルプロピルアン
モニオ基、ジイソプロピルアンモニオ基、ジブチルアン
モニオ基、ジシクロヘキシルアンモニオ基、ジドデシル
アンモニオ基、ジヘキサデシルアンモニオ基、ジベンジ
ルアンモニオ基、トリメチルアンモニオ基、トリエチル
アンモニオ基、メチルジエチルアンモニオ基、メチルジ
イソプロピルアンモニオ基、メチルジブチルアンモニオ
基、メチルジシクロヘキシルアンモニオ基、メチルジド
デシルアンモニオ基、トリヘキサデシルアンモニオ基及
びトリベンジルアンモニオ基等が挙げられる。

【００２７】芳香族アンモニオ基としては、ベンジルア
ンモニオ基、メチルフェニルアンモニオ基、メチルナフ
チルアンモニオ基、メチルジフェニルアミノ基、メチル
ジナフチルアミノ基及びトリベンジルアンモニオ基等が
挙げられる。

【００２８】これらのうち、脂肪族アンモニオ基、＞Ｃ
＝Ｎ⁺＝Ｃ＜で表される基及び−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）₂ＣＨ
₂−で表される基が好ましく、さらに好ましくは、メチ
ルアンモニオ基、エチルアンモニオ基、プロピルアンモ
ニオ基、ブチルアンモニオ基、トリメチルアンモニオ
基、トリエチルアンモニオ基、メチルジエチルアンモニ
オ基、メチルジイソプロピルアンモニオ基、メチルジブ
チルアンモニオ基、＞Ｃ＝Ｎ⁺＝Ｃ＜で表される基及び
−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）₂ＣＨ₂−で表される基、特に好まし
くは、メチルアンモニオ基、エチルアンモニオ基、トリ
メチルアンモニオ基、トリエチルアンモニオ基、メチル
ジエチルアンモニオ基、＞Ｃ＝Ｎ⁺＝Ｃ＜で表される基
及び−ＣＨ₂Ｎ（ＣＨ₃）₂ＣＨ₂−で表される基である。

【００２９】ホスファチジル基（Ａ４）としては、ＨＯ
ＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ^-）−で表さ
れる基（無置換ホスファチジル基）又はＲ¹ＯＣＨ₂ＣＨ
（ＯＲ²）ＣＨ₂ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ^-）−で表される基
（置換ホスファチジル基、Ｒ¹及びＲ²は、同じ又は異な
る飽和又は不飽和のアシル基、アルキル基又はアルケニ
ル基である）等が使用できる。アシル基、アルキル基又
はアルケニル基の炭素数は１〜２２が好ましく、さらに
好ましくは２〜１８、特に好ましくは１２〜１８であ
る。

【００３０】アシル基としては、飽和アシル基（アセチ
ル基、ブタノイル基、ヘキサノイル基、デカノイル基、
ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステ
アロイル基及びアラキドノイル基等）、及び不飽和アシ
ル基（リノレオイル基、オクタデシエノイル基及びオレ
オイル基等）等が挙げられる。

【００３１】アルキル基としては、メチル基、ヘキサデ
シル基、ブチル基、ヘキキル基、デシル基、ラウリル
基、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基及びア
ラキドイル基等が挙げられる。

【００３２】アルケニル基としては、リノレイル基、オ
クタデシルジエニル基及びオレオイル基等が挙げられ
る。これらのうち、無置換ホスファチジル基及び置換ホ
スファチジル基（Ｒ¹及びＲ²はアシル基である）が好ま
しく、さらに好ましくは無置換ホスファチジル基及び置
換ホスファチジル基（Ｒ¹及びＲ²は不飽和アシル基であ
る）、特に好ましくは置換ホスファチジル基（Ｒ¹及び
Ｒ²は同じ不飽和アシル基である）ホスファチジル基で
ある。

【００３３】リゾホスファチジル基（Ａ５）としては、
Ｒ³ＯＣＨ₂ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ₂ＯＰ（＝Ｏ）（Ｏ^-）−で
表される基（Ｒ³は、飽和又は不飽和のアシル基）等が
使用できる。アシル基の炭素数は１〜２２が好ましく、
さらに好ましくは２〜１８、特に好ましくは１２〜１８
である。

【００３４】アシル基としては、ホスファチジル基（Ａ
４）の場合と同じものが使用できる。これらのうち、Ｒ
³が不飽和アシル基である置換リゾホスファチジル基が
好ましい。

【００３５】糖（Ｂ１）としては、次の化学式（化１）
で表される基を１個以上有する構造等が使用でき、例え
ば、天然又は合成の糖が含有する構造等が用いられる。

【００３６】

【化１】

【００３７】（Ｒ⁴は、−Ｈ、−ＣＯＯ^-、−ＣＨ₂Ｏ
Ｈ、−ＣＨ₂ＯＣＯＣＨ₃、−ＣＨ₂ＯＳＯ ₃ ^-又は−ＣＨ₃
のいずれかを表し、Ｒ⁵は、−Ｈ、−ＣＯＣＨ₃、−ＣＨ
₃又は−ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＯＯ^-のいずれかを表し、Ｒ
⁶は、−ＯＨ、−ＯＣＯＣＨ₃、−ＮＨ ₂、−ＮＨＣＯＣ
Ｈ₃、−ＮＨＣＯＣＨ₂ＯＨ又は−Ｆのいずれかを表
す。）

【００３８】天然又は合成の糖としては、単糖類（ガラ
クトース、グルコース、マンノース、フコース、グルコ
サミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン、Ｎ−メチルグルコサミン、Ｎ−アセチルニューラミ
ン酸、アラビノース、デオキシグルコース、デオキシフ
ルオログルコース、リボース、デオキシリボース、エリ
スロース、フルクトース、イノシトール、リクソース、
マドゥロース、ムラミン酸、デオキシマンオース、ソル
ボース、キシロース及びトリアセチルグルカール等）、
多糖類（セロビオース、ジフルクトース、コジビオー
ス、ラクトース、ラクツロース、マルチトール、マルト
ース、トレハロース、ガラクトシラクトース、グルコシ
ルスクロース、イソマルトオリゴサッカライド、マルト
オリゴサッカライド、テハロサミン、パノース、キシロ
オリゴサッカロースフフルクトオリゴサッカライド、ニ
ストース、スタキロース、キトオリゴ糖、キトサンオリ
ゴ糖、ムコ多糖、アルギニン酸、カードラン、デキスト
ラン、レバン、パラミオール、ポリデキストロース、プ
ルラン、スターチ及びシクロデキストリン等）等が挙げ
られる。

【００３９】これらのうち、ガラクトース、グルコー
ス、マンノース、フコース、グルコサミン、ガラクトサ
ミン、Ｎ−メチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクト
サミン及びＮ−アセチルニューラミン酸が好ましく、さ
らに好ましくはガラクトース、グルコース、マンノー
ス、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びＮ−ア
セチルニューラミン酸である。

【００４０】ステロイド環（Ｂ２）としては、次の化学
式（化２）で表される環構造等が使用でき、例えば、天
然又は合成の胆汁酸又はステロールに含まれるステロイ
ド環等が用いられる。

【００４１】

【化２】

【００４２】天然又は合成の胆汁酸としては、ケノジオ
ール、コール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、
グリコリトコール酸、リソコール酸、スクアレン及びタ
ウロコール酸等が挙げられる。

【００４３】天然又は合成のステロールとしては、ブラ
シカステロール、カンペステロール、コレステロール、
エルゴステロール、フコステロール、ラノステロール、
シトステロール及びスチグマステロール等が挙げられ
る。これらのうち、胆汁酸に含まれるステロイド環が好
ましく、さらに好ましくはコール酸、デオキシコール
酸、グリココール酸、グリコリトコール酸又はリソコー
ル酸に含まれるステロイド環である。

【００４４】官能基（Ａ）及び構造（Ｂ）は、その全て
又は一部が基材表面に存在していることが好ましく、全
てが基材表面に存在していることがさらに好ましい。基
材表面の官能基（Ａ）及び構造（Ｂ）の含有量（個／ｃ
ｍ²）は、細胞の初期付着性向上効果又は増殖性向上効
果の観点から、基材の表面積１ｃｍ²当り、１×１０¹³
〜1×１０²⁰が好ましく、さらに好ましくは１×１０¹⁵
〜１×１０¹⁹、特に好ましくは１×１０¹⁵〜１×１０¹⁷
である。

【００４５】基材表面の官能基（Ａ）及び構造（Ｂ）の
含有量は、官能基（Ａ）及び構造（Ｂ）の種類によって
以下の方法により定量される。２級アミノ基（Ａ１）、
３級アミノ基（Ａ２）及びアンモニオ基（Ａ３）の場
合、通常のアミン価測定試薬（例えば、塩酸水溶液又は
硝酸銀水溶液等）を用いて、電位差滴定によりアミン価
を測定することにより求めることができる。

【００４６】ホスファチジル基（Ａ４）、リゾホスファ
チジル基（Ａ５）、糖（Ｂ１）及びステロイド環（Ｂ
２）の場合、酵素定量法により求めることができる。す
なわち、ホスファチジル基（Ａ４）及びリゾホスファチ
ジル基（Ａ５）の場合、例えば、カイノス社製リン脂質
測定キット「アクアオートカイノスＰＬ試薬」等を
用いることにより求めることができる。また、糖（Ｂ
１）の場合、ロッシュダイアグノスティックス社製「Ｆ
−キット糖質用」を用いることにより求めることがで
きる。また、ステロイド環（Ｂ２）の場合、例えば、ロ
ッシュダイアグノスティックス社製「Ｆ−キットステ
ロイド用」等を用いることにより求めることができる。

【００４７】本発明のポリペプチド含有基材の製造に用
いられる基材としては、細胞培養用基材として通常使用
されるもの等が使用でき、例えば、シャーレ、プレー
ト、フラスコ、ローラーボトル、マイクロキャリアビー
ズ及びホローファイバー等が挙げられる。これらの基材
の素材としては、無機物（ガラス、セラミックス及びヒ
ドロキシアパタイト等）、及び有機物｛合成高分子［ビ
ニル樹脂（ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、
ポリビニルホルマール、ポリメチルメンテン、ポリビニ
ルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレン及び
ポリプロピレ等）、ポリエステル、ポリカーボネート、
ウレタン樹脂及びエポキシ樹脂］及び天然高分子（ポリ
デキスラン、セルロース、コラーゲン及びゼラチン
等）｝等が挙げられる。

【００４８】シャーレとしては、基材の表面積（培養面
積）が５〜５００ｃｍ²／個のものが挙げられる。プレ
ートとしては、２〜３８４穴／プレートのものが挙げら
れる。フラスコとしいては、基材の表面積（培養面積）
が１０〜５００ｃｍ²／個のＴ−フラスコ及びスピナー
フラスコ等が挙げられる。ローラーボトルとしては、容
量が０．１〜１０L／個のもの等が挙げられる。マイク
ロキャリアビーズとしては、粒子径；２０〜５００μ
ｍ、密度；１．０〜１．１ｇ／ｃｍ³、基材の表面積
（培養面積）；１００〜１００，０００ｃｍ²／ｇのも
のが挙げられる。ホローファイバーとしては、内径が１
０〜５００μｍのもの等が挙げられる。

【００４９】これらの基材のうち、効率的に高密度の細
胞が得られるという点で、マイクロキャリアビーズが好
ましい。粒子径（μｍ）としては、単位重量当りの表面
積が大きく、また、細胞が接着し易いという点で、３０
以上が好ましく、さらに好ましくは４０以上、特に好ま
しくは５０以上である。また３００以下が好ましく、さ
らに好ましくは２００以下、特に好ましくは１００以下
である。また、密度（ｇ／ｃｍ³）としては、緩やかな
撹拌で浮遊し、また、撹拌を停止すると速やかに沈降し
やすいという点で、１．０以上が好ましく、さらに好ま
しくは１．０１以上、特に好ましくは１．０２以上であ
る。また１．１以下が好ましく、さらに好ましくは１．
０５以下、特に好ましくは１．０４以下である。

【００５０】また、細胞との親和性が高く、耐熱性に優
れるという点で、スチレン及び多官能性モノマー［ジビ
ニルベンゼン、エチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート、トリビニルベンゼン及びトリメチロールプロパン
トリ（メタ）アクリレート等］を必須構成単量体として
なる合成高分子を含有するものが好ましい。この場合の
多官能モノマーの含有量（重量％）は、基材の重量に基
づいて、０．１以上が好ましく、さらに好ましくは０．
５以上、特に好ましくは１以上である。また４０以下が
好ましく、さらに好ましくは２０以下、特に好ましくは
１０以下である。

【００５１】本発明のポリペプチド含有基材は、官能基
（Ａ）及び／又は構造（Ｂ）を有する基材にポリペプチ
ド（Ｐ）を配することにより（例えばコーティングによ
り）、基材に（Ｐ）を配した後官能基（Ａ）及び／又は
構造（Ｂ）を有する化合物を配することにより（例えば
コーティングにより）、又は、基材に官能基（Ａ）及び
／又は構造（Ｂ）を有する化合物と（Ｐ）を同時に配す
ることにより製造することができる。

【００５２】ポリペプチド（Ｐ）を基材（の表面）に配
する方法としては、例えば、ポリペプチド（Ｐ）を溶媒
に溶かした溶液又は分散させた分散液を予め作製し、こ
れと基材を接触させた後、乾燥する方法等が適用でき
る。

【００５３】ポリペプチド（Ｐ）の溶液又は分散液を作
製するために用いられる溶媒としては特に制限はない
が、無機塩、有機酸塩、アミノ酸、ビタミン、アルコー
ル、脂質・糖、酸及び／又は塩基を含有する水溶液及び
水等が使用できる。

【００５４】無機塩としては、ハロゲン化金属塩、硫酸
金属塩、リン酸金属塩、硝酸金属塩、炭酸金属塩及び過
ハロゲン酸金属等が使用でき、例えば、塩化ナトリウ
ム、塩化カルシウム、塩化カリウム、塩化リチウム、臭
化ナトリウム、臭化リチウム、硫酸ナトリウム、硫酸マ
グネシウム、硫酸銅、硫酸鉄、リン酸ナトリウム、リン
酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素カリウ
ム、硝酸鉄、炭酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム及び
過塩素酸リチウム等が挙げられる。有機酸塩としては、
炭素数１〜４の有機酸金属塩等が使用でき、例えば、蟻
酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸リチウム及び酒石
酸ナトリウム等が挙げられる。

【００５５】アミノ酸としては、天然アミノ酸等が使用
でき、例えば、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオ
ニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、
アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリ
ン、セリン及びグリシン等が挙げられる。ビタミンとし
ては、例えば、コリン、イノシトール、ニコチンアミ
ド、グルタミン、ビタミンＡ及びビタミンＢ₁₂等が挙げ
られる。アルコールとしては、炭素数１〜４のアルコー
ル等が使用でき、例えば、メタノール、エタノール、イ
ソプロピルアルコール及びブタノール等が挙げられる。

【００５６】脂質・糖としては、天然糖等が使用でき、
例えば、脂質、単糖、２糖、オリゴ糖、アミノ糖及び酸
性糖等が挙げられる。酸としては、無機酸及び炭素数１
〜６の有機酸等が使用でき、例えば、塩酸、硝酸、硫
酸、燐酸、酢酸、蟻酸、酒石酸、リンゴ酸、メタンスル
ホン酸、フェノール及びカテコール等が挙げられる。塩
基としては、無機塩基及び炭素数２〜６の有機塩基等が
使用でき、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸水素ナトリウム、アンモニア、モノエタノール
アミン、トリエタノールアミン及びトリエチルアミン等
が挙げられる。

【００５７】水としては、蒸留水、イオン交換水、水道
水及びイオン交換蒸留水等が挙げられる。これらの溶媒
の中で、無機塩、酸及び／又は塩基を含有する水溶液並
びに水が好ましく、さらに好ましくは無機塩を含有する
水溶液及び水、特に好ましくは無機塩を含有する水溶液
である。なお、これらの含有量（重量％）としては、水
溶液又は分散液の重量に基づいて、０．１以上が好まし
く、さらに好ましくは１以上である。また５０以下が好
ましく、さらに好ましくは３０以下である。

【００５８】ポリペプチド（Ｐ）の溶液又は分散液中の
（Ｐ）の濃度は、溶媒１ｍｌ当り、０．０１μｇ以上が
好ましく、さらに好ましくは０．１μｇ以上、特に好ま
しくは１μｇ以上である。また１００ｍｇ以下が好まし
く、さらに好ましくは１０ｍｇ以下、特に好ましくは１
ｍｇ以下である。ペプチド（Ｐ）の溶液又は分散液と基
材との接触は、溶液又は分散液を基材に振りかける方
法、溶液又は分散液に基材を浸漬する方法等のいずれで
もよい。

【００５９】接触時間としては、用いる基材によっても
異なるが、３０秒以上が好ましく、さらに好ましくは１
分以上、特に好ましくは３分以上である。また４８時間
以下が好ましく、さらに好ましくは２４時間以下、特に
好ましくは１２時間以下である。必要に応じて行われる
乾燥の条件についても特に制限はなく、通常の方法が適
用でき、例えば、必要に応じて順風乾燥機や減圧乾燥機
などを用いて、０〜２００℃、０．００１Ｐa〜大気圧
の圧力下で、１〜１００時間乾燥することで行える。

【００６０】また、必要に応じて行われる乾燥の前又は
後で、無機塩を含有する水溶液又は水で通常の方法で洗
浄することもできる。また、接触の後で、必要に応じて
滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限は無く、
例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オ
ートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。

【００６１】官能基（Ａ）及び／又は構造（Ｂ）を基材
に配する方法としては、ビニル樹脂を主成分とする基
材の場合、（Ａ）及び/又は（Ｂ）を有するモノマー
を、ビニル樹脂を主成分とする基材を作成する時に共重
合する方法、（Ａ）及び／又は（Ｂ）を有する反応性
化合物を基材に共有結合させる方法、（Ａ）及び/又
は（Ｂ）を有する化合物を基材の表面に接触させる方
法、（Ａ）及び/又は（Ｂ）を有する化合物を基材を
作製する時に基材を構成する材料に混合する方法等が挙
げられる。

【００６２】なお、（Ａ）及び／又は（Ｂ）は、基材表
面又はポリペプチド（Ｐ）等に化学結合していても、
（Ａ）及び／又は（Ｂ）を有する化合物として基材表面
又は（Ｐ）等に物理吸着しててもよい。糖が化学結合す
る場合、糖の１,３,４位のいずれかで化学結合させるこ
と、ステロイドが化学結合する場合、ステロイドの３,
７,１４位のいずれかで結合させることができる。

【００６３】の方法において、官能基（Ａ）及び／又
は構造（Ｂ）を有するモノマーとしては、２級アミノ基
（Ａ１）を有するモノマー（ｍａ１）、３級アミノ基
（Ａ２）を有するモノマー（ｍａ２）、アンモニオ基
（Ａ３）を有するモノマー（ｍａ３）、ホスファチジル
基（Ａ４）を有するモノマー（ｍａ４）、リゾホスファ
チジル基（Ａ５）を有するモノマー（ｍａ５）、糖（Ｂ
１）を有するモノマー（ｍｂ１）、ステロイド環（Ｂ
２）を有するモノマー（ｍｂ２）及びこれらの２種以上
の混合物等が使用できる。

【００６４】２級アミノ基（Ａ１）を有するモノマー
（ｍａ１）としては、２級アミノ基含有（メタ）アクリ
レート［Ｎ−メチルアミノエチル（メタ）アクリレー
ト、Ｎ−エチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、
Ｎ−プロピルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−
ベンジルアミノエチル（メタ）アクリレート及びピペリ
ジノエチル（メタ）アクリレート等］、２級アミノ基含
有（メタ）アクリルアミド［Ｎ−メチルアミノエチル
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアミノプロピル
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロピルアミノエチル
（メタ）アクリルアミド及びＮ−ベンジルアミノエチル
（メタ）アクリルアミド等］、２級アミノ基含有芳香族
ビニル炭化水素（Ｎ−メチルアミノスチレン、Ｎ−プロ
ピルアミノスチレン及びＮ−ベンジルアミノスチレン
等）及び２級アミノ基含有アリルエーテル（Ｎ−メチル
アミノエチルアリルエーテル及びＮ−エチルアミノエチ
ルアリルエーテル等）等が挙げられる。

【００６５】３級アミノ基（Ａ２）を有するモノマー
（ｍａ２）としては、３級アミノ基含有（メタ）アクリ
レート［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリ
レート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アク
リレート、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）ア
クリレート、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル
（メタ）アクリレート、モルホリノエチル（メタ）アク
リレート及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）アク
リレート等］、３級アミノ基含有（メタ）アクリルアミ
ド［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルア
ミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリ
ルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノエチル（メタ）ア
クリルアミド、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルアミノエチル
（メタ）アクリルアミド、モルホリノエチル（メタ）ア
クリルアミド及びＮ−メチルピペチジノエチル（メタ）
アクリルアミド等］、３級アミノ基含有芳香族ビニル炭
化水素（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスチレン、Ｎ，Ｎ−ジ
プロピルアミノスチレン及びＮ−ベンジル−Ｎ−メチル
アミノスチレン等）及び３級アミノ基含有アリルエーテ
ル（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及び
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等）等が
挙げられる。

【００６６】アンモニオ基（Ａ３）を有するモノマー
（ｍａ３）としては、アンモニオ基含有（メタ）アクリ
レート［（メタ）アクリロイルオキシエチルアンモニウ
ム・クロリド、メチル（メタ）アクリロイルオキシエ
チルアンモニウム・クロリド、ジメチル（メタ）アク
リロイルオキシエチルアンモニウム・クロリド、トリメ
チル（メタ）アクリロイルオキシエチルアンモニウム
・クロリド及びジエチルメチル（メタ）アクリロイル
オキシエチルアンモニウム・クロリド等］、アンモニオ
基含有（メタ）アクリルアミド［（メタ）アクリロイル
アミノエチルアンモニウム・クロリド、メチル（メ
タ）アクリロイルアミノエチルアンモニウム・クロリ
ド、ジメチル（メタ）アクリロイルアミノエチルアン
モニウム・クロリド、トリメチル（メタ）アクリロイ
ルアミノエチルアンモニウム・クロリド及びジエチル
メチル（メタ）アクリロイルアミノエチルアンモニウ
ム・クロリド等］、アンモニオ基含有芳香族ビニル炭化
水素（トリメチルビニルフェニルアンモニウム・クロ
リド等）及びアンモニオ基含有アリルエーテル（トリエ
チルアリルオキシエチルアンモニウム・クロリド等）
等が挙げられる。

【００６７】ホスファチジル基（Ａ４）を有するモノマ
ー（ｍａ４）としては、ホスファチジル基含有（メタ）
アクリレート［ホスファチジルエチル（メタ）アクリレ
ート、ジパルミトイルホスファチジルエチル（メタ）ア
クリレート及びジアラキドノイルホスファチジルプロピ
ル（メタ）アクリレート等］、ホスファチジル基含有
（メタ）アクリルアミド［ホスファチジルエチル（メ
タ）アクリレート、ジパルミトイルホスファチジルエチ
ル（メタ）アクリレート及びジアラキドノイルホスファ
チジルプロピル（メタ）アクリレート等］、ホスファチ
ジル基含有芳香族ビニル炭化水素（ジパルミトイルホス
ファチジルスチレン等）及びホスファチジル基含有アリ
ルエーテル（ジパルミトイルホスファチジルエチルアリ
ルエーテル等）等が挙げられる。

【００６８】リゾホスファチジル基（Ａ５）を有するモ
ノマー（ｍａ４）としては、リゾフォスファチジル基含
有（メタ）アクリレート［パルミトイルジゾホスファチ
ジルエチル（メタ）アクリレート及びアラキドノイルリ
ゾホスファチジルプロピル（メタ）アクリレート等］、
リゾフォスファチジル基含有（メタ）アクリルアミド
［パルミトイルリゾホスファチジルエチル（メタ）アク
リレート及びアラキドノイルリゾホスファチジルプロピ
ル（メタ）アクリレート等］、リゾフォスファチジル基
含有芳香族ビニル炭化水素（パルミトイルリゾホスファ
チジルスチレン等）及びリゾフォスファチジル基含有ア
リルエーテル（パルミトイルリゾホスファチジルエチル
アリルエーテル等）等が挙げられる。糖（Ｂ１）を有す
るモノマー（ｍｂ１）としては、糖含有芳香族ビニル炭
化水素（Ｎ−ｐ−ビニルベンジルラクトノアミド等）及
び糖含有（メタ）アクリレート［グルコース−６−（メ
タ）アクリレート等］等が挙げられる。

【００６９】ステロイド環（Ｂ２）を有するモノマー
（ｍｂ２）としては、ステロイド環含有（メタ）アクリ
レート［コレステロール（メタ）アクリレート及びエル
ゴステロール（メタ）アクリレート等］が挙げられる。
これらのモノマーを用いて共重合する方法としては、ビ
ニル樹脂を構成するモノマーにこれらを配合して、通常
の方法（バルク重合、懸濁重合等）で共重合させる方法
等が挙げられる。共重合させるときのこれらモノマーの
含有量（重量％）は、構成モノマーの全重量に基づい
て、０．００１以上が好ましく、さらに好ましくは０．
１以上である。また、３０以下が好ましく、さらに好ま
しくは２０以下である。

【００７０】の方法において、官能基（Ａ）及び／又
は構造（Ｂ）を有する反応性化合物としては、２級アミ
ノ基（Ａ１）を有する反応性化合物、３級アミノ基（Ａ
２）を有する反応性化合物、アンモニオ基（Ａ３）を有
する反応性化合物、ホスファチジル基（Ａ４）を有する
反応性化合物、リゾホスファチジル基（Ａ５）を有する
反応性化合物、糖（Ｂ１）を有する反応性化合物、ステ
ロイド環（Ｂ２）を有する反応性化合物及びこれらの２
種以上の混合物等が使用できる。２級アミノ基（Ａ１）
を有する反応性化合物としては、上記の（Ａ１）を有す
るモノマーのほか、炭素数３〜５の２級アミノ基含有ハ
ロゲン炭化水素（メチルアミノエチルクロリド及びメチ
ルアミノプロピルクロリド等）、炭素数４〜８の２級ア
ミノ基含有エポキシド（メチルアミノプロピルエポキシ
ド、メチルアミノブチルエポキシド及びメチルアミノエ
チルグリシジルエーテル等）等が挙げられる。

【００７１】３級アミノ基（Ａ２）を有する反応性化合
物としては、上記の（Ａ２）を有するモノマーのほか、
炭素数４〜６の３級アミノ基含有ハロゲン炭化水素（ジ
メチルアミノエチルクロリド及びジエチルアミノエチル
クロリド等）、炭素数５〜８の３級アミノ基含有エポキ
シド（ジメチルアミノプロピルエポキシド、ジメチルア
ミノエチルグリシジルエーテル等）等が挙げられる。

【００７２】アンモニオ基（Ａ３）を有する反応性化合
物としては、上記の（Ａ３）を有するモノマーのほか、
炭素数５〜８のアンモニオ基含有ハロゲン炭化水素（ト
リメチルクロロエチルアンモニウムクロリド等）、炭素
数６〜１０のアンモニオ基含有エポキシド（トリメチル
グリシジルエチルアンモニウムクロリド等）等が挙げら
れる。

【００７３】ホスファチジル基（Ａ４）を有する反応性
化合物としては、上記の（Ａ４）を有するモノマーのほ
か、炭素数２〜６のホスファチジル基含有ハロゲン炭化
水素（ホスファチジルエチルクロリド及びジミリストイ
ルホスファチジルエチルクロリド等）、炭素数３〜８の
ホスファチジル基含有エポキシド（ホスファチジルエチ
ルグリシジルエーテル及びジミリストイルホスファチジ
ルエチルグリシジルエーテル等）等が挙げられる。

【００７４】リゾホスファチジル基（Ａ５）を有する反
応性化合物としては、上記の（Ａ５）を有するモノマー
のほか、炭素数２〜６のリゾフォスファチジル基含有ハ
ロゲン炭化水素（ミリストイルリゾホスファチジルエチ
ルクロリド等）、炭素数３〜８のリゾホスファチジル基
含有エポキシド（ミリストイルリゾホスファチジルエチ
ルグリシジルエーテル等）等が挙げられる。

【００７５】糖（Ｂ１）を有する反応性化合物として
は、上記の（Ｂ１）を有するモノマーのほか、炭素数６
〜１８の糖含有ハロゲン炭化水素（グルコース−６−エ
チルクロリド等）、炭素数６〜１８の糖含有エポキシド
（グルコース−６−グリシジルエーテル等）等が挙げら
れる。

【００７６】ステロイド環（Ｂ２）を有する反応性化合
物としては、上記の（Ｂ２）を有するモノマーのほか、
炭素数１７〜３２のステロイド環含有ハロゲン化物（ク
ロロエチルコレステロール等）、炭素数１７〜３２のス
テロイド環含有エポキシド（グリシジルコレステロール
等）等が挙げられる。

【００７７】基材とこれらの反応性化合物を共有結合さ
せるとき、上記のモノマーを用いる場合は、パーオキシ
ド（過塩素酸ナトリウム、ジブチルパーオキシド、ジク
ミルパーオキシド、クメンハイドロパーオキシド等）と
ともに、基材とこれらの反応性化合物（水懸濁液として
もよい）を窒素雰囲気下、５０〜１２０℃で１〜４８時
間反応させる方法を適用してもよい。

【００７８】また、ハロゲン炭化水素又はエポキシドを
用いる場合、塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、トリエチルアミン、１，８−ジアザビシクロ［５，
４，０］ウンデセン−７（登録商標：ＤＢＵ）等）とと
もに、基材とこれらのハロゲン炭化水素又はエポキシド
（水懸濁液としてもよい）を、２０〜９０℃で１〜４８
時間反応させる方法等を適用してもよい。反応性化合物
の使用量（ｇ／ｃｍ²）は、基材の表面積１ｃｍ²当り、
１×１０ ^-8以上が好ましく、さらに好ましくは１×１０
^-6以上²である。また1以下が好ましく、さらに好ましく
は１×１０^-2以下である。

【００７９】の方法において、官能基（Ａ）及び／又
は構造（Ｂ）を有する化合物としては、２級アミノ基
（Ａ１）を有する化合物、３級アミノ基（Ａ２）を有す
る化合物、アンモニオ基（Ａ３）を有する化合物、ホス
ファチジル基（Ａ４）を有する化合物、リゾホスファチ
ジル基（Ａ５）を有する化合物、糖（Ｂ１）を有する化
合物、ステロイド環（Ｂ２）を有する化合物及びこれら
の２種以上の混合物等が使用できる。

【００８０】２級アミノ基（Ａ１）を有する化合物とし
ては、上記の（Ａ１）を有するモノマーからなる（共）
重合体のほか、重量平均分子量（以下Ｍｗと略する）５
００〜１，０００，０００の２級アミノ基含有ポリマー
（例えば、ポリエチレンイミン、ジシアンジアミド・ホ
ルマリン縮合物、ジシアンジアミド・ジエチレントリア
ミン重縮合物、ジシアンジアミド・ジエチレントリアミ
ン・尿素重縮合物及びジアリルアミン塩・二酸化硫黄共
重合物等）等が挙げられる。なお、Ｍｗは、ポリエチレ
ングリコールを基準物質としてゲルパーミエーションク
ロマトグラフィーにより測定されるものである。

【００８１】３級アミノ基（Ａ２）を有する化合物とし
ては、上記の（Ａ２）を有するモノマーからなる（共）
重合体のほか、Ｍｗ５００〜１，０００，０００の３級
アミノ基含有ポリマー（ジシアンジアミド・ジエチレン
トリアミン重縮合物、ジシアンジアミド・ジエチレント
リアミン・尿素重縮合物、ポリヒスチジン及びポリ（Ｎ
−メチルエチレンイミン）等）等が挙げられる。

【００８２】アンモニオ基（Ａ３）を有する化合物とし
ては、上記の（Ａ３）を有するモノマーからなる（共）
重合体のほか、Ｍｗ５００〜１，０００，０００のアン
モニオ基含有ポリマー（ポリエチレンイミンのメチルク
ロリド４級化物、ジシアンジアミド・ホルマリン縮合
物、エピクロルヒドリン・ジメチルアミン付加重合物、
ジメチルジアリルアンモニウムクロリド・二酸化硫黄共
重合物、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド重合物
等）等が挙げられる。

【００８３】ホスファチジル基（Ａ４）を有する化合物
としては、上記の（Ａ４）を有するモノマーからなる
（共）重合体のほか、ホスファチジル基含有化合物｛ホ
スファチジン酸（鶏卵黄身由来のホスファチジン酸ナト
リウム、β−アラキドノイル−γ−ステアロイルホスフ
ァチジン酸ナトリウム、ホスファチジン酸、ジラウロイ
ルホスファチジン酸、ジオレイルホスファチジン酸、ジ
ラウロイルホスファチジン酸ナトリウム及びジオレオイ
ルホスファチジン酸ナトリウム等）、ホスファチジルコ
リン（鶏卵黄身由来ホスファチジルコリンの水素添加
物、β−アセチル−γ−ヘキサデシルホスファチジルコ
リン、ジアラキドイルホスファチジルコリン、ジイリノ
レオイルホスファチジルコリン、ジ−トランス−２，ト
ランス−４−オクタデカジエノイルホスファチジルコリ
ン、ジステアロイルホスファチジルコリン、β−メチル
−γ−ヘキサデシルホスファチジルコリン及びβ−オレ
オイル−γ−パルミトイルホスファチジルコリン等）、
ホスファチジルエタノールアミン（ウシ脳由来のＩ型ホ
スファチジルエタノールアミン、大腸菌由来のＶ型ホス
ファチジルエタノールアミン、鶏卵黄身由来のホスファ
チジルエタノールアミン、大豆由来のホスファチジルエ
タノールアミン及びジミリストイルホスファチジルエタ
ノールアミン等）、ホスファチジルグリセロール（ホス
ファチジルグリセロールナトリウム、ホスファチジルグ
リセロール、ジミリストイルホスファチジルエタノール
アミンナトリウム及びウシ心臓由来のカルジオリピン２
ナトリウム等）、ホスファチジルセリン（ジパルミトイ
ルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジ
ルセリンナトリウム及びウシ脳由来のホスファチジルセ
リンナトリウム等）、ホスファチジルイノシトール（小
麦由来のホスファチジルイノシトールナトリウム等）及
びスフィンゴミエリン｝等が挙げられる。

【００８４】リゾフォスファチジル基（Ａ５）を有する
化合物としては、上記の（Ａ５）を有するモノマーから
なる（共）重合体のほか、リゾフォスファチジル基含有
化合物｛リゾホスファチジン酸（オレイルリゾホスファ
チジン酸ナトリウム及びステアリルリゾホスファチジン
酸等）、リゾホスファチジルコリン（鶏卵黄身由来のリ
ゾホスファチジルコリン、デカノイルリゾホスファチジ
ルコリン及びステアロイルリゾホスファチジルコリン
等）、リゾホスファチジルセリン（ウシ脳由来のリゾホ
スファチジルセリン２ナトリウム等）及びリゾホスファ
チジルイノシトール（大豆由来のリゾホスファチジルイ
ノシトールナトリウム等）等｝等が挙げられる。

【００８５】糖（Ｂ１）を有する化合物としては、上記
の（Ｂ１）を有するモノマーからなる（共）重合体のほ
か、糖含有化合物｛糖脂質（アシアロガングリオシド、
ガングリオシド、シアリルルイス、シアリルラクトテト
ラオシルセラミド、シアリルネオラクトテトラオシルセ
ラミド、ガラクロシルセラミド、グロボテトラシルセラ
ミド、グルコセレブロシド、グルコシルセラミ及びラク
ロシルセラミド等）、単糖類（ガラクトース、グルコー
ス、マンノース、フコース、グルコサミン、ガラクトサ
ミン、Ｎ-アセチルガラクトサミン、Ｎ-メチルグルコサ
ミン、Ｎ-アセチルニューラミン酸、アラビノース、デ
オキシグルコース、デオキシフルオログルコース、リボ
ース、デオキシリボース、エリスロース、フルクトー
ス、イノシトール、リクソース、マドゥロース、ムラミ
ン酸、デオキシマンオース、ソルボース、キシロース及
びトリアセチルグルカール等）、多糖類（セロビオー
ス、ジフルクトース、コジビオース、ラクトース、ラク
ツロース、マルチトール、マルトース、トレハロース、
ガラクトシラクトース、グルコシルスクロース、イソマ
ルトオリゴサッカライド、マルトオリゴサッカライド、
テハロサミン、パノース、キシロオリゴサッカロースフ
フルクトオリゴサッカライド、ニストース、スタキロー
ス、キトオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、ムコ多糖、アル
ギニン酸、カードラン、デキストラン、レバン、パラミ
オール、ポリデキストロース、プルラン、スターチ及び
シクロデキストリン等）｝等が挙げられる。

【００８６】ステロイド環（Ｂ２）を有する化合物とし
ては、上記の（Ｂ２）を有するモノマーからなる（共）
重合体のほか、ステロイド環含有化合物｛天然又は合成
の胆汁酸（ケノジオール、コール酸、デオキシコール
酸、グリココール酸、グリコリトコール酸、リソコール
酸、スクアレン及びタウロコール酸等）及び天然又は合
成のステロール（ブラシカステロール、カンペステロー
ル、コレステロール、エルゴステロール、フコステロー
ル、ラノステロール、シトステロール及びスチグマステ
ロール等）等｝等が挙げられる。

【００８７】基材にこれらの化合物を接触させる方法と
しては、前記、ポリペプチド（Ｐ）を基材に接触させる
方法と同様の方法が適用できる。これらの化合物の使用
量（ｇ／ｃｍ²）は、基材の表面積１ｃｍ²当り、１×１
０^-8以上が好ましく、さらに好ましくは１×１０^-6以上
である。また1以下が好ましく、さらに好ましくは１×
１０^-2以下である。

【００８８】の方法において、官能基（Ａ）及び／又
は構造（Ｂ）を有する化合物としては、の方法で用い
ることができる化合物と同じものが使用できる。官能基
（Ａ）及び／又は構造（Ｂ）を有する化合物を基材中に
混合する方法としては、基材を構成する素材と（Ａ）及
び／又は（Ｂ）を有する化合物とを混合した後に成型す
る方法や、基材がビニル樹脂の場合、（Ａ）及び／又は
（Ｂ）を有する化合物の存在下にビニル樹脂を構成する
モノマーを公知の方法で重合させる方法等が挙げられ
る。これら化合物の使用量（ｇ／ｃｍ²）は、基材の表
面積１ｃｍ²当り、１×１０ ^-8以上が好ましく、さらに
好ましくは１×１０^-6以上である。また1以下が好まし
く、さらに好ましくは１×１０^-2以下である。

【００８９】本発明のポリペプチド含有基材は、細胞培
養用に好適に使用されるほか、火傷などの治療に用いら
れる創傷被覆剤や、体内埋め込み型の組織再生用材料と
して使用できるものである。本発明のポリペプチド含有
基材を用いて、培養される動物細胞の種類としては特に
制限がなく、ヒト、サル、マウス、ハムスター、ラッ
ト、イヌ及び昆虫等の初代培養細胞や株化細胞、並びに
細胞培養実験、医薬品又はワクチン生産等に用いられる
公知の細胞等が使用できる。

【００９０】具体的には例えば、Ｖｅｒｏ（アフリカミ
ドリザル腎）細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵
巣）細胞、ＭＤＣＫ（イヌ腎）細胞、ＷＩ３８（ヒト胎
児肺）細胞、ヒト由来の幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、
実質細胞、線維芽細胞及び角質細胞等の正常細胞等が挙
げられる。これら細胞の中では、無血清培養のニーズが
高く、本発明のポリペプチド含有基材の特徴が最大限活
用される医薬品やワクチン生産用に用いられる細胞（Ｖ
ｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞及び正常細胞
等）に最適である。

【００９１】本発明の基材を用いて動物細胞を培養する
方法としては特に制限はなく、通常の方法、例えば、朝
倉書店発行日本組織培養学会編「組織培養の技術」に記
載されている方法等が適用できる。例えば、基材として
Ｔ−フラスコ（培養面積；１０〜５００ｃｍ²等）、プ
レート（２〜３８４穴等）又はディッシュ（培養面積；
５〜５００ｃｍ²等）を用いる場合、未成熟肥満細胞を
５０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散した培地を、深さ
が１〜２０ｍｍになる量だけディッシュ又はシャーレに
加え、ＣＯ₂濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュ
ベーター中で静置培養する方法等が挙げられる。この
際、１〜５日毎に、１／３量〜全量の培地を交換するこ
とが好ましい。

【００９２】基材としてローラーボトル（容量；０．１
〜１０L等）を用いる場合、未成熟肥満細胞を５０〜５
００万個／ｍＬの濃度で分散した培地を、０．５／１０
０〜３０／１００の容量になる量だけローラーボトルに
加え、ＣＯ₂濃度５体積％、３７℃の炭酸ガスインキュ
ベーター中で、０．１〜１０ｒｐｍの回転速度で回転さ
せながら培養する方法等が挙げられる。この際、１２〜
５日毎に、１／３量〜全量の培地を交換することが好ま
しい。

【００９３】基材としてマイクロキャリアビーズ（粒子
径；２０〜５００μｍ、密度；１．０〜１．１ｇ／ｃｍ
³、表面積；１００〜１００，０００ｃｍ²／ｇ等）を用
いる場合、スピナーフラスコ（容量；１０〜5００ｍL
等）中に、未成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの
濃度で分散した培地を、１／１０〜７／１０の容量にな
る量だけ加え、マイクロキャリアビーズを、培地１Ｌ当
り０．１〜５０ｇの割合で加え、ＣＯ₂濃度５体積％、
３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で、１〜１００ｒ
ｐｍの回転速度で撹拌しながら培養する方法等が挙げら
れる。この際、１２〜５日毎に、１／３量〜全量の培地
を交換することが好ましい。さらにスピナーフラスコの
代わりに流動層型バイオリアクターや充填型バイオリア
クター（容量；１０ｍＬ〜１０ｋＬ等）を用いて、マイ
クロキャリアビーズをバイオリアクター内にセットし未
成熟肥満細胞を５０〜５００万個／ｍＬの濃度で分散し
た１〜５倍容量の培地を循環させた後、ＣＯ₂濃度５体
積％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で調整した
培地を１〜１００ｃｍ／分の線速度で循環しながら連続
培養する方法等が挙げられる。

【００９４】基材としてホローファイバー（内径１０〜
５００μｍ等）を用いる場合、カートリッジ（容量；１
０〜１０００ｍL等）中に、未成熟肥満細胞を５０〜５
００万個／ｍＬの濃度で分散した培地をカートリッジに
加えたあと、ホローファイバー内に、ＣＯ₂濃度５体積
％、３７℃の炭酸ガスインキュベーター中で調整した培
地を１〜１００ｃｍ／分の線速度で循環し連続培養する
方法等が挙げられる。

【００９５】培養後は、ＥＤＴＡ等のキレート剤若しく
はトリプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか又はスク
レーパーで掻きとることによって、成熟肥満細胞が回収
される。これらのうち、ＥＤＴＡで処理する方法が好ま
しい。

【００９６】培地としては、用いる動物細胞の種類に応
じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ
培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆ
ｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ培
地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の
技術第三版」５８１頁に記載の基礎培地、これらの培地
に血清成分（ウシ胎児血清等）等を添加したもの、並び
に市販の無血清培地［味の素（株）製無血清培地ＡＳＦ
１０３，同ＡＳＦ１０４，同ＡＳＦ３０１、ギブコ社製
無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭ，同ＶＰ−ＳＦＭ等］等が用
いられる。

【００９７】血清培地を使用した場合、血清中に成分未
知の蛋白質等が含まれ再現性が得られにくいこと、細胞
を用いる医薬品生産の場合には精製工程が複雑となりコ
ストがかかること、さらにウィルス感染の危険性がある
こと等の理由から、血清を含まないいわゆる無血清培地
が好ましく、特に、本発明の基材は、無血清培地でも細
胞の接着・増殖性に優れているため、本発明の基材とと
もに用いる培地としては無血清培地が特に好ましい。

【００９８】さらに必要に応じて、細胞増殖因子（Ｓ）
を培地中に含有させることにより、動物細胞の増殖速度
をさらに高めたり、細胞活性を高めたり、細胞が本来有
する機能を発現させたりすることができる。細胞増殖因
子（Ｓ）は細胞を増殖させる活性のある物質であり、例
えば、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、
ＩＧＦ及びＢＭＰ等が挙げられ、この他に、例えば財団
法人名古屋大学出版会発行「上田実編ティッシュエンジ
ニアリング（１９９９年）」４３〜５１頁及び同文献に
付記されている参考文献に記載されているもの等も用い
られる。

【００９９】

【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。＜実施例１＞スチレン９９重量部、ジビニルベンゼン1
重量部を懸濁重合して得られたポリスチレンビーズを金
属製網篩（ＪＩＳＺ８８０１−２０００）で篩い分け
して、７５〜１０６μｍの間の粒子径を有するビーズを
得た。レーザー式粒度分布測定装置ＬＡ−９２０（堀場
製作所製）で測定した体積平均粒径は、９６μｍであっ
た。このビーズの平均表面積は、５９５ｃｍ²／ｇと計
算された。

【０１００】特表平３−５０２９３５号公報中の実施例
記載の方法に準じて、（Gly Ala Gly Ala Gly Ser）₉配
列（１０）とArg Gly Asp配列との繰り返し単位からな
るポリペプチドを、遺伝子組み替え大腸菌を増殖させ、
破砕し、抽出することにより作成し、（Ｍｎ）の違いに
よって精製し、以下のポリペプチドを単離した。

【０１０１】ポリペプチド（Ｆ１）；（Ｍｎ）８０，０
００、１分子あたりのＲＧＤ配列の数１０個、（ＧＡＧ
ＡＧＳ）₉配列の数１０個。ポリペプチド（Ｆ２）；（Ｍｎ）２４０，０００、１分
子あたりのＲＧＤ配列の数３０個、（ＧＡＧＡＧＳ）₉
配列の数３０個。ポリペプチド（Ｆ３）；（Ｍｎ）５０，０００、１分子
あたりのＲＧＤ配列の数６個、（ＧＡＧＡＧＳ）₉配列
の数６個。ポリペプチド（Ｆ４）；（Ｍｎ）５００，０００、１分
子あたりのＲＧＤ配列の数６０個、（ＧＡＧＡＧＳ）₉
配列の数６０個。

【０１０２】次いで、ポリペプチド（Ｆ１）の４．５規
定の過塩素酸リチウム溶液（ポリペプチドの濃度；１ｍ
ｇ／ｍｌ）をリン酸バッファー液（ＰＢＳ）でポリペプ
チド（Ｆ１）の濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように希
釈し、ポリペプチド（Ｆ１）溶液（１）を作製した。

【０１０３】１０ｍｌ試験管にジメチルアミノエチルメ
タクリレート２ｇ、アゾビスイソヴァレロニトリル０．
０４ｇおよびジオキサン２ｇを加え、窒素置換後、密閉
下、７０℃湯浴中で４時間振盪した。得られた溶液をヘ
キサン１００ｍＬ中に滴下し、析出したポリマー分を回
収し乾燥することによりジメチルアミノエチルメタクリ
レート重合体（ＰＤＡＭ）を得た。次いで、ＰＤＡＭを
イオン交換水に溶解し、ＰＤＡＭの濃度が１００μｇ／
ｍｌのＰＤＡＭ溶液を作製した。

【０１０４】ポリペプチド溶液（１）３７ｍｌ及びＰＤ
ＡＭ溶液３７ｍｌの混合物に上記で得られたビーズ５ｇ
を加え、ポリフッ化エチレン製撹拌子で１２時間、２０
〜３０℃の温度下で撹拌した。得られたビーズスラリー
を振盪器上にセットしたステンレス製バットに移し、１
００℃の熱風を吹きつけながら、２４時間振盪乾燥し
た。得られた乾燥ビーズをＰＢＳ５０ｍｌで２回洗浄
し、ＰＢＳ中で１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌
後、ＵＶ照射下に乾燥することにより、本発明のポリペ
プチド含有基材１を得た。

【０１０５】ポリペプチド含有基材１を４．５規定の過
塩素酸リチウム溶液中で２４時間、３７℃で撹拌後、過
塩素酸リチウム溶液上清中に溶出したポリペプチド（Ｆ
１）の含有量をピアスケミカル社製ＢＣＡ蛋白試薬で測
定することによって、ポリペプチド含有基材１のポリペ
プチド（Ｆ１）含有量を求めた結果、１．１μｇ／ｃｍ
²であった。

【０１０６】ポリペプチド含有基材１１ｇをイオン交換
水５０ｍｌに分散し、を１／１００規定硝酸銀水溶液で
電位差滴定することによって、ポリペプチド含有基材１
の表面に存在するジメチルアミノ基の量を求めた結果、
５×１０¹⁵個／ｃｍ²であった。

【０１０７】＜実施例２＞ＰＤＡＭ溶液の代わりに、ジ
シアンジアミド・ジエチレントリアミン・尿素重縮合物
（商品名：サンフィックス４１４、三洋化成工業株式会
社製）を用い、固形分を１００μｇ／ｍｌ・溶液とする
以外は実施例１と同様にして、本発明のポリペプチド含
有基材２を得た。実施例１と同様にして求めたポリペプ
チド含有基材２のポリペプチド（Ｆ１）含有量は１．１
μｇ／ｃｍ²であり、また１／１００規定塩酸溶液で電
位差滴定して得られた２級及び３級アミンの量は１×１
０¹⁶個／ｃｍ²であった。

【０１０８】＜実施例３＞ＰＤＡＭ溶液の代わりに、ジ
パルミトイルホスファチジルグリセロールの１００μｇ
／ｍｌ水溶液を用いる以外は実施例１と同様にして、本
発明のポリペプチド含有基材３を得た。実施例１と同様
にして求めたポリペプチド含有基材３のポリペプチド
（Ｆ１）含有量は１．１μｇ／ｃｍ²であり、また、カ
イノス社製リン脂質測定キット「アクアオートカイノ
スＰＬ試薬」を用いて測定したホスファチジル基の量
は、１×１０¹⁶個／ｃｍ²であった。

【０１０９】＜実施例４＞ＰＤＡＭ溶液の代わりに、コ
ール酸の１００μｇ／ｍｌ水溶液を用いる以外は実施例
１と同様にして、本発明のポリペプチド含有基材４を得
た。実施例１と同様にして求めたポリペプチド含有基材
４のポリペプチド（Ｆ１）含有量は１．１μｇ／ｃｍ²
であり、また、ロッシュダイアグノスティックス社製Ｆ
−キット（ステロイド用）を用いて測定したステロイド
環の量は、４×１０¹⁶個／ｃｍ²であった。

【０１１０】＜実施例５＞ポリペプチド（Ｆ１）の代わ
りに、ポリペプチド（Ｆ２）を用いる以外は実施例１と
同様にして本発明のポリペプチド含有基材５を得た。実
施例１と同様にして求めたポリペプチド含有基材５のポ
リペプチド（Ｆ２）含有量は１．０μｇ／ｃｍ²であ
り、また、１／１００規定硝酸銀水溶液で電位差滴定す
ることによって、測定されたジメチルアミノ基の量は、
２×１０¹⁵個／ｃｍ²であった。

【０１１１】＜実施例６＞ポリペプチド（Ｆ１）の代わ
りに、ポリペプチド（Ｆ３）を用いる以外は実施例１と
同様にして本発明のポリペプチド含有基材６を得た。実
施例１と同様にして求めたポリペプチド含有基材６のポ
リペプチド（Ｆ３）含有量は０．９μｇ／ｃｍ²であ
り、また、１／１００規定硝酸銀水溶液で電位差滴定す
ることによって、測定されたジメチルアミノ基の量は、
２×１０¹⁵個／ｃｍ²であった。

【０１１２】＜実施例７＞ポリペプチド（Ｆ１）の代わ
りに、ポリペプチド（Ｆ４）を用いる以外は実施例１と
同様にして本発明のポリペプチド含有基材７を得た。実
施例１と同様にして求めたポリペプチド含有基材７のポ
リペプチド（Ｆ４）含有量は１．２μｇ／ｃｍ²であ
り、また、１／１００規定硝酸銀水溶液で電位差滴定す
ることによって、測定されたジメチルアミノ基の量は、
４×１０¹⁵個／ｃｍ²であった。

【０１１３】＜実施例８＞特表平３−５０２９３５号公
報中の実施例記載の方法に準じて、（Gly AlaGly Ala G
ly Ser）₉配列（１０）とIle Lys Val Ala Val配列
（７）とを７個含む（Ｍｎ）約９万の遺伝子組換え大腸
菌の産生蛋白質ポリペプチドＬを作成した。ポリペプチ
ド（Ｆ１）の代わりに、このポリペプチドＬを用いる以
外は実施例１と同様にして本発明のポリペプチド含有基
材８を得た。実施例１と同様にして求めたポリペプチド
含有基材８のポリペプチドＬの含有量は１．１μｇ／ｃ
ｍ ²であり、また、１／１００規定硝酸銀水溶液で電位
差滴定することによって、測定されたジメチルアミノ基
の量は、３×１０¹⁵個／ｃｍ²であった。

【０１１４】＜実施例９＞ＰＤＡＭの代わりに、和光純
薬（株）製ポリエチレンイミン（分子量＝７０，００
０）を用いる以外は実施例１と同様にして、本発明のポ
リペプチド含有基材９を得た。実施例１と同様にして求
めたポリペプチド含有基材９のポリペプチド（Ｆ１）含
有量は１．１μｇ／ｃｍ²であり、また１／１００規定
塩酸溶液で電位差滴定して得られた２級アミンの量は４
×１０¹⁶個／ｃｍ²であった。

【０１１５】＜実施例１０＞ＰＤＡＭ溶液の代わりに、
ＰＤＡＭ溶液１００ｍＬにメチルクロリド５ｇを加え、
８０℃で８時間反応させて得られた溶液を用いる以外は
実施例１と同様にして、本発明のポリペプチド含有基材
１０を得た。実施例１と同様にして求めたポリペプチド
含有基材１０のポリペプチド（Ｆ１）含有量は１．１μ
ｇ／ｃｍ²であり、また１／１００規定塩酸溶液で電位
差滴定して得られた４級アンモニウム塩の量は２×１０
¹⁶個／ｃｍ²であった。

【０１１６】＜実施例１１＞ＰＤＡＭの代わりに、和光
純薬工業（株）製ガングリオシドＧボビンブレインを
用いる以外は実施例１と同様にして、本発明のポリペプ
チド含有基材１１を得た。実施例１と同様にして求めた
ポリペプチド含有基材１１のポリペプチド（Ｆ１）含有
量は１．１μｇ／ｃｍ²であり、また、ロッシュダイア
グノスティックス社製「Ｆ−キット糖質用」を用いて
得られた糖の量は１×１０¹⁶個／ｃｍ ²であった。

【０１１７】＜実施例１２＞ポリペプチド溶液（１）の
代わりに、ポリペプチド（Ｆ１）の濃度が４５μｇ／ｍ
ｌのポリペプチド溶液（２）を用いる以外は実施例１と
同様にして、本発明のポリペプチド含有基材１２を得
た。実施例１と同様にして求めたポリペプチド含有基材
１２のポリペプチド（Ｆ１）含有量は０．３μｇ／ｃｍ
²であり、また、１／１００規定硝酸銀水溶液で電位差
滴定することによって、測定されたジメチルアミノ基の
量は、２×１０¹⁵個／ｃｍ²であった。

【０１１８】＜実施例１３＞ポリペプチド溶液（１）の
代わりに、ポリペプチド（Ｆ１）の濃度が１０００μｇ
／ｍｌのポリペプチド溶液（３）を用いる以外は実施例
１と同様にして、本発明のポリペプチド含有基材１３を
得た。実施例１と同様にして求めたポリペプチド含有基
材１３のポリペプチド（Ｆ１）含有量は１０．０μｇ／
ｃｍ²であり、また、Ｎ／１００硝酸銀水溶液で電位差
滴定することによって、測定されたジメチルアミノ基の
量は、３×１０¹⁵個／ｃｍ²であった。

【０１１９】＜実施例１４＞スチレン９８重量部、ジビ
ニルベンゼン1重量部、ジメチルアミノエチルメタクリ
レート１重量部を懸濁重合して得られたポリスチレンビ
ーズを金属製網篩（ＪＩＳＺ８８０１−２０００）で
篩い分けして、７５〜１０６μｍの間の粒子径を有する
ビーズを得た。レーザー式粒度分布測定装置ＬＡ−９２
０（堀場製作所製）で測定した体積平均粒径は、９３μ
ｍであった。このビーズの平均表面積は、６２６ｃｍ²
／ｇと計算された。

【０１２０】ポリペプチド溶液（１）３７ｍｌに上記で
得られたビーズ５ｇを加え、ポリフッ化エチレン製撹拌
子で１２時間、２０〜３０℃の温度下で撹拌した。得ら
れたビーズスラリーを振盪器上にセットしたステンレス
製バットに移し、１００℃の熱風を吹きつけながら、２
４時間振盪乾燥した。得られた乾燥ビーズをＰＢＳ５０
ｍｌで２回洗浄し、ＰＢＳ中で１２１℃で２０分間オー
トクレーブ滅菌後、ＵＶ照射下に乾燥することにより、
本発明のポリペプチド含有基材１４を得た。

【０１２１】実施例１と同様にして求めたポリペプチド
含有基材１４のポリペプチド（Ｆ１）含有量は０．９μ
ｇ／ｃｍ²であり、また、１／１００規定硝酸銀水溶液
で電位差滴定することによって測定されたジメチルアミ
ノ基の量は、１×１０¹⁷個／ｃｍ²であった。

【０１２２】＜比較例１＞ポリペプチド溶液（１）の代
わりに、ＰＢＳを用いる以外は実施例１と同様にして、
比較用基材１５を得た。実施例１と同様にして求めた比
較用基材１５のジメチルアミノ基の量は４×１０¹⁵個／
ｃｍ²であった。

【０１２３】＜比較例２＞ＰＤＡＭ溶液の代わりに、Ｐ
ＢＳを用いる以外は実施例１と同様にして、比較用基材
１６を得た。実施例１と同様にして求めた比較用基材１
６のＳＬＰＦ含有量は１．０μｇ／ｃｍ²であった。

【０１２４】＜比較例３＞ＰＤＡＭの代わりに、和光純
薬工業（株）製ポリ−Ｌ−リジンを用いる以外は実施例
１と同様にして、比較用基材１７を得た。実施例１と同
様にして求めた比較用基材１７のＳＬＰＦ含有量は１．
１μｇ／ｃｍ²であり、また１級アミノ基の量は１×１
０¹⁴個／ｃｍ²であった。

【０１２５】＜比較例４＞ポリペプチド溶液（１）の代
わりに、ＰＢＳを用いる以外は実施例２と同様にして、
比較用基材１８を得た。実施例２と同様にして求めた比
較用基材１８の２級及び３級アミンの量は１×１０¹⁶個
／ｃｍ²であった。

【０１２６】＜比較例５＞ポリペプチド溶液（１）の代
わりに、ＰＢＳを用いる以外は実施例３と同様にして、
比較用基材１９を得た。実施例３と同様にして求めた比
較用基材１９のホスファチジル基の量は、１×１０¹⁶個
／ｃｍ²であった。

【０１２７】＜比較例６＞ポリペプチド溶液（１）の代
わりに、ＰＢＳを用いる以外は実施例４と同様にして、
比較用基材２０を得た。実施例４と同様にして求めた比
較用基材２０のステロイド環の量は、４×１０¹⁶個／ｃ
ｍ²であった。

【０１２８】＜細胞培養＞得られた基材１〜２０を用い
て無血清細胞培養実験を行った。２０個の１Ｌスピナー
フラスコに基材１〜２０を６ｇづつそれぞれ加え、２４
５ｍｌのインビトロジェン社製無血清培地ギブコＯｐｔ
ｉＰｒｏ-ＳＦＭを加え、３７℃で２０分間撹拌下温調
後、ＭＤＣＫ細胞［大日本製薬（株）から購入］を細胞
濃度：５．０×１０⁶個／ｍＬに分散したもの５ｍｌを
加え（細胞密度＝１０万個／ｍｌ）、２５ｒｐｍで撹拌
しながら、二酸化炭素と空気の混合物（二酸化炭素／空
気＝５／９５体積比）中、３７℃で培養を行なった。基
材への初期接着性を評価するため３０分後に、また、増
殖性を評価するため１日後及び３日後に、撹拌下に基材
の懸濁液１ｍｌをそれぞれサンプリングし、ＰＢＳで基
材を洗浄して基材に接着していない細胞を除去した後、
細胞核数をウィーゼル（Wezel）によるクリスタルバイ
オレットを用いた細胞核計数法（nuclei-counting meth
od）で計数することで、細胞密度（単位：万個/ｍｌ）
を測定した。結果を表１に示す。

【０１２９】

【表１】

【０１３０】なお、比較例１の基材１５を用い、インビ
トロジェン社製無血清培地ギブコＯｐｔｉＰｒｏ-ＳＦ
Ｍの代わりに、血清培地（ＦＢＳ１０％含有ＭＥＭＥ）
を用いた場合の細胞密度（万個／ｍｌ）は、３０分後；
５、１日後；１６、３日後；７０であった。

【０１３１】＜実施例１５＞旭テクノグラス製６０ｍｍ
φ細胞培養ディッシュ（培養面積；２８ｃｍ²／個）
に、実施例１で得られたポリペプチド溶液（１）とＰＤ
ＡＭ溶液の当重量混合物をＰＢＳで１０倍に希釈したも
のを1．５ｍｌ加え、２０〜２５℃のクリーンベンチ内
でで１週間放置することによって、自然乾燥させた。さ
らにＰＢＳ５ｍｌで２回洗浄して、本発明のポリペプチ
ド含有基材（ディッシュ１）を得た。

【０１３２】ディッシュ１に４．５規定の過塩素酸リチ
ウム溶液３ｍｌを加え、３７℃で４８時間振盪後、過塩
素酸リチウム溶液上清中に溶出したポリペプチド（Ｆ
１）の含有量をピアスケミカル社製ＢＣＡ蛋白試薬で測
定することによって、ディッシュ１のポリペプチド（Ｆ
１）含有量を求めた結果、２．０μｇ／ｃｍ²であっ
た。ディッシュ１にイオン交換水１．５ｍｌ加え、１／
１００規定硝酸銀水溶液で電位差滴定することによっ
て、ディッシュ１の表面に存在するジメチルアミノ基の
量を求めた結果、１×１０¹⁷個／ｃｍ²であった。

【０１３３】＜実施例１６＞ポリペプチド（Ｆ１）の代
わりにポリペプチドＬを用いる以外は実施例１５と同様
にして、本発明のポリペプチド含有基材（ディッシュ
２）を得た。実施例１５と同様にして求めたディッシュ
２のポリペプチドＬ含有量は２．１μｇ／ｃｍ ²であ
り、また、１／１００規定硝酸銀水溶液で電位差滴定す
ることによって、測定されたジメチルアミノ基の量は、
１×１０¹⁷個／ｃｍ²であった。

【０１３４】＜比較例７＞ポリペプチド溶液（１）の代
わりに、ＰＢＳを用いる以外は実施例１５と同様にし
て、比較用のディッシュ３を得た。実施例１５と同様に
して求めたディッシュ３のジメチルアミノ基の量は４×
１０¹⁶個／ｃｍ²であった。

【０１３５】＜細胞培養＞得られたディッシュ１〜３を
用いて無血清細胞培養実験を行った。各ディッシュに、
インビトロジェン社製無血清培地ギブコＯｐｔｉＰｒｏ
−ＳＦＭに、ＭＤＣＫ細胞［大日本製薬（株）から購
入］を細胞濃度：２万個／ｍＬに分散したもの５ｍｌを
加え（総細胞数；１０万個）、二酸化炭素と空気の混合
物（二酸化炭素／空気＝５／９５体積比）中、３７℃で
３日間培養を行なった。ディッシュをトリプシンで処理
し細胞を浮遊させ、血球計数盤を用いて顕微鏡で細胞数
（万個）を測定した。その結果を表２に示す。

【０１３６】

【表２】

【０１３７】なお、比較例７のディッシュ３を用いて、
インビトロジェン社製無血清培地ギブコＯｐｔｉＰｒｏ
-ＳＦＭの代わりに、血清培地（ＦＢＳ１０％含有ＭＥ
ＭＥ）を用いた場合の細胞数は、６５万個であった。

【０１３８】以上の実施例及び比較例から、本発明のポ
リペプチド含有基材を用いた場合、無血清培養において
も血清培地を使用した場合と同様以上かつ、ポリペプチ
ド（Ｆ１）等単独をコーティングしたものよりも優れた
細胞接着性及び細胞増殖性が得られ、細胞を効率的に培
養できることが判る。

【０１３９】

【発明の効果】本発明の基材を用いると、無血清でも細
胞を効率的に培養が可能であり、動物細胞を用いる医薬
品やワクチンの生産の完全無血清化が実現できるもので
ある。

【０１４０】

【配列表】 <110>三洋化成工業株式会社；SANYO CHEMICAL INDUSTRIES,LTD. <120>ポリペプチド含有基材 <160>11 <210>1 <211>4 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>1 Arg Glu Asp Val 1 <210>2 <211>5 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>2 Tyr Ile Gly Ser Arg 1 5 <210>3 <211>5 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>3 Pro Asp Ser Gly Arg 1 5 <210>4 <211>7 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>4 Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg 1 5 <210>5 <211>6 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>5 Leu Gly Thr Ile Pro Gly 1 5 <210>6 <211>10 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>6 Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile 1 5 10 <210>7 <211>5 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>7 Ile Lys Val Ala Val 1 5 <210>8 <211>4 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>8 Asp Gly Glu Ala 1 <210>9 <211>6 <213>PRT <213>Bombyx mori <400>9 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 1 5 <210>10 <211>54 <213>PRT <213>Bombyx mori <400>10 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 20 25 30 Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Gly Ser 50 <210>11 <211>30 <213>PRT <213>Homo sapiens <400>11 Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro 20 25 30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞接着シグナルを現す最小アミノ酸配
列を１分子中に少なくとも１個有するポリペプチド
（Ｐ）を含んでなり、かつ２級アミノ基（Ａ１）、３級
アミノ基（Ａ２）、アンモニオ基（Ａ３）、ホスファチ
ジル基（Ａ４）及びリゾホスファチジル基（Ａ５）から
なる群より選ばれる少なくとも１つの官能基（Ａ）、並
びに／又は糖（Ｂ１）及びステロイド環（Ｂ２）から選
ばれる少なくとも１つの構造（Ｂ）を有してなることを
特徴とするポリペプチド含有基材。
【請求項２】ポリペプチド（Ｐ）と官能基（Ａ）及び
／又は構造（Ｂ）との全て又は一部が基材表面に存在し
てなる請求項１記載のポリペプチド含有基材。
【請求項３】ポリペプチド（Ｐ）の含有量（μｇ／ｃ
ｍ²）が基材の表面積１ｃｍ²当り０．１以上１００以下
である請求項１又は２に記載のポリペプチド含有基材。
【請求項４】ポリペプチド（Ｐ）の細胞接着シグナル
を現す最小アミノ酸配列の数が、（Ｐ）１分子中に３〜
５０個である請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプ
チド含有基材。
【請求項５】ポリペプチド（Ｐ）の細胞接着シグナル
を現す最小アミノ酸配列が、Arg Gly Asp配列、Leu Asp
Val配列、Arg Glu Asp Val配列（１）、TyrIle Gly Se
r Arg配列（２）、Pro Asp Ser Gly Arg配列（３）、Ar
g Tyr Val Val Leu Pro Arg配列（４）、Leu Gly Thr I
le Pro Gly配列（５）、Arg Asn IleAla Glu Ile Ile L
ys Asp Ile配列（６）、Ile Lys Val Ala Val配列
（７）、Leu Arg Glu配列、Asp Gly Glu Ala配列（８）
及びHis Ala Val配列からなる群より選ばれる少なくと
も１種の配列である請求項１〜４のいずれかに記載のポ
リペプチド含有基材。
【請求項６】官能基（Ａ）及び／又は構造（Ｂ）の含
有量が基材の表面積１ｃｍ²当り１×１０¹³〜1×１０²⁰
個である請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド
含有基材。
【請求項７】官能基（Ａ）が、ジメチルアミノ基、ト
リメチルアンモニオ基、ジエチルアミノ基、ジエチルメ
チルアンモニオ基及び／若しくはグアニジノ基、並びに
／又はジシアンジアミドとホルマリンとの重縮合物、ジ
シアンジアミドとジエチレントリアミンとの重縮合物、
エピクロルヒドリンとジメチルアミンとの付加重合物、
ジメチルジアリルアミンモニウムクロリド重合物及びジ
アリルアミン塩酸塩と二酸化硫黄との共重合物からなる
群より選ばれる少なくとも１つの重合体に含まれる２級
アミノ基、３級アミノ基、アンモニオ基、イミノ基、ア
ミジノ基及び／若しくはグアジノ基である請求項１〜６
のいずれかに記載のポリペプチド含有基材。
【請求項８】基材が、体積平均粒子径（μｍ）が５０
以上１００以下、かつ密度（ｇ／ｃｍ³）が１．０２以
上１．０４以下の微粒子である請求項１〜７のいずれか
に記載のポリペプチド含有基材。
【請求項９】スチレン及び多官能性モノマーを必須構
成単量体としてなる合成高分子を含んでなる請求項１〜
９のいずれか記載のポリペプチド含有基材。
【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載のポリ
ペプチド含有基材を用い、無血清培地にて動物細胞を培
養することを特徴とする動物細胞の生産方法。