CN113966391A - 用于培养细胞的可溶性微载体及相关方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种细胞培养制品。所述细胞培养制品包括基材，所述基材具有与二价阳离子交联的聚半乳糖醛酸化合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及它们的盐。所述基材可被消化试剂消化成包含半乳糖醛酸单体和二价阳离子的组分。还提供了从细胞培养制品收获细胞的方法。所述方法包括：进行一系列的洗涤和/或离心循环，以减少收获溶液中的组分。

Description

用于培养细胞的可溶性微载体及相关方法

相关申请的交叉参考

本申请根据35 U.S.C§120要求2019年6月13日提交的系列号为62/861,084的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。

本申请涉及共同转让的第14/899,394号和第15/579,739号美国专利申请以及第8,4044,85号和第8,426,176号美国专利，本申请以其内容为基础，并通过引用将其全文纳入本文。

背景

技术领域

本公开一般涉及可消化的基材，更具体而言，涉及可以用于例如分离蛋白质、细胞和病毒以及还可以用于诊断应用和细胞培养的可消化微载体，以及使用可消化基材的方法，更具体地，涉及由可消化基材培养和回收细胞、蛋白质和病毒的方法。

背景技术

微载体能够在用于治疗应用的受控生物反应器中实现有效的细胞放大。在平坦表面上进行的细胞培养中，贴壁细胞可达到高度融合并因此通过细胞间接触抑制来限制细胞扩增，与这样的细胞培养不同的是，具有高表面积/体积比的球形微载体为有效的细胞培养放大或扩增提供了有吸引力的平台，其中收获的细胞或条件培养基可以是所需的产品。

细胞培养依靠的是充分的氧化以及向细胞供应营养物质。相关的挑战包括在不产生足以破坏正在生长的细胞的水动应力的情况下，搅拌微载体以提供所需的氧气和营养物质。常规来说，使用叶轮进行搅拌。

另一个挑战涉及从细胞或条件培养基中分离出微载体。酶处理可以用于例如收获贴壁细胞，但是酶的加入可破坏细胞。例如，蛋白水解酶可以非选择性地清洁细胞表面受体。

从微载体有效地回收细胞常要求使用浓缩的酶，延长处理时间，以及要求连续离心/过滤循环，这可能不利地影响细胞健康和回收产率。另外，存在微载体消化的可能副产物以及这些副产物可能对细胞健康和回收产率的影响的问题。

鉴于上述，将有利的是，提供细胞生长表面，其包括具有限定的消化副产物的微载体，以及在控制消化副产物的同时由生长表面有效地培养和收获细胞的方法。

概述

根据本公开的实施方式，提供了一种细胞培养制品，所述细胞培养制品包括细胞培养制品。所述制品包括基材，所述基材具有与二价阳离子交联的聚半乳糖醛酸化合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及它们的盐。所述基材可被消化试剂消化成包含半乳糖醛酸单体和二价阳离子的组分。

在另一些实施方式中，提供了一种由可溶性基材收获经培养的细胞的方法。所述方法包括：通过消化基材使经培养的细胞与基材分离，所述消化经由将基材暴露于(i)螯合剂、(ii)酶、或(iii)螯合剂和酶来进行，所述分离得到了收获溶液；以及在分离后对收获溶液的组分进行一系列的洗涤和/或离心循环。所述基材包含聚半乳糖醛酸化合物以及在聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘附聚合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自下列中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及它们的盐。

在以下的具体实施方式中提出了本公开主题的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的本公开主题而被认识。

应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式给出了本公开主题的实施方式，并且旨在用来提供理解要求保护的本公开主题的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本公开的主题的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的主题的各个实施方式，并与说明书一起用来解释本公开的主题的原理和操作。此外，附图和说明书仅仅是示例性的，并不试图以任意方式限制权利要求的范围。

附图说明

当结合以下附图阅读时，能对下文本公开的具体实施方式的详细描述有最好的理解，附图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：

图1是根据一个实施方式，示出了外交联PGA微载体上的hMSC细胞的相衬图；

图2是根据另一个实施方式，示出了外交联PGA微载体上的hMSC细胞的相衬图；

图3是根据另一个实施方式，示出了外交联PGA微载体上的hMSC细胞的相衬图；

图4是根据一个实施方式，示出了明胶涂覆的PGA微载体上的MRC5和Vero细胞的相衬图；

图5是在明胶涂覆的葡聚糖微载体上和在明胶涂覆的外交联微载体上的Vero细胞的倍数扩增图；

图6是在明胶涂覆的葡聚糖微载体上和在明胶涂覆的外交联微载体上的MRC5细胞的倍数扩增图；

图7是在明胶涂覆的可消化微载体以及在配备有康宁股份有限公司(CorningIncorporated)的

II表面的微载体上的hMSC细胞的倍数扩增图；

图8是示出了根据一个实施方式制造的单分散PGA珠粒的相衬图；

图9是根据一个实施方式，示出了在外交联PGA微载体上的MRC5细胞的相衬图；

图10是示出了比较性微载体的相衬图，其例示了通过乳化和内部凝胶化获得的宽尺寸分布；以及

图11是在接种到VN接枝PGA微载体后，在无血清培养基中的hMSC细胞的相衬图。

图12是使用尺寸排阻色谱法(SEC)的PGA和消化试剂的吸收度的图表；

图13是使用SEC的通过果胶酶和EDTA的PGA聚合物消化的吸收度的图表；

图14是在水中的PGA消化的质谱分析图表；

图15是使用SEC的PGA微载体消化的图表；

图16是根据一个或多个实施方式，对细胞悬浮液进行洗涤和离心的方法的流程图；

图17A是来自未稀释样品的PGA和消化组分的UV-VIS光谱的图表；

图17B是来自稀释样品的PGA和消化组分的UV-VIS光谱的图表；

图17C是在不同波长下的PGA和消化组分的光学密度的图表；

图17D是在各种洗涤之前和之后的图17C的组分的光学密度的图表；

图18是可溶性微载体的SYNTHEMAX II染色的图像；

图19是使用分光光度计测量的图19中染色的荧光强度的图表；

图20是可溶性微载体的抗SYNTHEMAX II抗体染色的图像；

图21是在消化溶液中的可溶性SYNTHEMAX II的斑点印迹分析的图像；

图22A是基于收获溶液的各种稀释液的Vero细胞浓度的图表；

图22B是基于果胶酶的各种稀释液的Vero细胞浓度的图表；并且

图22C是基于EDTA的各种稀释液的Vero细胞浓度的图表。

具体实施方式

下面将对本公开的主题的各个实施方式进行更详细的描述，其中的一些实施方式例示于附图中。在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部件。

公开了促进细胞附着和生长的细胞培养制品。根据一些实施方式，所公开的细胞培养制品允许不使用蛋白酶进行细胞收获。示例性的细胞培养制品为微载体，其也被称为珠粒或微珠粒(统称为“微载体”)。

在一些实施方式中，细胞培养制品是包含凝胶的光滑且透明的(或半透明的)珠粒，所述凝胶包括果胶酸、部分酯化的果胶酸或它们的盐。细胞培养制品可以是球形的或基本上是球形的，并且通过外部凝胶化形成。可以调整细胞培养制品的钙含量，以在减少对细胞的破坏的温和条件下快速收获细胞。促进锚着依存性细胞附着的分子可以通过化学偶联或物理吸附而附着于细胞培养制品的表面。

相比于本公开的外部凝胶化路线，微载体可以经由乳化和内部凝胶化形成。通过该内部凝胶化工艺，经由聚半乳糖醛酸(PGA)水溶液的凝胶化形成珠粒，所述PGA水溶液含有分散在水相中的不溶性钙盐，所述PGA水溶液在油相(也被称为连续相或分散介质)中被乳化。

在内部凝胶化的情形中，通过添加使可溶性二价金属离子(例如Ca²⁺或Mg²⁺)从盐中释放出来的油溶性酸引发交联。然而，使用该方法要求与大量的表面活性剂一样的大量的油相来稳定乳液。虽然植物油可用作连续相，但是在该分散介质中制备的珠粒难以清洗。

内部凝胶化方法的另一个缺点在于一部分的金属离子源(盐)可能仍然是原封不动的，并且在微载体中表现为不均匀性，这可损害表面粗糙度和透明度。此外，在微载体的使用过程中，该保留的金属盐可随着时间释放，这对细胞培养或者在细胞收获期间抑制微载体的消化是不利的。

本公开的外部凝胶化方法提供了廉价且环境友好的合成路线用于制备高度透明的PGA微载体，所述PGA微载体不含有不期望的内含物(第二相)和表面缺陷，并且其支持非蛋白水解的细胞分离和收获。如本文中所定义的，透明微载体在390至700nm的可见光谱内表现出至少90％的透射率，即90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％的透射率，包括前述任何数值之间的范围。

另外，在实施方式中，可提供微载体的均匀的尺寸分布。均匀的尺寸分布确保了在使用期间更加快速及更加干净地从上清液中分离出微载体。这可使培养基更换和最终的产品分离可预测性更高、更加地可靠及更加廉价。在实施方式中，可将微载体尺寸精确地调整到不同范围。这允许定制珠粒的沉降速度以匹配不同的生物工艺需求而不用改变珠粒的材料性质。

根据一些实施方式，提供了可使用乙二胺四乙酸(EDTA)和果胶酶溶解的钙交联的聚半乳糖醛酸(PGA)微载体。本文论述了该PGA聚合物和微载体、以及解离剂和副产物的表征，并且确定了这些组分对随后的细胞生长的影响。基于这些，已经确定了有效的PGA微载体以及使用PGA微载体培养和收获细胞的方法。

PGA微载体消化的副产物(例如，半乳糖醛酸单体、钙、EDTA和果胶酶)使用尺寸排阻色谱法(SEC)、电喷雾电离质谱法(ESI-MS)和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)来表征。使用了UV-Vis(紫外-可见)光谱法来证明这些可溶性组分可通过本文公开的方法移除，所述方法包括一系列的洗涤和/或离心循环。

还如下文所述，通过溶解后用抗

II肽的抗体来分析微载体上的

II涂层的位置，显示出本公开的PGA微载体的大多数

II在珠粒消化后变得可溶。在少量残余的

II仍与所释放的细胞缔合的一些实施方式中，通过向收获溶液添加蛋白酶(例如胰蛋白酶)可降低该水平。

通过将已知浓度的果胶酶和EDTA加回到细胞中，以鉴定对细胞生长影响最小的浓度，分析了消化溶液组分，果胶酶和EDTA对2D培养物中的细胞生长的影响。根据一些实施方式，方法包括一些步骤，在这些步骤中，EDTA的浓度保持在等于或低于1mM并且果胶酶的浓度保持在等于或低于30U/mL。此外，通过在传代或冻存细胞之前洗涤和/或离心或者过滤，可移除这些组分。

因此，根据本文公开的实施方式，提供了消化副产物减少或移除了的微载体。另外，通过根据本文的制品和方法知晓或控制副产物，从业者可增加PGA微载体的使用以及任何生物学和/或治疗意义的知识和信心。

虽然一些实施方式涉及微载体，但是基材可呈现各种形式而不限于微载体或珠粒。在一些实施方式中，基材可呈现适用于填充床生物反应器的形状，并且可以是具有例如圆柱形、矩形、三角形或盘形的泡沫支架。因此，根据实施方式，提供了用于细胞培养的可溶性泡沫支架。所述可溶性泡沫支架包括离子移变(ionotropically)交联的聚半乳糖醛酸化合物，其选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及它们的盐。在一些实施方式中，所述支架可包括至少一种具有表面活性的第一水溶性聚合物。

PGA聚合物

聚半乳糖醛酸(PGA)或果胶酸是在成熟水果和一些蔬菜中发现的果胶降解的水溶性生物聚合物。其最为熟知的是在食品产业中作为增稠剂，但是也可用作药物和生物技术产业中的药品、蛋白质和细胞递送的基质或结合剂。聚合物的粘度取决于分子量、酯化度、浓度、pH和溶液中的抗衡离子的存在。与糖含量无关，PGA聚合物产生凝胶，显示出对pH变化的敏感性小，并且需要限定量的钙或其他二价阳离子来控制凝胶化。PGA聚合物微载体例如可通过将PGA的溶液滴入到氯化钙浴中来制备，这使得液滴作为球形珠粒快速凝胶化。在用促进细胞附着的基材(例如

II或变性胶原)涂覆微载体之前，通过一系列洗涤循环从微载体移除过量的氯化钙。

通过使用乙二胺四乙酸(EDTA)来移除钙离子，可使PGA微载体去稳定。使用酶—果胶酶可进一步降解PGA聚合物，所述酶使单体单元之间的连接水解，并因此减小了PGA聚合物的分子量及增加了其溶解度。一般地，果胶酶与果实成熟有关，因为其促进了植物细胞壁的软化；因此，FDA已经授予果胶酶一般认为安全(GRAS)通知，可用作直接的人类食品成分。

可以使用至少一种离子移变交联的多糖制造微载体。实例包括果胶酸——也被称为聚半乳糖醛酸(PGA)，或其盐；或者被称为果胶酯酸的部分酯化的果胶酸(PE PGA)，或其盐。

果胶酸可通过某些果胶酯的水解形成。果胶是细胞壁多糖并且在自然界中，在植物中具有结构性作用。果胶的主要来源包括柑桔皮(例如柠檬和酸橙的皮)和苹果皮。果胶主要是基于1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸主链的线性聚合物，其被1,2-连接的L-鼠李糖随机中断。平均分子量在约50,000至约200,000道尔顿的范围内。

果胶的聚半乳糖醛酸链可例如用甲基基团部分酯化，并且游离的酸基团可以用单价离子，例如钠、钾或铵离子部分或完全中和。用甲醇部分酯化的聚半乳糖醛酸被称为果胶酯酸，其盐被称为果胶酯酸盐(pectinate)。高甲氧基(HM)果胶的甲基化程度(DM)可为例如60摩尔％至75摩尔％，并且低甲氧基(LM)果胶的甲基化程度可为1摩尔％至40摩尔％。

在选择果胶酯酸的一些实施方式中，酯化度可以为40摩尔％或更小(例如1摩尔％、5摩尔％、10摩尔％、20摩尔％、30摩尔％或40摩尔％，包括前述任何数值之间的范围)。较高的酯化度使得不能有效地通过离子移变交联形成珠粒。不囿于理论，认为需要最小量的游离羧酸基团(未酯化的)以获得有利的离子移变交联程度。

在一些实施方式中，使用LM果胶，例如含有20摩尔％或更少(例如0摩尔％、5摩尔％、10摩尔％、15摩尔％或20摩尔％)甲氧基基团的聚半乳糖醛酸来形成微载体珠粒。这种聚半乳糖醛酸作为果胶酸可以不具有或者具有可忽略不计的甲基酯含量。如在本文中所使用的，不具有或仅具有可忽略不计的甲基酯含量的果胶酯酸以及低甲氧基(LM)果胶被统称为PGA。

在一些实施方式中，使用果胶酸和果胶酯酸的混合物形成微载体珠粒。可以使用纯的果胶酸和/或果胶酯酸。也可以使用与聚合物相容的掺混物。例如，果胶酸或果胶酯酸可以与多糖混合，所述多糖例如葡聚糖、取代的纤维素衍生物、藻酸、淀粉、糖原、阿拉伯糖基木聚糖、琼脂糖等。还可使用葡糖胺基葡聚糖(Glycosaminoglycans)，如透明质酸和硫酸软骨素，或者各种蛋白质，如弹性蛋白、纤维蛋白、丝纤蛋白、胶原及它们的衍生物。其他水溶性合成聚合物也可与果胶酸和/或果胶酯酸掺混。非限制性实例包括聚亚烷基二醇、聚(羟基烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚(甲基)丙烯酰胺和衍生物、聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚乙烯基醇等。相容性聚合物可以是阴离子型、中性或阳离子型的，条件是它们的内含物不影响微载体的消化。

外部离子移变凝胶化

外部凝胶化也被称为扩散凝固，其涉及将水胶体(PGA)溶液引入到离子溶液，同时通过离子扩散到水胶体溶液中发生凝胶化。在实施方式中，将带负电荷的多糖水溶液逐滴分配到二价阳离子溶液中，例如钙、镁或钡溶液中，其诱导PGA聚合物的交联。所述交联为与共价交联相反的离子交联，其允许随后消化交联的聚合物。

根据一些实施方式，PGA在水胶体溶液中的浓度在0.5重量％至5重量％的范围内，例如0.5重量％、1重量％、1.5重量％、2重量％、2.5重量％、3重量％、3.5重量％、4重量％、4.5重量％或5重量％，包括前述任何数值之间的范围。

用于形成水胶体(PGA)溶液的液滴的示例性方法包括使用注射器滴下或挤出；喷射破碎或粉碎，为此通过从喷嘴中拉出液滴的同轴空气流完成珠粒形成；静电珠粒的生成，其使用静电场将液滴从喷嘴拉入凝胶化浴中；磁力驱动振动；喷射切割，为此通过旋转切割工具完成珠粒形成，所述切割工具将喷射流切割成均匀的圆柱区段；以及转盘雾化。

PGA溶液的液滴可以是球形或基本上是球形的，并且其平均直径在10至500微米的范围内，例如10、20、25、50、75、100、150、200、252、300、350、400、450或500微米，包括前述任何数值之间的范围。

凝胶化浴可以包含二价金属盐的水溶液。在实施方式中，凝胶化浴中的盐(如氯化钙)浓度为至少1％(重量/体积)，例如1、2、4、6、8、10、12、14、16、18或20％，包括前述任何数值之间的范围。如果钙含量太低，则由于交联密度太低，珠粒表现出差的稳定性。

水溶液可以包含醇，如乙醇。醇与水的比例(体积/体积)可以在0/100至80/20的范围内，例如0/100、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30和80/20。

在实施方式中，可发生某种共价交联，但是这种不可逆的共价交联的水平应当足够的低，例如小于约10至20摩尔％，以保持珠粒的可消化性。

微载体珠粒可以是球形或基本上是球形的，并且其平均直径在10至500微米的范围内，例如10、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500微米，包括前述任何数值之间的范围。在实施方式中，微载体珠粒的变异系数(CV)也被称为相对标准偏差，其小于20％，例如2、5、10或15％，包括前述任何数值之间的范围。在实施方式中，尺寸分布Δd5-d95(d95与d5之间的差，其中，d5是比5％的微载体群的直径大的微载体直径，并且d95是比95％的微载体群的直径大的微载体直径)小于25微米，例如，10、15或20微米，包括前述任何数值之间的范围。在实施方式中，尺寸分布Δd10-d90(d90与d10之间的差，其中，d10是比10％的微载体群的直径大的微载体直径，并且d90是比90％的微载体群的直径大的微载体直径)小于20微米，例如，5、10或15微米，包括前述任何数值之间的范围。在实施方式中，d5到d95的曲率半径分布(比5％的微载体群直径大的微载体直径的曲率半径与比95％的微载体群体直径大的微载体直径的曲率半径之间的差)小于10cm^-1，例如2、5或8cm^-1，包括前述任何数值之间的范围。

珠粒尺寸的控制

在实施方式中，可在窄的且特定的尺寸范围内制造微载体珠粒。也就是说，可对它们进行尺寸控制。出于一些原因，微载体珠粒的尺寸控制是重要的。如果存在宽的尺寸分布——范围从小微载体到大微载体，则具有较小尺寸的微载体将比较大尺寸的微载体悬浮得更久。在工艺中，精确的沉降时间将更长(因为存在较小的珠粒)或难以限定。在使用时，将需要更长的时间以确保上清液不含微载体。

窄的尺寸分布能够使各珠粒以一致的速度沉降，这允许在培养基更换或培养产物分离期间可预测性更高地从上清液中分离出微载体。可将微载体的尺寸精细调整到不同范围以控制沉降速度。这能够定制沉降速度以匹配不同的工艺需求。尺寸控制的微载体具有均匀的表面积，这提供了可用于每个微载体接种细胞的相同面积。这使得计算可用于细胞接种的表面积变得更加容易。另外，细胞能在相同的时间或相近的时间达到融合。如在本文中所使用的，术语“融合”或“融合的”用于表示细胞在所有细胞与其他细胞接触的生长表面上形成了连贯层，以使得几乎所有可获得的生长表面均得到利用的时刻。例如，“融合”已经被定义为“所有细胞在其周边的全部周围均与其他细胞接触并且不存在剩下未被覆盖的可获得的基材”的情况[R.I.Freshney,Culture of Animal Cells-AManual of BasicTechniques(《动物细胞培养和基础技术手册》)第二版,Wiley-Liss公司，纽约，1987，第363页]。如常规的一样，被细胞覆盖的生长表面的量被称为融合的比例。例如，约一半的生长表面被细胞覆盖的情况在本文中被称为50％融合，或者替换性地被称为半融合。可在相同的搅拌条件中悬浮尺寸受控的微载体。这能够精细控制剪切力来平衡微载体的良好悬浮，并且可以允许具有对细胞造成较小损伤的条件。对于不同组的尺寸受控的微载体，明确的沉降时间可有助于在连续细胞培养期间轻松的分离，以防止在不同时间供给的珠粒上细胞生长不均匀。例如，可将细胞首先接种在尺寸为250μm的尺寸受控的微载体上。在细胞达到了半融合后，可将尺寸为350μm的尺寸受控的微载体添加到生物反应器中以用于珠粒到珠粒转移。在250微米微载体的融合时刻，通过其独特的沉降速度或通过过滤，可移除具有该尺寸的微载体。在生物反应器中仅留下尺寸为350μm且半融合的珠粒。接着可添加新鲜的250μm的微载体。在350μm微载体达到融合后，可将它们收集起来，并且加入新鲜的350μm微载体。这一方法可以确保当珠粒达到融合时，所有的珠粒均被去除。相反，如果将相同尺寸的微载体用于珠粒-珠粒转移和连续细胞培养，较早喂养的珠粒上的细胞比之后喂养的珠粒上的细胞将在生物反应器中停留更久，并且细胞的质量可因为过度融合而下降。

在一些实施方式中，在制造过程中使用振动包封机对可溶性微载体进行尺寸控制。通过经过具有限定孔尺寸、流速和振动频率的喷嘴形成尺寸受控的珠粒。将获得的珠粒的尺寸控制在变异系数小于10％的窄范围内。

珠粒消化

适于消化微载体、收获细胞或者两项都适合的非蛋白水解酶包括果胶裂解酶或果胶酶，它们是水解果胶物质的相关酶的异质群。

细胞收获包括使装载细胞的微载体和包含果胶裂解酶或果胶酶与二价阳离子螯合剂的混合物的溶液接触。

用于收获培养的细胞的示例性方法包括在如本文公开的微载体表面上培养细胞，以及使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与微载体分离。

果胶酶(聚半乳糖醛酸酶)是将复合的果胶分子分解成较短的半乳糖醛酸分子的酶。果胶酶催化聚半乳糖醛酸释出果胶寡糖(POS)。果胶酶由真菌、酵母、细菌、原生动物、昆虫、线虫和植物产生。果胶酶的商购来源一般是多酶，例如Novozyme Pectinex^TM ULTRASPL——一种由选定的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)株产生的果胶酶制剂。NovozymePectinex^TM ULTRA SPL主要含有聚半乳糖醛酸酶、(EC 3.2.1.15)果胶反式消去酶(EC4.2.2.2)和果胶酯酶(EC:3.1.1.11)。EC名称是基于酶催化的化学反应，针对酶的酶委员会分类方案。已知果胶酶水解果胶。它们可以攻击甲酯化果胶或去酯化果胶。

果胶裂解酶在消化溶液中的浓度可以为1至200U，例如1、2、5、10、20、50、100、150或200U，包括前述任何数值之间的范围。

示例性的螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、环己二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇四乙酸(ETGA)、柠檬酸、酒石酸等。消化溶液中的螯合剂浓度可以为1至200mM，例如10、20、50、100、150或200mM。为了防止细胞毒性副作用，螯合剂在消化溶液中的浓度可以为10mM或更小，例如1、2、5或10mM，包括前述任何数值之间的范围。

在实施方式中，包含果胶裂解酶和螯合剂的消化溶液的总体积小于微载体体积的10倍，例如小于微载体体积的1、2、4、5或10倍，包括前述任何数值之间的范围。

根据消化时间、温度和添加的果胶裂解酶的量，可选择或预先确定珠粒的消化程度。已经观察到，在珠粒被完全消化之前，细胞与微载体表面脱离。因此，可在珠粒被完全消化或者未完全消化的情况下收获细胞。在从部分消化的微载体中收获细胞的实施方式中，可以通过过滤、滗析、离心和类似加工中的一种或多种使细胞与剩余的微载体分离。

当珠粒的钙含量为小于2g/l湿润珠粒，例如小于2、1.5、1、0.8或0.5g/l时，珠粒易于消化。当在收获阶段时珠粒的钙含量大于1g/l时，可使用更多体积和/或更高浓度的果胶裂解酶和二价阳离子螯合剂。完全消化的时间可以小于一小时，例如10、15、30或45分钟。如在本文中所使用的，术语“完全消化”是指使微载体颗粒计数符合如美国药典和国家处方集788(USP<788>)中标题为“注射剂中的颗粒物(Particulate Matter in Injections)”中所述的颗粒计数测试的微载体的消化。如USP<788>所述，如果测试的单位中存在的颗粒的平均数目为每毫升不超过25个等于或大于10μm的颗粒，以及每毫升不超过3个等于或大于25μm的颗粒，则制剂符合测试。在实施方式中，在消化微载体之后，尺寸大于或等于10μm的颗粒的微载体颗粒计数小于10个颗粒，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8或9个颗粒，包括前述任何数值之间的范围。在实施方式中，在消化微载体之后，尺寸大于或等于25μm的颗粒的微载体颗粒计数小于1个颗粒，例如，0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9，包括前述任何数值之间的范围。

如本文中所定义的，“湿润珠粒”体积是滗析或离心后珠粒床的体积。所述床包括溶胀珠粒以及间隙水(即，存在于各溶胀珠粒之间的水)。根据测量，湿润珠粒含有70体积％溶胀珠粒和30体积％间隙水。对于1％PGA溶液，溶胀珠粒含有99％水；对于2％PGA溶液，含有98％水；对于3％PGA溶液，含有97％水等。

举例来说，由3％(重量/体积)PGA溶液制备的微珠粒在平衡时含有约1.48g/l钙离子。使用5倍体积(相比于珠粒的体积)的消化溶液，将微珠粒暴露于至少10mM EDTA和至少50U酶，使得在小于10分钟内实现微珠粒的完全消化。

细胞附着

由于PGA珠粒的水凝胶性质及带负电荷，在未经过特定处理的情况下，PGA珠粒不易于支持细胞附着。为了促进锚着依存性细胞的附着，可对微珠粒提供涂层或其他表面处理。举例来说，PGA珠粒可用促进细胞粘附的部分进行官能化，例如用肽(如包含RGD序列的肽)进行官能化。

其他候选肽包括含有某些氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列可能被整联蛋白族的蛋白质识别，或者导致与细胞分子相互作用从而能够维持细胞粘附。实例包括BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型和IV型胶原、变性胶原(明胶)以及类似肽和它们的混合物。其他示例性肽为分别具有以下序列的BSP和玻连蛋白(VN)肽：Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH₂(seq.ID No.1)和Ac-Lys-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH₂(seq.ID No.2)。

在实施方式中，用可作为涂层接枝或施涂的细胞粘附促进重组蛋白对微珠粒进行表面官能化。示例性的重组蛋白包括以商品名

和

plus市售的纤连蛋白样工程改造蛋白，但是也可使用促进锚着依存性细胞附着的其他重组蛋白。

实施例

实施例1：与3％钙交联的1％PGA微珠粒。

通过在持续搅拌下，于80-85℃将聚半乳糖醛酸钠盐[西格玛(Sigma)产品目录号#P3850]溶解到水中，由1重量％的聚半乳糖醛酸(PGA)溶液制备微珠粒。在真空下使用20微米聚丙烯过滤器过滤溶液，以去除悬浮液中的颗粒。

在单独的烧杯中使用400ml的3％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液制备凝胶化浴，使用磁力搅拌器搅拌该凝胶化浴。

使用配有30号规格针头的注射器，通过向凝胶化浴中添加25ml的PGA溶液来制备液滴。施加约2巴的注射器压力。

在氯化钙浴中硬化珠粒120分钟，随后用水洗涤四次。如实施例9所述确定珠粒中的钙含量。在进行四次清洗后，钙浓度为约0.5-0.6g/l湿润珠粒。

在涂覆前，将珠粒在4℃下储存在无菌容器的无菌水中。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。

当在25℃下与5mM EDTA/50U果胶酶接触时，珠粒在5分钟内完全溶解。

实施例2：与12％钙交联的1％PGA微载体。

重复实施例1的步骤，不同之处在于用12％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液替代3％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液。在进行四次清洗后，钙浓度为约0.5-0.6g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。

当在25℃下与5mM EDTA/50U果胶酶接触时，珠粒在5分钟内完全溶解。

实施例3：与3％钙交联的1.5％PGA微载体。

重复实施例1的步骤，不同之处在于使用1.5重量％的聚半乳糖醛酸溶液和4巴的压力。

在进行四次清洗后，钙浓度为约0.7-0.8g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。

实施例4：与12％钙交联的1.5％PGA微载体。

重复实施例3的步骤，不同之处在于使用12％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液替代3％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液。

在进行四次清洗后，钙浓度为约0.7-0.8g/l湿润珠粒。

实施例5-a.与3％钙交联的2％PGA微载体。

重复实施例1的步骤，不同之处在于使用2重量％的聚半乳糖醛酸溶液和5巴的压力。将PGA溶液预热到30℃并且在30℃下喷射到保持在25℃下的凝胶化浴中。

在进行四次清洗后，钙浓度为约0.9-1.0g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。

实施例5-b：与3％钙交联的3％PGA微载体。

重复实施例1的步骤，不同之处在于使用3重量％的聚半乳糖醛酸溶液和6巴的压力。将PGA溶液预热到40℃并且在40℃下喷射到保持在25℃下的凝胶浴中。

在进行四次清洗后，钙浓度为1.48g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。

当在25℃下与5mM EDTA/50U果胶酶接触时，珠粒在10分钟内完全溶解。

实施例6：与12％钙交联的2％PGA微载体。

重复实施例5-a的程序，不同之处在于使用12％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液。

在进行四次清洗后，钙浓度为约0.9-1.0g/l湿润珠粒。

实施例7：用与戊二醛交联的0.1％明胶涂覆的PGA珠粒。

通过首先将0.5g(A型)猪皮(西格玛#G1890)浸泡于20ml的水中，然后添加480ml的热水(60℃-80℃)制备0.1％猪皮明胶溶液。

离心收集根据实施例1-6制备的10毫升PGA珠粒，向其中添加10mL的猪皮明胶溶液。温和振荡得到的混合物并在25℃下孵育60分钟。去除上清液并在水中洗涤一次珠粒。

为了使明胶涂层交联，向珠粒床中添加由25％储液(西格玛C5882)制备的100ml的0.05％戊二醛溶液，并且在温和振荡下在23℃下孵育1小时。随后用水清洗珠粒三次并在4℃下储存在无菌容器中。

实施例8：具有

II-SC合成共聚物表面的PGA珠粒

将根据实施例1制备的约9ml的溶胀珠粒置于50ml塑料离心管中。向珠粒中添加36ml的0.25mg/ml粘附促进肽水溶液以形成康宁股份有限公司(Corning Incorporated)的

II-SC表面。温和振荡离心管并在40℃下静置30分钟，以使合成共聚物对珠粒进行官能化。冷却后，用去离子水洗涤官能化珠粒三次。将珠粒储存在无菌容器中的4℃水中。

实施例9：钙滴定

为了对钙含量进行定量，通过将1ml的PGA珠粒与10ml的5mM EDTA/50U果胶酶溶液合并来消化PGA珠粒。剧烈振荡悬浮液以及在25℃下温和振荡一小时直至完全消化。

通过电感耦合等离子体发射光谱法(Axial ICP-OES，瓦里安720ES工具)对珠粒的钙含量进行定量。通过在9.9ml的1％HNO₃中稀释100μl的含有消化珠粒的溶液制备待分析的样品。使用由1g/l标准水溶液制备的已知钙浓度的溶液建立校准曲线，如对每个样品所做的那样，用HNO₃稀释所述1g/l标准水溶液来制备已知钙浓度的溶液。

实施例10-a：用涂覆有肽共聚物的微载体静置培养hMSC

用70％乙醇/水清洁根据实施例2制备并且具有根据实施例8的

II-SC共聚物表面的珠粒，并且用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，然后用MesenCult^TM-XF完全培养基(MC-XF)清洗。在静置条件下，在24孔ULA板中的MC-XF中进行骨髓间充质干细胞(hMSC)培养。以100k个细胞/孔接种细胞。通过用50U果胶酶/5mM EDTA处理5分钟，从微载体中收获细胞。接种2天后的细胞形态学示于图1。接种4天后的细胞形态学示于图2。

实施例10-b：用涂覆有明胶的微载体静置培养hMSC

根据实施例4制备珠粒并且根据实施例7用明胶涂覆珠粒。图3示出了在24孔板中以100k个细胞/孔接种2天后人骨髓间充质干细胞(hMSC)的粘附和生长的示例性相衬显微图。

实施例11：在涂覆有明胶的PGA微载体上的Vero细胞的扩增

在连续搅拌下，在根据实施例2制备并且根据实施例7涂覆的涂覆有明胶的外部交联的1％PGA微载体上培养Vero细胞。

珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用(IMDM+10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml Glutamax^TM培养基)清洗。

使用补充有10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml Glutamax^TM培养基的IMDM作为培养基，在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。将烧瓶用1M的Vero(p5)接种，不搅拌2小时，随后进行连续搅拌。传代数名称(p#，在本实施例中为“p5”)表示用于产生细胞的扩增和收获周期的数目(#)(即，培养中的细胞已经具有的分裂数目)。

在第5天时用10mL的50U/ml果胶酶、5mM EDTA进行细胞收获。

图4示出了在接种4天后Vero细胞的粘附和生长的示例性相衬显微图。倍数扩增数据示于图5。

实施例12：在涂覆有明胶的PGA微载体上的MRC5细胞的扩增

在间歇搅拌下，在根据实施例2制备并且根据实施例7涂覆的明胶涂覆、外部交联的1％PGA微载体上培养人胚肺成纤维细胞(MRC5)细胞。

珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用(IMDM+10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml Glutamax^TM培养基)清洗。

使用补充有10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml Glutamax^TM培养基的IMDM作为培养基，在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。将烧瓶用1M的MRC5细胞(p4)接种，不搅拌过夜，随后进行间歇搅拌(1/4h每2h)。

在第5天时用10mL的50U/ml果胶酶、5mM EDTA进行细胞收获。

图4示出了在接种4天后MRC5细胞的粘附和生长的示例性相衬显微图。倍数扩增数据示于图6。

图4的显微图示出了Vero和MRC5细胞能够在PGA微载体上粘附并达到融合。

实施例13：在涂覆有肽共聚物的微载体上的hMSC细胞的扩增

在连续搅拌下，在如实施例1所述制备并具有根据实施例8的

II-SC共聚物表面的外部交联的PGA珠粒上培养hMSC细胞。

珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用MesenCult^TM-XF完全培养基(MC-XF)清洗。以1M个细胞/烧瓶接种细胞并且使用MC-XF在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。

在第7天时，通过用10ml 50U果胶酶/5mM EDTA处理5分钟，从微载体中收获细胞。倍数扩增数据示于图7。

实施例14：在涂覆有肽共聚物的微载体上的hMSC细胞的扩增

在连续搅拌下，重复如实施例13所述的hMSC细胞的扩增，不同之处在于，使用的外部交联的PGA珠粒是如实施例5-a所述制备，从2％PGA溶液制备并且具有如实施例8所述的康宁Synthemax II合成肽共聚物表面。倍数扩增数据示于图7。

实施例15：在涂覆有明胶的微载体上的hMSC细胞的扩增

在连续搅拌下，在如实施例1所述制备并如实施例7所述用明胶涂覆的外部交联的PGA珠粒上培养hMSC细胞。

珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用MesenCult^TM-XF完全培养基(MC-XF)清洗。以1M个细胞/烧瓶接种细胞并且使用MC-XF在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。

在第7天时，通过用10ml 50U果胶酶/5mM EDTA处理5分钟，从微载体中收获细胞。倍数扩增数据示于图7。

实施例16：在涂覆有明胶的微载体上的hMSC细胞的扩增

重复如实施例15所述的在连续搅拌条件下进行的hMSC细胞的扩增，不同之处在于使用的外部交联的、涂覆有明胶的PGA珠粒如实施例5-a所述制备并且如实施例7所述用明胶涂覆。倍数扩增数据示于图7。

实施例17：PGA微载体的化学稳定性

通过向塑料离心管容器中添加1ml溶胀珠粒和5ml杜氏磷酸盐缓冲盐水(dPBS)(1X)，评估微载体珠粒的化学稳定性。将管在37℃下孵育24小时。在24小时后，珠粒的体积与初始体积相当，显示珠粒不溶于磷酸盐缓冲液。

实施例18.

使用电磁驱动层流喷嘴系统(Nisco Engineering AG，瑞士苏黎世)，由1.5重量％的PGA溶液制备单分散微载体珠粒。该系统配有100μm喷嘴。设定频率为2.5kHz，并且振幅为100％。通过施加约3psi的压力而产生的溶液流速为约100ml/h(毫升/小时)。

喷嘴位于凝胶化浴(4重量％CaCl₂的50:50(体积/体积)水/乙醇溶液)表面上约7.5cm处。对凝胶化浴进行连续搅拌(170rpm)。

得到的微珠粒的平均直径为240±15μm，这相当于6.25％的变异系数(CV)。这一窄的尺寸分布示于图9(放大倍数：4X)。

如实施例7所述对珠粒进行明胶涂覆，不同之处在于使用50ml而不是100ml的0.05％戊二醛溶液来交联明胶涂层。

实施例10-c：用涂覆有明胶的微载体静置培养MRC5

在静置条件中，在根据实施例18制备及涂覆有明胶的微载体上培养人胚肺成纤维细胞(MRC5)细胞。使用补充有10％FBS的IMDM作为培养基，以100k个细胞/孔将细胞接种在24孔ULA板中。接种1天后的细胞形态学示于图10的相衬显微图中。

实施例19：玻连蛋白肽接枝到PGA微载体

将根据实施例18制备的约3ml的溶胀珠粒置于15ml塑料离心管中。添加12毫升的包含200mM N-乙基-N'-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)和50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液。在23℃下温和搅拌离心管30分钟，以活化PGA珠粒中的羧酸基团。通过离心收集活化的微载体并且用10ml去离子水清洗三次。

将经过清洗的微载体重悬于含有49mg玻连蛋白肽(Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2；购自美国多肽公司(American peptide)，目录号：341587)的12ml硼酸盐缓冲液(pH 9.2)中。在温和搅拌下使悬浮的微载体反应30分钟。

通过离心收集肽缀合的微载体并且用10ml pH为7.4的PBS缓冲液洗涤三次。通过用12ml 1M乙醇胺(pH8.4)抑制(block)60分钟使过量的活化酯失活。

收集肽接枝并被抑制的微载体，用PBS清洗三次。在去除过量的PBS后，用乙醇/水(70/30体积/体积)清洗微载体2次，并且在细胞培养之前于4℃下储存在无菌容器中。

实施例10-d：使用VN接枝的微载体静置培养hMSC

在静置条件中，在根据实施例19制备的VN接枝的微载体珠粒上培养人间充质干细胞(hMSC 2637,p3)。以50k个细胞/孔将细胞接种于24孔ULA板中。图12为示出了接种24小时后在无血清培养基(Mesencult XF)中的hMSC细胞的相衬图。

实施例10a-10d的数据证明完全合成的微载体和涂覆有明胶的微载体均支持hMSC附着和生长。

实施例20：使用外部凝胶化生成具有不同尺寸的可溶性微载体

将聚半乳糖醛酸钠盐溶于水中，使其为2％。使用NISCO单喷嘴振动包封系统进行外部凝胶化。将珠粒滴入溶于乙醇与水的1:1(体积/体积)混合物中的4％CaCl₂中。针对目标尺寸范围，根据表I使用不同尺寸的喷嘴、流速和振动频率。

表I

目标尺寸	喷嘴尺寸	流速	频率	获得的尺寸	CV
						250μm	100μm	120ml/hr	3.00kHz	243±15μm	0.062
350μm	100μm	120ml/hr	1.15kHz	346±11μm	0.032
						450μm	250μm	400ml/hr	1.15kHz	485±17μm	0.035

实施例21：沉降时间测量和分析

为了评价沉降速度，将不同尺寸的微载体的实施方式与以下三种可商购的微载体进行比较：

-1[可商购自宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗生物科学(GEHealthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,Pennsylvania)的基于交联葡聚糖的微载体]、

P102-1521[可商购自纽约华盛顿港的颇尔公司(Pall Corporation,PortWashington,New York)的塑料交联聚苯乙烯微载体]和

II(可商购自纽约华盛顿港的颇尔公司的改性聚苯乙烯微载体)。这三种类型的可商购微载体范围从水凝胶到固体塑料并且密度范围从1.02到1.09。如下文更加详细描述的，测量光密度(OD)并且用于确定悬浮液中的珠粒浓度。由于遮蔽，微载体能够阻挡可见光。一般来说，较低的OD与悬浮液中较低浓度的微载体相关。

测量OD的方法涉及在不同阶段使珠粒在比色皿中沉降。所使用的光路可以靠近比色皿的底部。在微载体珠粒从溶液中沉降出来的时段内，可存在OD变化。一般来说，在测量开始时，微载体珠粒完全悬浮于溶液中，并且以最高水平阻挡光。随着微载体珠粒开始沉降，由于微载体珠粒以相同的方向移动，因此悬浮液的顶部部分开始澄清，但是光路中的微载体珠粒浓度相对仍未改变。随着微载体珠粒开始沉降到光路上限下方，OD下降。当微载体珠粒到达光路的大致中间处时，OD下降了一半。微载体珠粒到达光路的大致中间处的时间段用t_m表示。当总的悬浮液高度和光路位置固定时，珠粒沉降得越快，t_m将会越小。沉降速度在本文中用v_m表示，其可通过微载体从悬浮液顶部行进到光路中间的距离(在本文中用l_m表示)所用的时间(在本文中用t_m表示)来估算。

这示于式(1)：

对于尺寸不均匀的微载体珠粒群体来说，预计不同尺寸的微载体珠粒具有不同的沉降速度。因此，沉降速度v_m表示群体的中值沉降速度。

光路具有宽度，其在本文中用l_w表示，并且存在微载体珠粒经过宽度l_w的时间，其在本文中用t_w表示。当微载体珠粒群体具有均匀的沉降速度时(即：微载体珠粒具有均匀的尺寸分布)，可如式(2)所示利用光路宽度l_w和沉降速度v_m估算t_w：

当微载体珠粒群体具有不同沉降速度的分布时(即：微载体珠粒具有不均匀的尺寸分布)，最快沉降的微载体珠粒将比最慢沉降的微载体珠粒更早地到达光路。随着最快沉降的微载体珠粒通过光路，观察到OD有所减小，然而，直到最慢沉降的微载体珠粒通过光路才观察到OD完全减小。具有不同沉降速度分布的微载体珠粒群体将表现出比具有均匀沉降速度的微载体珠粒群体更大的t_w。因此，t_w越小，微载体珠粒群体的沉降速度越均匀，并且微载体珠粒群体的尺寸分布越均匀。虽然上文假设可确定OD变化的起点和终点，但是应理解该起点和终点可能难以限定。因此，OD变化的斜率可用来表示微载体珠粒群体中沉降速度变化的大小。

实际上，优选等待所有的珠粒完全与上清液分离以使沉降过程结束。因此，本文中用t表示的观察OD完全减小的时间与估算最终的沉降时间更相关。使用微载体珠粒群体的平均沉降时间和微载体珠粒群体的沉降时间的变化可以确定最终的沉降时间。对于定量测量，最终的沉降时间可以通过使用t_m和t_w或者使用OD变化的斜率来确定。

在本实验中，对三种类型的可商购微载体进行再水化并且悬浮于DPBS溶液中。如实验1所述形成具有三种不同尺寸(250μm、350μm和450μm)的可溶性微载体(DMC)。将约0.5ml压紧的微载体添加到每个比色皿中。然后，将DPBS填充到比色皿中直到总体积为3.5ml。通过上下移液10次使微载体悬浮，然后立即进行测量。根据上文所述的方法测量OD并且在400nm的波长下进行测量。也可选择其他可见波长。每2.0秒进行OD测量。由于各种类型的微载体由不同材料形成，具有不同的光学指数、具有不同的尺寸并且具有不同的光学净度，因此使用初始OD来对每个样品的测量进行标准化，从而可比较不同的样品。

将三种尺寸的DMC与三种可商购的微载体比较。结果显示出，直径为350μm的DMC的沉降是直径为250μm的DMC的2倍快，直径为450μm的DMC的沉降是直径为250μm的DMC的3倍快。通过改变DMC的尺寸，沉降速度能够匹配由不同材料制造并且具有不同密度的三种商购珠粒的中值沉降速度。与

-1和

P102-1521微载体相比，尺寸为250μm和350μm的DMC表现出相当的中值沉降速度，但是表现出显著更短的t_w和更陡的OD变化的斜率。如将在实施例21中更加详细描述的，t_w更小并且OD变化的斜率更陡是与可商购的微载体相比尺寸分布更小的结果，这使得相比于可商购的微载体，沉降速度更加一致。比较沉降时间t，尺寸为250μm和350μm的DMC比

-1和

P102-1521微载体沉降得更快，这提示相比于商购的微载体，DMC将需要显著更短的时间来完全沉降。

实施例21：微载体尺寸分布和曲率半径分析

将实施例20中根据目标尺寸为250μm的微载体所形成的可溶性微载体(DMC)的尺寸分布和曲率半径与三种商购微载体进行比较，所述三种商购微载体为：

-1、

P102-1521和

-3(基于交联葡聚糖的微载体，其可商购自宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗生物科学)。使用已知的光学显微技术和用于分析由光学显微镜捕获的图像的软件来确定微载体尺寸。然后使用式(3)，由所确定的微载体尺寸来计算曲率半径：

其中K为微载体曲率半径并且R为微载体半径。对于每种类型的微载体，表II示出了尺寸范围d5-d95(其中d5为比5％的微载体群体的直径大的微载体直径并且d95为比95％的微载体群体的直径大的微载体直径)；尺寸范围d10-d90(其中d10为比10％的微载体群体的直径大的微载体直径并且d90为比95％的微载体群体的直径大的微载体直径)；尺寸分布Δd5-d95(d95与d5之间的差)，d5-d95的变异系数，尺寸分布Δd10-d90(d90与d10之间的差)以及d10-d90的变异系数。

表II

对于每种类型的微载体，表III示出了平均微载体直径(d)、平均曲率半径(K)、d5的曲率半径、d95的曲率半径和d5到d95的曲率半径分布(d5曲率半径与d95曲率半径之间的差)。

表III

表II和III的数据示出了本文公开的DMC比三种可商购的微载体具有更加均匀的尺寸分布和更加均匀的曲率半径。如前所述，均匀的尺寸分布能够使各珠粒以一致的速度沉降，这允许在培养基更换或培养产物分离期间可预测性更高地使微载体与上清液分离。均匀的尺寸分布和均匀的曲率半径还为细胞提供了按每个微载体计可用于细胞接种的相同的表面积，这能够使细胞在相同的时间或相近的时间达到融合。

实施例22：微载体颗粒计数分析

将根据实施例20中所述的微载体所形成的可溶性微载体(DMC)产生的碎片颗粒计数与以下两种商购微载体进行比较：

P102-1521和

-3。对每种类型的微载体进行多步洗涤，再进行搅拌以将颗粒数降低至小于2个颗粒/mL。对于每种类型的微载体，将约1000cm²体积的微载体置于单独的

125mL一次性旋转烧瓶(可商购自纽约州康宁的康宁股份有限公司)并且悬浮于约100mL杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。两个一次性旋转烧瓶用DMC填充。将微载体以约60rpm的速度在室温下连续搅拌共6天。其中一个一次性旋转烧瓶中的DMC根据本文所述的方法溶解，而另一个一次性旋转烧瓶中的DMC未溶解。待完成搅拌后，使微载体与DPBS分离并且使用HIAC 9703+颗粒计数器[商购自印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特生命科学公司(Beckman Coulter Life Sciences)]，利用美国药典和国家处方集788(USP<788>)中标题为“注射剂中的颗粒物”中所述的光阻颗粒计数测试测量DPBS中的颗粒计数。如USP<788>所述，如果测试的单位中存在的颗粒的平均数目每毫升不超过25个等于或大于10μm的颗粒，以及每毫升不超过3个等于或大于25μm的颗粒，则制剂符合测试。表IV示出了对于每种微载体——包括未溶的DMC和溶解的DMC，每毫升DPBS的剩余的尺寸大于或等于25μm的颗粒的数目。表V示出了对于每种微载体——包括未溶的DMC和溶解的DMC，每毫升DPBS的剩余的尺寸大于或等于10μm的颗粒的数目。

表IV

表V

如表IV和V所示，在DMC既有溶解的又有未溶解的情况下，在一次性旋转烧瓶中搅拌后所剩余的DMC颗粒比搅拌另两种商购的微载体后所剩余的颗粒少。这适用于尺寸大于10μm的颗粒以及尺寸大于25μm的颗粒。

比较例1

如实施例11所述重复Vero细胞培养，不同之处在于使用不可消化的

-3基材区域而不是PGA微载体。需要胰蛋白酶使细胞与

-3珠粒的表面脱离。倍数扩增数据概括于图5。用可消化的微载体获得的扩增与

-3上的扩增相当。

比较例2

如实施例12所述重复MRC5细胞培养，不同之处在于使用不可消化的

-3基材而不是PGA微载体。需要胰蛋白酶使细胞与

珠粒的表面脱离。倍数扩增数据概括于图6。用可消化的微载体获得的扩增与

-3上的扩增相当。

比较例3

图11为通过WO2014/209865的实施例1的内部凝胶化形成的珠粒的相衬显微图。珠粒的平均直径为231±54μm，这相当于23％的变异系数(CV)。

本公开的方法提供了廉价且环境友好的路线用于制备高度透明的PGA微载体，所述PGA微载体不含有不期望的内含物和表面缺陷，并且其支持非蛋白水解的细胞分离和收获。

来自PGA消化的副产物的表征

为了证明可溶性微载体消化物的组成，使用尺寸排阻色谱(SEC)，根据分子量来分离PGA聚合物消化的副产物。图12示出了每种单独的试剂的结果(左)，以及数据的放大图(右)以更好地分辨PGA和盐的峰。如图12所示，每种单独的试剂作为对照来运行以确定相对洗脱分布和保留时间。根据此，由于在214nm处的高吸收度，观察到果胶酶和EDTA强峰。PGA峰具有2.1分钟的最短保留时间，这提示其具有最高的分子量，而果胶酶显示出在2.2至3.0分钟之间具有多个峰，符合多种酶组分的混合物。在低分子量PGA峰与果胶酶峰之间有一些重叠，这可干扰PGA的较大的消化碎片的检测。类似地，EDTA由于292.17道尔顿的相对较低的分子量，因此在3.91分钟处具有峰；这也可能遮蔽预期分子量为194.14道尔顿的PGA单体峰和预期分子量为370.26道尔顿的PGA二聚体峰的观察。

为了更好地显示PGA的小分子消化副产物，首先对通过果胶酶消化PGA聚合物进行分析。在无EDTA的情况下，将PGA聚合物的溶液和果胶酶混合在一起。如图13所示，在低分子量处产生了新的周期性峰，这很可能是消化的半乳糖醛酸低聚物长度不同的结果，每个低聚物通过一个残基分开。随着消化时间增加，新的低分子量峰变得更强，这提示PGA低聚物被不断消化成更低分子量的低聚物。在长时间后，周期性峰消失，结果在4.17分钟处得到了强的低分子量峰。该保留时间提示，其分子量比EDTA的低并且极有可能是半乳糖醛酸单体。由于SEC的流动相(例如，杜氏磷酸盐缓冲盐水或DPBS)而不能使用质谱法来确定分子量并鉴定每个峰，因此，使用电喷雾电离质谱法来分析单独的消化溶液，结果示于图14。随着消化时间增加观察到增强峰(m/z＝193)(图14)，这证实了SEC数据，即，PGA聚合物将完全消化成单体。质谱(MS)数据证实，单体峰在小于15分钟内快速增加，但是从15分钟到60分钟改变得显著更少。相较之下，SEC分析显示出在10分钟之后单体峰增加最多。不囿于理论，这提示两种可能的解释：(1)消化迅速发生，并且在不同的分析(MS对比SEC)中所用的不同的样品引入方法可在真实时间中引入一定的位移，以及(2)MS峰强度可能不像SEC的吸收度那样定量地响应于样品浓度。

接着，将PGA聚合物的降解副产物与PGA微载体的降解副产物进行比较。当仅添加EDTA时，微载体解离成PGA聚合物。如图15所示，PGA峰在2.10分钟左右，EDTA峰在3.91和4.03分钟。当加入果胶酶和EDTA二者时，微载体解离，同时发生PGA聚合物的消化。在2.2分钟与3.0分钟之间显示出了额外的果胶酶峰，在3.5分钟后显示出多个周期性峰，其随着消化时间增加而变弱，并且在4.17分钟处显示出单个强峰，其对应于PGA单体(图15)。不同于来自PGA聚合物的SEC数据，由于来自EDTA峰的遮蔽，在3.85分钟至4.10分钟之间不可分辨出PGA低聚物峰。

钙和EDTA浓度

为了促进PGA微载体的溶解，可添加EDTA以隔离并捕获钙离子，由此使聚合物网络和珠粒结构去稳定。因此，电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)与SEC联用，以更好地理解珠粒溶解时释放的钙离子的预期量以及隔离被释放的钙离子所需的EDTA的量。对于如在下文的“方法”部分中所述的两种分析，类似地制备样品，并且通过ICP-MS测得的经消化的溶液中的所得钙含量为90-110mg/L，或者约2.25-2.75mM钙离子(数据未示出)。SEC数据显示出在包含4mM EDTA的消化溶液中，在3.91分钟处的EDTA峰有约60％的下降(数据未示出)，这很好地符合ICP-MS的释放的钙量结果。该数据提示，从所溶解的微载体释放的大多数钙与EDTA结合，并且4mM的EDTA是过量的。应注意，现有的消化方案可能推荐10mM EDTA来确保快速的珠粒消化。然而，根据本公开的实施方式，如上文数据所证明的，可使用显著更低的EDTA浓度来用于珠粒溶解。

从回收的细胞去除可溶性消化组分

可溶性微载体消化产物包括：小的PGA低聚物(单体)、EDTA、钙和果胶酶。为了说明这些组分可如何与细胞分离，根据本公开的一些方法实施方式，在回收后，采用一系列的洗涤和离心循环。如在方法部分中所述，以及如图16所示，通过离心从所溶解的微载体回收细胞，并且通过UV-VIS光谱分析来自每次洗涤循环的75％的上清液。图17A示出了单独的消化溶液试剂的UV-VIS光谱。使用四种不同波长下的光学密度(OD)来代表不同组分的特征谱，该四种波长为：215nm(通常用于一般有机物)；260nm(通常用于DNA)；280nm(通常用于蛋白质)；以及用于可见色的400nm。在未稀释的样品中，由于过饱和，因此在215nm处的OD是不精确的；因此，利用1:10稀释来定量比较(图17B)。如图17C所示，每种试剂具有独特的四种选定波长下的OD组合；这些OD之间的比值用于鉴别消化溶液中的每种试剂，以及对它们的浓度进行进一步的定量，如图17D所示。实验样品的每个波长下的OD值与单独的消化试剂和PGA的附加OD一致。

进一步地，通过每个洗涤/离心循环导致的OD减小与理论的75％培养基减少模型一致，证明了根据实施方式，消化试剂和微载体副产物的移除遵循相似的稀释方案，并且可通过一系列洗涤循环减少。基于这些结果并且考虑到副产物是蛋白质(果胶酶)和水溶性小分子(PGA低聚物、EDTA)，切向流过滤或其他惯用的细胞纯化方法将能够移除这些副产物。

PGA微载体溶解的可溶性副产物应通过洗涤来减少或移除。然而，之前尚不清楚附着基材——

II(来自细胞外基质蛋白(ECM)的合成肽，玻连蛋白)或变性胶原的命运。因此，使用抗

II抗体来测量细胞上的残余肽根据细胞密度而变化的情况。简而言之，以增加的细胞浓度，即，每个孔15x 103、30x 103和60x 103个细胞，将人骨髓间充质干细胞(hMSC)接种在

II(S2)可溶性微载体(DMC)上。用60x 103个细胞/孔对变性胶原(DC)DMC接种以作为阴性对照。使细胞扩增5天，然后用果胶酶和EDTA消化溶液进行收获。如在方法部分中所述，用抗

II抗体对经消化的细胞悬浮液进行免疫染色。使用相同的方法对未接种的DMC进行染色。

如图18所示，当与阴性对照的变性胶原珠粒(NDC)比较时，未接种

IIDMC(NSM)上的

II染色明显。类似地，在从DC DMC(DC 60)收获的细胞上观察到低背景荧光。相较之下，在从

II DMC收获的细胞上观察到与

II免疫检测对应的荧光(S2 15、S2 30和S2 60)。总的荧光信号随着细胞密度而增加；然而，基于使用分光光度计测得的定量荧光强度，每个细胞的检测到的

II的量在不同的条件下是相似的(图19)。进一步地，当荧光强度被归一化成

II DMC的总荧光(图19中的下方图表)时，与收获的细胞缔合的

II的量是消化前存在于微载体上的总

II的1-6％。

根据一些实施方式，一种消化微载体的方法可包括微载体消化期间的标准细胞培养蛋白酶，以促进细胞-ECM网络的分解和单细胞悬浮。为了确定将胰蛋白酶加入到果胶酶/EDTA消化溶液中是否会减少与收获的细胞缔合的

II的量，比较了几种收获条件：果胶酶/EDTA(NSM PE)，仅胰蛋白酶(NSM胰蛋白酶)，胰蛋白酶/果胶酶/EDTA(NSM TPE)，以及先加入胰蛋白酶直到细胞开始与珠粒脱离，随后加入果胶酶/EDTA(NSM T+PE)。然后如前文所进行地，用抗

II抗体对各条件样品进行免疫染色，并且使用荧光显微镜法使样品可视化，如图20所示。当在细胞收获过程期间使用胰蛋白酶时，对应于

II的荧光强度显著减小。进一步地，用胰蛋白酶预处理，随后用果胶酶/EDTA溶液处理相比于胰蛋白酶/果胶酶/EDTA平行处理得到了更少的

II信号。

进一步地，将模拟消化溶液暴露于一系列离心和洗涤循环，如图16中所示，以确定在DMC消化溶液中是否可检测到可溶性Synthemax II肽。基于来自每个洗涤循环的样品的抗

II抗体斑点印迹分析，检测原始消化溶液、洗涤1和洗涤2中的

II(图21)。在洗涤3中检测到痕量的

II，基于

II系列稀释，这被认为处于检测极限～100pg(20ng/mL，5uL印迹)。这些结果证明了通过洗涤可移除或减少微载体稀释液的可溶性副产物，并且仅少量的

II(<6％)仍与回收的细胞缔合。

消化组分对细胞生长的影响

为了证明消化副产物和试剂对随后的细胞生长的影响，收获变性胶原DMC上的Vero细胞并成团块，以完全移除消化溶液，然后重新接种在T75烧瓶中的新鲜培养基中，该培养基包含所收集的消化溶液的稀释液(1:5至1:100)。持续几天监测细胞附着和生长。如图22A所示，低稀释的收获溶液(1:5-1:10)的存在显著影响Vero细胞生长，并且在高达1:40稀释时观察到生长适度抑制。这些结果提示，在消化溶液中存在会抑制细胞生长的组分。为了进一步研究果胶酶和EDTA对在DMC上重新接种Vero细胞的影响，将果胶酶(10-100U/mL终浓度)或EDTA(1至5mM终浓度)加入到含有可溶性微载体的一次性旋转烧瓶中。然后以10000个细胞/cm²将Vero细胞加入到每个旋转烧瓶中。在第3天收获细胞并进行定量。

如图22B所示，细胞培养基中存在浓度≥40U/mL的果胶酶使得细胞收率减少，并且不超过30U/mL的果胶酶浓度对细胞浓度的影响最小(减少小于10％)。因此，根据一些实施方式，可以大于1:3来稀释消化溶液，以最大程度地减少因为果胶酶导致的细胞生长的抑制。类似地，EDTA对细胞生长有显著影响，并且≥2mM的浓度对DMC完整性有影响，其导致DMC溶解(图22C)。因此，根据一些实施方式，为了最大程度地减小EDTA的影响，终浓度可以小于1mM。

进一步地，在细胞重新接种期间加入氯化钙不能够中和EDTA，而在细胞接种之前使氯化钙与含EDTA的细胞悬浮液预平衡的作用可忽略不计(数据未示出)。基于这些结果，会推荐在重新接种之前先通过离心、过滤或灌注从细胞去除微载体消化溶液，或者优化微载体在更低的果胶酶和EDTA浓度(例如，30U/mL果胶酶，1mM EDTA)下溶解。

因此，根据本公开的实施方式以及如上文所证明的，由微载体溶解得到的可溶性组分包括：PGA单体/低聚物、钙、EDTA、果胶酶和表面涂层，并且这些可溶性组分可通过一系列的洗涤/离心循环而从回收的细胞中减少或去除。而且，少量(1-6％)的残余SynthemaxII涂层仍与回收的细胞缔合，这可通过在珠粒消化期间用蛋白酶(例如，胰蛋白酶)来进一步减少。进一步地，由于残余的用于微载体消化的果胶酶和EDTA对随后的细胞生长可具有不利影响，因此，方法可在细胞传代或长期贮存之前通过离心、过滤或灌注来移除或显著减少这些组分。

方法

对于尺寸排阻色谱法，如下制备溶解的微载体：将1mL的浓缩消化溶液(400U/mL果胶酶±40mM EDTA)加入到1mL压紧体积的水化DMC珠粒(或1mL的1.75％PGA溶液，其包含相当量的PGA材料)中，该珠粒在8mL的杜氏改良缓冲盐水(DPBS)中被稀释。使用UPLC-PDA沃特世(Waters)Acquity H-CLASS仪器，并且具有以下设置：柱＝4.6X150 mm,BEH 125SEC(1.7um)；柱温＝30℃；流速＝0.4ml/min；流动相＝20mM磷酸盐(pH5)；并且注射＝10ul。

对于质谱法，如用于SEC那样制备样品，并且在乙腈/水混合物(1:9体积/体积)中稀释，以获得1:10,000的最终稀释液。HPLC级乙腈和水购自飞世尔科技公司(FisherScientific)。使用安捷伦(Agilent)6560离子淌度四极杆飞行时间系统进行电喷雾电离(ESI)-质谱(MS)实验。安捷伦离子淌度系统由下述组成：前漏斗、捕集漏斗、漂移管、和后漏斗，其通过六极杆连接到Q-TOF质谱分析仪。对于所有ESI-MS实验，通过直接注入，以5uL/min的流速将样品引入到双AJS(安捷伦射流)电离源。操作条件如下：气体温度：300℃，干燥气：7L/min，雾化压力：35psi，鞘气温度：275℃，鞘气流：12L min-1,VCap(V_毛细管)：3500V，以及喷嘴电压：2000V。在50-1700m/z的质量范围收集数据获取。通过MassHunterWorkstation软件，B.08.00版，累加和处理获得的所有质谱。

对于电感耦合等离子体质谱法，像用于SEC那样制备样品，并且使用位于1000级洁净室中的安捷伦7700s四极杆电感耦合等离子体质谱仪(Q-ICP-MS)进行分析。用加有铟的高纯度1％HNO3溶液稀释样品，铟用作内标。仅在反应模式(氢气)中测量钙。在无气体模式(仅氩气)和碰撞模式(氦气)中测量钠。在全部三个模式中测量铟。需要时，进行额外的稀释以保持所测量的浓度在校准曲线的线性范围内。记录两次测量的平均浓度。

为了进行可溶性微载体副产物的清除研究，在包含50mL DMEM(康宁公司目录号15-018-CM)并补充有10％FBS(康宁公司目录号：35-074-CV)和2mM L-谷氨酰胺(康宁公司目录号：25-005)的125mL一次性旋转烧瓶(康宁公司目录号：3152)中的200cm2

II可溶性微载体(康宁公司目录号：4988)上培养人间充质干细胞(hMSC)(RoosterBio公司，目录号MSC-001，一百万个细胞)。使用无细胞的一样的旋转烧瓶作为模拟对照。在间歇搅拌下，细胞附着于微载体(30rpm 5分钟，0rpm 6小时，三个循环；Wheaton公司的Micro-StirPlatform，目录号W900701-A)；以35rpm连续搅拌并且在第3天和第5天更换一半体积的培养基，以促进细胞扩增直到第7天。

对于从溶解的微载体收获细胞，将每个旋转烧瓶的内容物转移到50mL的圆锥管中并且使珠粒沉降。移除上清液并且用20mL DPBS洗涤培养物两次。加入由DPBS中的50U/mL果胶酶(西格玛公司，目录号P2611)/5mM EDTA(康宁公司目录号46-034-CI)组成并且1:1混有1X TrypLE的消化溶液直到10cm2/mL的终浓度。10分钟后通过显微镜法证实微载体消化。然后在259x g下使管离心5分钟。在离心后，去除75％的上清液并且在UV-Vis分光光度计(Laxco公司UV-vis，型号Alpha-1106)上测量。在未稀释的情况下或者通过在3000ul DPBS中加入100ul(30倍稀释)或300ul(10倍稀释)稀释的情况下，测量样品吸收度，以确保在检测极限内精确测量。DPBS既用作稀释介质又用作基线。从200nm到500nm扫描所有样品。接着，使用相同体积的DPBS来重悬剩余的液体(模拟样品)或细胞团块并再次离心。重复该过程，共4个DPBS洗涤/离心步骤。

对于进行DMC溶解后的hMSC免疫染色，在ULA 6孔板(康宁公司目录号3471)的每个孔的10mg可溶性微载体上接种人间充质干细胞，并且使细胞附着并在微载体上扩增直到达到期望的细胞密度(15,000-60,000个细胞/孔)。对于细胞收获，将微载体转移到15mL的管中以去除废培养基，并且用DPBS洗涤。弃去洗涤液并且将包含50U/mL果胶酶和5mM EDTA的收获溶液添加到每个悬浮液中。10分钟后观察到珠粒完全消化。对于使用胰蛋白酶、果胶酶和EDTA进行细胞收获，添加2mL的由0.125％胰蛋白酶、5mM EDTA、50U/mL果胶酶组成的混合物；而对于用胰蛋白酶孵育随后用果胶酶和EDTA处理，添加1mL的0.25％胰蛋白酶，孵育5分钟，然后向反应中添加1mL的5mM EDTA和50U/mL果胶酶并且再孵育5分钟。在300x g下使释放的细胞成团块2分钟，并且重悬在1mL DPBS中。

对于细胞固定和免疫染色，将细胞团块重悬在500μL的4％甲醛中并在室温下孵育10分钟。细胞成团块，用DPBS洗涤，并且重悬在250μl的一抗溶液(在DPBS中的抗SynthemaxII多克隆抗体，1:1000稀释)中。在室温下孵育一抗45分钟。用1mL的DPBS洗涤细胞，并且在暗处于室温下重悬在250μL的二抗溶液(在DPBS中的抗兔Alexa488，1:500)中持续45分钟。用1mL的DPBS洗涤细胞两次，然后重悬于200μL DPBS中，以用于在488nm下的荧光显微检测。或者，将100uL的染色细胞(或珠粒)转移到96孔板中以使用分光光度计进行荧光强度定量。使用与针对显微检测相同的方案对未接种的Synthemax II和变性胶原珠粒进行染色，然后将剩余的珠粒溶解在2mL的果胶酶/EDTA收获溶液中以用于荧光测量。

对于用于检测可溶性

II的斑点印迹分析，根据标准方案在水中水化

II可溶性微载体(250mg)。去除水并且用30mL的包含在DPBS中的100U/mL果胶酶和10mM EDTA的消化溶液替换。10分钟后，在125x g下旋转溶解的珠粒溶液10分钟。弃去上清液，仅留下2mL。用12mL DPBS稀释并混合该剩余溶液(洗涤1)。在第二离心循环后，去除上清液，仅留1mL，并且加入13mL的DPBS(洗涤2)。该顺序再重复两次。

收集每次洗涤的样品，并且与等体积的SDS-PAGE运行缓冲液混合，将5uL点到硝酸纤维素膜上。类似地，对

II肽的系列稀释液进行印迹以作为对照并用于浓度比较。在印迹的样品干燥后，用在TBS-吐温(Tween)缓冲液中的5％奶粉饱和该膜30分钟，洗涤，用抗

II抗体(在TBS吐温中的1:1000稀释液)孵育2小时，洗涤，用连接有过氧化物酶的抗兔二抗孵育1小时。在最终洗涤后，使用ECL底物使

II肽可视。

对于存在消化溶液试剂的情况下的Vero细胞生长，在125mL一次性旋转烧瓶中以10,000个细胞/cm2将Vero细胞接种在变性胶原DMC上，保持3-5天。收获细胞，并且对培养物进行离心以完全移除收获溶液。将细胞重新接种到T-75烧瓶中的培养基中，该培养基包含收获溶液的稀释液(1:2至高达1:100稀释)。在T烧瓶中培养细胞5-6天。每天获取细胞的图像。在培养阶段结束时，使用ViCell自动细胞计数器对附着的细胞进行定量。

为了确定果胶酶和EDTA对在微载体上的细胞生长的影响，在细胞加入(10,000个细胞/cm2)之前，将果胶酶(10-100U/mL终浓度)或EDTA(1-5mM终浓度)加入到每个旋转烧瓶中。在细胞附着和细胞扩增阶段期间持续混合细胞。每天获取DMC的图像。在第3天或第5天收获细胞并进行定量。

示例性实施方案

以下是对所公开的主题的各个实施方案的各个方面的描述。每个方面可以包括所公开的主题的各种特征、特性或优点中的一种或多种。实施方案旨在例示所公开的主题的几个方面，并且不应被认为是对所有可能的实施方案的全面或详尽的描述。

方面1涉及一种细胞培养制品，其包括基材，所述基材包括与二价阳离子交联的聚半乳糖醛酸化合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及它们的盐；其中，所述基材可被消化试剂消化成包含半乳糖醛酸单体和二价阳离子的组分。

方面2涉及方面1的制品，其中，所述基材是球形或基本上是球形的。

方面3涉及方面2的制品，其中，基材包含10至500微米的直径。

方面4涉及前述方面1-3中任一方面的制品，其中，二价阳离子的浓度在0.5至2g/l基材的范围内。

方面5涉及方面4的制品，其中，二价阳离子选自下组：钙、镁和钡。

方面6涉及前述方面1-5中任一方面的制品，其还包括在基材表面上的粘附聚合物。

方面7涉及方面6的制品，其中，所述粘附聚合物包括多肽。

方面8涉及方面6-7中任一方面的制品，其中，粘附聚合物接枝于基材表面或者被涂覆在基材表面上。

方面9涉及前述方面1-8中任一方面的制品，其中，聚半乳糖醛酸化合物是离子移变交联的。

方面10涉及前述方面1-9中任一方面的制品，其中，消化试剂包括EDTA和酶中的至少一种。

方面11涉及方面10的制品，其中，所述酶为果胶酶。

方面12涉及方面6-8中任一方面的制品，其中，当基材被消化时，至少一部分的粘附聚合物变得可溶。

方面13涉及方面12的制品，其中，变得可溶的该部分粘附聚合物为至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。

方面14涉及一种用于培养细胞的方法，所述方法包括：使细胞与具有根据方面1-13中任一方面所述的细胞培养制品的细胞培养基接触，以及在培养基中培养细胞。

方面15涉及一种用于收获培养的细胞的方法，所述方法包括：在方面1-13中任一方面的细胞培养制品的表面上培养细胞；以及使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与细胞培养制品分离。

方面16涉及方面15的方法，其中，所述螯合剂包括EDTA。

方面17涉及从可溶性基材收获培养的细胞的方法，所述方法包括：通过消化基材使经培养的细胞与基材分离，所述消化经由将基材暴露于(i)螯合剂、(ii)酶、或(iii)螯合剂和酶来进行，所述分离得到了收获溶液；以及在分离后对收获溶液的组分进行一系列的洗涤和/或离心循环，其中，所述基材包括聚半乳糖醛酸化合物以及在聚半乳糖醛酸化合物表面上的粘附聚合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自下述中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及它们的盐。

方面18涉及方面17的方法，其中，所述酶包括非蛋白水解酶。

方面19涉及方面18的方法，其中，所述非蛋白水解酶选自果胶裂解酶和果胶酶。

方面20涉及方面17-19中任一方面的方法，其中，消化可溶性基材包括：将可溶性基材暴露于约1U/mL至约200U/mL的酶，或者约1U/mL至约50U/mL的酶，或者约1U/mL至约30U/mL的酶，或者小于约30U/mL的酶。

方面21涉及方面17-20中任一方面的方法，其包括：将可溶性泡沫支架暴露于螯合剂，所述螯合剂的浓度小于约10mM，小于约9mM，小于约8mM，小于约7mM，小于约6mM，小于约5mM，小于约4mM，小于约3mM，小于约2mM，或者等于或小于约1mM。

方面22涉及方面17-21中任一方面的方法，其中，所述螯合剂是EDTA。

方面23涉及方面17-22中任一方面的方法，其中，在消化后，至少一部分的粘附聚合物变得可溶。

方面24涉及方面23的方法，其中，变得可溶的该部分粘附聚合物为至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。

方面25涉及方面23或方面24的方法，其还包括：通过向收获溶液添加蛋白酶，移除粘附聚合物的不可溶部分。

方面26涉及方面25的方法，其中，蛋白酶为胰蛋白酶。

除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，除非上下文另外清楚地说明，否则，例如，对一种“二价阳离子”的引用包括具有两种或更多种此类“二价阳离子”的实例。

术语“包括”或“包含”意为包括但不限于，即内含而非排它。

“任选”或“任选地”表示随后描述的事件、情况或情形可能发生，或可能不发生，而且该描述包括事件、情况或情形发生的实例和不发生的实例。

本文中，范围可表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当用先行词“约”将数值表示为近似值时，应理解具体数值构成了另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。

除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任何方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面或与任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面置换。

还应注意本文中涉及将部件“构造成”或“使其适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，将该部件“构造成”或使其“适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期应用的描述。更具体而言，本文所述的将部件“构造成”或使其“适于”的方式表示该部件现有的物理条件，因此可以将其看作该组件的结构特征的限定性描述。

虽然使用过渡语“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代性实施方式。因此，例如，包含果胶酸和水的水胶体溶液的暗示替代性实施方式包括水胶体溶液由果胶酸和水组成的实施方式，以及水胶体溶液基本上由果胶酸和水组成的实施方式。

对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明技术进行各种修改和变动而不偏离本公开的精神和范围。因为本领域技术人员可以结合本发明技术的精神和实质，对所述的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此应认为本发明技术包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (26)

1.一种细胞培养制品，包括：

基材，所述基材包括与二价阳离子交联的聚半乳糖醛酸化合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自以下中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及其盐；

其中，所述基材能够被消化试剂消化成包含半乳糖醛酸单体和二价阳离子的组分。

2.如权利要求1所述的制品，其中，所述基材是球形或基本上是球形的。

3.如权利要求2所述的制品，其中，基材包含10至500微米的直径。

4.如前述权利要求中任一项所述的制品，其中，二价阳离子的浓度在0.5至2g/l基材的范围内。

5.如权利要求4所述的制品，其中，二价阳离子选自下组：钙、镁和钡。

6.如前述权利要求中任一项所述的制品，其还包括在基材表面上的粘附聚合物。

7.如权利要求6所述的制品，其中，所述粘附聚合物包括多肽。

8.如权利要求6-7中任一项所述的制品，其中，粘附聚合物接枝于基材表面或者被涂覆在基材表面上。

9.如前述权利要求中任一项所述的制品，其中，聚半乳糖醛酸化合物是离子移变交联的。

10.如前述权利要求中任一项所述的制品，其中，消化试剂包括EDTA和酶中的至少一种。

11.如权利要求10所述的制品，其中，所述酶是果胶酶。

12.如权利要求6-8中任一项所述的制品，其中，当基材被消化时，至少一部分的粘附聚合物变得可溶。

13.如权利要求12所述的制品，其中，变得可溶的该部分粘附聚合物为至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。

14.一种用于培养细胞的方法，所述方法包括：使细胞与具有根据权利要求1-13中任一项所述的细胞培养制品的细胞培养基接触，以及在培养基中培养细胞。

15.一种用于收获培养的细胞的方法，所述方法包括：

在如权利要求1-13中任一项所述的细胞培养制品的表面上培养细胞；以及

使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与细胞培养制品分离。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述螯合剂包括EDTA。

17.一种从可溶性基材收获经培养的细胞的方法，所述方法包括：

通过消化基材使经培养的细胞与基材分离，所述消化经由将基材暴露于(i)螯合剂、(ii)酶、或(iii)螯合剂和酶来进行，所述分离得到了收获溶液；以及

在分离后对收获溶液的组分进行一系列的洗涤和/或离心循环，

其中，所述基材包含聚半乳糖醛酸化合物以及在聚半乳糖醛酸化合物的表面上的粘附聚合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自下述中的至少一种：果胶酸；部分酯化的果胶酸，部分酰胺化的果胶酸及它们的盐。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述酶包括非蛋白水解酶。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述非蛋白水解酶选自果胶裂解酶和果胶酶。

20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中，消化可溶性基材包括：将可溶性基材暴露于约1U/mL至约200U/mL的酶，或者约1U/mL至约50U/mL的酶，或者约1U/mL至约30U/mL的酶，或者小于约30U/mL的酶。

21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其包括：将可溶性泡沫支架暴露于螯合剂，所述螯合剂的浓度小于约10mM，小于约9mM，小于约8mM，小于约7mM，小于约6mM，小于约5mM，小于约4mM，小于约3mM，小于约2mM，或者等于或小于约1mM。

22.如权利要求17-21中任一项所述的方法，其中，所述螯合剂是EDTA。

23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中，在消化后，至少一部分的粘附聚合物变得可溶。

24.如权利要求23所述的方法，其中，变得可溶的该部分粘附聚合物为至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。

25.如权利要求23或权利要求24所述的方法，其还包括：通过向收获溶液添加蛋白酶，移除粘附聚合物的不可溶部分。

26.如权利要求25所述的方法，其中，所述蛋白酶是胰蛋白酶。

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