CN1320162A - 三维细胞培养物质及使用它培养细胞的方法 - Google Patents
三维细胞培养物质及使用它培养细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1320162A CN1320162A CN99811448A CN99811448A CN1320162A CN 1320162 A CN1320162 A CN 1320162A CN 99811448 A CN99811448 A CN 99811448A CN 99811448 A CN99811448 A CN 99811448A CN 1320162 A CN1320162 A CN 1320162A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- sugar
- containing polymer
- dimensional
- sugar chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 238000011534 incubation Methods 0.000 title 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 56
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 50
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 claims abstract description 27
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims abstract description 27
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 23
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims abstract description 17
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims abstract description 17
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 claims abstract description 9
- LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N pectic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)O[C@H](C(O)=O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O2)C(O)=O)O)[C@@H](C(O)=O)O1 LCLHHZYHLXDRQG-ZNKJPWOQSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 62
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 33
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 33
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 14
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 7
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- -1 six quadrols Chemical compound 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Chemical compound CC(O)CN(CC(C)O)CCN(CC(C)O)CC(C)O NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RPOKRGMOEWYIKB-ZFCLCKFASA-N (2r,3r,4r,5r)-n-[(4-ethenylphenyl)methyl]-2,3,6-trihydroxy-5-methyl-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexanamide Chemical compound O([C@H]([C@@H](CO)C)[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)NCC=1C=CC(C=C)=CC=1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RPOKRGMOEWYIKB-ZFCLCKFASA-N 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 4
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 3-bromoimidazo[1,2-a]pyridine-6-carbonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CN2C(Br)=CN=C21 UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 229940099563 lactobionic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 2
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHQULXYNBKWNDF-UHFFFAOYSA-N 3,4-dimethylbenzene-1,2-diamine Chemical compound CC1=CC=C(N)C(N)=C1C MHQULXYNBKWNDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000018361 Contactin Human genes 0.000 description 1
- 108060003955 Contactin Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037505 Secretin Human genes 0.000 description 1
- 108010086019 Secretin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000005859 cell recognition Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N iodine Chemical compound II PNDPGZBMCMUPRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000505 pernicious effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004184 polymer manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 244000195895 saibo Species 0.000 description 1
- 229960002101 secretin Drugs 0.000 description 1
- OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N secretin human Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 OWMZNFCDEHGFEP-NFBCVYDUSA-N 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010129 solution processing Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/067—Hepatocytes
- C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/70—Polysaccharides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明的技术方案是将包括含糖聚合物的一种细胞培养物质制成三维形状,在所述的含糖聚合物中,至少一类糖链通过间隔分子被作为侧链结合,由此制备三维细胞物质。就所述的含糖聚合物而言,优选使用带有诸如藻酸、透明质酸、果胶酸或其衍生物这样的羧基的含糖聚合物。具有对细胞特异性识别特性的糖链作为侧链被结合,因此,当使用所述细胞培养物质对细胞进行培养时,能够维持和改善细胞的增殖、形态和功能并因细胞与糖链之间的特异性相互作用而保持细胞形态与体内细胞形态接近。
Description
发明领域
本发明涉及一种制成三维形状的三维细胞培养物质，由此可以按照与在体内细胞中相同的方式来表达细胞的增殖、形态和功能；本发明还涉及一种使用所述细胞培养物质培养细胞的方法。
发明背景
近年来在改造糖的领域中已经取得了显著的进展。例如，植物细胞细胞壁中的蛋白聚糖、糖脂、糖蛋白等是带有糖链的生物聚合物的典型实例。认为它们中的每一种均参与：(1)细胞的稳定；(2)细胞的分化、增殖、粘附和迁移以及(3)细胞之间的相互作用和细胞识别；且已经得到了各种有关报导。此外，已经逐步明确了机理，其中这些聚合物的糖链彼此起另外的作用、辅助、扩展、调节或抑制其功能，由此它们可控制高级和精确的生物反应。
此外，这类糖链使细胞分化和增殖并参与细胞的粘附并且已经明确了它们与细胞免疫和恶性改变的关系。因此，预计通过尝试进行一种用改造糖与药物的最接近关系、细胞改造或组织改造的新型开发可以发展各种工业。
一个实例是在对因细胞表面上糖链之间和糖链受体中的异常相互作用而导致的疾病发作方面或对糖链在诸如AIDS这样的病毒感染中的作用方面的研究已经非常活跃(Takehiro Kawano,Bio Industry,14,22-30(1997))。此外，对识别诸如促胰液素、接触蛋白和contactinhibin这样作为介导细胞之间粘附的分子的蛋白质的研究在理解生物反应中是重要的(Tuneshige Takeuchi和NaokiTakahashi,Saibo Kogaku,16,801-812(1997))。
本发明者已经进行了充分的研究，将注意力集中在糖链的细胞特异性相互作用方面；且作为用于对脱唾液酸糖蛋白受体的配体模型，他们设计并合成了聚(N-对乙烯基苄基-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺])(缩写为PVLA)，它是在侧链上带有半乳糖的聚苯乙烯。例如，在用这种PVLA作为细胞培养物质包被的培养皿上进行的肝细胞培养实验中，发现通过PVLA与肝实质细胞表面上脱唾液酸糖蛋白受体的特异性亲和力可以选择性地培养肝实质细胞且甚至在二维培养物质环境中也可以将肝实质细胞本身制成三维形状且特别是以球形体存在(A.kobayashi,M.Goto,K.Kobayashi,T.Akaike,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.,6,325-342(1994))。然而，这种PVLA具有含有聚苯乙烯的结构，它是作为主链的合成聚合物；且因此它具有下列缺陷：无法获得生物降解力且存在表达抗原性和具有毒性的可能性。
同时，还使用用诸如属于天然蛋白质的胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白这样的粘着蛋白包被的培养皿对细胞进行培养。然而，这是一种二维培养且由此并不能充分实现细胞的增殖、细胞功能的表达等。
近来已经进行了一种尝试，其中使用紫外线、放射线或化学交联剂来交联诸如胶原蛋白、藻酸、透明质酸和聚异丙基丙烯酰胺这样的天然或合成聚合物，从而得到一种三维形式的培养物质且使用它来培养细胞。然而，存在细胞粘附不充分的难题，由此细胞的增殖通常受到抑制、细胞功能降低、细胞形式的扩展不同于体内等且没有获得用于良好培养细胞的系统。
发明的公开
本发明的目的由此是提供一种制成三维形式的三维细胞培养物质，由此促进细胞的粘附和增殖、维持并改善细胞功能且可以保持细胞形式接近体内细胞形式；且本发明另外的目的是提供一种使用所述三维细胞培养物质培养细胞的方法。
因此，本发明的技术方案是一种三维细胞培养物质，其特征在于将一种包括含糖聚合物的细胞培养物质制成三维形状，在所述的含糖聚合物中，至少一类糖链通过间隔分子被作为侧链结合。
此外，本发明的技术方案是一种用于培养细胞的方法，其特征在于使用所述的三维细胞培养物质培养细胞，由此维持并改善细胞的增殖、形态和功能。
附图简述
附图1是表示来自肝实质细胞的清蛋白产量与培养天数之间关系的示意图，其中使用LA-AG和藻酸的凝胶珠。
附图2是表示在用胶原蛋白包被的培养皿上培养的肝实质细胞形态的显微照片。
附图3是表示使用LA-AG凝胶珠培养的肝实质细胞形态的显微照片。
实施本发明的最佳方式
本发明的三维细胞培养物质的特征在于含糖聚合物(即含有糖链的聚合物)作为主链且糖链通过间隔分子与主链连接作为侧链。当使用二胺作为间隔分子时，一般结构通式如下列通式(1)中所示。
在上述通式(1)中，方括弧中的部分是一种含糖聚合物且优选使用带有诸如藻酸、透明质酸、果胶酸或其衍生物这样的羧基基团的含糖聚合物。就果胶酸而言，也可以使用果胶酸作为主要成分的果胶。尽管在本发明中也可以使用非上述含糖聚合物的各种其它含糖聚合物以便它们能够引入所述糖链作为侧链，但是将上述典型的含糖聚合物广泛用作用于食品、化妆品等的物质且它们与细胞的亲和力良好，由此它们是特别优选的。就含糖聚合物的分子量而言，可以优选使用大约30,000-200,000分子量的含糖聚合物。当分子量过低时，产生溶胶形态且由此难以存在形成三维形状的趋向。
在上述通式(1)中，R是与含糖聚合物连接作为侧链的糖链。就本发明的糖链而言，可以使用任意的糖链，只要是能够在与含糖聚合物连接作为侧链的情况中保持与细胞相互作用的糖残基，且其实例是单糖和寡糖诸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、乳糖、麦芽糖、昆布二糖(laminalibiose)、几丁二糖、麦芽糖、与糖醛酸相关的物质、硫酸化糖类等。
通过间隔分子进行含糖聚合物与糖链之间的结合。就间隔基而言，可以优选使用如上述通式(1)中所示分子中带有两个氨基的二胺。因此，在二胺中的一个氨基与内酯化糖中末端羧基之间形成酰胺键，而在该二胺中另一个氨基与含糖聚合物中羧基之间形成另一个酰胺键(amino)，由此可以有效而方便地将所含的糖引入含糖聚合物中。在通式(1)中，间隔分子中的R’是烷基、苯环等且二胺是乙二胺、六乙二胺、二氨基二甲苯等。除二胺外，还可以使用诸如氨基乙醇这样的分子中带有两个官能基的化合物作为间隔分子。就氨基乙醇而言，分子中的氨基和羧基能够分别通过酰胺键和酯键与含糖聚合物糖链结合。另一方面，可以使预先引入了间隔分子的含糖聚合物与糖链结合或可以使预先引入了间隔分子的糖链与含糖聚合物结合。然而，当糖链能够被直接引入含糖聚合物的羧基时，并不总是需要间隔分子。
尽管并不对引入含糖聚合物的糖链的量作特别限定，但是优选在含糖聚合物中引入大约10-50％羧基数量的糖链。引入含糖聚合物中的糖链可以是一类糖链或可以引入两类或多类糖链。细胞具有其自身特异性糖链识别能力，且由此当将引入了两类或多类具有细胞不同识别特性的糖链的含糖聚合物用作培养物质时，能够通过控制所结合的糖链的类型及其引入的比例而自由地控制细胞的增殖、形态和功能。
当两类或多类糖链与含糖聚合物结合时，不同类型的糖链能够同时与含糖聚合物结合或还能够在一类糖链与含糖聚合物结合时另一种糖链随后与含糖聚合物结合。
引入糖链作为侧链的含糖聚合物的特殊实例通过表示其结构通式而在下文中描述。附带地说，糖链与含糖聚合物的结合是聚合物与低分子量物质的反应且由此它可随机发生而并不总是将这种结合限定在如通式中所示的结合位置。
由上述通式(2)代表的1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲酰胺藻酸酯(下文缩写为LA-AG)是这样一种化合物，其中乳糖酸与乙二胺中的氨基之一结合，而另一个氨基与藻酸中的羧基结合。
由上述通式(3)代表的1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲酰胺透明质酸酯(下文缩写为LA-HA)是这样一种化合物，其中乳糖酸与乙二胺中的氨基之一结合，而另一个氨基与透明质酸中的羧基结合。
由上述通式(4)代表的1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲酰胺果胶酸酯(下文缩写为LA-PA)是这样一种化合物，其中乳糖酸与乙二胺中的氨基之一结合，而另一个氨基与果胶酸中的羧基结合。
由上述通式(5)代表的化合物是这样一种化合物，其中任意的糖链R与任意间隔化合物中的氨基之一结合，而另一个氨基与藻酸中的羧基结合。
由上述通式(6)代表的化合物是这样一种化合物，其中任意的糖链R与任意间隔化合物中的氨基之一结合，而另一个氨基与透明质酸中的羧基结合。
由上述通式(7)代表的化合物是这样一种化合物，其中任意的糖链R与任意间隔化合物中的氨基之一结合，而另一个氨基与果胶酸中的羧基结合。
在本发明中，将一种包括上述含糖的聚合物的细胞培养物质制成三维形状，其中糖链与所述含糖聚合物连接作为侧链，由此制备三维细胞培养物质。就用于制成三维形状的方法而言，可以采用各种文献中对常用含糖聚合物成形方法所述的公知方法(在含糖聚合物中，糖链不被连接成侧链)。
例如，就藻酸是含糖聚合物的培养物质而言，将钙加入到这种培养物质的溶液中，由此可以制备含有所述培养物质与钙的复合物的凝胶形式的珠。此外，就透明质酸是含糖聚合物的培养物质而言，将所述培养物质的浓缩溶液用紫外线线、放射线、化学交联剂等处理以便交联透明质酸、随后冻干或在冻干后交联，由此可以制备所述培养物质的海绵状物。此外，当将藻酸是含糖聚合物的培养物质溶液与钙溶液混合以便匀化、随后冻干时，可以制备海绵状物。
还能够通过诸如吸附这样的物化方法或通过诸如形成三维形状的共价键这样的化学方法将培养物质装配在载体上。
在将细胞培养物质制成三维形状的过程中，能够进一步如上所述使包括含糖聚合物的混合物成形，其中糖链被作为侧链结合和通常的含糖聚合物(在含糖聚合物中，没有糖链被作为侧链结合)。
在使用上述本发明的三维细胞培养物质进行细胞培养的过程中，可以采用截止到目前通常使用的细胞培养方法。例如，在使用包括凝胶形式的珠的三维细胞培养物质的情况中，使细胞混悬液与细胞培养物质的溶液混合并向其中加入钙以便形成珠，由此可以制备包含有细胞的凝胶珠且可以在液体培养基中培养所述的珠。
还能够将细胞混悬液接种在预先制备的海绵状三维细胞培养物质上以便引入细胞且随后通过用常规方法培养而使之混入所述海绵状物。
当照此培养细胞时，由于细胞的特异性糖链识别能力，所以能够促进细胞的粘附和增殖、维持和改善细胞功能且保持细胞形状与体内细胞形状类似。
在上述细胞培养过程中，仅可以使用本发明的一类三维细胞培养物质或可以混合两类或多类三维细胞培养物质并使用它们。此外，不仅本发明的三维细胞培养物质而且(如果必要)与含糖聚合物诸如胶原蛋白这样的粘着蛋白、各种天然聚合物等混合的本发明三维细胞培养物质均可以进行细胞培养。实施例1.LA-AG(通式(1))的合成
(a)1-N-[O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡糖酰胺]甲基-2-N’-甲胺(下文缩写为LA-ED)：按照下列反应式合成LA-ED。
首先，用M.Goto等在J.Controlled Release,28,223-233(1994)中所述的方法使乳糖内酯化。将该过程概括如下。即将乳糖分散在蒸馏水中并用甲醇稀释。将稀释的分散液加入到温热的碘的甲醇溶液中，且在搅拌后，向其中逐步加入氢氧化钾的甲醇溶液，直到碘的颜色消失为止。此后，用冰使反应溶液冷却并过滤从其中析出的沉淀。将该沉淀进行洗涤并重结晶至得到一种所述酸的钾盐。使所得钾盐通过离子交换树脂以便转化一种类型的酸并将甲醇加入到该酸型的级分中，随后通过在减压条件下浓缩而得到结晶。把将该结晶溶于少量甲醇并将乙醚加入到沉淀中的操作重复几次并在此后将所述沉淀冻干至得到一种乳糖内酯。
将所得乳糖内酯(5g)溶于50ml的DMSO并向其中加入20g的乙二胺，随后在回流条件下使反应进行4小时。使反应冷却，过滤出沉淀，将该反应溶液加入到300ml的氯仿中并过滤出沉淀的白色结晶。用乙醚和少量冷甲醇将其洗涤至得到5g的LA-ED。
(b)LA-AG的合成：
将藻酸溶于50ml的TEMED缓冲液(pH4.7)，加入0.97g的水溶性碳化二亚胺(WSC)作为缩合剂并通过搅拌使该混合物在室温下反应1小时。将上述制备的LA-ED(2g)加入到该溶液中并使该混合物在室温下通过搅拌反应3天。将该溶液对20升纯水透析且在完成透析后进行冻干至得到所需的产物。从该产物的1H-NMR光谱中可以观察到乙二胺CH2CH2为2.69ppm、酰胺NH为3.25ppm、乳糖和藻酸糖链为4.5ppm且证明产物是LA-AG。将引入其中的糖链的量计算约为15％。实施例2．使用LA-AG珠培养肝实质细胞
(a)肝实质细胞的收集：
按照文献中所述的方法(A.Kobayashi,M.Goto,K.Kobayashi,T.Akaike,J.Biomater.Sci.Polymer Edn.,6,325-342(1994))从小鼠肝脏中收集并分离肝实质细胞。通过用含有5％胎牛血清的Willium’s培养基E稀释来使用分离的肝实质细胞。
(b)含细胞的LA-AG珠的制备：
向藻酸(1％w/v)和LA-AG(1％w/v)溶于生理盐水的水溶液中所得到的混合溶液中加入胎牛血清(ECS；5％v/v)、表皮生长因子(EGF；20ng/ml)和胰岛素(Ins；10-8M)，使得它们的各自浓度为圆括弧中给出的值；且然后使肝实质细胞与之混合而使细胞浓度为800,000个细胞/ml。将细胞溶液放入注射器并使用26号针头(G×1/2”)将其滴入100mM氯化钙的水溶液中，由此制成凝胶珠。如此制备了具有约3mm平均颗粒大小的凝胶珠。通过培养5分钟或5分钟以上来使该珠胶凝。
接下来，在用CHES缓冲液(pH5.0)洗涤几次后，用生理盐水溶液洗涤几次以上。此后，将该凝胶珠表面用聚-L-赖氨酸溶于生理盐水溶液所得到的0.05％溶液处理5分钟并用生理盐水洗涤几次。然后，将该凝胶珠表面用0.15％的藻酸水溶液包被5分钟，随后用生理盐水溶液洗涤几次。将该珠进一步用50mM的柠檬酸钠水溶液处理5分钟并且用生理盐水溶液洗涤3次以便制备含细胞的LA-AG珠。
根据引入LA-AG的糖链含量的不同，还能够制成LA-AG和藻酸不混合而仅使用LA-AG的珠。
为进行比较，除仅使用含2％w/v藻酸的生理盐水溶液替代上述藻酸与LA-AG溶于生理盐水溶液所得到的混合溶液外，进行与如上所述相同的操作，由此制备含细胞的藻酸珠。
(c)含细胞的LA-AG珠的培养：
在含有FCS(5％v/v)、EGF(20ng/ml)和Ins(10-8M)的L15培养基中培养所得的含细胞的LA-AG珠并评估该珠中包含的肝实质细胞的功能。为进行比较，对含细胞的藻酸珠也进行相同的培养并评估该珠中包含的肝实质细胞的功能。
(e)肝实质细胞功能的评估：
通过从肝实质细胞中产生的清蛋白的量来评估所述凝胶珠中肝实质细胞的功能。通过使用测定清蛋白的试剂盒(由Bio-Rad,U.S.A.生产)的常用方法来进行清蛋白的测定。
清蛋白产生量的测定结果如附图1中所示。就用LA-AG凝胶珠培养的肝实质细胞而言，在培养后第8天产生的清蛋白的量为0.0158μg/ml，而仅用藻酸凝胶珠培养的肝实质细胞产生的清蛋白的量为0.00765μg/ml。从上述结果中注意到：在用LA-AG凝胶珠培养的产物中，肝实质细胞分功能得到了更好地维持和改善。
还注意到：就在LA-AG凝胶珠培养的肝实质细胞而言，从培养的第3天开始观察到了含几个细胞的球形体，由此促进了细胞的迁移和增殖。
进一步明确了当使用三维形状的LA-AG凝胶珠进行培养时，产生了不同于在胶原蛋白包被的培养皿上培养肝实质细胞过程中观察到的二维形状的扩展形(参照附图2的显微照片)的球形(参照附图3的显微照片)。从上述结果中注意到：当在LA-AG凝胶珠中培养肝实质细胞时，可以保持肝实质细胞在体内的形态。实施例3．使用LA-AG海绵状物培养肝实质细胞
(a)LA-AG海绵状物的制备：
按照文献中所述的方法(L.Shapio,S.Cohen,Biomaterials,18,583-590(1997))进行该过程。即将1mlLA-AG(1％v/v)和藻酸(1％w/v)的混合溶液加入到24孔多孔平板上且然后逐步向其中加入相同量的0.01％(w/v)氯化钙水溶液。使用匀浆器(6G,31,800rpm)将该体系混合3分钟、在-18℃的冷冻机中冷冻且然后冻干至得到一种LA-AG海绵状物。
为进行比较，使用仅含藻酸(2％w/v)的水溶液替代LA-AG和藻酸的混合水溶液来进行与如上所述相同的操作来制备藻酸海绵状物
(b)在海绵状物上培养肝实质细胞：
用实施例2中所述的方法来收集并分离小鼠的肝实质细胞，将该细胞加入到含有FCS(5％v/v)、EGF(20ng/ml)和Ins(10-8M)的Willium’s培养基E中并接种在所述的海绵状物上以便使细胞浓度为800,000个细胞/ml。将该海绵状物培养预定的期限并通过测定清蛋白的产生量来评估海绵状物上培养的肝实质细胞的功能。
在培养的第8天时在LA-AG海绵状物上培养的肝实质细胞产生0.0144μg/ml的清蛋白，而在仅含藻酸的海绵状物中产生的清蛋白的量为0.00544μg/ml。实施例4．使用LA-HA海绵状物培养肝实质细胞
(a)LA-HA的合成：
按照实施例1中合成LA-AG的方法来进行该过程。即，将透明质酸溶于50ml的TEMED缓冲液(pH4.7)，加入0.97g的WSC作为缩合剂并通过在室温下搅拌使该混合物反应1小时。向该溶液中加入实施例1中获得的2gLA-ED并使该反应在室温下通过搅拌反应3天。将该溶液对20升纯水透析且在完成透析后进行冻干至得到所需的产物。从该产物的1H-NMR光谱中可以观察到透明质酸CH3为2.0ppm、酰胺NH为3.30ppm、乳糖和藻酸糖链为3.3-4.6ppm，由此证明产物是LA-HA。将引入其中的糖链的量计算约为13％。
(b)LA-HA的制备：
按照文献中所述的方法(J.R.Glass等，Biomaterials,17,1101-1108(1997))进行该过程。即，将LA-HA(1％w/v)和透明质酸(1％w/v)混合并分散在0.5％的氢氧化钠水溶液中。向该分散液中加入0.5μl的1,4-丁二醇二环氧甘油醚(交联剂)并使反应进行16小时。在透析该反应溶液后，使用-20℃的冷冻机将其冷冻且然后冻干以制备一种LA-HA海绵状物。
为进行比较，仅使用透明质酸替代LA-AH和透明质酸来进行与如上所述相同的操作以便制备透明质酸海绵状物。
(c)在海绵状物上培养肝实质细胞：
用实施例2中所述的方法来收集并分离小鼠的肝实质细胞，将该细胞加入到含有FCS(5％v/v)、EGF(20ng/ml)和Ins(10-8M)的Willium’s培养基E中并接种在所述的海绵状物上以便使细胞浓度为800,000个细胞/ml。将该海绵状物培养预定的期限并通过测定产生清蛋白的量来评估海绵状物上培养的肝实质细胞的功能。
在培养的第8天时在LA-HA海绵状物上培养的肝实质细胞产生0.0166μg/ml的清蛋白，而在仅含透明质酸的海绵状物的情况中，产生的清蛋白的量为0.00483μg/ml。
工业实用性
由于本发明的三维细胞培养物质包括含糖聚合物，其中对细胞具有特异性识别能力的糖链被作为侧链结合，所以能够因细胞与糖链之间的特异性相互作用而通过使用这类细胞培养物质培养细胞来促进细胞的粘附和增殖、维持和改善细胞功能并保持细胞的形状与体内的形状类似。因此，能够制备可保持与体内相同增殖和功能的任意形式的细胞，且例如能够将由此制备的细胞应用于杂交人工肝脏。
此外，类似于不含诸如藻酸和透明质酸这样的糖链的含糖聚合物，本发明的细胞培养物质能够方便地产生三维形状。特别是当使用含有藻酸、透明质酸、果胶酸或其衍生物时，可以方便地引入糖链作为侧链且由于生产成本也相对较低，所以能够制备一种一次性使用的产品。
Claims (10)
1．一种三维细胞培养物质，其特征在于将一种包括含糖聚合物的细胞培养物质制成三维形状，在所述的含糖聚合物中，至少一类糖链通过间隔分子被作为侧链结合。
2．一种三维细胞培养物质，其特征在于将一种细胞培养物质制成三维形状，所述的细胞培养物质包括至少一类糖链通过间隔分子被作为侧链结合的含糖聚合物与没有糖链被作为侧链结合的含糖聚合物的混合物。
3．根据权利要求1或2所述的三维细胞培养物质，其中所述的含糖聚合物是带有羧基基团或其衍生物的含糖聚合物。
4．根据权利要求3所述的三维细胞培养物质，其中所述的含糖聚合物是藻酸或其衍生物。
5．根据权利要求3所述的三维细胞培养物质，其中所述的含糖聚合物是透明质酸或其衍生物。
6．根据权利要求3所述的三维细胞培养物质，其中所述的含糖聚合物是果胶酸或其衍生物。
7．根据权利要求1-6中任意一项所述的三维细胞培养物质，其中所述的含糖聚合物是两类或多类糖链被作为侧链结合的含糖聚合物。
8．根据权利要求1-7中任意一项所述的三维细胞培养物质，其中所述的间隔分子是一种二胺。
9．一种用于培养细胞的方法，其特征在于使用权利要求1-8中任意一项所述的三维细胞培养物质培养细胞，由此维持并改善细胞的增殖、形态和功能。
10．一种用于培养细胞的方法，其特征在于使用混合了权利要求1-8中任意一项所述的两种或多种三维细胞培养物质的细胞培养物质培养细胞，由此维持并改善细胞的增殖、形态和功能。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11213465A JP2001037472A (ja) | 1999-07-28 | 1999-07-28 | 三次元細胞培養基材及びそれを用いた細胞培養方法 |
| JP213465/1999 | 1999-07-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1320162A true CN1320162A (zh) | 2001-10-31 |
Family
ID=16639666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN99811448A Pending CN1320162A (zh) | 1999-07-28 | 1999-11-10 | 三维细胞培养物质及使用它培养细胞的方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6642050B1 (zh) |
| EP (1) | EP1123975A4 (zh) |
| JP (1) | JP2001037472A (zh) |
| KR (1) | KR20010075288A (zh) |
| CN (1) | CN1320162A (zh) |
| IL (1) | IL142064A0 (zh) |
| WO (1) | WO2001007582A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107849528A (zh) * | 2015-06-08 | 2018-03-27 | 康宁股份有限公司 | 用于细胞培养的可消化底物 |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL136232A0 (en) * | 2000-05-18 | 2001-05-20 | Bar Ilan University Res Author | Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population |
| US20030175966A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-18 | Genteric, Inc. | Cationic sugar derivatives for gene transfer |
| IL154677A0 (en) * | 2003-02-27 | 2003-09-17 | Univ Bar Ilan | A method and apparatus for manipulating an individual cell |
| US7888110B2 (en) | 2003-06-26 | 2011-02-15 | Seng Enterprises Ltd. | Pico liter well holding device and method of making the same |
| US8597597B2 (en) | 2003-06-26 | 2013-12-03 | Seng Enterprises Ltd. | Picoliter well holding device and method of making the same |
| US9200245B2 (en) | 2003-06-26 | 2015-12-01 | Seng Enterprises Ltd. | Multiwell plate |
| WO2005008626A1 (en) * | 2003-07-11 | 2005-01-27 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop |
| US20050064524A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-03-24 | Mordechai Deutsch | Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same |
| AU2005210236B2 (en) * | 2004-02-03 | 2010-09-09 | Chemagis Ltd. | Stable amorphous forms of montelukast sodium |
| EP1757680B1 (en) * | 2004-05-11 | 2009-09-16 | Shukokai Incorporated | Methods for cultivating antigen presenting cells |
| EP1763665A1 (en) * | 2004-07-07 | 2007-03-21 | Seng Enterprises Limited | Method and device for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component |
| US7403647B2 (en) * | 2004-09-13 | 2008-07-22 | Seng Enterprises Ltd. | Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component |
| JP4931351B2 (ja) * | 2005-01-12 | 2012-05-16 | 有限会社 ミクロデント | ３次元定型培地 |
| US8038964B2 (en) | 2005-01-25 | 2011-10-18 | Seng Enterprises Ltd. | Device for studying individual cells |
| CA2620663A1 (en) * | 2005-09-02 | 2007-03-08 | Colbar Lifescience Ltd. | Cross-linked polysaccharide and protein matrices and methods for their preparation |
| AR056499A1 (es) | 2005-09-06 | 2007-10-10 | Serapis Farmaceuticals Ltd | Compuestos |
| US8288120B2 (en) | 2005-11-03 | 2012-10-16 | Seng Enterprises Ltd. | Method for studying floating, living cells |
| US20060223999A1 (en) * | 2006-05-10 | 2006-10-05 | Chemagis Ltd. | Process for preparing montelukast and precursors thereof |
| US20080220526A1 (en) * | 2007-03-09 | 2008-09-11 | Ellison Adam J | Gum coatings for cell culture, methods of manufacture and methods of use |
| EP2084264A1 (en) * | 2007-03-09 | 2009-08-05 | Corning Incorporated | Three dimensional gum matrices for cell culture, manufacturing methods and methods of use |
| JPWO2009025043A1 (ja) * | 2007-08-22 | 2010-11-18 | 有限会社セラジックス | 新規架橋ポリマー、その製造方法及びその用途 |
| US9145540B1 (en) | 2007-11-15 | 2015-09-29 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
| WO2009081409A2 (en) | 2007-12-26 | 2009-07-02 | Seng Enterprises Ltd. | Device for the study of living cells |
| JP5721319B2 (ja) * | 2009-08-17 | 2015-05-20 | 国立大学法人北海道大学 | 軟骨細胞培養基材及び培養方法 |
| JP5945802B2 (ja) * | 2011-05-31 | 2016-07-05 | 国立大学法人 千葉大学 | 複合型肝細胞組織体およびその作製方法 |
| EP3013940B1 (en) * | 2013-06-24 | 2017-04-12 | Corning Incorporated | Cell culture article and methods thereof |
| JP2021503894A (ja) * | 2017-11-21 | 2021-02-15 | コーニング インコーポレイテッド | 細胞培養のための溶解可能な発泡足場及びその製造方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE451848B (sv) | 1983-10-19 | 1987-11-02 | Gullfiber Ab | Aerobt forfarande varvid en mikroorganism immobiliseras i en fibermatris |
| US5032508A (en) * | 1988-09-08 | 1991-07-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
| IT1219587B (it) | 1988-05-13 | 1990-05-18 | Fidia Farmaceutici | Polisaccaridi carbossiilici autoreticolati |
| JPH02131578A (ja) | 1988-11-11 | 1990-05-21 | Kohjin Co Ltd | 微生物固定化担体 |
| WO1993009176A2 (en) | 1991-10-29 | 1993-05-13 | Clover Consolidated, Limited | Crosslinkable polysaccharides, polycations and lipids useful for encapsulation and drug release |
| ATE192487T1 (de) * | 1992-02-13 | 2000-05-15 | Surmodics Inc | Immobilisierung eines chemischen spezies in einer vernetzten matrix |
| US5308641A (en) * | 1993-01-19 | 1994-05-03 | Medtronic, Inc. | Biocompatibility of solid surfaces |
| WO1997045532A1 (en) * | 1996-05-28 | 1997-12-04 | Brown University Research Foundation | Hyaluronan based biodegradable scaffolds for tissue repair |
| IT1293484B1 (it) * | 1997-06-11 | 1999-03-01 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Materiale biologico comprendente una efficiente coltura di cellule e una matrice tridimensionale biocompatibile e biodegradabile |
| US6630457B1 (en) * | 1998-09-18 | 2003-10-07 | Orthogene Llc | Functionalized derivatives of hyaluronic acid, formation of hydrogels in situ using same, and methods for making and using same |
-
1999
- 1999-07-28 JP JP11213465A patent/JP2001037472A/ja active Pending
- 1999-11-10 US US09/787,239 patent/US6642050B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-10 IL IL14206499A patent/IL142064A0/xx unknown
- 1999-11-10 CN CN99811448A patent/CN1320162A/zh active Pending
- 1999-11-10 EP EP99973970A patent/EP1123975A4/en not_active Withdrawn
- 1999-11-10 WO PCT/JP1999/006248 patent/WO2001007582A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1999-11-10 KR KR1020017003668A patent/KR20010075288A/ko active IP Right Grant
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107849528A (zh) * | 2015-06-08 | 2018-03-27 | 康宁股份有限公司 | 用于细胞培养的可消化底物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001037472A (ja) | 2001-02-13 |
| IL142064A0 (en) | 2002-03-10 |
| WO2001007582A1 (fr) | 2001-02-01 |
| EP1123975A4 (en) | 2002-06-19 |
| US6642050B1 (en) | 2003-11-04 |
| EP1123975A1 (en) | 2001-08-16 |
| KR20010075288A (ko) | 2001-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1320162A (zh) | 三维细胞培养物质及使用它培养细胞的方法 | |
| CN106467613B (zh) | 一种自愈合聚阴离子-壳聚糖季铵盐水凝胶及其应用 | |
| CN100488512C (zh) | 用于治疗细胞增殖性紊乱的组合物及其用途 | |
| CN103087333B (zh) | 一种可快速解离型温敏性透明质酸水凝胶的制备方法 | |
| CN104004231A (zh) | 一种生物大分子互穿网络水凝胶及其制备方法 | |
| US10603406B2 (en) | Hydrogel for cell culture and biomedical applications | |
| CN1208094C (zh) | 组织再生用基材、移植用材料及其制法 | |
| CN111533926B (zh) | 一种基于硼酯键的手性超分子核苷水凝胶及其制备方法和用途 | |
| CN1718592A (zh) | 荧光标记疏水改性壳寡糖聚合物及制备方法和应用 | |
| JP2014226088A (ja) | 光および加水分解性架橋剤、光および加水分解性ゲル、細胞培養器具、細胞配列・分別装置、細胞配列方法、細胞分別方法、並びに、組織体形成方法 | |
| JP2014187901A (ja) | バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体及びその製造方法 | |
| CN1446256A (zh) | 哺乳动物配子和胚胎培养基添加剂及其使用方法 | |
| JP3139957B2 (ja) | レクチンの固定化法及びそれを用いた細胞用基材 | |
| Pandit et al. | Alginates production, characterization and modification | |
| CN100393368C (zh) | 一种细胞培养和脱附用的智能膜及其制备方法 | |
| CN111218421A (zh) | 一种黏附型细胞支架及其制备和应用 | |
| CN102010601B (zh) | 一种肝细胞特异性大孔微载体及其制备方法和用途 | |
| JPS5974984A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物の製造方法 | |
| JP2011130720A (ja) | 細胞培養基材およびその使用方法 | |
| CN117384456A (zh) | 一种多价键结合的凝胶及其制备方法与应用 | |
| CN114849601B (zh) | 蛋白修饰微球及其应用 | |
| CN113699111A (zh) | 一种用于乳腺癌细胞立体培养基质材料，制备方法及医药应用 | |
| CN110699322B (zh) | 一种肿瘤细胞三维培养基及其制备方法 | |
| JPS5978122A (ja) | コロニ−刺激因子の製造法 | |
| CN105854075B (zh) | 一种基于甲基乙烯基醚马来酸共聚物/硫酸软骨素pH敏感复合水凝胶及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |