CN105492595B - 细胞培养制品及其方法 - Google Patents

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Abstract

一种细胞培养制品，其包含：基材，该基材包含选自下述中的至少一种的聚半乳糖醛酸化合物：果胶酸；酯化度为1‑40摩尔％的部分酯化的果胶酸,或其盐；和聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物。还揭示了制造和使用该制品的方法。

Description

细胞培养制品及其方法
本申请要求2013年06月24日提交的美国临时申请号61/838452的优先权，其全文通过引用结合于此。
本文所述的任何出版物或专利文献的全文内容通过参考结合于本文。
相关申请的交叉引用
本申请涉及以下共同拥有和转让的专利申请：2011年3月17日提交的美国临时专利申请号61/453,654，其题目为“用于细胞培养的合成涂层”；2010年05月27日提交的美国专利申请号12/788917，其题目为“用于培养细胞的可溶胀的合成的微载体；2010年7月28日提交的专利申请号PCT/IB10/002160,其题目为“用于细胞培养涂层的预聚物制备”；和2012年04月13日提交的美国专利申请号13/446734，其题目为“用于细胞培养的合成的组合物和涂层”。本文以上述文献的内容为基础，且以上各文的全部内容通过引用纳入本文，但不要求它们的优先权。
背景
本发明总体涉及细胞培养制品,例如微载体,以及制备和使用制品的方法。
概述
在一些实施方式中,本发明提供细胞培养制品,例如具有化学改性的表面的基材,以及制备和使用制品的方法。
在一些实施方式中,本发明提供完全合成的细胞培养制品，其使得能在纯化学培养基或不含血清的培养基中进行细胞培养，并允许在不使用任何蛋白酶的情况下收集培养的细胞。
在优选实施方式中，所述基材是微载体。本发明的微载体特别适用于纯化学培养基中的大规模的细胞增殖。微载体可支持纯化学培养基中的细胞生长。
附图简要说明
在本发明的实施方式中：
图1A和1B分别显示在PGA微载体上的衍生自人骨髓的间质干细胞(hMSC)的粘合和生长的示例性相差显微图，该PGA微载体用粘合聚合物Synthemax II(“PGA-SMII”)进行涂覆并在旋转烧瓶预搅拌的培养基中培养3天,图片(1B)显示在旋转烧瓶中培养5天之后测量的细胞扩增。
图2显示在用100U果胶酶/5mMEDTA进行5分钟处理之后，来自PGA-SMII微载体的细胞释放的相差显微图。
图3的图片显示沿着6次迁移的旋转烧瓶中在PGA-SMII微载体上的hMSC生长的累积的细胞扩增。
图4的图表显示通过流式细胞仪测量的在PGA-SMII微载体上生长40天的hMSC细胞的间叶特异性标记物(mesenchymal specific markers)。
图5A-5C显示PGA-SMII微载体上不同hMSC细胞系的分化的相差显微图。
图6显示静态条件下用SMII或PGA-SMII小珠涂覆的酯化的果胶(20-32％)上的hMSC粘合的相差显微图。
图7A-7E显示hMSC的相差显微图的总结，其于静态条件下在不同小珠表面上接种，用于非优化过程。
图8A-8C显示来自具有选定的处理的PGA-SMII微载体的细胞释放的相差显微图。
图9显示示例性粘合聚合物；肽共轭聚合物结构,即现有技术的p(MAA-PEG4-VN)。
图10显示另一示例性粘合聚合物；肽共轭聚合物结构，即现有技术的p(HEMA-共聚-MAA-PEG4-VN)。
详细描述
下面将参考附图(如果有)详细描述本发明的各种实施方式。对各种实施方式的参考不限制本发明的范围，本发明范围仅受所附权利要求书的范围的限制。此外，在本说明书中列出的任何实施例都不是限制性的，且仅列出要求保护的本发明的诸多可能实施方式中的一些实施方式。
在一些实施方式中，所揭示的设备以及制造和使用该设备的方法提供了一个或多个优势特征或方面，包括例如，如下文所述。任一项权利要求所述的特征或方面一般在本发明的所有方面适用。在任一项权利要求中所述的任意单个或多个特征或方面可以结合或与任一项或多项其它权利要求中所述的任意其它特征或方面置换。
定义
“完全合成的”或“全合成的”指细胞培养制品,例如微载体或培养容器的表面完全由合成的来源的材料组成，且没有任何动物衍生的或动物来源的材料。批露的完全合成的细胞培养制品消除异种污染的风险。
“包括”、“包含”或类似术语意为包括但不限于，即内含而非排它。
用来描述本发明实施方式的修饰例如组合物中成分的量、浓度、体积、加工温度、加工时间、产量、流速、压力、粘度等数值及它们的范围或者组件的尺寸等数值以及它们的范围的“约”指数量可发生变化，该变化可发生在例如：制备材料、组合物、复合物、浓缩物、组分零件、制品制造或应用制剂的常规测定和处理步骤中；这些步骤中的无意误差；制造、来源或用来实施所述方法的原料或成分的纯度方面的差异中；以及类似考虑因素中。术语“约”还包括由于具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂的老化而不同的量，以及由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物或制剂而不同的量。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，描述内容包括事件或情况发生的场合以及事件或情况没有发生的场合。
实施方式中的“主要由下述组成”或“由下述组成”可指，例如：
一种细胞培养制品，它包含：
基材，该基材包含选自下述中的至少一种的聚半乳糖醛酸化合物：
果胶酸；
部分酯化的果胶酸，其具有1-40摩尔％的酯化度,
或它们的盐；和
在选定的聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物,其中在聚半乳糖醛酸化合物的表面上的该粘合聚合物是例如,具有含通式聚(HEMA-共聚-MAA-PEG4-VN)共聚物的共轭多肽的聚合物,且该聚半乳糖醛酸化合物任选地是交联的；
一种用于收集培养的细胞的方法,该方法包含:
培养细胞；和
使在如上所述的培养制品的表面上的培养的细胞接触果胶酶和螯合剂例如EDTA的混合物，从而将细胞从制品分离，如本文所定义。
本发明的制品、制备制品的方法和使用制品的方法可包括权利要求书中所列的组分或步骤，再加上对本发明的组合物、制品、设备或者制备和使用方法的基本性质和新颖性质没有实质影响的其它组分或步骤，如特定的制品构造、特定的添加剂或成分、特定的试剂、特定的结构材料或组件、特定辐射或温度条件，或者类似的结构、材料，或者所选的工艺变量。
除非另外说明，否则，本文所用的不定冠词“一个”或“一种”及其相应的定冠词“该”表示至少一(个/种)，或者一(个/种)或多(个/种)。
可采用本领域普通技术人员熟知的缩写(例如，表示小时的“h”或“hr”，表示克的“g”或“gm”，表示毫升的“mL”，表示室温的“rt”，表示纳米的“nm”以及类似缩写)。
在组分、成分、添加剂、尺度、条件和类似方面公开的具体和优选的数值及其范围仅用于说明，它们不排除其他限定数值或限定范围内的其他数值。本发明的设备和方法可包括本文所述的任何数值或数值、具体数值、更具体的数值和优选数值的任何组合，包括明示或暗示的中间值和范围。
一旦培养的细胞达到覆盖之后，常常施加胰蛋白酶来从下层解离粘合的细胞。例如,美国专利号4,994,388批露一种用于培养和收集贴壁依赖性(anchorage-dependent)的细胞的方法，其使用用胶原涂覆的微载体小珠。一旦生长完成，从微载体消化掉胶原,并从不可溶的微载体分离培养的细胞。然而,因为胰蛋白酶的蛋白质分解活性,常常分裂掉细胞表面蛋白质，这可导致细胞功能失调。已报道了胰蛋白酶能诱导蛋白质组改变和细胞生理学变化。黄(Huang)等报道胰蛋白酶化下调生长相关和代谢相关的蛋白质表达，并上调调亡相关的蛋白质表达,这表明用于细胞次培养的胰蛋白酶对细胞生理具有不利影响(参见黄香令(Hsiang-Ling Huang)等,“细胞次培养过程中胰蛋白酶在哺乳动物细胞中诱导的蛋白质组改变(Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture inmammalian cells)”,《生物医学科学学报(Journal Biomedical Science)》,2010,17:36)。
作为蛋白酶的有害影响的另一示例,还已知用蛋白酶例如胰蛋白酶处理细胞除去癌细胞的抗原，且可能使它们不适用于开发用于抗癌治疗的疫苗。卢克霍夫(Lokhov)等报道胰蛋白酶化从细胞表面释放糖蛋白质和糖(参见“用胰蛋白酶从人红细胞释放的涎黏液肽(A sialomucopeptide liberated by trypsin from the human erythrocyte),”《自然》(Nature),1960；188:1011-2,加希克G.(Gasic,G.)“肿瘤细胞中的细胞涂层的除去和再生”，《自然》,1962；196:170,和乌兰布鲁克G.(Uhlenbruck,G.)，“蛋白水解酶对热红细胞表面的作用”，《自然》,1961；190:181和“从动物组织隔离活细胞”，《细胞学国际评论(International Review of Cytology)》,1956；7:587-647),由此导致损失抗原性质(参见戴维J.R.(David,J.R.)等,“用胰蛋白酶在体外对敏感细胞进行脱敏”J Exp Med.,1964；120:1189-200,40,韦丝L(Weiss,L)等,“通过免疫技术来演示细胞表面的破坏,”Exp CellRes.,1963；30:331-8,奥孙克亚B.O.(Osunkoya,B.O.)等,“培养的伯基特氏淋巴瘤细胞上的免疫的表面受体的合成和命运,”Int J Cancer,1969；4(2):159-65,塔克奇N(Takeichi,N)等,“胰蛋白酶处理的通过X辐射诱导的猿病毒40-转换的BALB/3T3细胞表面抗原的加速的再生,”Cancer Res.,1976；36(4):1258-62)。塔克奇N(Takeichi,N)等表明在足垫评估中，SV40-转换的3T3细胞的胰蛋白酶处理降低它们的抗原性。类似地,已表明在足垫溶胀评估中，用胰蛋白酶处理的多瘤病毒转换的细胞不能诱导对抗肿瘤特异性抗原的延迟的过敏性反应(参见莫琳纳丽J.A.(Molinari,J.A.)等,“用胰蛋白酶改性表面膜抗原”，Proc SocExp Biol Med.,1975；148(4):991-4)。
美国专利申请号5,100,799(慕纳德(Mundt)等)批露了一种从微载体释放细胞培养物的方法，其中在流穿过程中，引导胰蛋白酶溶液通过具有微载体的容器。该专利提及释放的细胞必须立刻从载体取出，且在离开容器之后钝化和/或除去胰蛋白酶溶液，从而阻止蛋白酶对收集的细胞形成有害的影响。慕纳德提及“高百分比的细胞非常快地释放，并因此在胰蛋白酶溶液中保持较长时间。这带来不足，即胰蛋白酶的作用给这些细胞带来不利影响。细胞生长和在新的微载体上的细胞再次沉降能力尤其受到不利影响。结果，非常需要不使用胰蛋白酶来收集细胞或在不存在胰蛋白酶的情况下收集细胞。
美国专利号6,378,527(和WO0056251)(亨格福特(Hungerford)等)报道了用消化多糖小珠的非蛋白水解酶来取代胰蛋白酶，其题目是“细胞-培养和聚合物构建(Cell-culture and polymer constructs)”。亨格福特提及“所用的最常见的细胞收集方法通过胰蛋白酶化,这可能不能完全从微载体取回细胞。因此，他们提出了一种微载体，在该微载体上生长细胞并随后通过酶消化微载体来将细胞与微载体分离。具体来说,在葡聚糖微载体小珠上生长软骨细胞，然后使用葡聚糖酶消化小珠，来从载体分离软骨细胞。该专利还描述了一种葡聚糖微载体，其可通过葡聚糖酶来消化，但没有像本发明这样批露小珠可由果冻酸制备并由可果胶酶来消化。此外,亨格福特没有提及怎样在纯化学培养基或不含血清的培养基中生长细胞。实际上,所用的微载体是I型胶原涂覆的葡聚糖小珠,即Cytodex3，微载体上的细胞扩增是在添加了胎牛血清的杜比克(Dulbecco)的改性的英格培养基(EagleMedium)中进行的，但没有在纯化学培养基或不含血清的培养基中进行。
最近，WO/2011/025445描述了通过葡聚糖酶消化的葡聚糖小珠，如之前亨格福特等(同上)所述。WO/2011/025445还描述了可通过淀粉酶消化的淀粉涂覆的微载体。该‘445申请提及促进细胞连接的细胞-结合配体必须共价地接枝到细胞培养物表面,该表面已用双官能度反应物进行活化。它还提及通过特殊的配体例如烯丙基缩水甘油基(allylglycidyl)醚或类似的双官能度反应物，连接配体，从而降解多糖。该‘445申请描述了分别可通过葡聚糖酶或蛋白酶消化的葡聚糖微载体和淀粉涂覆的微载体，但没有提及可由果冻酸制备且可通过果胶酶消化的小珠。此外,‘445申请没有教导怎样在纯化学培养基或不含血清的培养基中生长细胞。还此外，‘445申请没有教导细胞连接可在没有任何化学衍生化的情况下，容易地通过用粘合聚合物例如合成的肽聚合物涂覆载体来实现。
哈米尔顿全球真核微载体(Hamilton Global Eukaryotic Microcarrier)(GEMTM)(参见例如,网址:hamiltoncompany.com)是另一类市售微载体，其由具有嵌入磁性颗粒的海藻酸核和表面组成，该表面可共价地结合到基材以用于细胞连接和生长。不幸是，该微载体涂覆了薄的明胶分子层，以构建适用于细胞培养的表面。根据生产商，可使用胰蛋白酶(Trypsin)或Accutase容易地进行从GEM除去细胞，其可溶解微载体并温和地解离细胞，这允许收集单一细胞悬浮液。结果，尽管这类基于海藻酸的微载体可潜在地通过添加非蛋白水解酶例如海藻酸裂解酶来消化，但在实际中必须使用蛋白水解的酶来收集细胞。
JP3771510提及组织的内部再生材料，其特征在于由细胞粘合性活性材料(A)和生物吸附性材料(B)组成。(A)优选地是多肽(A1)，其通过基因重组微生物来合成。给出了合适的天然存在的生物吸附性材料的列表，其包含果胶酸。该专利申请没有提及可使用离子移变(ionotropically)的交联的聚半乳糖醛酸(PGA)来制备微载体。此外，细胞粘合性活性材料通过基因重组微生物来合成，且不是通过化学合成来制备。
如本文所述的全合成的微载体是有用的，其使得能在不含血清的下，在纯化学培养基中实现细胞扩增且在不添加蛋白酶的情况下实现细胞收集。
共同拥有和转让的弗鲁土斯(Frutos)等的美国专利申请号12/420735即现在的2013年3月21日公开的美国专利申请公开号US20130071916(也公开为WO2012158235)提及一种涂覆细胞培养制品的表面的方法，其包含将具有共价地连接的多肽的聚合物溶解于水性溶液中，从而形成聚合物溶液。该聚合物由单官能度单体(即,单体都不具有双官能度或更高的官能度)形成。相对于共轭到多肽的聚合物的多肽的重量百分数高到足以使共轭到多肽的聚合物变成水溶性的。该水性溶液基本不含有机溶剂。该方法还包含(i)在细胞培养制品的表面上设置聚合物溶液，以制备涂覆的制品；和(ii)使涂覆的制品暴露于足够的热量或电磁辐射，从而将共轭到多肽的聚合物连接到该细胞培养制品的表面。示例性肽共轭聚合物包含例如p(MAA-PEG4-VN)和p(HEMA-共聚-MAA-PEG4-VN)(如本发明的图9和图10所示)。
在一些实施方式中,可由例如选自下述的至少一种离子移变地交联的生物聚合物制备本发明的合成的微载体:
果胶酸,也称为聚半乳糖醛酸(PGA)；或
部分酯化的果胶酸(也称为果冻酸)(PEPGE)；或它们的盐,或它们的混合物。
当选择部分酯化的果胶酸时,酯化度可为例如约40摩尔％或更小,例如1摩尔％-39摩尔％,5-35摩尔％,10-30摩尔％,包含中间数值和范围。
在一些实施方式中,本发明的微载体使得能通过下述方式来快速和完全地收集细胞：使上面生长有细胞的微载体接触果胶酶和任选的螯合剂(例如,EDTA)，且无需添加任何蛋白酶。
在一些实施方式中,本发明的微载体有利地和优选地由具有微球尺寸的果胶酸或果冻酸小珠,或它们的盐制成,该小珠用促进细胞粘合的肽进行功能化，且更优选地用涂层进行功能化且该涂层包含具有粘合肽的合成的聚合物。该粘合肽使得能生物特异性地粘合培养的细胞。所批露的微载体适用于大规模地扩增和回收不含血清的培养物中粘合的细胞。
在一些实施方式中,本发明的制品、材料和方法具有下述优势例如:
全合成的细胞培养基材防止异种污染；
在不添加蛋白酶的情况下，通过例如使用果胶酶和螯合剂例如EDTA可很容易地从PGA小珠收集细胞,该果胶酶溶解PGA小珠并温和地解离细胞,得到单一细胞悬浮液以用于进一步下游加工；
合成的细胞培养基材(例如微载体)使得表面积和体积的比例最大化，这使得能以紧凑的设计实现大规模的细胞培养；和
合成的细胞培养基材可通过例如直接的涂覆过程来制备，这减少了反应物的消耗和减少了劳动力。
细胞培养基材组合物可包含例如至少果胶酸、部分酯化的果胶酸或它们的盐和它们的混合物；和至少一种肽，其促进贴壁依赖性细胞的连接。
优选地，该组合物包含肽-聚合物共轭物,该共轭物促进贴壁依赖性细胞的连接,更优选地肽-聚合物共轭物是包含粘合肽的聚(甲基)丙烯酸酯或聚(甲基)丙烯酰胺共聚物,和更优选地肽-聚合物共轭物是
Figure BDA0000928552240000091
II。
在一些实施方式中,该组合物优选地是离子地交联的。该交联优选地通过离子移变凝胶化方法来获得,和更优选地该交联通过至少一种内部凝胶化方法来获得。
在一些实施方式中,本发明提供细胞培养制品,其包含:
基材，该基材包含选自下述中的至少一种的聚半乳糖醛酸化合物：
果胶酸；
部分酯化的果胶酸，其具有1-40摩尔％的酯化度,
或它们的盐；和
在所述聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物。
在一些实施方式中,聚半乳糖醛酸化合物可为例如共价地交联的、离子地交联的或它们的混合物。
在一些实施方式中,部分酯化的果胶酸可为例如羧基烷基酯，其具有含1-10个碳原子的烷基基团。
在一些实施方式中,聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物可为例如多肽。
在一些实施方式中,聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物可为例如具有共轭多肽的聚合物。
在一些实施方式中,聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物是具有共轭多肽的聚合物，其选自下述中的至少一种：
聚(MAA-PEG4-VN)均聚物,即
Figure BDA0000928552240000092
I(SMI)；
聚(HEMA-共聚-MAA-PEG4-VN)共聚物,即
Figure BDA0000928552240000093
II(SMII)；
或它们的混合物,
其中：
MAA是甲基丙烯酸；
HEMA是甲基丙烯酸羟乙酯；
PEG4是聚乙二醇四聚低聚物；和
VN是共轭玻连蛋白多肽。
Figure BDA0000928552240000101
I聚合物和
Figure BDA0000928552240000102
II共聚物和制备方法参见上述USSN13/420,735。
在一些实施方式中,以制品的总重量为基准计，粘合聚合物的含量可为例如0.1-30重量％。
在一些实施方式中,粘合聚合物可例如促进贴壁依赖性活的细胞和基材的连接。
在一些实施方式中,基材可为例如微载体颗粒。
在一些实施方式中,本发明提供一种用于收集培养的细胞的方法,其包含:
培养细胞；和
使在如上所述的培养制品的表面上的培养的细胞接触果胶酶和螯合剂的混合物，从而将细胞从制品分离。
在一些实施方式中,该方法还可包含例如将分离的细胞从组合物隔离。
在一些实施方式中,螯合剂可为例如EDTA,类似的多配位螯合剂,或它们的混合物。
在一些实施方式中,可在例如不含蛋白酶的情况下实现接触。
在一些实施方式中,制备如上所述的细胞培养组合物或制品的方法,其包含:
用粘合聚合物涂覆基材的表面，该基材由如上所述的任意聚半乳糖醛酸化合物组成。
在一些实施方式中,该方法还可包含例如通过离子交联、通过内部凝胶化或其组合，来交联选定的聚半乳糖醛酸化合物。
在一些实施方式中,基材可为例如微载体。
PGA聚合物
本发明的合成的微载体可由至少一种离子移变的交联的多糖制成，其选自例如也称作聚半乳糖醛酸(PGA)的果胶酸,或它们的盐,或者也称作果冻酸的部分酯化的果胶酸(PEPGA),或它们的盐。当选择果冻酸时,酯化度是优选地小于约40摩尔％，因为较高的酯化度使得不能有效地通过离子移变交联来形成小珠。虽然无意受限于理论，但据信可需要极少量的游离羧酸基团来获得可接受的水平的离子移变交联。
用作本发明的微载体的小珠优选地由果胶酸或果冻酸的混合物制备。果胶酸可通过某些果胶的酯的水解来形成。果胶是细胞壁多糖，其在植物中具有结构作用。它们是主要基于被1,2-连接的L-鼠李糖随机打乱的1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸酯骨架的线性聚合物。平均分子量是约50,000-约200,000道尔顿(Dalton)。
果胶的两个主要来源是例如柑橘皮(主要是柠檬和酸橙)或苹果皮，且可通过它们的提取物来获得。
果胶的聚半乳糖醛酸链可用甲基部分酯化，且游离的酸基可用单价离子如钠、钾或铵离子部分或全部中和。用甲醇部分酯化的聚半乳糖醛酸称作果胶酸,它们的盐称作果胶酯。
市售高甲氧基(HM)果胶的甲基化程度(DM)通常可为例如60-75摩尔％，低甲氧基(LM)果胶的甲基化程度(DM)可为1-40摩尔％,10-40摩尔％,和20-40摩尔％,包含中间数值和范围。
本发明的微载体优选地由LM果胶制备，且优选地聚半乳糖醛酸包含小于20摩尔％甲氧基,更优选地聚半乳糖醛酸不含或只含可忽略的甲基酯含量作为果胶酸。在本发明中，为了简化起见，将不含或只含可忽略的甲基酯的果胶酸和低甲氧基(LM)果胶称作PGA。
通过PGA的离子移变凝胶化来交联
本发明的聚半乳糖醛酸小珠可进行交联，以防止它们溶解进入细胞培养的培养基。交联优选地通过如下所述的离子移变凝胶化和更优选地通过内部凝胶化来实施。离子移变凝胶化基于在存在多价抗衡离子时，聚电解质进行交联来形成交联的水凝胶的能力。
这些聚电解质例如海藻酸盐和果胶酸酯的凝胶化来自二价阳离子例如钙以及分别用于PGA和海藻酸盐的半乳糖醛酸和古罗糖醛酸残基之间的强烈的相互作用(参见“存在Ca2+和K+离子时的多糖凝胶层:测量和机理”,阿勒克斯J.德克尔霍夫(Alexis J.deKerchove)等,《生物大分子(Biomacromolecules)》,2007,8,113-121)。离子移变凝胶化方法简单且便宜。
在一些实施方式中,可实施一些化学交联，但不可逆的化学交联的水平应充分低，例如小于约10-20摩尔％,从而保持用果胶酶消化小珠的能力。从现有的研究可知，凝胶的结构可现在影响降解，其中例如交联程度更高的凝胶可导致更长的总体降解时间。交联减小水凝胶的孔径并限制酶进入，结果降低消化效率。
已报道相对于海藻酸钙凝胶，离子移变地交联的果胶酸酯可提供许多优势。在固定细胞的许多应用中，当将这种凝胶用于包封细胞时，果胶酸钙凝胶是海藻酸钙凝胶的更好的替代物(参见P.基米尼尔(P.Gemeiner),《生物技术进展(Progress inBiotechnology)》,卷：11,1996,页码：76–83)。PGA凝胶小珠的最高的机械强度、最低的收缩率和相对于单价阳离子的最佳稳定性可物有所值，因为PGA包含100摩尔％半乳糖醛残基，其能与二价阳离子相互作用来形成交联位点，但海藻酸盐没有。
结果,果胶酸钙凝胶对离子和化学试剂更不敏感，特别是对于损坏海藻酸钙凝胶的螯合阴离子而言。
优选的离子移变的交联的PGA小珠(与海藻酸盐小珠相比)的稳定性是显著的优势，尤其是当将小珠用作用于细胞培养的基材时。这种高稳定性阻止在细胞培养过程中，小珠发生解裂，尤其是在微载体搅拌的悬浮培养中。
比较例2和图7B和7C显示在通过外部凝胶化(参见图7B)或通过内部凝胶化(参见图7C)然后用
Figure BDA0000928552240000121
II涂覆制备的海藻酸盐小珠上，细胞都不能生长。
离子移变地交联小珠的方法
PGA小珠制备可通过下述方式来实现：例如从PGA溶液的液滴形成微载体小珠，其掉入包含多价阳离子例如钙、镁、锌等阳离子的凝胶化浴，以允许如上所述的进行离子移变凝胶化。
外部和内部离子移变凝胶化
存在至少两种不同的制备离子移变的交联的PGA小珠的方法或过程:外部和内部凝胶化。还已知可将内部和外部凝胶化组合在一起。在外部凝胶化中,将PGA水性溶液通过针头逐滴分配进入二价阳离子例如钙或镁的溶液,这诱导PGA聚合物的离子交联。已报道外部凝胶化的小珠通常是非均相的，在靠近小珠表面具有较高的聚合物浓度,因此降低所得小珠的孔隙率。比较例8显示通过使用钙的PGA聚合物的外部交联和后续地用Corning
Figure BDA0000928552240000131
II涂覆制备的这种小珠不支持不含血清的培养基中的细胞生长(参见图7A)。此外，工业放大复杂，得到笨拙的生产系统。此外,当使用这种外部凝胶化过程时，难以获得较小尺寸的微颗粒。
在已经报道能放大的内部凝胶化中,小珠通过PGA水性溶液的凝胶化来形成，该PGA水性溶液包含分散在水相中并在油中乳化的不可溶的钙盐。通过添加可溶于油的酸来降低PGA溶液的pH，并从不可溶的盐释放可溶的Ca2+或Mg2+来引发凝胶化。
可使用不同的钙盐例如草酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等有机和无机阴离子，或它们的组合。离子交联可容易地通过使用金属盐来实现，例如:镁、钙、锌、锶、钡等阳离子,或其组合。优选的二价阳离子是钙。钙是广泛用作多糖水凝胶交联剂的不可溶解的阳离子。例如,已将离子地交联的多糖水凝胶用于伤口敷料。钙盐已广泛用作治疗目的的离子交联剂。
制备PGA小珠的技术的非限制性例子包含例如:用注射器浸渍或挤出,喷射破碎或粉碎,其中小珠的形成通过将液滴从针尖拉入凝胶化浴的同轴空气来实现；静电小珠生成器,其使用静电场来将液滴从针尖拉入凝胶化浴；导致破碎的磁驱动振动器；喷射切割技术，其中小珠的形成通过旋转的刀具来实现,该刀具将喷射物切割成均匀的圆柱片段(该技术可从Genialab公司获得)。在掉入凝胶化浴时，这些片段形成球形的小珠。旋转盘雾化小珠形成可通过旋转盘雾化器来实现。还可使用如下所述的乳液化。
用于PGA小珠制备的乳液化/内部凝胶化方法(优选的方法)
制备PGA或海藻酸盐微颗粒的最常用的方法包含对PGA或海藻酸盐的溶液进行乳液化，然后凝胶化液滴。形成海藻酸盐微球的乳液化/内部凝胶化技术如现有技术所示(参见波内塞特D.(Poncelet,D.)等,通过乳液化/内部凝胶化制备海藻酸盐小珠I.方法，Appl.Microbiol.Biotechnol,38,39–451992b)。
小直径的PGA小珠通过水性PGA溶液或分散体的内部凝胶化来形成，其在有机相例如合成油或植物油之内乳液化并包含分散的钙盐。通过添加可溶于油的酸来降低PGA溶液的pH，并从不可溶的盐释放可溶的Ca2+来引发凝胶化。优选的盐是碳酸钙。优选的钙盐可为具有窄的粒度分布和小尺寸颗粒的沉淀的碳酸钙,其提供更稳定的碳酸钙颗粒在分散的水相中的分散体。中值粒度可为约0.01-0.5微米,优选地0.04-0.15微米,包含中间数值和范围。典型的平均粒度可为例如约0.04-约0.08微米,包含中间数值和范围。合适的油可为例如植物油、石蜡油、脂肪醇、类似的油或其组合。特别合适的油是正辛醇。
通常添加表面活性剂，来稳定乳液液滴使其不发生聚集。非限制性具有低HLB的油可溶性表面活性剂可包含,例如,Span 85失水山梨醇三酯,Span 60失水山梨醇单硬脂酸酯-SM,Span 80失水山梨醇油酸酯,Tergitol NP-4,Tergitol NP-7,Tergitol 15-S3,Triton X-15,Triton X-35,Triton X-45,聚合物分散剂例如纤维素-乙酸酯-丁酸酯、或类似的表面活性剂,和它们的混合物。
促进细胞连接的PGA小珠的后处理
因为PGA小珠的水凝胶性质和负性电荷，在不经过特殊处理的情况下，PGA小珠不容易支持细胞连接。可用促进细胞粘合的部分例如用肽功能化PGA小珠。包含潜在地通过来自整合素家族的蛋白质识别的氨基酸序列的肽，或者导致与能维持细胞粘合的细胞分子形成相互作用的肽都是功能化本发明的微载体的备选者。例如,优选的肽可选自BSP,玻连蛋白,纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白，和类似的肽,和它们的混合物。特别优选的肽是玻连蛋白(VN)和BSP肽，其分别具有下述序列:Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2(序列编号：1),和Ac-Lys-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2(序列编号：2)。
如有需要，本发明的微载体可优选地通过聚合物例如粘合性肽的简单的物理吸附来功能化。
合适的促进细胞粘合的聚合物优选地包含合成的聚合物。这种促进细胞粘合和生长的具有肽的合成的聚合物的示例包含康宁有限公司(Corning Incorporated)的
Figure BDA0000928552240000151
II。通过使用促进粘合的聚合物的物理吸附，来从制造过程中消除化学衍生化看起来是吸引人的，因为化学衍生化耗时、费力、需要大量的反应物并产生大量的废弃化学品。
当在通过内部凝胶化交联的小珠上实施时，由包含粘合性肽的聚合物制备的涂层是特别有效的，相反，在通过外部凝胶化交联的小珠上实施时失效。
如比较例8所示,对于由外部凝胶化制备的小珠,肽共聚物的涂层不能支持通过外部凝胶化制备的PGA小珠上的细胞扩增。
虽然无意受限于理论，但据信与通过内部凝胶化形成的多孔和更均匀凝胶上的肽聚合物的更好的吸附相比，外部地形成的凝胶的表面紧凑性为用于涂覆的肽聚合物的扩散提供更高的阻力。据信，获得更稳定的肽聚合物的吸附，并导致更有效的细胞连接和更好的细胞生长。
适用于收集细胞的非蛋白水解酶
对于由果胶聚合物制成的小珠,适用于收集细胞和/或消化微载体的非蛋白水解酶可包含果胶分解酶或果胶酶,其是与水解果胶物质的酶相关的异质组，大多数存在于植物中。
果胶酶(聚半乳糖醛酸酶)是将复杂的果胶分子粉碎成更短的半乳糖醛酸分子的酶。果胶酶催化从聚半乳糖醛酸释放果胶低聚糖(POS)。
果胶酶由真菌、酵母、细菌、原生动物、昆虫、线虫和植物产生。
市售来源的果胶酶通常是多种酶性的,例如Novozyme PectinexTM ULTRA SPL，其是果胶分解酶并由选定的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)株来制备。其主要包含聚半乳糖醛酸酶,(EC 3.2.1.15)果胶反式消去酶(pectintranseliminase)(EC 4.2.2.2)和果胶酯酶(EC:3.1.1.11)。已知果胶酶水解果胶。它们可攻击甲基酯化的果胶或脱酯化的果胶。EC标记和编号是基于酶催化的化学反应的酶的酶委员会分类方案。
部分或全部的小珠消化
取决于消化时间、温度和添加的果胶分解酶的量，可选择或预先决定消化小珠的程度。我们观察到在整个小珠被全部消化之前，细胞从表面脱离。因此,能在不完全消化小珠的情况下或在小珠完全消化之后，收集细胞。在前一种情况下，必须通过物理方法将小珠与细胞分离，例如过滤、倾滗、离心等加工或其组合。
参考附图，图1A和1B分别显示于旋转烧瓶中在搅拌的培养物中培养3天之后hMSC在用SynthemaxII涂覆的PGA微载体(PGA-SMII)上的粘合和生长的相差显微图(1A),图片(1B)对应于在旋转烧瓶中培养5天之后测量的细胞扩增。
图2显示在用100U果胶酶/5mM EDTA进行5分钟处理之后，来自PGA-SMII微载体的细胞释放的相差显微图。
图3的图片显示沿着6次迁移的旋转烧瓶中在PGA-SMII微载体上的hMSC生长的累积的细胞扩增。
图4的图表显示通过流式细胞仪测量的在PGA-SMII微载体上生长40天的hMSC细胞的间叶特异性标记物。
图5A-5C显示hMSC在PGA-SMII微载体上生长40天的分化的相差显微图，其分化成成脂细胞系(5A)、成骨细胞系(5B),和形成软骨的细胞系(5C)，并分别用红色、油O、茜红和阿尔新蓝进行染色。
图6显示静态条件下用SMII或PGA-SMII小珠涂覆的酯化的果胶(20-32％)上的hMSC粘合的相差显微图。提供了可见光通道或在DAPI染色之后的图象。
图7A-7E显示hMSC的相差显微图的总结，其于静态条件下在以下不同小珠表面上接种，用于非优化过程：通过使用CaCl2溶液作为硬化溶液的外部凝胶化制备的PGA小珠(7A)；通过使用CaCl2溶液作为硬化溶液的外部凝胶化制备的海藻酸盐小珠(7B)；通过乳液化/内部凝胶化方法制备的海藻酸盐小珠(7C)；通过外部凝胶化和随后的内部凝胶化方法制备的PGA小珠(7D)；和通过外部凝胶化制备的酯化的果胶(20-32％)(7E)。所有的小珠都用SMII进行涂覆。
图8A-8C显示从PGA-SMII微载体释放的细胞的相差显微图，其用50U果胶酶、5mMEDTA或50U果胶酶/5mMEDTA混合物处理5分钟。只有果胶酶和EDTA/混合的处理(8C)观察到作为单一细胞的细胞释放，这表明组合时反应物的配合效应或协同效应。
图9和10分别显示具有肽共轭的聚合物结构的示例性粘合聚合物，即共同拥有的现有技术的p(MAA-PEG4-VN)和p(HEMA-共聚-MAA-PEG4-VN)。
实施例
以下实施例用于更完整地描述使用上述本发明的方式并进一步列出为实施本发明各方面而考虑的最佳实施方式。这些实施例不对本发明的范围构成限制，而是出于举例说明的目的。工作实施例进一步描述了怎样制备和使用本发明的细胞培养制品的方面。
实施例1
通过乳液化/内部凝胶化技术制备的PGA微球
在80℃下，在搅拌下将西格玛(Sigma)产品号为P3850的聚半乳糖醛酸(PGA)钠盐在去离子水中分散16小时，得到2.0％(重量/体积)PGA悬浮液。通过在去离子水中悬浮CaCO3粉末(5％,重量/体积)，来制备西格玛产品号为21061的微晶CaCO3的悬浮液。通过添加冰乙酸(1滴)，将pH调节到6.5-7.0。将500微升的该CaCO3悬浮液添加到20mL 2.0％(重量/体积)PGA钠盐，并用
Figure BDA0000928552240000171
分散器将混合物匀化几秒。通过使用配备了锚式搅拌器的HeidolphRZR2020混合机在260rpm下搅拌，将该混合物在包含2％(重量/重量)
Figure BDA0000928552240000172
85的100g正辛醇中乳液化。水性PGA和油相的比例是约14/86(体积/体积)。在10分钟的乳液化之后,添加包含80微升冰乙酸的20mL正辛醇，并继续搅拌45分钟，以溶解碳酸钙。用4％(重量/重量)乙醇中的CaCl2溶液，将PGA凝胶化的小珠洗涤3次。然后，用无水乙醇将小珠洗涤3次，然后用去离子水洗涤3次。涂覆之前，将小珠储存在去离子水中。
实施例2
使用粘合聚合物
Figure BDA0000928552240000181
II合成的共聚物涂覆PGA微球
将根据实施例1制备的9毫升的溶胀的小珠置于50毫升的塑料离心管。还制备
Figure BDA0000928552240000182
II–SC共聚物在去离子水中的溶液,其浓度是0.25毫克/毫升。将33mL的该
Figure BDA0000928552240000183
II–SC共聚物溶液添加到溶胀的PGA小珠。温和地摇动该管，并在40℃下静置30分钟，使合成的共聚物功能化小珠。冷却之后，用去离子水将功能化小珠洗涤3次。将去离子水中的小珠在4℃下储存于无菌容器中。
比较例3
通过乳液化/内部凝胶化技术制备海藻酸盐微球
如实施例1所述来制备通过乳液化/内部凝胶化制备的海藻酸盐小珠，但使用来自褐藻的低粘度海藻酸钠盐(西格玛产品号A2158),而不是PGA钠盐。
比较例4
通过外部凝胶化技术制备PGA微球
在80℃下，在搅拌下将西格玛产品号为P3850的聚半乳糖醛酸(PGA)钠盐在去离子水中分散16小时，得到2.0％(重量/体积)PGA悬浮液。将250毫升的用作凝固流体的3％重量/体积氯化钙水/乙醇75/25体积/体积溶液置于烧杯中，并使用磁力搅拌器缓慢搅拌。使用装配了30号针头的注射泵，以250毫升/小时的速度，将10毫升的PGA分散体逐滴加入凝固流体。将小珠在氯化钙中硬化60分钟，然后用Milli-Q水洗涤2次，然后储存于无菌容器中的无菌水中。
比较例5
通过外部凝胶化技术制备的海藻酸盐微球
如比较例4所述来制备通过外部凝胶化技术制备海藻酸盐微球，但使用海藻酸钠盐(西格玛产品号A2158)，而不是PGA钠盐。
实施例6
使用本发明的微载体的搅拌条件下的hMSC的扩增
于旋转烧瓶中在搅拌的培养物中，在PGA微载体上培养hMSC，该PGA微载体是实施例2所述的用粘合聚合物SynthemaxII-SC涂覆的PGA微载体(PGA-SMII)。在5天后测量的细胞形貌和扩增参见图1。预期的细胞形貌和细胞扩增是明显的。从用100U果胶酶/5mM EDTA处理5分钟的PGA-SMII微载体收集细胞(参见图2)。小珠的消化和hMSC细胞释放是明显的。沿着6次迁移的在PGA-SMII微载体上的累积的细胞扩增如图3的图片所示。在约40天之后，获得10,000倍扩增。
通过流式细胞仪测量间叶特异性标记物的表达,与在烧瓶中的细胞生长相比较(未显示)，测得间叶特定标记物CD73和CD105的表达水平大于90％。如所预期，没有检测到阴性标记物CD14和CD45的表达(图4)。
在5次迁移之后，在不含异源成分(xeno-free)的培养基中从微载体收集细胞，并重新设置在6孔板上，用于定向分化成成脂细胞系、成骨细胞系和形成软骨的细胞系。
图5的相差显微图清楚地表明hMSC成功地分化成这3种细胞系中的每一种。
实施例7
在静态条件下，评估小珠上的hMSC的粘合，该小珠通过酯化的果胶(20-34％)或PGA的乳液化/内部凝胶化制备，并用粘合聚合物SMII进行涂覆。图6的显微图表明细胞能粘附到两种小珠。
比较例8
在静态条件下评估以下小珠上接种的hMSC的粘合：PGA小珠，其通过如比较例4所述的外部凝胶化制备,海藻酸盐小珠，其通过如比较例5所述的外部凝胶化来制备,海藻酸盐小珠，其通过如比较例3所述的乳液化/内部凝胶化方法来制备，以及通过酯化的果胶(20-34％)的外部凝胶化制备的小珠。所有的小珠类型都用SMII进行涂覆，以促进细胞连接。图7的显微图表明不是全部的小珠类型都支持优化的hMSC细胞连接。这些数据提供的证据表明海藻酸盐不适于制备本发明的微载体，且甚至当使用PGA时外部凝胶化也不是合适的方法。
实施例9
EDTA、果胶酶或两者的混合物对细胞释放的效率
在粘合聚合物
Figure BDA0000928552240000201
II涂覆的PGA小珠上，测量单独的EDTA、单独的果胶酶或两者的混合物从小珠释放细胞的效率。在静态条件下，细胞在MesenCultXF培养基中的微载体上生长3天，并用50单位的果胶酶、5mMEDTA或50U果胶酶5mM EDTA混合物进行处理。如图8所示,当只用果胶酶(8A)或EDTA(8B)处理细胞时,观察到细胞从小珠脱离，但细胞趋于仍然结合成聚集体。当果胶酶和EDTA(8C)作为混合物使用时，细胞从小珠脱离，且细胞聚集体解离，得到作为单一细胞的细胞脱离。对于许多细胞类型，当传代培养细胞来获得均匀的细胞接种并阻止在进一步的培养步骤中形成过度融合的区域时，避免聚集是有意义的。如果细胞表征使用例如利用流式细胞仪的方法，作为单一细胞收集细胞也是至关重要的。
细胞培养的材料和方法
细胞
人骨髓衍生的间质干细胞(hMSC)获自干细胞技术公司(STEMCELL Technologies)(产品号MSC-001F)。对于在
Figure BDA0000928552240000202
-XF培养基(产品号05429)中的常规维护,在获自干细胞技术公司
Figure BDA0000928552240000203
-XF连接基材涂覆的板(产品号05424)上生长细胞。
果胶酶EDTA处理
在PBS(100U/mL)中稀释果胶酶(Novozyme pectinex Ultra SPL(西格玛P2611))，并添加10mMEDTA pH8。在37℃下预培养该释放缓冲液。对于小珠消化和细胞释放,收集具有粘合的细胞的小珠，通过在1500rpm下的2分钟的离心造粒,在PBS中洗涤并于37℃下在果胶酶和EDTA溶液中培养5分钟。如果培养时间更长，则果胶酶EDTA处理持续时间也成比例的更长。
静态培养
将微载体再次悬浮于1mL培养培养基中，并转移到ULA处理的24孔ULA板(康宁产品号3473)。然后，将50,000hMSC细胞直接接种在孔中。在37℃和5％CO2气氛中，在细胞培养培养箱中培养板。每隔一天更换培养培养基(50-60％)。
旋转烧瓶培养
将微载体再次悬浮于培养培养基中，并转移到
Figure BDA0000928552240000211
125mL一次性旋转烧瓶(康宁产品号3152)。将hMSC直接接种到微载体上，最终体积为15mL(1E6细胞/旋转烧瓶)。在37℃和5％CO2气氛中，在没有搅拌的情况下，在细胞培养培养箱中将旋转烧瓶培养18-20小时。然后，将培养基体积调节到35mL(最高达45mL，类似地进行),且每2小时以30rpm的速度将培养物搅拌15分钟。每隔一天更换培养培养基(50-60％)。
如上所述，在
Figure BDA0000928552240000212
hMSC培养基中进行一系列的hMSC接种迁移。在7天之后,通过在温和的匀化之后，除去80％的培养物来迁移细胞。将新鲜的PGA–SMII微载体加回旋转烧瓶。用
Figure BDA0000928552240000213
hMSC培养基将最终培养物体积调节到35mL，每2小时启动15分钟的在30rpm下的搅拌。通过离心来对收集的细胞-微载体进行造粒，用dPBS洗涤,并用果胶酶/EDTA处理。使用利用细胞计数器的台盼蓝排除法，对脱离的细胞进行计数。收集细胞样品的复制品，用于流式细胞仪分析和定向分化实验。
流式细胞仪
室温下将收集的细胞在dPBS中的2％多聚甲醛中固定10分钟，然后洗涤并储存在dPBS中。将细胞在阻断缓冲液中于4℃下培养15分钟，然后在阻断缓冲液中于室温下与针对CD14,CD45,CD73,CD105的一级抗体(密理博化学公司(Millipore Chemicon))或相应的同种型对照物(英杰公司(Invitrogen)/分子探针公司(Molecular Probes))培养30分钟。在简单的洗涤之后，在黑暗中将细胞与相应的二级抗体的1：200的稀释液在室温下培养30分钟。对于个样品，使用BD FACS Calibur流式细胞仪(BD生物科技公司(BD Biosciences))采集30,000次事件。使用BD Cell
Figure BDA0000928552240000221
Pro软件(BD生物科技公司)执行柱状图重叠减法分析，来计算标记物阳性细胞的百分比。
定向分化
在5次迁移之后，在不含异源动物成分的培养基中从微载体收集细胞，并重新设置在6孔板上，用于引导分化成成脂细胞系、成骨细胞系和形成软骨的细胞系，且使用下述试剂盒：成脂分化试剂盒(Lonza,产品号PT3102A/B),
Figure BDA0000928552240000222
成骨分化试剂盒(Gibco,产品号A10072-01)和
Figure BDA0000928552240000223
形成软骨的分化试剂盒(Gibco,产品号A10071-01)。所用染色：油红染色试剂盒(密立博(Millipore)),茜红染色(密立博),和1％阿尔新蓝染色(费舍尔科技(Fisher Scientific))。根据制造商的推荐实施用于分化和染色的方案。
已结合各种具体实施方式和技术对本发明进行了描述。但是，应当了解可以在本发明的范围内做出多种变化和改进。

Claims (16)

1.一种细胞培养制品，其包含：
基材，该基材包含选自下述中的至少一种的聚半乳糖醛酸化合物：
果胶酸；
部分酯化的果胶酸，其具有1-40摩尔％的酯化度,
或它们的盐；和
在所述聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物，
其中所述聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物包含选自下组的多肽：BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和它们的混合物。
2.如权利要求1所述的制品，其特征在于，该聚半乳糖醛酸化合物是共价地交联的、离子地交联的或它们的混合物。
3.如权利要求1所述的制品，其特征在于，该部分酯化的果胶酸包含羧基烷基酯，该羧基烷基酯具有含1-10个碳原子的烷基基团。
4.如权利要求1所述的制品，其特征在于，所述聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物包含具有共轭多肽的聚合物。
5.如权利要求1所述的制品，其特征在于，所述聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘合聚合物是具有共轭多肽的聚合物，其选自下述中的至少一种：
聚(MAA-PEG4-VN)均聚物；
聚(HEMA-共聚-MAA-PEG4-VN)共聚物；
或它们的混合物,
其中：
MAA是甲基丙烯酸；
HEMA是甲基丙烯酸羟乙酯；
PEG4是聚乙二醇四聚低聚物；和
VN是共轭玻连蛋白多肽。
6.如权利要求1所述的制品，其特征在于，以制品的总重量为基准计,该粘合聚合物的含量是0.1重量％-30重量％。
7.如权利要求1所述的制品，其特征在于，该粘合聚合物促进贴壁依赖性的活细胞连接到基材。
8.如权利要求1所述的制品，其特征在于，该基材包含微载体颗粒。
9.一种用来收集培养的细胞的方法，该方法包括:
培养细胞；和
使所述在如权利要求1所述的制品的表面上培养的细胞接触果胶酶和螯合剂的混合物，从而从所述制品分离细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包含将分离的细胞与组合物隔离。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述螯合剂是EDTA。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述接触是在不使用蛋白酶的情况下实现的。
13.一种制备如权利要求1所述的细胞培养制品的方法，该方法包含:
在包含聚半乳糖醛酸化合物的基材的表面涂覆粘合聚合物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，还包含使聚半乳糖醛酸化合物交联。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述使聚半乳糖醛酸化合物交联的操作通过离子地、通过内部凝胶化或其组合来实现。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述基材是微载体。
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