CN107849528A - 用于细胞培养的可消化底物 - Google Patents

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C·威尔莱克
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Abstract

提供了一种细胞培养制品。细胞培养底物包含聚半乳糖醛酸化合物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自下列中的至少一种：果胶酸或其盐，以及酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐。聚半乳糖醛酸化合物与二价阳离子交联，并且二价阳离子浓度在0.5至2g/l底物的范围内。

Description

用于细胞培养的可消化底物
相关申请的交叉引用
本申请依据35 U.S.C.§119要求于2015年9月25日提交的序列号为62/233,044的美国临时申请以及2015年6月8日提交的序列号为62/172,299的美国临时申请的优先权权益，本申请以其内容为基础，并通过引用将其全文纳入本文。本申请涉及共同转让的第8,4044,85号和第8,426,176号美国专利以及涉及共同未决及共同转让的第WO2014/209865号和第WO2014/0120616号国际申请，本申请以其内容为基础，并通过引用将其全文纳入本文。
背景
技术领域
本公开一般涉及制造可消化的底物的方法，更具体而言，涉及可以用于例如分离蛋白质、细胞和病毒以及还可以用于诊断应用和细胞培养的透明可消化微载体。
背景技术
在位于平坦表面上进行的细胞培养中，粘附细胞可达到高度汇合并因此通过细胞间接触抑制来限制细胞扩增，与这样的细胞培养不同的是，具有高表面积/体积比的球形微载体为有效的细胞培养放大或扩增提供了有吸引力的平台，其中收获的细胞或条件培养基可以是所需的产品。
细胞培养依靠的是充分的氧化以及向细胞供应营养物质。相关的挑战包括搅拌微载体以提供所需的氧气和营养物质而不产生足以破坏正在生长的细胞的水动应力。常规来说，使用叶轮进行搅拌。
另一个挑战涉及从细胞或条件培养基中分离出微载体。酶处理可以用于例如收获粘附细胞，尽管酶的加入可破坏细胞。例如，蛋白水解酶可以非选择性地清洁细胞表面受体。
一旦培养的细胞达到汇合，胰蛋白酶常用于使粘附细胞与基质分离。作为一个实例，在使用涂覆有胶原的微载体珠粒培养和收获锚着依存性细胞的方法中，一旦完成生长，则胶原可以消化掉微载体。然而，由于胰蛋白酶的蛋白水解活性，细胞表面蛋白常被切割，这可能导致不期望的细胞功能破坏。认为胰蛋白酶诱导了蛋白质组改变和细胞生理学改变。胰蛋白酶化可以诱导下调生长相关及代谢相关的蛋白质表达和上调凋亡相关的蛋白质表达，提示用于细胞传代培养的胰蛋白酶对细胞生理学可具有不利影响。
作为蛋白酶有害影响的另一个实例，还已知用蛋白酶(如胰蛋白酶)处理细胞使得从癌细胞中除去了抗原，因此可能使其不能用于开发抗癌治疗的疫苗。因此，不使用胰蛋白酶或在不存在蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)的情况下收获细胞是非常需要的。
鉴于上述，有利的是，提供低成本、有效的方法来合成细胞生长表面，所述细胞生长表面包括微载体，尤其是具有受控粒径、组成、均匀性和晶体结构，以及具有支持细胞附着和/或生长，能够使非蛋白水解细胞分离和收获的表面化学的微载体。
发明内容
根据本公开的实施方式，细胞培养制品包括含有聚半乳糖醛酸化合物的底物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自果胶酸或其盐以及酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐中的至少一种。聚半乳糖醛酸化合物与二价阳离子交联。底物中的二价阳离子浓度在0.5至2g/l底物的范围内。
制造细胞培养制品的方法包括将水胶体溶液分配(即，逐滴)到凝胶浴中。水胶体溶液包含聚半乳糖醛酸(PGA)化合物，所述聚半乳糖醛酸化合物(PGA)选自果胶酸或其盐和酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐中的至少一种。凝胶浴包含二价金属盐。
培养细胞的方法包括使细胞与具有上述细胞培养制品的细胞培养基接触以及在培养基中培养细胞。收获培养的细胞的方法包括在上述细胞培养表面上培养细胞，以及使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以从制品中分离出细胞。
在实施方式中，微载体是透明的，能够进行细胞观察的，并且适于在化学成分明确的培养基或有血清培养基中进行大规模细胞繁殖。
PGA底物的制备与现有的能够制备具有均匀尺寸分布的微载体的高通量制造工艺相兼容。均匀的尺寸分布免除了额外的筛分步骤的需要，筛分步骤是劳动密集型的、耗时的，并且要求另外的仪器及大量的水和有机溶剂。本公开的合成不是基于乳化方法，因此不需要使用表面活性剂或者作为分散介质的大量有机溶剂。另外，所述方法使用水溶形式的钙，因此，能够制备允许容易地观察细胞的具有光滑表面的均匀且透明的PGA底物。所述方法是环境友好型的，并且比基于乳化或内部凝胶化的方法更加经济。
可消化的细胞培养制品公开于共同转让的国际公布号WO2014/209865中，其内容通过引用的方式全文纳入本文。
在以下的具体实施方式中提出了本公开主题的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所述的本公开主题而被认识。
应理解，前面的一般性描述和以下的具体实施方式给出了本公开主题的实施方式，并且旨在用来提供理解要求保护的本公开主题的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对本公开的主题的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本公开的主题的各个实施方式，并与说明书一起对本公开的主题的原理和操作进行阐述。此外，附图和说明书仅仅是示例性的，并不试图以任意方式限制权利要求的范围。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可对下文本公开的具体的实施方式的详细描述有最好的理解，附图中相同的结构用相同的附图标记表示，其中：
图1A、B和C为根据一些实施方式所述的微载体的不同尺寸的示意图；
图2为示出了作为PGA浓度函数的钙含量的图表；
图3为示出了在根据一个实施方式的外交联PGA微载体上的hMSC细胞的相衬图；
图4为示出了在根据另一个实施方式的外交联PGA微载体上的hMSC细胞的相衬图；
图5为示出了在根据另一个实施方式的外交联PGA微载体上的hMSC细胞的相衬图；
图6示出了显示在根据一个实施方式的明胶涂覆的PGA微载体上的MRC5和Vero细胞的相衬图；
图7为在明胶涂覆的葡聚糖微载体和在明胶涂覆的外交联微载体上的Vero细胞的倍数扩增图；
图8为在明胶涂覆的葡聚糖微载体和在明胶涂覆的外交联微载体上的MRC5细胞的倍数扩增图；
图9为在明胶涂覆的可消化微载体以及在配备有康宁股份有限公司(CorningIncorporated)的II表面的微载体上的hMSC细胞的倍数扩增图；
图10为示出了根据一个实施方式制造的单分散PGA珠粒的相衬图；
图11为示出了在根据一个实施方式的外交联PGA微载体上的MRC5细胞的相衬图；
图12为示出了对比微载体的相衬图，其例示了通过乳化和内部凝胶化获得的宽尺寸分布；以及
图13为在将hMSC细胞接种到VN接枝PGA微载体后，在无血清培养基中的hMSC细胞的相衬图。
图14A、C和E为根据实施方式所述的尺寸控制的微载体的显微图，图14B、D和F示出了图14A、C和E所示的尺寸控制的微载体的尺寸分布。
图15为实施方式中的比色皿的图。
图16为微载体从溶液中沉降的示意图，该图包括例示了标准沉降过程的OD的曲线图。
图17为相比于现有技术产品，例示了根据实施方式所述的示例性微载体的沉降时间的曲线图。
具体实施方式
下面将对本公开的主题的各个实施方式进行更详细的描述，其中的一些实施方式例示于附图中。在附图中使用相同的附图标记表示相同或相似的部件。
公开了促进细胞附着和生长以及允许不使用蛋白酶而进行细胞收获的细胞培养制品。示例性的细胞培养制品为微载体，其也被称为珠粒或微珠粒(统称为“微载体”)。图1A、B和C例示了在一些实施方式中的微载体珠粒100的三种不同尺寸。在一些实施方式中，细胞培养制品是包含凝胶的光滑且透明的(或半透明的)珠粒，所述凝胶包括果胶酸、部分酯化的果胶酸或它们的盐。细胞培养制品可以是球形的或基本上是球形的，并且通过外部凝胶化形成。可以调整细胞培养制品的钙含量以在减少对细胞的破坏的温和条件下快速收获细胞。促进锚着依存性细胞附着的分子可以通过化学偶联或物理吸附附着于细胞培养制品的表面。
相比于本公开的外部凝胶化路线，微载体可以经由乳化和内部凝胶化形成。通过该内部凝胶化工艺，珠粒经由PGA水溶液的凝胶化来形成，所述PGA水溶液含有分散在水相中的不溶性钙盐，所述PGA水溶液在油相(也被称为连续相或分散介质)中被乳化。
在内部凝胶化的情形中，通过添加使可溶性二价金属离子(例如Ca2+或Mg2+)从盐中释放出来的油溶性酸引发交联。然而，使用该方法要求与大量的表面活性剂一样的大量的油相来稳定乳液。虽然植物油可用作连续相，但是在该分散介质中制备的珠粒难以清洗。
内部凝胶化方法的另一个缺点在于一部分的金属离子源(盐)可能仍然是完整的，并且在微载体中表现为不均匀性，这可损害表面粗糙度和透明度。此外，在微载体的使用过程中，该保留的金属盐可随着时间释放，这对细胞培养或者在细胞收获期间抑制微载体的消化是不利的。
本公开的外部凝胶化方法提供了廉价且环境友好的合成路线用于制备高度透明的PGA微载体，所述PGA微载体不含有不期望的内含物(第二相)和表面缺陷，并且其支持非蛋白水解的细胞分离和收获。如本文中所定义的，透明微载体在390至700nm的可见光谱内表现出至少90％的透射率，即90％、92％、94％、96％、98％、99％或100％的透射率，包括前述任意数值之间的范围。
另外，在一些实施方式中，可提供微载体的均匀的尺寸分布。均匀的尺寸分布确保了在使用期间更加快速及更加干净地从上清液中分离出微载体。这可使培养基更换和最终的产品分离可预测性更高、更加地可靠及更加廉价。在一些实施方式中，可将微载体尺寸精确地调整到不同范围。这允许定制珠粒的沉降速度以匹配不同的生物工艺需求而不用改变珠粒的材料性质。
PGA聚合物
可以使用至少一种离子移变交联的多糖制造微载体。实例包括果胶酸——也被称为聚半乳糖醛酸(PGA)，或其盐；或者被称为果胶酯酸的部分酯化的果胶酸(PE PGA)，或其盐。
果胶酸可通过某些果胶酯的水解形成。果胶是细胞壁多糖并且在自然界中，在植物中具有结构性作用。果胶的主要来源包括柑桔皮(例如柠檬和酸橙的皮)和苹果皮。果胶主要是基于1,4-连接的α-D-半乳糖醛酸酯骨架的线性聚合物，所述骨架被1,2-连接的L-鼠李糖随机中断。平均分子量在约50,000至约200,000道尔顿的范围内。
果胶的聚半乳糖醛酸链可例如用甲基基团部分酯化，并且游离的酸基团可以用单价离子，例如钠、钾或铵离子部分或完全中和。用甲醇部分酯化的聚半乳糖醛酸被称为果胶酯酸，其盐被称为果胶酯酸盐(pectinate)。高甲氧基(HM)果胶的甲基化程度(DM)可为例如60摩尔％至75摩尔％，并且低甲氧基(LM)果胶的甲基化程度可为1摩尔％至40摩尔％。
在选择果胶酯酸的一些实施方式中，酯化度可以为40摩尔％或更小(例如1摩尔％、5摩尔％、10摩尔％、20摩尔％、30摩尔％或40摩尔％，包括前述任意数值之间的范围)。较高的酯化度使得不能有效地通过离子移变交联形成珠粒。不囿于理论，认为需要最小量的游离羧酸基团(未酯化的)以获得有利的离子移变交联程度。
在一些实施方式中，使用LM果胶，例如含有20摩尔％或更少(例如0摩尔％、5摩尔％、10摩尔％、15摩尔％或20摩尔％)甲氧基基团的聚半乳糖醛酸来形成微载体珠粒。这种聚半乳糖醛酸作为果胶酸可以不具有或者具有可忽略不计的甲基酯含量。如在本文中所使用的，不具有或仅具有可忽略不计的甲基酯含量的果胶酯酸以及低甲氧基(LM)果胶被统称为PGA。
在一些实施方式中，使用果胶酸和果胶酯酸的混合物形成微载体珠粒。可以使用纯的果胶酸和/或果胶酯酸。也可以使用与聚合物相容的掺混物。例如，果胶酸或果胶酯酸可以与多糖混合，所述多糖例如葡聚糖、取代的纤维素衍生物、藻酸、淀粉、糖原、阿拉伯糖基木聚糖、琼脂糖等。还可使用葡糖胺基葡聚糖(Glycosaminoglycans)，如透明质酸和硫酸软骨素，或者各种蛋白质，如弹性蛋白、纤维蛋白、丝纤蛋白、胶原及它们的衍生物。其他水溶性合成聚合物也可与果胶酸和/或果胶酯酸掺混。非限制性实例包括聚亚烷基二醇、聚(羟基烷基(甲基)丙烯酸酯)、聚(甲基)丙烯酰胺和衍生物、聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚乙烯基醇等。相容性聚合物可以是阴离子型、中性或阳离子型的，条件是它们的内含物不影响微载体的消化。
外部离子移变凝胶化
外部凝胶化也被称为扩散凝固，其涉及将水胶体(PGA)溶液引入到离子溶液，同时通过离子扩散到水胶体溶液中发生凝胶化。在一些实施方式中，将带负电荷的多糖水溶液逐滴分配到二价阳离子溶液中，例如钙、镁或钡溶液中，其诱导PGA聚合物的交联。所述交联为离子交联，其与共价交联相反允许随后消化交联聚合物。
根据一些实施方式，PGA在水胶体溶液中的浓度在0.5重量％至5重量％的范围内，例如0.5重量％、1重量％、1.5重量％、2重量％、2.5重量％、3重量％、3.5重量％、4重量％、4.5重量％或5重量％，包括任意上述数值之间的范围。
用于形成水胶体(PGA)溶液的液滴的示例性方法包括使用注射器滴下或挤出；喷射破碎或粉碎，为此通过从喷嘴中拉出液滴的同轴空气流完成珠粒形成；静电珠粒的生成，其使用静电场将液滴从喷嘴拉入胶凝浴中；磁力驱动振动；喷射切割，为此通过旋转切割工具完成珠粒形成，所述切割工具将喷射流切割成均匀的圆柱区段；以及转盘雾化。
PGA溶液的液滴可以是球形或基本上是球形的，并且其平均直径在10至500微米的范围内，例如10、20、25、50、75、100、150、200、252、300、350、400、450或500微米，包括任意前述数值之间的范围。
凝胶浴可以包含二价金属盐的水溶液。在一些实施方式中，凝胶浴中的盐(如氯化钙)浓度为至少1％(重量/体积)，例如1、2、4、6、8、10、12、14、16、18或20％，包括任意前述数值之间的范围。如果钙含量太低，则由于交联密度太低，珠粒表现出差的稳定性。
水溶液可以包含醇，如乙醇。醇与水的比例(体积/体积)可以在0/100至80/20的范围内，例如0/100、10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30和80/20。
在一些实施方式中，可发生某种共价交联，但是这种不可逆的共价交联的水平应当足够的低，例如小于约10至20摩尔％，以保持珠粒的可消化性。
微载体珠粒可以是球形或基本上是球形的，并且其平均直径在10至500微米的范围内，例如10、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500微米，包括任意前述数值之间的范围。在一些实施方式中，微载体珠粒的变异系数(CV)也被称为相对标准偏差，其小于20％，例如2、5、10或15％，包括前述任意值之间的范围。在一些实施方式中，尺寸分布Δd5-d95(d95与d5之间的差，其中d5是比5％的微载体群体的直径大的微载体直径，d95是比95％的微载体群体的直径大的微载体直径)小于25微米，例如10、15或20微米，包括任意前述值之间的范围。在一些实施方式中，尺寸分布Δd10-d90(d90与d10之间的差，其中d10是比10％的微载体群体的直径大的微载体直径，d90是比90％的微载体群体的直径大的微载体直径)小于20微米，例如5、10或15微米，包括任意前述值之间的范围。在一些实施方式中，d5到d95的曲率半径分布(比5％的微载体群体直径大的微载体直径其曲率半径与比95％的微载体群体直径大的微载体直径其曲率半径之差)小于10cm-1，例如2、5或8cm-1，包括任意前述值之间的范围。
珠粒尺寸的控制
在一些实施方式中，可在窄的且特定的尺寸范围内制造微载体珠粒。也就是说，可对它们进行尺寸控制。出于一些原因，微载体珠粒的尺寸控制是重要的。如果存在宽的尺寸分布——范围从小微载体到大微载体，则具有较小尺寸的微载体将比较大尺寸的微载体悬浮得更久。在工艺中精确的沉降时间将更长(因为存在较小的珠粒)或难以限定。在使用时，将需要更长的时间以确保上清液不含微载体。
窄的尺寸分布能够使各珠粒以一致的速度沉降，这允许在培养基更换或培养产物分离期间可预测性更高地从上清液中分离出微载体。可将微载体的尺寸精细调整到不同范围以控制沉降速度。这能够定制沉降速度以匹配不同的工艺需求。尺寸控制的微载体具有均匀的表面积，这提供了可用于每个微载体接种细胞的相同面积。这使得计算可用于细胞接种的表面积变得更加容易。另外，细胞能在相同的时间或相近的时间达到汇合。如在本文中所使用的，术语“汇合”或“汇合的”用于表示细胞在所有细胞与其他细胞接触的生长表面上形成了连贯层，以使几乎所有可获得的生长表面均得到利用的时刻。例如，“汇合”已经被定义为“所有细胞在其周边的全部周围均与其他细胞接触并且不存在剩下未被覆盖的可获得的底物的情况”[R.I.Freshney,Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechniques(《动物细胞培养和基础技术手册》)第二版,Wiley-Liss公司，纽约，1987，第363页]。如常规的一样，被细胞覆盖的生长表面的量被称为汇合的比例。例如，约一半的生长表面被细胞覆盖的情况在本文中被称为50％汇合，或者替换性地被称为半汇合。可在相同的搅拌条件中悬浮尺寸控制的微载体。这能够精细控制剪切力来平衡微载体的良好悬浮，并且可以允许具有对细胞造成较小损伤的条件。对于不同组的尺寸控制的微载体，明确的沉降时间可有助于在连续细胞培养期间轻松的分离，以防止在不同时间供给的珠粒上细胞生长不均匀。例如，可将细胞首先接种在尺寸为250μm的尺寸控制的微载体上。在细胞达到了半汇合后，可将尺寸为350μm的尺寸控制的微载体添加到生物反应器中用于珠粒-珠粒传递。在250μm微载体的汇合时刻，具有该尺寸的微载体可通过其独特的沉降速度或通过过滤被去除。在生物反应器中仅留下尺寸为350μm和半汇合的珠粒。接着可添加新鲜的250μm微载体。在350μm微载体达到汇合之后，可将它们收集并添加新鲜的350μm微载体。这一方法可以确保当珠粒达到汇合后，所有的珠粒均被去除。相反，如果将相同尺寸的微载体用于珠粒-珠粒传递和连续细胞培养，较早喂养的珠粒上的细胞比之后喂养的珠粒上的细胞将在生物反应器中停留更久，并且细胞的质量可因为过度汇合而下降。
在一些实施方式中，在制造过程中使用振动包封机对可溶性微载体进行尺寸控制。通过经过具有限定孔尺寸、流速和振动频率的喷嘴形成尺寸控制的珠粒。将获得的珠粒的尺寸控制在变异系数小于10％的窄范围内。
珠粒消化
适于消化微载体、收获细胞或者两项都适合的非蛋白水解酶包括果胶裂解酶或果胶酶，它们是水解果胶物质的相关酶的异质群。
细胞收获包括使装载细胞的微载体和包含果胶裂解酶或果胶酶与二价阳离子螯合剂的混合物的溶液接触。
用于收获培养的细胞的示例性方法包括在如本文公开的微载体表面上培养细胞，以及使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与微载体分离。
果胶酶(聚半乳糖醛酸酶)是将复合的果胶分子分解成较短的半乳糖醛酸分子的酶。果胶酶催化聚半乳糖醛酸释出果胶寡糖(POS)。果胶酶由真菌、酵母、细菌、原生动物、昆虫、线虫和植物产生。果胶酶的商购来源一般是多酶，例如Novozyme PectinexTMULTRASPL——一种由选定的棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)株产生的果胶酶制剂。NovozymePectinexTMULTRA SPL主要含有聚半乳糖醛酸酶、(EC 3.2.1.15)果胶反式消去酶(EC4.2.2.2)和果胶酯酶(EC:3.1.1.11)。EC名称是基于酶催化的化学反应，针对酶的酶委员会分类方案。已知果胶酶水解果胶。它们可以攻击甲酯化果胶或去酯化果胶。
果胶裂解酶在消化溶液中的浓度可以为1至200U，例如1、2、5、10、20、50、100、150或200U，包括任意前述值之间的范围。
示例性的螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、环己二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇四乙酸(ETGA)、柠檬酸、酒石酸等。消化溶液中的螯合剂浓度可以为1至200mM，例如10、20、50、100、150或200mM。为了防止细胞毒性副作用，螯合剂在消化溶液中的浓度可以为10mM或更小，例如1、2、5或10mM，包括任意前述值之间的范围。
在一些实施方式中，包含果胶裂解酶和螯合剂的消化溶液的总体积小于微载体体积的10倍，例如小于微载体体积的1、2、4、5或10倍，包括任意前述数值之间的范围。
根据消化时间、温度和添加的果胶裂解酶的量，可选择或预先确定珠粒的消化程度。已经观察到，在珠粒被完全消化之前，细胞与微载体表面脱离。因此，可在珠粒被完全消化或者未完全消化的情况下收获细胞。在从部分消化的微载体中收获细胞的实施方式中，可以通过过滤、滗析、离心和类似加工中的一种或多种使细胞与剩余的微载体分离。
当珠粒的钙含量为小于2g/l湿润珠粒，例如小于2、1.5、1、0.8或0.5g/l时，珠粒易于消化。当在收获阶段时珠粒的钙含量大于1g/l时，可使用更多体积和/或更高浓度的果胶裂解酶和二价阳离子螯合剂。完全消化的时间可以小于一个小时，例如10、15、30或45分钟。如在本文中所使用的，术语“完全消化”是指使微载体颗粒计数符合如美国药典和国家处方集788(USP<788>)中标题为“注射剂中的颗粒物(Particulate Matter in Injections)”中所述的颗粒计数测试的微载体的消化。如USP<788>所述，如果测试的单位中存在的颗粒的平均数目不超过等于或大于10μm的每毫升25个颗粒并且不超过等于或大于25μm的每毫升3个颗粒，则制剂符合测试。在一些实施方式中，在消化微载体之后，尺寸大于或等于10μm的颗粒的微载体颗粒计数小于10个颗粒，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8或9个，包括前述任意值之间的范围。在一些实施方式中，在消化微载体之后，尺寸大于或等于25μm的颗粒的微载体颗粒计数小于1个颗粒，例如0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9个，包括前述任意值之间的范围。
如本文中所定义的，“湿润珠粒”体积是滗析或离心后珠粒床的体积。所述床包括溶胀珠粒以及间隙水(即存在于各溶胀珠粒之间的水)。根据测量，湿润珠粒含有70体积％溶胀珠粒和30体积％间隙水。对于1％PGA溶液，溶胀珠粒含有99％水；对于2％PGA溶液，含有98％水；对于3％PGA溶液，含有97％水等。
举例来说，由3％(重量/体积)PGA溶液制备的微珠粒在平衡时含有约1.48g/l钙离子。使用5倍体积(相比于珠粒的体积)的消化溶液，将微珠粒暴露于至少10mM EDTA和至少50U酶，使得在小于10分钟内实现微珠粒的完全消化。
细胞附着
由于PGA珠粒的水凝胶性质及带负电荷，在未经过特定处理的情况下，PGA珠粒不易于支持细胞附着。为了促进锚着依存性细胞的附着，可对微珠粒提供涂层或其他表面处理。举例来说，PGA珠粒可用促进细胞粘附的部分进行官能化，例如用肽(如包含RGD序列的肽)进行官能化。
其他候选肽包括含有某些氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列可能被整联蛋白族的蛋白质识别，或者导致与细胞分子相互作用从而能够维持细胞粘附。实例包括BSP、玻连蛋白、纤连蛋白、层连蛋白、I型和IV型胶原、变性胶原(明胶)以及类似肽和它们的混合物。其他示例性肽为分别具有以下序列的BSP和玻连蛋白
(VN)肽：Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2(seq.ID No.1)和
Ac-Lys-Gly-Gly-Asn-Gly-Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr-Tyr-Arg-Ala-Tyr-NH2(seq.ID No.2)。
在一些实施方式中，用可作为涂层接枝或施涂的细胞粘附促进重组蛋白对微珠粒进行表面官能化。示例性的重组蛋白包括以商品名和plus市售的纤连蛋白样工程改造蛋白，但是也可使用促进锚着依存性细胞附着的其他重组蛋白。
实施例
实施例1.与3％钙交联的1％PGA微珠粒。
通过在持续搅拌下，于80-85℃将聚半乳糖醛酸钠盐[西格玛(Sigma)产品目录号#P3850]溶解到水中，由1重量％的聚半乳糖醛酸(PGA)溶液制备微珠粒。在真空下使用20微米聚丙烯过滤器过滤溶液以去除悬浮液中的颗粒。
在单独的烧杯中使用400ml的3％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液制备凝胶浴，使用磁力搅拌器搅拌该凝胶浴。
使用配有30号规格针头的注射器，通过向凝胶浴中添加25ml的PGA溶液来制备液滴。施加约2巴的注射器压力。
在氯化钙浴中硬化珠粒120分钟，随后用水洗涤四次。如实施例9所述确定珠粒中的钙含量。在进行四次清洗后，钙浓度为约0.5-0.6g/l湿润珠粒。
在涂覆前，将珠粒在4℃下储存在无菌容器的无菌水中。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。
当在25℃下与5mM EDTA/50U果胶酶接触时，珠粒在5分钟内完全溶解。
实施例2.与12％钙交联的1％PGA微载体。
重复实施例1的步骤，不同之处在于用12％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液替代3％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液。在进行四次清洗后，钙浓度为约0.5-0.6g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。
当在25℃下与5mM EDTA/50U果胶酶接触时，珠粒在5分钟内完全溶解。
实施例3.与3％钙交联的1.5％PGA微载体。
重复实施例1的步骤，不同之处在于使用1.5重量％的聚半乳糖醛酸溶液和4巴的压力。
在进行四次清洗后，钙浓度为约0.7-0.8g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。
实施例4.与12％钙交联的1.5％PGA微载体。
重复实施例3的步骤，不同之处在于使用12％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液替代3％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液。
在进行四次清洗后，钙浓度为约0.7-0.8g/l湿润珠粒。
实施例5-a.与3％钙交联的2％PGA微载体。
重复实施例1的步骤，不同之处在于使用2重量％的聚半乳糖醛酸溶液和5巴的压力。将PGA溶液预热到30℃并且在30℃下喷射到保持在25℃下的凝胶浴中。
在进行四次清洗后，钙浓度为约0.9-1.0g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。
实施例5-b.与3％钙交联的3％PGA微载体。
重复实施例1的步骤，不同之处在于使用3重量％的聚半乳糖醛酸溶液和6巴的压力。将PGA溶液预热到40℃并且在40℃下喷射到保持在25℃下的凝胶浴中。
在进行四次清洗后，钙浓度为1.48g/l湿润珠粒。珠粒高度透明并且没有任何可观察到的表面缺陷。
当在25℃下与5mM EDTA/50U果胶酶接触时，珠粒在10分钟内完全溶解。
实施例6.与12％钙交联的2％PGA微载体。
重复实施例5-a的步骤，不同之处在于使用12％(重量/体积)氯化钙的水/乙醇(75/25体积/体积)溶液。
在进行四次清洗后，钙浓度为约0.9-1.0g/l湿润珠粒。
实施例7.用与戊二醛交联的0.1％明胶涂覆的PGA珠粒。
通过首先将0.5g(A型)猪皮(西格玛#G1890)浸泡于20ml的水中，然后添加480ml的热水(60℃-80℃)制备0.1％猪皮明胶溶液。
离心收集根据实施例1-6制备的10毫升PGA珠粒，向其中添加10mL的猪皮明胶溶液。温和振荡得到的混合物并在25℃下孵育60分钟。去除上清液并在水中洗涤一次珠粒。
为了使明胶涂层交联，向珠粒床中添加由25％储液(西格玛C5882)制备的100ml的0.05％戊二醛溶液，并且在温和振荡下在23℃下孵育1小时。随后用水清洗珠粒三次并在4℃下储存在无菌容器中。
实施例8.具有 II-SC合成共聚物表面的PGA珠粒
将根据实施例1制备的约9ml的溶胀珠粒置于50ml塑料离心管中。向珠粒中添加36ml的0.25mg/ml粘附促进肽水溶液以形成康宁股份有限公司(Corning Incorporated)的II-SC表面。温和振荡离心管并在40℃下静置30分钟，以使合成共聚物对珠粒进行官能化。冷却后，用去离子水洗涤官能化珠粒三次。将珠粒在4℃下储存无菌容器中的水中。
实施例9.钙滴定
为了对钙含量进行定量，通过将1ml的PGA珠粒与10ml的5mM EDTA/50U果胶酶溶液合并来消化PGA珠粒。剧烈振荡悬浮液以及在25℃下温和振荡一小时直至完全消化。
通过电感耦合等离子体发射光谱法(Axial ICP-OES，瓦里安720ES工具)对珠粒的钙含量进行定量。通过在9.9ml的1％HNO3中稀释100μl的含有消化珠粒的溶液制备待分析的样品。使用由1g/l标准水溶液制备的已知钙浓度的溶液建立校准曲线，如对每个样品所做的那样，用HNO3稀释所述1g/l标准水溶液来制备已知钙浓度的溶液。
平衡时(为了去除未结合的钙而用水充分洗涤之后)的钙含量与用于通过外部凝胶化制备珠粒的PGA钠盐的量之间的线性关系示于图2。钙含量对应于聚半乳糖醛酸水凝胶的钙捕获能力。
实施例10-a.用涂覆有肽共聚物的微载体静置培养hMSC
用70％乙醇/水清洁根据实施例2制备并且具有根据实施例8的II-SC共聚物表面的珠粒，并且用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，然后用MesenCultTM-XF完全培养基(MC-XF)清洗。在静置条件下，在24孔ULA板中的MC-XF中进行骨髓间充质干细胞(hMSC)培养。以100k个细胞/孔接种细胞。通过用50U果胶酶/5mM EDTA处理5分钟，从微载体中收获细胞。接种2天后的细胞形态学示于图3。接种4天后的细胞形态学示于图4。
实施例10-b.用涂覆有明胶的微载体静置培养hMSC
根据实施例4制备珠粒并且根据实施例7用明胶涂覆珠粒。图5示出了在24孔板中以100k个细胞/孔接种2天后人骨髓间充质干细胞(hMSC)的粘附和生长的示例性相衬显微图。
实施例11.在涂覆有明胶的PGA微载体上的Vero细胞的扩增
在连续搅拌下，在根据实施例2制备并且根据实施例7涂覆的涂覆有明胶的外部交联的1％PGA微载体上培养Vero细胞。
珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用(IMDM+10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml GlutamaxTM培养基)清洗。
使用补充有10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml GlutamaxTM培养基的IMDM作为培养基，在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。将烧瓶用1M的Vero(p5)接种，不搅拌2小时，随后进行连续搅拌。传代数名称(p#，在本实施例中为“P5”)表示用于产生细胞的扩增和收获周期的数目(#)(即培养中的细胞已经具有的分裂数目)。
在第5天时用10mL的50U/ml果胶酶、5mM EDTA进行细胞收获。
图6示出了在接种4天后Vero细胞的粘附和生长的示例性相衬显微图。倍数扩增数据示于图7。
实施例12.在涂覆有明胶的PGA微载体上的MRC5细胞的扩增
在间歇搅拌下，在根据实施例2制备并且根据实施例7涂覆的明胶涂覆、外部交联的1％PGA微载体上培养人胚肺成纤维细胞(MRC5)细胞。
珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用(IMDM+10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml GlutamaxTM培养基)清洗。
使用补充有10％FBS+5ml青霉素链霉素+5ml GlutamaxTM培养基的IMDM作为培养基，在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。将烧瓶用1M的MRC5细胞(p4)接种，不搅拌过夜，随后进行间歇搅拌(1/4h每2h)。
在第5天时用10mL的50U/ml果胶酶、5mM EDTA进行细胞收获。
图6示出了在接种4天后MRC5细胞的粘附和生长的示例性相衬显微图。倍数扩增数据示于图8。
图6的显微图示出了Vero和MRC5细胞能够在PGA微载体上粘附并达到汇合。
实施例13.在涂覆有肽共聚物的微载体上的hMSC细胞的扩增
在连续搅拌下，在如实施例1所述制备并具有根据实施例8的II-SC共聚物表面的外部交联的PGA珠粒上培养hMSC细胞。
珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用MesenCultTM-XF完全培养基(MC-XF)清洗。以1M个细胞/烧瓶接种细胞并且使用MC-XF在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。
在第7天时，通过用10ml 50U果胶酶/5mM EDTA处理5分钟，从微载体中收获细胞。倍数扩增数据示于图9。
实施例14.在涂覆有肽共聚物的微载体上的hMSC细胞的扩增
在连续搅拌下，重复如实施例13所述的hMSC细胞的扩增，不同之处在于，使用的外部交联的PGA珠粒是如实施例5-a所述制备，从2％PGA溶液制备并且具有如实施例8所述的康宁Synthemax II合成肽共聚物表面。倍数扩增数据示于图9。
实施例15.在涂覆有明胶的微载体上的hMSC细胞的扩增
在连续搅拌下，在如实施例1所述制备并如实施例7所述用明胶涂覆的外部交联的PGA珠粒上培养hMSC细胞。
珠粒首先用70％乙醇/水清洁，再用磷酸盐缓冲盐水(dPBS)清洗两次，接着用MesenCultTM-XF完全培养基(MC-XF)清洗。以1M个细胞/烧瓶接种细胞并且使用MC-XF在康宁股份有限公司的一次性旋转烧瓶中进行细胞培养。
在第7天时，通过用10ml 50U果胶酶/5mM EDTA处理5分钟，从微载体中收获细胞。倍数扩增数据示于图9。
实施例16.在涂覆有明胶的微载体上的hMSC细胞的扩增
重复如实施例15所述的在连续搅拌条件下进行的hMSC细胞的扩增，不同之处在于使用的外部交联的、涂覆有明胶的PGA珠粒如实施例5-a所述制备并且如实施例7所述用明胶涂覆。倍数扩增数据示于图9。
实施例17.PGA微载体的化学稳定性
通过向塑料离心管容器中添加1ml溶胀珠粒和5ml杜氏磷酸盐缓冲盐水(dPBS)(1X)，评价微载体珠粒的化学稳定性。将管在37℃下孵育24小时。在24小时后，珠粒的体积与初始体积相当，显示珠粒不溶于磷酸盐缓冲液。
实施例18.
使用电磁驱动层流喷嘴系统(Nisco Engineering AG，瑞士苏黎世)，由1.5重量％的PGA溶液制备单分散微载体珠粒。该系统配有100μm喷嘴。设定频率为2.5kHz，并且振幅为100％。通过施加约3psi的压力而产生的溶液流速为约100ml/h(毫升/小时)。
喷嘴位于凝胶浴(4重量％CaCl2的50:50(体积/体积)水/乙醇溶液)表面上约7.5cm处。对凝胶浴进行连续搅拌(170rpm)。
得到的微珠粒的平均直径为240±15μm，这相当于6.25％的变异系数(CV)。这一窄的尺寸分布示于图10(放大倍数：4X)。
如实施例7所述对珠粒进行明胶涂覆，不同之处在于使用50ml而不是100ml的0.05％戊二醛溶液来交联明胶涂层。
实施例10-c.用涂覆有明胶的微载体静置培养MRC5
在静置条件中，在根据实施例18制备及涂覆有明胶的微载体上培养人胚肺成纤维细胞(MRC5)细胞。使用补充有10％FBS的IMDM作为培养基，以100k个细胞/孔将细胞接种在24孔ULA板中。接种1天后的细胞形态学示于图11的相衬显微图中。
实施例19.玻连蛋白肽接枝到PGA微载体
将根据实施例18制备的约3ml的溶胀珠粒置于15ml塑料离心管中。添加12毫升的包含200mM N-乙基-N'-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺(EDC)和50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的水溶液。在23℃下温和搅拌离心管30分钟，以活化PGA珠粒中的羧酸基团。通过离心收集活化的微载体并且用10ml去离子水清洗三次。
将经过清洗的微载体重新悬浮于含有49mg玻连蛋白肽(Ac-Lys-Gly-Pro-Gln-Val-Thr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe-Thr-Met-Pro-NH2；购自美国多肽公司(Americanpeptide)，目录号：341587)的12ml硼酸盐缓冲液(pH 9.2)中。在温和搅拌下使悬浮的微载体反应30分钟。
通过离心收集肽缀合的微载体并且用10ml pH为7.4的PBS缓冲液洗涤三次。通过用12ml 1M乙醇胺(pH8.4)抑制(block)60分钟使过量的活化酯失活。
收集肽接枝并被抑制的微载体，用PBS清洗三次。在去除过量的PBS后，用乙醇/水(70/30体积/体积)清洗微载体2次，并且在细胞培养之前于4℃下储存在无菌容器中。
实施例10-d.使用VN接枝的微载体静置培养hMSC
在静置条件中，在根据实施例19制备的VN接枝的微载体珠粒上培养人间充质干细胞(hMSC 2637,p3)。以50k个细胞/孔将细胞接种于24孔ULA板中。图13为示出了接种24小时后在无血清培养基(Mesencult XF)中的hMSC细胞的相衬图。
实施例10a-10d的数据证明完全合成的微载体和涂覆有明胶的微载体均支持hMSC附着和生长。
实施例20.使用外部凝胶化生成具有不同尺寸的可溶性微载体
将聚半乳糖醛酸钠盐溶于水中，使其为2％。使用NISCO单喷嘴振动包封系统进行外部凝胶化。将珠粒滴入溶于乙醇与水的1:1(体积/体积)混合物中的4％CaCl2中。为了获得目标尺寸范围，根据表I使用不同尺寸的喷嘴、流速和振动频率。图14示出了用不同参数制造的珠粒的光学显微图像和尺寸分布。使用光学成像分析针对目标尺寸250μm(示于图14A和图14B)、350μm(示于图14C和图14D)和450μm(示于图14E和图14F)的平均尺寸和变异系数。
表I
目标尺寸 喷嘴尺寸 流速 频率 获得的尺寸 CV
250μm 100μm 120ml/hr 3.00kHz 243±15μm 0.062
350μm 100μm 120ml/hr 1.15kHz 346±11μm 0.032
450μm 250μm 400ml/hr 1.15kHz 485±17μm 0.035
实施例21.沉降时间测量和分析
为了评价沉降速度，将不同尺寸的微载体的实施方式与以下三种可商购的微载体进行比较：[可商购自宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗生物科学(GEHealthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,Pennsylvania)的基于交联葡聚糖的微载体]、P102-1521[可商购自纽约华盛顿港的颇尔公司(Pall Corporation,PortWashington,New York)的塑料交联聚苯乙烯微载体]和II(可商购自纽约华盛顿港的颇尔公司的改性聚苯乙烯微载体)。这三种类型的可商购微载体范围从水凝胶到固体塑料并且密度范围从1.02到1.09。如下文更加详细描述的，测量光密度(OD)并且用于确定悬浮液中的珠粒浓度。由于遮蔽，微载体能够阻挡可见光。一般来说，较低的OD与悬浮液中较低浓度的微载体相关。
图16例示了用于测量OD的示例性方法。图16的顶部示出了在不同阶段的比色皿中沉降的珠粒的示意图。穿过比色皿图像的宽的箭头例示了在用于测量OD的方法中使用的光路。如图所示，光路可以靠近比色皿的底部。图15例示了示例性的比色皿。图16为微载体在比色皿(如图15所示的比色皿)中沉降的示意图。图16的底部为例示了在微载体珠粒从溶液中沉降出来的时段内OD变化的图表。一般来说，在测量开始时，如图16(a)所示将微载体珠粒完全悬浮于溶液中，并且以最高水平阻挡了光。随着微载体珠粒开始沉降，由于微载体珠粒以相同的方向移动，因此悬浮液的顶部部分开始澄清，但是光路中的微载体珠粒浓度相对仍未改变，如图16(b)所示。随着微载体珠粒开始沉降到光路上限下方，OD如图16(c)所示下降。当微载体珠粒到达光路的大致中间处时，如图16(d)所示，OD下降了一半。微载体珠粒到达光路的大致中间处的时间段用tm表示。当总的悬浮液高度和光路位置固定时，珠粒沉降得越快，tm将会越小。沉降速度在本文中用vm表示，其可通过微载体从悬浮液顶部行进到光路中间的距离(在本文中用lm表示)所用的时间(在本文中用tm表示)来估算。这示于式(1)：
对于尺寸不均匀的微载体珠粒群体来说，预计不同尺寸的微载体珠粒具有不同的沉降速度。因此，沉降速度vm表示群体的沉降速度中值。
光路具有宽度，其在本文中用lw表示，并且微载体珠粒经过宽度lw的时间(在本文中用tw表示)在图16(c)至图16(e)的行进中示出。当微载体珠粒群体具有均匀的沉降速度时(即：微载体珠粒具有均匀的尺寸分布)，可如式(2)所示利用光路宽度lw和沉降速度vm估算tw：
当微载体珠粒群体具有不同的沉降速度分布时(即：微载体珠粒具有不均匀的尺寸分布)，最快沉降的微载体珠粒将比最慢沉降的微载体珠粒更早地到达光路。随着最快沉降的微载体珠粒通过光路，观察到OD有所减小，然而，直到最慢沉降的微载体珠粒通过光路才观察到OD完全减小。具有不同沉降速度分布的微载体珠粒群体将表现出比具有均匀沉降速度的微载体珠粒群体更大的tw。因此，tw越小，微载体珠粒群体的沉降速度越均匀，并且微载体珠粒群体的尺寸分布越均匀。虽然上文假设可确定OD变化的起点和终点，但是应理解该起点和终点可能难以限定。因此，OD变化的斜率可用来表示微载体珠粒群体中沉降速度变化的大小。
实际上，优选等待所有的珠粒完全与上清液分离以使沉降过程结束。因此，本文中用t表示的观察OD完全减小的时间与估算最终的沉降时间更相关。使用微载体珠粒群体的平均沉降时间和微载体珠粒群体的沉降时间的变化可以确定最终的沉降时间。对于定量测量，最终的沉降时间可以通过使用tm和tw或者使用OD变化的斜率来确定。
在本实验中，对三种类型的可商购微载体进行再水化并且悬浮于DPBS溶液中。如实验1所述形成具有三种不同尺寸(250μm、350μm和450μm)的可溶性微载体(DMC)。将约0.5ml压紧的微载体添加到每个比色皿中。然后，将DPBS填充到比色皿中直到总体积为3.5ml。通过上下移液10次使微载体悬浮，然后立即进行测量。根据上文所述的方法测量OD并且在400nm的波长下进行测量。也可选择其他可见波长。每2.0秒进行OD测量。由于各种类型的微载体由不同材料形成，具有不同的光学指数、具有不同的尺寸并且具有不同的光学净度，因此使用初始OD来对每个样品的测量进行标准化，从而可比较不同的样品。
沉降速度测量结果示于图17。将三种尺寸的DMC与三种可商购的微载体比较。结果示出了350μm直径的DMC的沉降是250μm的DMC的2倍快，并且450μm直径的DMC的沉降是250μm的DMC的3倍快。通过改变DMC的尺寸，沉降速度能够匹配由不同材料制造并且具有不同密度的三种商购珠粒的沉降速度中值。与和P102-1521微载体相比，尺寸为250μm和350μm的DMC表现出具有相当的沉降速度中值，但是表现出tw显著更小并且OD变化的斜率更陡。如将在实施例21中更加详细描述的，tw更小并且OD变化的斜率更陡是与可商购的微载体相比尺寸分布更小的结果，这使得相比于可商购的微载体，沉降速度更加一致。比较沉降时间t，尺寸为250μm和350μm的DMC比和P102-1521微载体沉降得更快，这提示了相比于可商购的微载体，DMC将需要更短的时间来完成沉降。
实施例21.微载体尺寸分布和曲率半径分析
将实施例20中根据目标尺寸为250μm的微载体所形成的可溶性微载体(DMC)的尺寸分布与曲率半径与以下三种可商购微载体的尺寸分布与曲率半径进行比较：P102-1521和(基于交联葡聚糖的微载体，其可商购自宾夕法尼亚州匹兹堡的通用电气医疗生物科学)。使用已知的光学显微技术和用于分析由光学显微镜捕获的图像的软件来确定微载体尺寸。然后使用式(3)，由所确定的微载体尺寸来计算曲率半径：
其中K为微载体曲率半径并且R为微载体半径。对于每种类型的微载体，表II示出了尺寸范围d5-d95(其中d5为比5％的微载体群体的直径大的微载体直径并且d95为比95％的微载体群体的直径大的微载体直径)；尺寸范围d10-d90(其中d10为比10％的微载体群体的直径大的微载体直径并且d90为比95％的微载体群体的直径大的微载体直径)；尺寸分布Δd5-d95(d95与d5的差)；d5-d95的变异系数；尺寸分布Δd10-d90(d90与d10的差)以及d10-d90的变异系数。
表II
对于每种类型的微载体，表III示出了平均微载体直径(d)、平均曲率半径(K)、d5的曲率半径、d95的曲率半径和d5到d95的曲率半径分布(d5曲率半径与d95曲率半径之间的差)。
表III
表II和III的数据示出了本文公开的DMC比三种可商购的微载体具有更加均匀的尺寸分布和更加均匀的曲率半径。如前所述，均匀的尺寸分布能够使各珠粒以一致的速度沉降，这允许在培养基更换或培养产物分离期间可预测性更高地使微载体与上清液分离。均匀的尺寸分布和均匀的曲率半径还为细胞提供了按每个微载体计可用于细胞接种的相同的表面积，这能够使细胞在相同的时间或相近的时间达到汇合。
实施例22.微载体颗粒计数分析
将根据实施例20中所述的微载体所形成的可溶性微载体(DMC)产生的碎片颗粒计数与以下两种可商购的微载体进行比较：P102-1521和对每种类型的微载体进行多步洗涤，再进行搅拌以将颗粒数降低至小于2个颗粒/mL。对于每种类型的微载体，将约1000cm2体积的微载体置于单独的125mL一次性旋转烧瓶(可商购自纽约州康宁镇的康宁股份有限公司)并且悬浮于约100mL杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。两个一次性旋转烧瓶用DMC填充。将微载体以约60rpm的速度在室温下连续搅拌共6天。其中一个一次性旋转烧瓶中的DMC根据本文描述的方法溶解，而另一个一次性旋转烧瓶中的DMC未溶解。待完成搅拌后，使微载体与DPBS分离并且使用HIAC 9703+颗粒计数器[商购自印第安纳州印第安纳波利斯的贝克曼库尔特生命科学公司(Beckman Coulter Life Sciences,Indianapolis,Indiana)]，利用美国药典和国家处方集788(USP<788>)中标题为“注射剂中的颗粒物”中所述的光阻颗粒计数测试测量DPBS中的颗粒计数。如USP<788>所述，如果测试的单位中存在的颗粒的平均数目不超过等于或大于10μm的每毫升25个颗粒并且不超过等于或大于25μm的每毫升3个颗粒，则制剂符合测试。表IV示出了对于每种微载体——包括未溶的DMC和溶解的DMC，剩余的尺寸大于或等于25μm/mL DPBS的颗粒数目。表V示出了对于每种微载体——包括未溶的DMC和溶解的DMC，剩余的尺寸大于或等于10μm/mL DPBS的颗粒数目。
表IV
表V
如表IV和V所示，在DMC既有溶解的又有未溶解的情况下，在一次性旋转烧瓶中搅拌后所剩余的DMC颗粒比搅拌另两种商购的微载体后所剩余的颗粒少。这对于尺寸大于10μm的颗粒以及尺寸大于25μm的颗粒来说是真实的。
对比例1
如实施例11所述重复Vero细胞培养，不同之处在于使用不可消化的底物区域而不是PGA微载体。需要胰蛋白酶使细胞与珠粒的表面脱离。倍数扩增数据概括于图7。用可消化微载体获得的扩增与上的扩增相当。
对比例2
如实施例12所述重复MRC5细胞培养，不同之处在于使用不可消化的底物而不是PGA微载体。需要胰蛋白酶使细胞与珠粒的表面脱离。倍数扩增数据概括于图8。用可消化微载体获得的扩增与上的扩增相当。
对比例3
图12为通过WO2014/209865的实施例1的内部凝胶化形成的珠粒的相衬显微图。珠粒的平均直径为231±54μm，这相当于23％的变异系数(CV)。
本公开的方法提供了廉价且环境友好的路线用于制备高度透明的PGA微载体，所述PGA微载体不含有不期望的内含物和表面缺陷，并且其支持非蛋白水解的细胞分离和收获。
根据本公开的方面(1)，提供了一种细胞培养制品。所述细胞培养制品包括含有聚半乳糖醛酸化合物的底物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自下列中的至少一种：果胶酸或其盐，以及酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐，其中，聚半乳糖醛酸化合物与二价阳离子交联，并且二价阳离子浓度在0.5至2g/l底物的范围内。
根据本公开的另一个方面(2)，提供了根据方面(1)所述的制品，其中，所述底物是球形的或基本上是球形的。
根据本公开的另一个方面(3)，提供了根据方面(2)所述的制品，其中，底物包含10至500微米的直径。
根据本公开的另一个方面(4)，提供了根据方面(1)-(3)中任一个方面所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于20％的变异系数。
根据本公开的另一个方面(5)，提供了根据方面(1)-(4)中任一个方面所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于10％的变异系数。
根据本公开的另一个方面(6)，提供了根据方面(2)-(5)中任一个方面所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于25微米的尺寸分布Δd5-d95，其中，d5是比5％的多个细胞培养制品的直径大的直径，其中，d95是比95％的多个细胞培养制品的直径大的直径，并且其中Δd5-d95是d95与d5之间的差。
根据本公开的另一个方面(7)，提供了根据方面(2)-(5)中任一个方面所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于20微米的尺寸分布Δd10-d90，其中，d10是比10％的多个细胞培养制品的直径大的直径，其中，d90是比90％的多个细胞培养制品的直径大的直径，并且其中Δd10-d90是d90与d10之间的差。
根据本公开的另一个方面(8)，提供了根据方面(2)-(7)中任一个方面所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于10cm-1的曲率半径分布ΔKd5-Kd95，其中，Kd5是直径比5％的多个细胞培养制品的直径大的细胞培养制品的曲率半径，其中，Kd95是直径比95％的多个细胞培养制品的直径大的细胞培养制品的曲率半径，并且ΔKd5-Kd95是Kd5与Kd95之间的差。
根据本公开的另一个方面(9)，提供了根据方面(1)-(8)中任一个方面所述的制品，其中，二价阳离子选自钙、镁和钡。
根据本公开的另一个方面(10)，提供了根据方面(1)-(9)中任一个方面所述的制品，其还包括在底物表面上的粘附聚合物。
根据本公开的另一个方面(11)，提供了根据方面(10)所述的制品，其中，粘附聚合物包括多肽。
根据本公开的另一个方面(12)，提供了根据方面(10)-(11)中任一个方面所述的制品，其中，粘附聚合物接枝于底物表面或者被涂覆在底物表面上。
根据本公开的另一个方面(13)，提供了根据方面(1)-(12)中任一个方面所述的制品，其中，所述底物是尺寸控制的。
根据本公开的另一个方面(14)，提供了制造细胞培养制品的方法。所述方法包括将水胶体溶液分配到凝胶浴中，其中，所述水胶体溶液包含选自以下至少一种的聚半乳糖醛酸化合物：果胶酸或其盐，以及酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐，并且其中，凝胶浴包含二价金属盐。
根据本公开的另一个方面(15)，提供了如方面(14)所述的方法，其中，二价金属选自钙、镁和钡。
根据本公开的另一个方面(16)，提供了如方面(14)-(15)中任一个方面所述的方法，其中，将水胶体溶液逐滴分配到凝胶浴中。
根据本公开的另一个方面(17)，提供了如方面(14)-(16)中任一个方面所述的方法，其中，将水胶体溶液分配到凝胶浴中包括用注射器挤出。
根据本公开的另一个方面(18)，提供了如方面(14)-(17)中任一个方面所述的方法，其中，水胶体溶液包含0.5至5重量％聚半乳糖醛酸。
根据本公开的另一个方面(19)，提供了如方面(14)-(18)中任一个方面所述的方法，其中，凝胶浴包含1至20％(重量/体积)二价金属盐。
根据本公开的另一个方面(20)，提供了如方面(14)-(19)中任一个方面所述的方法，其中，凝胶浴还包含醇。
根据本公开的另一个方面(21)，提供了如方面(14)-(20)中任一个方面所述的方法，所述方法还包括将细胞培养制品悬浮在含肽溶液中。
根据本公开的另一个方面(22)，提供了用于培养细胞的方法。所述方法包括使细胞与具有根据方面(1)-(13)中任一个方面所述的细胞培养制品的细胞培养基接触，以及在培养基中培养细胞。
根据本公开的另一个方面(23)，提供了用于收获培养的细胞的方法。所述方法包括在根据方面(1)-(13)中任一个方面所述的细胞培养制品的表面上培养细胞，以及使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与细胞培养制品分离。
根据本公开的另一个方面(24)，提供了如方面(23)所述的方法，其中，螯合剂包括EDTA。
根据本公开的另一个方面(25)，提供了如方面(23)-(24)中任一个方面所述的方法，其中，使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与细胞培养制品分离是不含蛋白酶的。
除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，除非上下文另外清楚地说明，否则，例如，对一种“二价阳离子”的引用包括具有两种或更多种此类“二价阳离子”的实例。
术语“包括”或“包含”意为包括但不限于，即内含而非排他。
“任选”或“任选地”表示随后描述的事件、情形或部分可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件、情形或部分发生的情况和不发生的情况。
本文中，范围可以表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当使用先行词“约”表示数值为近似值时，应理解，具体数值构成了另一个方面。还应理解的是，每个范围的端点值在与另一个端点值相结合以及独立于另一个端点值的情况下都是有意义的。
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任意方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，如果方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序，或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，则都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面或与任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面置换。
还应注意本文中涉及将部件“构造成”或使其“适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，将该部件“构造成”或使其“适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期应用的描述。更具体而言，本文所述的将部件“构造成”或使其“适于”的方式表示该部件现有的物理条件，因此可以将其看作该组件的结构特征的限定性描述。
虽然使用过渡语“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由……构成”或“基本上由……构成”描述在内的替代性实施方式。因此，例如，包含果胶酸和水的水胶体溶液的暗示替代性实施方式包括水胶体溶液由果胶酸和水组成的实施方式，以及水胶体溶液基本上由果胶酸和水组成的实施方式。
对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明技术进行各种修改和变动而不偏离本公开的精神和范围。因为本领域技术人员可以结合本发明技术的精神和实质，对所公开的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此应认为本发明技术包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。

Claims (25)

1.一种细胞培养制品，包括：
含有聚半乳糖醛酸化合物的底物，所述聚半乳糖醛酸化合物选自下列中的至少一种：
果胶酸或其盐，和
酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐，
其中，聚半乳糖醛酸化合物与二价阳离子交联，并且二价阳离子浓度在0.5至2g/l底物的范围内。
2.如权利要求1所述的制品，其中，所述底物是球形或基本上是球形的。
3.如权利要求2所述的制品，其中，底物包含10至500微米的直径。
4.如前述权利要求中任一项所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于20％的变异系数。
5.如前述权利要求中任一项所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于10％的变异系数。
6.如权利要求2-5中任一项所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于25微米的尺寸分布Δd5-d95，其中，d5是比5％的多个细胞培养制品的直径大的直径，其中，d95是比95％的多个细胞培养制品的直径大的直径，并且其中Δd5-d95是d95与d5之间的差。
7.如权利要求2-6中任一项所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于20微米的尺寸分布Δd10-d90，其中，d10是比10％的多个细胞培养制品的直径大的直径，其中，d90是比90％的多个细胞培养制品的直径大的直径，并且其中Δd10-d90是d90与d10之间的差。
8.如权利要求2-7中任一项所述的制品，其中，多个细胞培养制品包含小于10cm-1的曲率半径分布ΔKd5-Kd95，其中，Kd5是直径比5％的多个细胞培养制品的直径大的细胞培养制品的曲率半径，其中，Kd95是直径比95％的多个细胞培养制品的直径大的细胞培养制品的曲率半径，并且ΔKd5-Kd95是Kd5与Kd95之间的差。
9.如前述权利要求中任一项所述的制品，其中，二价阳离子选自下组：钙、镁和钡。
10.如前述权利要求中任一项所述的制品，其还包括在底物表面上的粘附聚合物。
11.如权利要求10所述的制品，其中，所述粘附聚合物包括多肽。
12.如权利要求10-11中任一项所述的制品，其中，粘附聚合物接枝于底物表面或者被涂覆在底物表面上。
13.如权利要求1-12中任一项所述的制品，其中，所述底物是尺寸控制的。
14.一种制造细胞培养制品的方法，所述方法包括：
将水胶体溶液分配到凝胶浴中，
其中，所述水胶体溶液包含选自以下至少一种的聚半乳糖醛酸化合物：
果胶酸或其盐，和
酯化度为1至40摩尔％的部分酯化的果胶酸或其盐，并且
其中，凝胶浴包含二价金属盐。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，二价金属选自下组：钙、镁和钡。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的方法，其中，将水胶体溶液逐滴分配到凝胶浴中。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，将水胶体溶液分配到凝胶浴中包括使用注射器挤出。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中，水胶体溶液包含0.5至5重量％聚半乳糖醛酸。
19.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中，凝胶浴包含1至20％(重量/体积)二价金属盐。
20.根据权利要求14-19中任一项所述的方法，其中，凝胶浴还包含醇。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，还包括将细胞培养制品悬浮在含肽溶液中。
22.一种用于培养细胞的方法，所述方法包括使细胞与具有根据权利要求1-13中任一项所述的细胞培养制品的细胞培养基接触，以及在培养基中培养细胞。
23.一种用于收获培养的细胞的方法，所述方法包括：
在如权利要求1-13中任一项所述的细胞培养制品的表面上培养细胞；以及
使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与细胞培养制品分离。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述螯合剂包括EDTA。
25.如权利要求23-24中任一项所述的方法，其中，使培养的细胞与果胶酶和螯合剂的混合物接触以使细胞与细胞培养制品分离是不含蛋白酶的。
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