CN114058569B - 一种动物细胞培养微载体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种动物细胞培养微载体，通过在经过处理的基质表面用交联活化剂交联不同的配基得到，使用安全性高，显著增加细胞的贴壁速度，微载体中复合型离子配基、氨基酸或多肽可使微载体表面具有动物明胶蛋白结构，为细胞提供良好的粘附生长环境，安全性显著提高，同时该微载体的鱼明胶蛋白与人体蛋白同源性差异大，避免了带来动物源病毒的风险，该微载体的制备过程简单易行，原材料价格低廉；制备得到的微载体可应用于大规模细胞、病毒和重组细胞产物(例如干扰素、酶、核酸、激素)的生产，本发明提供的微载体在动物细胞大规模培养方面的应用具有很大潜力。

Description

一种动物细胞培养微载体及其制备方法

技术领域

本发细胞培养领域，具体涉及一种动物细胞培养微载体及其制备方法。

背景技术

微载体培养：微载体以微小颗粒作为细胞贴附的载体，可提供相当大的贴附面积，由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使得细胞悬浮在培养液内，最终能够使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术。作为一种适合大规模动物细胞培养的研究生产技术，微载体培养对于研究动物细胞的结构、功能和分化以及生产许多重要的生物材料(如酶、激素、抗体、核酸、病毒、疫苗以及用于基因治疗的病毒载体)具有重要意义。

在实践操作中，动物细胞培养需要贴壁生长，但传统细胞培养所用容器(例如培养瓶、载玻片或其他容器)的比表面积较小，因此常规的贴壁细胞培养产生的细胞数量有限。而微载体作为一种微米级别的颗粒，具有高比表面积，贴壁细胞可以在其表面附着生长，并且通过搅拌悬浮在培养液中，可以实现每毫升几百万个细胞的产量。另外，微载体培养技术可以提供多种形式的细胞培养方式，如悬浮培养、灌注培养以及孔板培养等，这使得动物细胞培养具有更多选择性并且更加经济可行。

目前商业化微载体通常使用的基质有葡聚糖、纤维素、聚乙烯或其他聚合物等，为了增加细胞与微载体表面的相互吸引力，可以在微载体表面修饰正电荷，利用静电引力加快表面带有负电荷细胞的贴壁速度。目前市售的表面修饰正电荷的微载体主要有带二乙氨基乙基(DEAE)基团的交联葡萄糖颗粒，如GE Healthcare BioSciences AB(GE)的Cytodex1。而对于一些粘附力较低，体外贴壁较为困难的细胞，常用的微载体是以变性动物明胶蛋白——猪胶原蛋白作为配基，将动物明胶蛋白通过共价交联在基质为求上制备而成，如GE的Cytodex 3。此外一些微载体的动物胶原蛋白含有例如猪、牛等动物来源成分，会带来生物制品外源性病毒的风险从而引起安全性问题。而氨基酸、复合离子配基、多肽或者人工合成多肽具有和动物明胶蛋白相似的性质，能够为细胞提供良好的粘附生长环境，又不会在细胞培养中引入动物来源成分。因此，表面带有氨基酸或者多肽的微载体或者根据实际需要如何准备合适的配基已经成为本领域的研究的热点。

为了同时提高动物细胞在微载体表面的粘附速度和生长速率，并且克服动物来源成分带来的安全性问题，市场上迫切需要含电荷和氨基酸或者多肽双重作用的新型微载体，以建立在整个细胞培养过程中高效安全的系统和方案。

发明内容

本发明第一方面，提供一种含环氧类胺盐和氨基酸或者多肽双重作用的微载体及其制备和应用，该微载体不含动物源性成分。

进一步地，微载体不含动物源性成分，微载体的基质表面附有环氧类胺盐。

进一步地，基质是天然高分子或合成高分子，天然高分子为多糖；合成高分子为聚苯乙烯、聚乙烯/二氧化硅。

进一步地，基质为微球或薄片形状，微球的直径为60～250μm，薄片的比表面积为800～1500cm².g^-1。

微载体系统提供极大的培养表面积/体积比提供了高的细胞产量而无需凭借大容量的设备和单调的方法。相对于其他类型的单层培养而言，微载体培养需要相当少的空间，就可生产一定量的细胞或细胞产物。已经报道的不同载体的直径范围为10μm-5mm，众所周知，载体越小表面积越大。传统的单层技术小规模培养不可能达到高的培养表面积/体积比。而本发明制备的微载体直径和比表面积都较为优异，可以用在很少量细胞培养的情况下，并且能够保持高的细胞密度并且刺激细胞的生长。本发明优化的微载体大小以及比表面积可以促进均一的培养，使各种细胞优良地生长和高产。

进一步地，天然高分子为葡聚糖、琼脂糖或纤维素。

进一步地，环氧类胺盐为胺或胺盐，并具有取代或未取代的C_1-20直链或支链的烷烃或烯烃，取代的基团选自氨基、羟基或卤素。

优选地，环氧类胺盐为伯、仲、叔胺或季铵盐。

进一步地，氨基酸为精氨酸或赖氨酸，多肽序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。

以胶原蛋白为配基的微载体对细胞具有良好的相容性，可以用来培养较难生长的细胞。明胶是用于细胞培养的胶原蛋白最常用的形式，而本发明选取的多肽序列与明胶序列相似，具有与明胶相似的性质，可以采用化学的方法交联到基质上，避免了微载体表面配基的快速损失。以上述多肽序列制备得到的微载体能够加大细胞在微载体上的粘附力，有利于细胞的生长。同时，又完全没有动物性明胶带来的外源性病毒的风险，为一些表面粘附较弱的细胞类型提供了一个高粘附的安全性培养表面。

含环氧类胺盐和氨基酸或者多肽双重作用配基与基质的制备方法的技术方案如下：将环氧类胺盐共价接枝到基质上，用交联活化剂将氨基酸或多肽交联于带有环氧类胺盐的基质表面。

进一步地，交联活化剂选自含环氧基团的双官能团或多官能团取代的化合物；官能团选自卤素、氨基、烯烃基、胍基或羧基。

优选地，交联活化剂为烯丙基缩水甘油醚。

具体的制备步骤为：

1)基质的微球或薄片干粉加水膨胀后，加入碱溶液以提供碱性环境；

2)加入环氧类胺盐，在一定温度下反应使环氧类胺盐上的环氧基打开并与基质微球或薄片的表面的羟基进行反应；

3)加入交联活化剂，在一定温度下使其环氧基打开，与步骤(2)中环氧类胺盐开环后得到的羟基进行反应；

4)使交联活化剂在碱性条件下与氨基酸或多肽进行反应，制备得到微载体。

进一步地，步骤1)中的碱溶液为NaOH溶液，优选其浓度为0.5-2M，例如为0.5M、1.0M、1.5M、2M；每克微球或薄片中加入碱溶液0.5～5ml，例如0.5ml/g、1ml/g、1.5ml/g、2ml/g、2.5ml/g、3ml/g、3.5ml/g、4ml/g、4.5ml/g、5ml/g。

优选地，步骤1)中的碱溶液为1M NaOH溶液。

进一步地，步骤2)每克微球或薄片中环氧类胺盐的用量为1～10mmol，例如为1mmol/g、2mmol/g、3mmol/g、4mmol/g、5mmol/g、7mmol/g、9mmol/g、10mmol/g，优选为2-5mmol/g；步骤2)的反应温度为15～65℃，例如为15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，优选为55℃；步骤2)的反应时间为1～24h，例如为1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h，优选为8h。

优选地，步骤2)中环氧类胺盐的用量为2～5mmol/g。

进一步地，步骤3)每克微球或薄片中交联活化剂的用量为1～10mmol，例如为1mmol/g、2mmol/g、3mmol/g、4mmol/g、5mmol/g、7mmol/g、9mmol/g、10mmol/g，步骤3)中的交联温度为15～65℃，例如为15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，优选为55℃；步骤3)中的交联时间为1～24h，例如为1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h，优选为12h。

优选地，步骤3)中交联活化剂的用量为2～5mmol/g。

进一步地，步骤4)每克微球或薄片中氨基酸或多肽的用量为0.1～1mol，例如为0.1mol/g、0.2mmol/g、0.3mmol/g、0.4mmol/g、0.5mmol/g、0.6mmol/g、0.7mmol/g、0.8mmol/g，0.9mmol/g，1.0mmol/g，步骤3)中的反应温度为15～80℃，例如为15℃、30℃、45℃、60℃、75℃、80℃，优选为45℃；步骤3)中的反应时间为1～24h，例如为1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h，优选为24h。

优选地，步骤4)中氨基酸或多肽的用量为2～5mmol/g。

进一步地，步骤4)中多肽的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示。

进一步地，步骤4)的反应所需pH＝8～10，优选为pH＝9。

以上步骤制备的含环氧类胺盐和氨基酸或者多肽双重作用的微载体的有益效果为：

1)环氧类胺盐自带的环氧基团为其和基质微球或薄片的连接提供了可能性，无需外加交联活化剂，减少了化学试剂的使用，简化实验步骤，更为简便和经济；

2)带有C_1-20直链或支链烷烃或烯烃的环氧类胺盐，降低了多肽与基质微球或薄片的表面的空间位阻，使得多肽在基质微球或薄片表面的交联效率更高；

3)环氧类胺盐引入了正电荷，能够加快细胞在微载体上的贴壁速度；

4)通过交联活化剂与环氧类胺盐开环后羟基的反应，增加了链长，从而使得氨基酸或多肽向外延伸，减少细胞粘附时的位阻效应；

5)通过氨基酸或多肽的共价接枝，在不引入动物源性物质的前提下，可使微载体表面具有动物明胶蛋白结构，为细胞提供良好的粘附生长环境。

本发明的第二方面提供一种低风险动物来源成分的含环氧类胺盐且含正电荷集聚和鱼明胶蛋白覆层的细胞培养微载体。该微载体含环氧类胺盐和鱼明胶蛋白覆层，环氧类胺盐含正电荷聚集，微载体与环氧类胺盐化学交联，然后通过交联活化剂将鱼明胶蛋白连接到微载体的表面。

进一步地，环氧类胺盐为伯、仲、叔胺或季铵盐，并具有取代或未取代的C_1-20直链或支链的烷烃或烯烃，取代的基团选自氨基、羟基或卤素。

优选地，环氧类胺盐是2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)。

进一步地，基质为微球或薄片形状，微球的直径为60～250μm，薄片的比表面积为800～1500cm².g^-1。

进一步地，微载体的基质为微球或薄片状的多糖、合成高分子聚合物或二氧化硅，多糖为魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻酸盐或纤维素，合成高分子聚合物为聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯。

优选地，多糖为葡聚糖。

优选地，合成高分子聚合物为聚乙烯。

进一步地，交联活化剂为含环氧基团的双官能团或多官能团取代的化合物。

优选地，交联活化剂为环氧氯丙烷(ECH)，其中环氧氯丙烷(ECH)具有电荷修饰作用。

该微载体的制备方法，包括以下步骤：

1)微载体的基质微球或薄片干粉加水膨胀后，加入碱溶液以提供碱性环境；

2)加入环氧类胺盐，在一定温度下反应使环氧类胺盐上的环氧基打开并与基质的微球或薄片的表面的羟基进行反应；

3)加入交联活化剂，在一定温度下使其环氧基打开，与步骤2)中环氧类胺盐开环后得到的羟基进行反应；

4)活化后的基质的微球或薄片在碱性条件下与鱼明胶进行交联反应，形成鱼明胶蛋白覆层，制备得到微载体。

进一步地，步骤1)中碱溶液为NaOH溶液，优选其浓度为0.5～2M，例如为0.5M、1.0M、1.5M、2M，优选为1.0M，碱溶液相对于微球的添加量为0.1～5ml/g，例如0.1ml/g、0.5ml/g、1ml/g、2ml/g、3ml/g、4ml/g、5ml/g。

进一步地，步骤2)中环氧类胺盐相对于微球或薄片的用量为1～10mmol/g，例如为1mmol/g、2mmol/g、3mmol/g、4mmol/g、5mmol/g、7mmol/g、9mmol/g、10mmol/g，优选地，环氧类胺盐的用量为2～5mmol/g。步骤2)的一定温度为15～65℃，例如为15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，优选为55℃，反应时间为1～24h，例如为1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h，优选为8h。

进一步地，步骤3)中交联活化剂相对于微球或薄片的用量为0.1～3ml/g，例如为0.5mL/g、1.0mL/g、1.5mL/g、2.0mL/g、2.5mL/g、3.0mL/g，优选为0.5～1.5mL/g，步骤3)的一定温度为15～65℃，例如为15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，优选为30℃。步骤3)的反应时间为1～24h，例如为1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h，优选为2h。

进一步地，步骤4)中鱼明胶的鱼明胶蛋白分子量为2000～30000，鱼明胶相对于微球的用量为0.01～10mmol/g。

优选地，鱼明胶蛋白的分子量为7000～15000。

优选地，步骤4)中鱼明胶的使用量为0.01～1mmol/g。

进一步地，步骤4)的反应温度为15～80℃，例如为15℃、30℃、45℃、60℃、75℃、80℃，优选为45℃。步骤4)的反应时间为1～24h，1h、4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h，优选为5h。步骤4)的反应碱性环境pH值为9～10，优选为pH值为9.5。

低风险动物来源成分的含环氧类胺盐且含正电荷集聚和鱼明胶蛋白覆层的细胞培养微载体在动物细胞培养中的应用。

进一步地，含正电荷集聚和鱼明胶蛋白覆层的细胞培养微载体在吸附较慢且贴壁依赖性的动物细胞的高质量高密度培养中的应用。

含正电荷集聚和鱼明胶蛋白覆层的细胞培养微载体的有益效果为：

(1)该微载体通过环氧类胺盐的交联以及ECH的活化，在基质微球表面接臂，从而使得鱼明胶配基向外伸展减少了细胞粘附是的空间位阻。

(2)微载体交联的环氧类胺盐含有正电荷集聚，其与带有负电荷细胞的相互作用吸引可提高细胞的吸附速率。

(3)微载体基质表面连接有鱼明胶，相较现有的Cytodex 3采用的猪明胶，鱼明胶与人体蛋白的同源性差异性较大，可以降低给人体带来动物源病毒的风险。

(4)本发明的微载体既能充分发挥鱼明胶蛋白的促进和调控细胞生长的功能，又能发挥集聚正电荷基质易于黏附细胞的优势，对于一些吸附较慢且贴壁依赖性细胞的高质量高密度培养，该新型微载体是首选。

本发明第三方面提供一种无动物来源成分的含有复合型离子配基的微载体及其制备方法。

利用交联活化剂将复合型离子配基交联于多糖基质表面进而合成一种无动物来源成分的微载体。

本发明的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供了一种动物培养用微载体，由基质和配基交联而成，其中，基质为微球或薄片形状，微球的直径为60～250μm，薄片的比表面积为800～1500cm².g^-1。微载体基质为微球或薄片状的多糖，配基为复合型离子配基，复合型离子配基通过交联活化剂交联于基质表面。

进一步地，多糖包含琼脂糖、葡聚糖、纤维素或淀粉。

优选地，多糖为葡聚糖。

进一步地，复合型离子配基具有以下通式：

其中，R是C1～C12直链烷基、C4～C8环烷基、不饱和芳香烃基团；S是-SH，-OH，-NH₂基团；n是0～8；m是0～1；X₁是C0～C4烷基；X₂＝C0～C4烷基。

进一步地，交联活化剂选自含环氧基团的双官能团或多官能团取代的化合物。

进一步地，官能团选自卤素、氨基、烯烃基、胍基或羧基。

优选地，交联活化剂为烯丙基缩水甘油醚。

复合型离子配基微载体的制备方法包括以下步骤：

1)一定温度下，加入氢氧化钠溶液，使交联活化剂和基质微球或薄片表面的羟基进行反应；

2)将溴水加入到步骤1)产物中，使其溴化；

3)使步骤2)中溴化后的产物与复合型离子配基进行反应。

进一步地，步骤1)中交联活化剂用量为0.1～1ml/g微球或薄片，氢氧化钠用量为0.1～1g/g微球或薄片，反应温度为10～85℃。

进一步地，步骤2)中溴水用量为0.1～1g/g微球或薄片，反应温度为15～65℃，反应时间为0.5～3h。

进一步地，步骤3)中复合型离子配基用量为0.1～1mol/g微球或薄片，反应温度为15～80℃，反应时间为1～24h。

复合型离子配基微载体在动物细胞培养中的应用。

复合型离子配基微载体的有益效果为：

(1)微载体表面配基为复合型离子配基，都属于非动物来源，不仅有利于纯化，而且避免了使用动物胶原蛋白带来的病毒风险，更具安全性，有利于产品的申报和监管。

(2)该微载体既为细胞贴壁生长提供了带电荷的结合位点，有利于细胞的快速贴附和高密度生长，能够实现更优的细胞培养效果，并且制作该微载体的成本低、周期短，更利于形成工业化生产模式。

(3)该微载体也解决了在细胞大规模培养过程中因引入动物性来源成分而可能带来的产品安全问题。

(4)该微载体的制备工艺简单，并且可以重复多次使用，适用于工业化生产。

本发明第四方面提供一种无动物来源的细胞培养用微载体，该微载体包含有人工合成多肽覆层。该微载体包括基质和配基，配基为人工合成多肽，基质的表面通过烯丙基缩水甘油醚(AGE)进行活化偶联，微载体表面包含交联的人工合成多肽覆层及正电荷集聚。

进一步地，基质为多糖、合成高分子聚合物微球或二氧化硅。

进一步地，基质为微球或薄片形状，微球的直径为60～250μm，薄片的比表面积为800～1500cm².g^-1。

进一步地，多糖为魔芋葡甘聚糖、葡聚糖、壳聚糖、琼脂糖、海藻酸盐或纤维素。

优选地，多糖为葡聚糖。

进一步地，合成高分子聚合物为聚乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯。

优选地，合成高分子聚合物为聚乙烯。

进一步地，人工合成多肽包括如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.11所示的人工合成多肽以及多聚组氨酸、多聚赖氨酸或含有上述多肽片段的蛋白。

人工合成多肽覆层微载体的制备方法，包括如下步骤：

1)多糖微球或薄片干粉加水膨胀后，加入碱溶液提供碱性环境；

2)加入烯丙基缩水甘油醚后搅拌，使烯丙基缩水甘油醚的环氧基打开并与葡聚糖微球或薄片表面的羟基反应共价偶联；

3)加入溴水，打开烯丙基缩水甘油醚的醚键，在碱性条件下与人工合成多肽上的氨基进行反应，使人工合成多肽接枝到多糖微球表面形成多肽覆层制，得到微载体。

进一步地，步骤1)中碱溶液为NaOH溶液，其浓度为0.5-2M，例如为0.5M、0.75M、1.25M、1.75M、2M。

进一步地，步骤1)中碱溶液的加入量为1～15ml/g微球或薄片。

进一步地，步骤1)中碱溶液的加入量为5ml/g、6ml/g、7ml/g、8ml/g、9ml/g、10ml/g、11ml/g、12ml/g、13ml/g、14ml/g、15ml/g微球或薄片。

优选地，步骤1)中碱溶液的加入量为9～12ml/g微球或薄片。

进一步地，步骤2)的反应温度为15～65℃。

进一步地，步骤2)的反应温度为15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃。

进一步地，步骤2)的反应时间为12～24h。

进一步地，步骤2)的反应时间为12h、16h、20h、24h。

进一步地，步骤3)中人工合成多肽的用量为0.1～100mmol/g微球或薄片。

进一步地，步骤3)中人工合成多肽的用量为0.1mmol/g、1mmol/g、10mmol/g、20mmol/g、30mmol/g、40mmol/g、50mmol/g、60mmol/g，70mmol/g，80mmol/g，90mmol/g，100mmol/g微球或薄片。

优选地，步骤3)中人工合成多肽的用量为为10-50mmol/g微球或薄片。

进一步地，步骤3)的反应温度为15-80℃。

进一步地，步骤3)的反应温度为15℃、30℃、45℃、60℃、75℃、80℃。

进一步地，步骤3)的反应时间为1-24h。

进一步地，步骤3)的反应时间1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h。

人工合成多肽覆层微载体在动物细胞培养中的应用。

人工合成多肽覆层微载体的有益效果：

(1)以人工合成多肽作为配基，不含有动物源成分，但具备与动物明胶蛋白相似的表面结构，可以达到细胞良好依附作用，且其含有正电荷集聚，可以提高细胞的吸附速率；

(2)配基通过烯丙基缩水甘油醚的交联，在葡聚糖表面形成了一个立体的稳固的空间结构，可以减少在细胞培养过程中的配基脱落；

(3)通过烯丙基缩水甘油醚作为配基与微球表面的接臂，可以使多肽的向外衍生，有利于细胞的快速吸附。

本发明第五方面，提供了一种枝接了动物明胶蛋白的细胞培养用微载体，微载体包括形状为微球或薄片的基质和配基，微球基质为纤维素、聚乙烯/二氧化硅或多糖，微球或薄片具有酰亚胺盐与氨基酸形成酰胺键，配基接枝在微球基质的碳原子延伸臂上，配基为动物明胶蛋白，碳原子延伸臂的数量≥1。进一步地，微球的直径为60～250μm，薄片的比表面积为800～1500cm².g^-1。

进一步地，微球或薄片基质为葡聚糖、甘露聚糖或半乳聚糖。

进一步地，微球或薄片基质为半乳聚糖(琼脂糖)，半乳聚糖浓度为1～10％。

优选地，半乳聚糖浓度为4％。

进一步地，酰亚胺盐为N-羟基琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、戊二酰亚胺、马来酰亚胺。

优选地，酰亚胺盐为N-羟基琥珀酰亚胺；

进一步地，氨基酸为氨基甲酸、氨基丁酸、氨基己酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。

进一步地，动物明胶蛋白包括猪明胶、牛明胶、驴明胶、鱼明胶。

优选地，动物明胶蛋白为鱼明胶。

枝接动物明胶蛋白微载体的制备方法包括如下步骤：

(a)微球或薄片的干粉加水溶胀，加入碱液和活化剂，将微球基质活化，每克微球基质对应加入活化剂1～10mmol，活化时的反应温度为15～65℃，反应时间为1～24h；

(b)向活化后的微球或薄片加入溴，进行溴化反应；

(c)向步骤b)获得的微球基质加入氨基酸和酰亚胺盐，使氨基酸和酰亚胺盐与活化后的微球基质偶联，形成酰胺键，获得预活化的微球基质，预活化的微球带有多个碳原子延伸臂；

(d)加入动物明胶蛋白，通过接枝反应，使动物明胶蛋白接枝在预活化的微球基质上，得到微载体产品；

(e)将步骤d)中得到的产品经酒精洗、丙酮洗，再真空烘干至形成干粉，得最终微载体产品。

进一步地，碱液为NaOH溶液或KOH溶液。

进一步地，碱液为NaOH溶液，其浓度为0.5～2M，例如为0.5M、1.0M、1.5M、2M。

进一步地，NaOH溶液的添加量为0.5～5mL/g微球或薄片，例如0.5ml/g、1ml/g、1.5ml/g、2ml/g、2.5ml/g、3ml/g、3.5ml/g、4ml/g、4.5ml/g、5ml/g。

进一步地，活化剂为环氧基团的双官能团或多官能团取代的化合物，官能团选自卤素、氨基、烯烃基、胍基或羧基。

优选地，活化剂为烯丙基缩水甘油醚。

进一步地，步骤1)中活化剂的加入量为1～10mmol/g微球或薄片，例如为1mmol/g、2mmol/g、3mmol/g、4mmol/g、5mmol/g、7mmol/g、9mmol/g、10mmol/g，优选为2～5mmol/g；步骤1)的交联反应温度为15～65℃，例如为15℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃；步骤1)的交联反应时间为1～24h，例如为1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h。

进一步地，步骤4)中动物明胶蛋白用量为0.1～100mmol/g微球或薄片，例如为0.1mmol/g、1mmol/g、10mmol/g、20mmol/g、30mmol/g、40mmol/g、50mmol/g、60mmol/g，70mmol/g，80mmol/g，90mmol/g，100mmol/g，优选为10～50mmol/g。

进一步地，步骤4)的反应温度为15～80℃，例如为15℃、30℃、45℃、60℃、75℃、80℃。

进一步地，步骤4)的反应时间为1～24h，例如为1h、4h、8h、12h、16h、20h、24h。

枝接动物明胶蛋白微载体在细胞、病毒或者细胞产物的培养、体外细胞研究、常规细胞的培养中的应用。

枝接动物明胶蛋白微载体的有益效果为：

(1)本发明的细胞培养用微载体基质原料为半乳聚糖(琼脂糖)，该多糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体，适于细胞培养；半乳聚糖(琼脂糖)相比其他多糖，价格较低，适于微载体产品的大规模生产。

(2)本发明选用的活化剂为环氧基团的双官能团或多官能团取代的化合物，这是一类含不饱和碳碳双键和环氧基的活泼单体，具有良好的水溶性和表面活性，该活化反应简单易控，操作方便。

(3)微球或薄片基质是带有多个碳原子的延伸臂，降低了配基与基质表面的空间位阻，在微载体的制备过程中避免使用剧毒原料，使得制备过程简单易操作，降低了生产成本。

(4)该微载体是由以下合成路径制备所得：①琼脂糖经AGE活化；②溴化；③偶联氨基酸和动物明胶蛋白。由以上步骤所得微载体，酰亚胺盐与蛋白形成酰胺键，化学稳定性强，使得最终微载体产品反复利用的次数比普通微载体多近一倍，使用效率大大提高。

(5)接枝反应用无水乙醇做溶剂，无水乙醇是实验室常用的助分散剂，使得反应体系分散均匀，更有利于接枝反应的进行；并且无水乙醇是无毒、无腐蚀性，不管对于反应过程还是最终产品都更加安全；预活化的基质微球在无水乙醇中的体积相比于在盐溶液中的体积小很多(相比传统的反应溶剂可缩小近三分之二的体积)，这样不仅可以缩小反应体系有利于规模化生产，也节省了相关原料的使用和清洗步骤中有机溶剂的使用。

附图说明

下面结合附图说明优选实施例，对本发明的重组Protein A蛋白进行进一步解释说明。

图1为以猪胶原蛋白为配基，葡聚糖凝胶为基质的微载体(Cytodex 3)合成路线图；

图2为以葡聚糖凝胶为基质，共价接枝2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，并通过烯丙基缩水甘油醚交联氨基酸/多肽的微载体合成路线图；

图3以葡聚糖凝胶为基质，通过烯丙基缩水甘油醚交联氨基酸/多肽的新型微载体合成路线图；

图4为实施例1和Cytodex 3培养Vero细胞的显微镜照片；

图5为细胞增长曲线对比示意图；

图6为接枝环氧类胺盐微载体的合成路线图；

图7为接枝环氧类胺盐微载体和Cytodex 3培养Vero细胞的显微镜照片；

图8为实施例5所制接枝环氧类胺盐微载体与Cytodex3培养Vero细胞的生长曲线示意图；

图9为通过烯丙基缩水甘油醚交联活化复合型离子配基于葡聚糖表面的合成路线图；

图10为交联复合型离子配基微载体和Cytodex 3培养Vero细胞的显微镜照片；

图11为交联复合型离子配基微载体和Cytodex 3细胞增长曲线对比图；

图12为人工合成多肽微载体的合成路线图；

图13为人工合成多肽微载体与Cytodex3培养Vero细胞的显微镜照片；

图14为人工合成多肽微载体与Cytodex3培养Vero细胞的生长曲线；

图15是本发明实施例11微载体产品的合成机理；

图16是实施例11微载体产品和Cytodex3细胞培养密度对比示意图；

图17是实施例11微载体产品和Cytodex3细胞培养镜检对比示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于下列实施例。实施例中提供相关附表及附图，可用于解释本发明实施例的实验原理，本领域普通技术人员可参考该内容理解本发明的优势。如无特殊说明均为常规方法。

实施例1

含2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTA)与精氨酸(多聚精氨酸)配基的微载体的制备。

(1)GTA与葡聚糖微球或葡聚糖薄片交联

取100g葡聚糖加入到圆底烧瓶，加入1kg纯净水，充分搅拌使其溶胀，加入110gNa₂SO₄，在30℃搅拌1小时后，将15ml 1M氢氧化钠溶液加入到圆底烧瓶中，搅拌溶解后，升温至55℃，加入50g GTA反应8小时。产物用无水乙醇沉洗涤3次，纯化水洗涤一次，抽滤得到葡聚糖-GTA凝胶。

(2)烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球或薄片

取100g步骤(1)中制备的葡聚糖-GTA加入圆底烧瓶中，加入1kg纯净水，加入70g氢氧化钠，搅拌溶解后加入烯丙基甘油醚，在55℃反应12小时。12小时后，依次用10倍体积的纯化水、乙醇、纯化水洗涤得到的活化凝胶。

(3)溴化烯丙基甘油醚

取1L步骤(2)中制备的活化凝胶加入圆底烧瓶，在圆底烧瓶中加入250mL纯化水和30g无水乙酸钠。充分搅拌后，在圆底烧瓶中加入溴水直至瓶内液体变黄色。溴化10分钟，后加入甲酸钠终止反应直至黄色消失。随后搅拌反应30分钟，并抽滤。

(4)交联精氨酸(多聚精氨酸)配基

在1L水中加入100g多聚精氨酸，完全溶解后，加入步骤(3)中制备的凝胶。用氢氧化钠调节pH至9.0，在45℃下反应24小时后，依次用100mM的Tris缓冲溶液(pH 8.0)和50mM的醋酸缓冲溶液(pH 4.0)反浸洗5次，最后用0.9％的氯化钠溶液浸洗一次。洗涤完成后用丙酮脱水，并在70℃烘箱中干燥。

实施例2

含GTA与赖氨酸(多聚赖氨酸)配基的微载体的制备。

操作步骤与实施例1相同，步骤4)中的精氨酸(多聚精氨酸)替换为赖氨酸(多聚赖氨酸)。

实施例3

含精氨酸(多聚精氨酸)配基的微载体的制备。

(1)烯丙基甘油醚活化葡聚糖微球或薄片

取100g葡聚糖加入圆底烧瓶中，加入1kg纯化水，充分搅拌使其溶胀，加入110gNa₂SO₄，将70g氢氧化钠加入到圆底烧瓶中，搅拌溶解后加入烯丙基甘油醚，在55℃反应12小时。12小时后，依次用10倍体积的纯化水、乙醇、纯化水洗涤得到的活化凝胶。

(2)溴化烯丙基甘油醚

取1L步骤(2)中制备的活化凝胶加入圆底烧瓶，在圆底烧瓶中加入250mL纯化水和30g无水乙酸钠。充分搅拌后，在圆底烧瓶中加入溴水直至瓶内液体变黄色。溴化10分钟，后加入甲酸钠终止反应直至黄色消失。随后搅拌反应30分钟，并抽滤。

(3)交联精氨酸(多聚精氨酸)配基

在1L水中加入100g多聚精氨酸，完全溶解后，加入步骤(3)中制备的凝胶。用氢氧化钠调节pH至9.0，在45℃下反应24小时后，依次用100mM的Tris缓冲溶液(pH 8.0)和50mM的醋酸缓冲溶液(pH 4.0)反浸洗5次，最后用0.9％的氯化钠溶液浸洗一次。洗涤完成后用丙酮脱水，并在70℃烘箱中干燥。

实施例4

用微球状微载体培养非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)。

(1)细胞培养

使用实施例1、实施例2、实施例3制备得到的微载体和猪胶原蛋白微载体(Cytodex3，对照组)对非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)进行培养，具体方法如下：

将微载体在磷酸缓冲溶液(PBS)中溶胀后高压灭菌，并用含青霉素/链霉素的培养基洗涤两次。用细胞培养基稀释微载体，使其浓度为6g/L。将Vero细胞接种于12孔培养板中，接种密度为2×10⁵cells/mL，随后取1mL上述浓度为6g/L的微载体加入到相应的培养孔中，并且在充有7％CO₂的培养箱中保温过夜。

(2)细胞计数与观察

当实施例1、实施例2、实施例3制备得到的微载体和Cytodex 3分别连续培养细胞6h，24h，72h，120h和144h时，用显微镜观察细胞的生长情况。结果显示，用细胞接种后6小时细胞开始附着，12小时后已经开始贴壁生长，72小时后，表面已被细胞覆盖。在培养144小时后，细胞计数器显示，实施例1、实施例2培养的细胞密度分别可达9.65×10⁵/mL和9.75×10⁵/mL，实施例3培养的细胞密度为7.52×10⁵/mL，而对照样Cytodex 3培养的细胞为8.79×10⁵/mL。结果表明，实施例1、实施例2、制备得到的微载体适用于Vero细胞生长，并能实现细胞高密度培养，比Cytodex 3效果更为优异，可用于动物细胞的大规模培养。

实验结果如表1、图4、图5所示。

表1，细胞计数统计表

实施例5

接枝环氧类胺盐微载体的制备。

本实施例中葡聚糖微球或薄片与GTA反应，制备流程如图6所示，常规的猪胶原蛋白微载体制备流程如图1所示。

称取100g葡聚糖，加入1000g纯化水，充分搅拌。葡聚糖溶胀后，加入110g Na₂SO₄，调节温度至30℃，搅拌反应1h后，加入15ml 1M氢氧化钠溶液，调节温度至55℃，加入50gGTA反应8小时。将反应制得产物依次使用无水乙醇和纯化水各洗涤3次，抽干得到产物凝胶。

ECH活化

取100g上述交联葡聚糖凝胶，加入200mL纯化水，加入2g氢氧化钠，加入100mL环氧氯丙烷，在30℃下恒温反应2h，活化反应结束后，使用纯化水洗涤。

交联鱼明胶蛋白

取上述葡聚糖活化微球或薄片50g，加入鱼明胶蛋白24g，加入150mL浓度为0.1mol/L缓冲液(pH＝9.5)，45℃下搅拌反应5h。冷水冷凝，用PBS缓冲液清洗并抽干，再加入150mL PBS缓冲液和2.5mL浓度为25％的戊二醛，45℃下搅拌反应5h。反应结束后，凝胶抽干，依次纯化水和PBS缓冲溶液洗涤3次再抽干，制得鱼明胶覆层的微载体。

实施例6

用接枝环氧类胺盐的微球状微载体培养非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)。

(1)细胞培养

使用接枝环氧类胺盐微载体培养和猪胶原蛋白微载体(Cytodex 3，对照组)对非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)进行培养，具体方法如下：

将微载体在磷酸缓冲溶液(PBS)中溶胀后高压灭菌，并用含青霉素/链霉素的培养基洗涤两次。用细胞培养基稀释微载体，使其浓度为6g/L。将Vero细胞接种于12孔培养板中，接种密度为2×10⁵cells/mL，随后取1mL上述浓度为6g/L的微载体加入到相应的培养孔中，并且在充有7％CO₂的培养箱中保温过夜。

(2)细胞计数与观察

当接枝环氧类胺盐微载体培养和猪胶原蛋白微载体分别连续培养细胞6h、24h、48h、96h时，用显微镜观察细胞的生长情况(图7)。结果显示，用新型微载体培养的细胞接种后4小时细胞开始附着，20小时后已经开始贴壁生长，48小时后，表面大部分被细胞覆盖，96小时后，表明基本被细胞覆盖。而对照样Cytodex 3培养的细胞在接种后6小时开始附着，22小时开始贴壁生长，48小时后，表面大部分被细胞覆盖，96小时后，表面也基本被细胞覆盖。

细胞接种96小时后，细胞计数器显示，新型微载体培养的细胞密度可达0.9×10⁶/mL，而对照样Cytodex 3培养的细胞为0.8×10⁶/mL。结果如图7、图8所示。

实施例7复合型离子配基微载体的制备

传统Cytodex 3合成路线图为图1，图9为本发明复合型离子配基微载体的合成技术路线图。

动物细胞培养用复合型离子配基微载体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

1.利用烯丙基缩水甘油醚活化多糖基质微球或薄片：

取100g基质干粉(葡聚糖微球或薄片)加入三颈烧瓶中，加入1kg水并搅拌使其充分溶胀。加入110g固体硫酸钠，搅拌均匀后，继续加入70g固体氢氧化钠。搅拌溶解后，在三颈烧瓶中加入50mL烯丙基缩水甘油醚，在55℃下反应12小时。12小时后，分别用10倍体积的纯化水、酒精、纯化水依次洗涤4-5遍。

2.溴化烯丙基缩水甘油醚：

将1L烯丙基缩水甘油醚活化的葡聚糖微球或薄片加入到三颈瓶中，并加入250mL水。加入30g的无水乙酸钠并充分搅拌。加入溴水直至悬液呈黄色后，继续溴化10分钟。加入甲酸钠终止反应至黄色消失。继续搅拌30分钟后将凝胶在一烧结玻璃漏斗中抽干。

3.交联复合型离子配基

将100g配基溶液溶解于1L水中并制成0.1g/mL的配基溶液，加入到抽干的葡聚糖凝胶中并用NaOH调pH值至9.0。45℃条件下反应24小时后，依次用100mM的Tris缓冲液(pH8.0)，50mM醋酸缓冲液(pH4.0)，浸洗5次，然后用0.9％的NaCl溶液浸洗一次。将洗涤好的微载体过滤，用丙酮脱水后再70℃的烘箱中彻底干燥。将干燥好的微载体放置于密闭容器中保存。

步骤(1)～(3)的反应体系中所涉及的各物料用量可按比例缩放。

本实施例中动物细胞培养用微载体的制备方法如下所示：

以葡聚糖微球或薄片为基质，烯丙基缩水甘油醚为交联活化剂，将表2中复合型离子配基1～12分别按照实验步骤(1)～(3)交联到葡聚糖基质表面，得到对应的细胞培养用微载体1～细胞培养用微载体12。

(R＝C1～C12直链烷基、C4～C8环烷基、不饱和芳香烃基团；S＝-SH，-OH，-NH₂基团；n＝0～8；m＝0～1；X₁＝C0～C4烷基；X₂＝C0～C4烷基)

表2复合型离子配基结构表

实施例8

用微球状微载体培养非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)

1.细胞培养

将本发明制备的细胞培养用微载体1用于培养Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)，并且与Cytodex 3(猪胶原蛋白微载体)进行对照实验，以检验本发明所制备的微载体的性能，具体方法如下：

通过上述实施例制备获得微载体后，用D-PBS浸泡3小时，在120℃的环境下进行湿热灭菌20分钟，灭菌结束后将浸泡微载体的D-PBS的DMEM培养基浸泡12小时。

2.细胞计数与观察

在显微镜下观察分别用细胞培养用微载体1及猪胶原蛋白微载体连续培养6小时、24小时、72小时、120小时和144小时的细胞生长情况(如图10、11所示)。用细胞培养用微载体1培养Vero细胞，接种6小时后细胞开始附着，培养24小时后细胞已开始贴壁生长，培养72小时后，细胞已覆盖微载体表面。用复合型离子配基制备而成的非动物来源性微载体较市售的猪胶原蛋白微载体培养效果更佳。

细胞计数统计结果如表3所示，比较结果如图10、11所示。

表3，细胞计数统计表

动物细胞培养技术对于生产疫苗、抗体和基因工程产品具有重要意义。利用微载体培养，有利于贴壁培养的动物细胞贴附于微载体表面而悬浮生长，不仅极大地提高了细胞的生长密度，而且有效缩短了细胞的生长时间。从对比试验可以发现，利用复合型离子配基，用烯丙基缩水甘油醚作为交联活化剂将其交联于葡聚糖(G50)表面进而合成一种无动物来源成分的微载体更适合Vero细胞贴壁生长，并且实现细胞高密度培养，细胞计数显示细胞密度可达9.35×10⁵/mL，与目前市售的猪胶原蛋白微载体的效果无区别。本发明的微载体与猪胶原蛋白微载体对动物细胞培养的作用相同，完全可以替代猪胶原蛋白微载体用于动物细胞的大规模培养。

实施例9人工合成多肽微载体的制备

如图12示，人工合成多肽微载体的制备步骤如下:

1.葡聚糖微球或薄片的活化：将100g葡聚糖干粉加入1000g蒸馏水，搅拌，使其充分溶胀，加入固体硫酸钠110g，30℃下搅拌1h，加入1M NaOH溶液15mL，充分搅拌溶解，将温度提升到55℃，加入烯丙基缩水甘油醚反应12h，结束后用大量的乙醇和蒸馏水依次洗涤一遍；

2.溴化：在活化葡聚糖微球或薄片中加入250mL蒸馏水，加入30g的无水乙酸钠，充分搅拌。再加入溴水充分反应直至悬液呈现黄色，持续溴化10分钟后，使用甲酸钠以终止溴化反应，直至悬液黄色消失，继续搅拌0.5h，将反应产物凝胶过滤抽干；

3.交联人工合成多肽链配基：配制0.1g/mL的配基溶液1L，将其倒入葡聚糖凝胶中，加入NaOH溶液调节pH值(pH＝9.0)，调整温度至45℃，反应20h。反应结束后，使用100mM的Tris缓冲液浸洗5次，使用50mM醋酸缓冲剂浸洗5次，再使用0.9％的NaCl溶液浸洗1次。洗涤后的微载体用丙酮脱水，并置于65℃的烘箱中直至干燥，彻底干燥后密封保存。

本实施例所述反应步骤相关物料都可等比例放大制得该多肽链微载体。该微载体颗粒的直径分布在60μm到250μm之间，薄片基质的比表面积为比表面积为800～1500cm².g^-1，表面电荷的密度为30～200μmol/mL，培养试验表明此微载体适于Vero细胞贴壁生长，细胞密度可达1×10⁶/mL以上。

作为对比，商品化的猪胶原蛋白微载体(Cytodex 3)合成路线图如图15所示。

实施例10用人工合成多肽的微球状微载体培养非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)

(1)细胞培养

使用人工合成多肽微载体对非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)进行培养，并且设立试验对照组，用猪胶原蛋白微载体(Cytodex 3)进行培养，最后观察生长细胞密度，比较分析本发明微载体的性能。具体方法如下：

将微载体在磷酸缓冲溶液(PBS)中溶胀后高压灭菌，并用含青霉素/链霉素的培养基洗涤两次。用细胞培养基稀释微载体，使其浓度为6g/L。将Vero细胞接种于12孔培养板中，接种密度为2×10⁵cells/mL，随后取1mL上述浓度为6g/L的微载体加入到相应的培养孔中，并且在充有7％CO₂的培养箱中保温过夜。

(2)细胞计数与观察

当人工合成多肽微载体培养和猪胶原蛋白微载体分别连续培养细胞6h、24h、72h和144h时，用显微镜观察细胞的生长情况。结果显示，用人工合成多肽微载体培养的细胞接种后6小时细胞开始附着，24小时后已经开始贴壁生长，72小时后，表面基本被细胞覆盖，144小时后细胞表面全部被细胞覆盖。144小时后，细胞计数器显示，人工合成多肽微载体培养的细胞密度可达1.21×10⁶/mL，对照样Cytodex 3培养的细胞为1.19×10⁶/mL。分析结果可知，本发明的提供的人工合成多肽微载体相比Cytodex 3的细胞培养效果相近，甚至更优。以上观察及检测结果如图13、图14所示。

实施例11

接枝动物明胶蛋白微载体的合成机理如图15所示，具体制备方法如下：

1)活化：取50g半乳聚糖(琼脂糖)的微球或薄片干粉加入1000ml三口烧瓶中，再加入500ml纯净水，加入70g NaOH和40g烯丙基缩水甘油醚，55℃，150rpm搅拌反应12h；后用纯净水抽洗4-5遍，直至将碱液与未反应的物质清洗干净(用pH试纸测滤液酸碱性，显中性即为清洗干净)，得半乳聚糖(琼脂糖)-AGE活化凝胶微球或薄片，即活化的微球或薄片基质。

2)溴化：取步骤(1)中得到的半乳聚糖(琼脂糖)-AGE活化凝胶微球或薄片加入到1000ml三口烧瓶，加入125ml纯净水和15g无水乙酸钠，充分搅拌均匀；再缓慢滴加入溴水直至反应体系变黄，27℃，150rpm搅拌反应15min；后加入甲酸钠终止反应，待黄色消失后继续搅拌30min；将反应液用纯净水抽洗4-5遍。

3)交联：取上述步骤2)中得到的微球或薄片加入1000ml三口烧瓶中，加入35gNaOH，50g氨基甲酸，50℃，150rpm，搅拌反应18h；后加入25g N-羟基琥珀酰亚胺，27℃，150rpm，搅拌反应12h；后用纯净水抽洗4-5遍，得预活化微球。

4)接枝：将抽干后的预活化微球或薄片加入1000ml三口烧瓶中，加入无水乙醇200mL，再加入10g鱼明胶蛋白，37℃，150rpm，搅拌反应18h。

5)反应结束后，将其全部倒入500mL砂芯漏斗中，真空抽干，再用纯净水抽洗6-8遍，直至将未反应的物质洗干净，用pH计测滤液的pH(pH＝4-5)，用电导率仪测其电导(G≤20us/cm)，即为清洗干净，得到的最终微载体产品。

6)将抽干后的微载体用无水乙醇抽洗3-4遍，再用丙酮抽洗2-3遍，最后放入真空干燥箱烘干，得细胞培养用微载体干粉产品。

实施例12

1)使用实施例11中的微球状微载体和猪胶原蛋白微载体(Cytodex3，对照组)对非洲绿猴肾细胞系(vero细胞)进行培养，参照实施例4的步骤进行。

当实施例11中制备微载体和Cytodex3分别连续培养6h，24h，48h，72h，96h，120h，144h时，用显微镜观察细胞的生长情况，实验结果如下表4，图16，图17所示，结果表明，在同一条件下进行细胞培养，使用Cytodex 3微载体培养的Vero细胞密度最大是1.2×10⁶cell/mL，而使用实施例11制备的微载体培养Vero细胞密度最大是1.3×10⁶cell/mL。由此可见，实施例11中制备的微载体能够达到甚至优于市面上同类型的主要产品，可在无哺乳动物源性成分的前提下，实现安全可靠的大规模培养细胞。

实施例13

微球状微载体接枝蛋白稳定性分析，步骤如下：

取8g实施例11中微载体和Cytodex 3用500mL PB缓冲液浸泡，分别于15天、1个月、3个月、6个月、12个月取上清液，用考马斯亮染色法测蛋白浓度，将结果记录在表5中。将12个月后实施例11的微载体灭菌后培养Vero细胞，培养144h后，细胞密度达到1.34×10⁶cell/mL，与新制微载体效果相同。

实施例14

由上可得微载体接枝胶原蛋白稳定，不会脱落，且优于市面上常见的微载体Cytodex 3。

表4，细胞计数统计表

实施例编号

0h

6h

24h

48h

72h

96h

120h

144h

实施例11

2.11×10<sup>5</sup>

1.57×10<sup>5</sup>

3.62×10<sup>5</sup>

5.74×10<sup>5</sup>

8.01×10<sup>5</sup>

9.87×10<sup>5</sup>

1.25×10<sup>6</sup>

1.34×10<sup>6</sup>

Cytodex 3

2.11×10<sup>5</sup>

1.78×10<sup>5</sup>

4.55×10<sup>5</sup>

4.99×10<sup>5</sup>

7.82×10<sup>5</sup>

9.43×10<sup>5</sup>

1.04×10<sup>6</sup>

1.18×10<sup>6</sup>

备注：上表为实施例11和Cytodex 3每24h记录的Vero细胞培养密度单位：cell/mL

表5，蛋白稳定性分析表

实施例编号	15天	1个月	3个月	6个月	12个月
						实施例11	0	0	0	0	0
Cytodex 3	0	0	0	0	0.004

备注：上表为实施例11和Cytodex 3在PBS缓冲液中不同时间段的上清蛋白浓度单位：mg/mL

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 博格隆（浙江）生物技术有限公司

博格隆（上海）生物技术有限公司

<120> 一种动物细胞培养微载体及其制备方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Pro Gly Lys Gln

1 5

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Ile Pro

1

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Arg Gly Asp Ala

1 5

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Asp Val Arg

1

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ile Ala Gly Pro Asp

1 5

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Arg Thr Pro Phe

1

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Arg His Trp Ser

1

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Val Leu Ala Gly

1 5

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Tyr Thr Leu Gly Ala

1 5

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

His Tyr Ile Ser Tyr

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Lys Arg Trp Val Gly

1 5

Claims (6)

1.一种细胞培养用微载体，微载体包括基质和配基，基质经过活化后与配基结合，其特征在于，所述基质为天然高分子或合成高分子，所述天然高分子为多糖，所述多糖包括葡聚糖、琼脂糖，所述配基是氨基酸、多肽、人工合成多肽、动物明胶蛋白，所述基质为球状的微球或片状的薄片，所述微球的直径为60～250μm，所述薄片的比表面积为800～1500cm².g^-1；所述基质表面附有环氧类胺盐；所述环氧类胺盐为胺或胺盐，并具有取代或未取代的C1-20直链或支链的烷烃或烯烃，取代的基团选自氨基、羟基或卤素；

其中，所述合成高分子为聚苯乙烯、聚乙烯和/或二氧化硅；

基质的活化剂为烯丙基甘油醚或环氧氯丙烷；

所述氨基酸为精氨酸或赖氨酸，多肽序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示；

所述动物明胶蛋白包括猪明胶蛋白、牛明胶蛋白、驴明胶蛋白、鱼明胶蛋白。

2.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述多糖还包括纤维素。

3.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述环氧类胺盐为伯、仲、叔胺或季铵盐。

4.根据权利要求1所述的微载体，其特征在于，所述动物明胶蛋白是鱼明胶蛋白。

5.一种权利要求1所述的微载体的制备方法，其特征在于，将所述环氧类胺盐共价接枝到所述基质的微球或薄片上，用交联活化剂将所述氨基酸、所述多肽或动物明胶蛋白交联于带有所述环氧类胺盐的所述基质的表面，具体地，包括以下步骤：

1）所述基质为微球或薄片，将所述微球或薄片的干粉加水膨胀后，加入碱溶液以提供碱性环境；

2）加入所述环氧类胺盐，在15～65℃的碱性环境下打开所述环氧类胺盐上的环氧基与基质微球或基质薄片表面的羟基进行反应；

3）加入交联活化剂，在15～65℃下使所述交联活化剂的环氧基打开，与步骤2）中所述环氧类胺盐开环后得到的羟基进行反应；

4)溴化程序，利用无水乙酸钠、溴水和甲酸钠溴化所述交联活化剂；

5）在pH 8~10的碱性条件下使所述交联活化剂与所述氨基酸、所述多肽或动物明胶蛋白进行反应，制备得到所述微载体；

其中，所述交联活化剂是烯丙基缩水甘油醚或环氧氯丙烷，所述动物明胶蛋白为鱼明胶。

6.根据权利要求1～4任一项所述的微载体在动物细胞培养中的应用。

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