KR20010075288A - 3차원 세포 배양 물질 및 이것을 사용한 세포 배양 방법 - Google Patents

3차원 세포 배양 물질 및 이것을 사용한 세포 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1종류 이상의 당쇄를 스페이서 분자를 통해 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자로 이루어진 세포 배양 물질을, 3차원 형태로 성형시킴으로써 3차원 세포 배양 물질을 제조하는 것에 관한 것이다. 당쇄고분자로는, 알긴산, 히알루론산, 펙틴산 또는 이들의 유도체 등의 카르복실기를 갖는 당쇄고분자를 사용하는 것이 바람직하다. 세포에 대한 특이 인식성을 갖는 당쇄를 측쇄로서 결합시키므로, 이 세포 배양 물질을 사용하여 세포를 배양하면, 세포와 당쇄의 특이적 상호작용에 기인하여 세포의 증식성, 형태 및 기능을 유지하여 향상시키는 것과, 세포 형태를 생체내의 것과 근접한 형태로 유지할 수 있다.

Description

3차원 세포 배양 물질 및 이것을 사용한 세포 배양 방법{THREE-DIMENSIONAL CELL INCUBATION MEDIA AND METHOD FOR INCUBATING CELLS BY USING THE SAME}
최근 몇년간 당쇄(糖鎖) 공학은 눈에 띠게 진보하였다. 예를 들면, 식물 세포의 세포벽내 프로테오글리칸, 당지질, 당단백질 등이 당쇄를 갖는 생체 고분자이다. 이들 각각은 (1) 세포 안정화, (2) 세포의 분화, 증식, 접착 및 이동, 및 (3) 세포간 상호 작용 및 세포 인식에 관여하고 있는 것으로 추정되며, 다양하게 보고되어 있다. 또한, 이들 고분자의 당쇄가 서로 기능을 대행, 보조, 증폭, 조절 또는 억제하면서 고도로 정밀한 생체반응을 제어하는 메카니즘이 점차 밝혀지고 있다.
또한, 이러한 당쇄들은 세포를 분화 및 증식시켜 세포 접착에 관여하고, 면역과 세포 악성화의 관계를 명확하게 할 수 있다. 따라서, 이 당쇄 공학을, 의학, 세포 공학 또는 장기 공학과 밀접하게 연관시켜 새로운 전개를 계획함으로써 여러 산업의 발전을 기대할 수 있다.
그 일례로, 세포 표면의 당쇄와 당쇄 수용체 사이의 비정상적인 상호 작용에 의한 질병의 발병, 또는 AIDS 등의 바이러스 감염에 있어서, 당쇄의 역할에 대한 연구가 활발하게 진행중이다[Takehiro Kawano,Bio Industry,14, 22∼30(1970)]. 또한, 세포-세포간의 접착을 매개하는 분자인 세크레틴, 콘택틴(contactin), 콘택트인히빈(contactinhibin) 등의 당쇄 인식 단백질에 대한 연구도 생체반응을 이해하는 데 중요할 수 있다[Tuneshige Takeuchi 및 Naoki Takahashi,Saibo Kogaku, 16, 801∼812(1997)].
본 발명자들은 이미 당쇄의 세포 특이적 상호 작용에 대해 관심을 두고 열심히 연구를 수행하였다. 예를 들면, 아시알로당단백질 수용체에 대한 리간드 모델로서 갈락토오스를 측쇄에 갖는 폴리스티렌인, 폴리(N-p-비닐벤질-[O-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루콘아미드])(이하, PVLA로 약기함)를 설계하여 합성하였다. 예를 들면, 이 PVLA를 세포 배양 물질로서 코팅한 배양 접시에서의 간세포 배양 실험에 있어서, PVLA와 간실질세포 표면의 아시알로당단백질 수용체의 특이적 친화력을 통해 간실질세포를 선택적으로 배양해서, PVLA 코팅 배양 접시라고 하는 2차원 배양 물질 조건하에서도 간실질세포 그 자체가 3차원화하고, 세포 집합체로서 특이적으로 존재하는 것을 발견하였다[A. Kobayashi, M. Goto, K. Kobayashi, T. Akaike,J. Biomater. Sci. Polymer Edn, 6, 325∼342(1994)]. 그러나, 이 PVLA는 합성 고분자인 폴리스티렌을 주쇄로 갖는 구조이므로, 생체분해성이 없고 항원성 발현 및 독성을 가질 가능성이 있다는 단점이 있다.
한편, 천연 단백질인 콜라겐, 피브로넥틴 또는 라미닌과 같은 접착 단백질로코팅된 배양 접시를 사용하여 세포 배양을 수행하였다. 그러나, 이것은 2차원 배양이므로 세포 증식, 세포 기능 발현 등이 충분히 발휘되지 않는다.
최근에, 콜라겐, 알긴산, 히알루론산 및 폴리이소프로필아크릴아미드와 같은 천연 고분자 또는 합성 고분자를, 자외선, 방사선 또는 화학 가교제를 사용하여 가교시켜 배양 물질을 3차원 형태로 제공하고, 이것을 사용하여 세포를 배양하려는 시도가 있었다. 그러나, 세포 증착이 양호하지 못해 세포 증식이 자주 억제되고, 세포 기능이 저하되며 세포 형태가 생체내와는 달리 확장되어 버리는 등의 문제가 있어, 세포를 양호하게 배양하는 계를 얻을 수 없다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 세포의 생착 및 증식을 촉진시켜 세포 기능을 유지하고 향상시켜서, 세포 형태를 생체내 형태에 근접하도록 하는 3차원 형태의 3차원 세포 배양 물질을 제공하고, 또한 이 3차원 세포 배양 물질을 사용한 세포 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다.
따라서, 본 발명은 1종류 이상의 당쇄를 스페이서 분자를 통해 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자를 포함하는 세포 배양 물질을 3차원 형태로 제조하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 이 3차원 세포 배양 물질을 사용하여 세포를 배양하는 것으로 세포의 증식성, 형태 및 기능을 유지하고 향상시키는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법이다.
본 발명은 세포의 증식성, 형태 및 기능을 생체내 세포와 동일한 방식으로 발현시킬 수 있는 3차원 형태로 제조된 된 3차원 세포 배양 물질, 및 이 세포 배양 물질을 사용한 세포 배양 방법에 관한 것이다.
도 1은 LA-AG 겔 비드 및 알긴산만의 겔 비드에 대해서, 간실질세포의 알부민 생성량과 배양 일수 사이의 관계를 보여주는 그래프이다.
도 2는 콜라겐 코팅 배양 접시에서 배양한 간실질세포의 형태를 보여주는 현미경 사진이다.
도 3은 LA-AG 겔 비드로 배양한 간실질세포의 형태를 보여주는 현미경 사진이다.
본 발명의 3차원 세포 배양 물질은 당쇄고분자를 주쇄로 하고, 이 주쇄에 스페이서 분자를 통해서 당쇄를 측쇄로서 주쇄에 결합시킨 것이다. 스페이서 분자로서 디아민을 사용하는 경우, 일반 구조식은 하기 화학식 1로 나타낸다:
상기 화학식 1에서, 괄호안의 부분은 당쇄고분자를 나타내고, 알긴산, 히알루론산, 펙틴산 또는 이들의 유도체와 같은 카르복실기를 갖는 당쇄고분자를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 펙틴산으로는 펙틴산을 주성분으로 하는 펙틴도 사용할 수 있다. 이들 이외의 당쇄고분자들로는 측쇄로서 당쇄를 도입할 수 있는 한 다양한 당쇄고분자가 본 발명에 사용될 수 있지만, 상기에 예시한 당쇄고분자는 식품, 화장품 등의 원료로서 광범위하게 사용할 수 있고, 세포에 대한 친화성이 양호하므로 특히 바람직하다. 당쇄고분자의 분자량은 일반적으로 약 30,000∼200,000을 사용하는 것이 바람직하다. 분자량이 너무 낮은 경우, 졸 상태가 되므로 3차원 형태가 형성되기 어렵다.
상기 화학식 1의 R은 측쇄로서 당쇄고분자에 결합된 당쇄를 나타낸다. 본 발명에서, 당쇄는 당쇄고분자에 측쇄로서 결합된 상태로 세포와 상호 작용하는 당 잔류기를 유지할 수 있으면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들면, 글루코스, 갈락토스, 만노스, N-글루코스아민, N-아세틸갈락토스아민, 락토스, 말토스, 라미날리비오스, 키토비오스, 말토비오스, 우론산 관련 물질, 황산화된 당류 등의 단당류 및 올리고당류 등을 들 수 있다.
당쇄고분자와 당쇄 사이의 결합은 스페이서 분자를 통해 이루어진다. 스페이서로는, 상기 화학식 1에 나타낸 바와 같이 분자내 2개의 아민기를 갖는 디아민을 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 디아민내 1개의 아미노기와 락톤화된 당쇄의 말단 카르복실기 사이에 아미드 결합이 형성되고, 디아민 중 나머지 1개의 아미노기와 당쇄고분자의 카르복실기 사이에 또 다른 아미드 결합을 형성함으로써 당쇄를 당쇄고분자에 효과적이고 용이하게 도입할 수 있다. 화학식 1에 있어서, 스페이서 분자내 R'는 알킬기 또는 벤젠 고리 등을 나타내고, 디아민으로는 에틸렌디아민, 헥사에틸렌디아민, 디아미노크실렌 등을 들 수 있다. 디아민 이외에, 아미노에탄올과 같은 분자내 2개의 작용기를 갖는 화합물 또한 스페이서 분자로서 사용할 수 있다. 아미노에탄올의 경우, 분자내 아미노기와 히드록실기는 각각 아미드 결합과 에스테르 결합에 의해 당쇄고분자를 당쇄에 결합시킬 수 있다. 또한, 스페이서 분자를 이미 도입한 당쇄고분자를 당쇄와 결합시킬 수 있거나, 또는 스페이서 분자를 이미 도입한 당쇄를 당쇄고분자와 결합시킬 수 있다. 그러나, 당쇄를 당쇄고분자의 카르복실기로 직접 도입하는 경우, 스페이서 분자가 항시 필요한 것은 아니다.
당쇄고분자에 대한 당쇄 도입량은 특별히 제한되는 것은 아니나, 당쇄고분자내 카르복실기 수의 약 10∼50%로 당쇄를 도입하는 것이 바람직하다. 또한, 당쇄고분자로 도입하는 당쇄는 1종류 또는 2종류 이상의 당쇄를 도입할 수도 있다. 세포의 종류에 따라 특이한 당쇄 인식성을 가지므로, 세포에 의한 인식성이 다른 당쇄를 2 종류 이상 도입한 당쇄고분자를 배양 물질로서 사용하는 경우, 조합되는 당쇄 종류와 이것의 도입 비율을 제어함으로써 세포의 증식성, 형태 및 기능을 임의로 제어할 수 있다.
2종류 이상의 당쇄를 당쇄고분자에 결합시키는 경우, 종류가 다른 당쇄를 동시에 당쇄고분자에 결합시킬 수 있거나, 또는 1종류의 당쇄를 당쇄고분자에 결합시킨 후에 또 다른 종류의 당쇄를 연속적으로 상기 당쇄고분자에 결합시킬 수도 있다.
당쇄를 측쇄로서 도입하는 당쇄고분자의 구체예를 구조식으로 나타내고 후술하였다. 덧붙여 말하자면, 당쇄고분자에 대한 당쇄 결합은 고분자와 저분자의 반응이므로 무작위로 발생하고, 식에 도시된 바와 같이 결합 위치를 항시 제한하는것은 아니다.
알긴산
상기 화학식 2로 나타낸 1-N-[O-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루콘아미드]메틸-2-N'-메틸아미드 알긴산(이하, LA-AG로 약기함)은 락토비온산과 에틸렌디아민의 1개의 아미노기를 결합시키고, 에틸렌디아민의 나머지 1개의 아미노기와 알긴산의 카르복실기를 결합시킨 화합물이다.
히알루론산
상기 화학식 3으로 나타낸 1-N-[O-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루콘아미드]메틸-2-N'-메틸아미드 히알루론산(이하, LA-HA로 약기함)은 락토비온산과 에틸렌디아민의 1개의 아미노기를 결합시키고, 에틸렌디아민의 나머지 1개의 아미노기와 히알루론산의 카르복실기를 결합시킨 화합물이다.
펙틴산
상기 화학식 4로 나타낸 1-N-[O-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루콘아미드]메틸-2-N'-메틸아미드 펙틴산(이하, LA-PA로 약기함)은 락토비온산과 에틸렌디아민의 1개의 아미노기를 결합시키고, 에틸렌디아민의 나머지 1개의 아미노기와 펙틴산의 카르복실기를 결합시킨 화합물이다.
상기 화학식 5로 나타낸 화합물은 임의의 당쇄 R을 임의의 스페이서 화합물의 1개의 아미노기와 결합시키고, 이 스페이서 화합물의 나머지 1개의 아미노기와 알긴산의 카르복실기를 결합시킨 화합물이다.
상기 화학식 6으로 나타낸 화합물은 임의의 당쇄 R을 임의의 스페이서 화합물의 1개의 아미노기와 결합시키고, 이 스페이서 화합물의 나머지 1개의 아미노기와 히알루론산의 카르복실기를 결합시킨 화합물이다.
상기 화학식 7로 나타낸 화합물은 임의의 당쇄 R을 임의의 스페이서 화합물의 1개의 아미노기와 결합시키고, 이 스페이서 화합물의 나머지 1개의 아미노기와 펙틴산의 카르복실기를 결합시킨 화합물이다.
본 발명에 있어서, 전술한 당쇄를 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자를 포함하는 세포 배양 물질을 3차원 형태로 성형시킴으로써 3차원 세포 배양 물질이 제조된다. 3차원 형태의 성형 방법은 일반 당쇄고분자(당쇄를 측쇄로서 결합시키지 않은 당쇄고분자)의 성형 방법으로 여러 문헌에 기재되어 있는 공지의 방법을 사용할 수 있다.
예를 들면, 알긴산을 당쇄고분자로 하는 배양 물질의 경우, 이 배양 물질 용액에 칼슘을 첨가하자 마자, 배양 물질과 칼슘의 착물로 이루어진 겔 형태의 비드를 제조할 수 있다. 또한, 히알루론산을 당쇄고분자로 하는 배양 물질의 경우, 배양 물질의 농축 용액을 자외선, 방사선, 화학 가교제 등으로 처리하여 히알루론산을 가교시킨 후, 동결 건조시키거나, 또는 동결 건조시킨 뒤 가교시킴으로써 상기 배양 물질의 스폰지 형태를 제조할 수 있다. 또한, 알긴산을 당쇄고분자로 하는 배양 물질 용액과 칼슘 용액을 혼합하여 균질화시킨 후 동결 건조하면, 스폰지 구조물을 제조할 수 있다.
또한, 폴리스티렌과 같은 담체 상에 배양 물질을 물리-화학적 방법(예, 흡착) 또는 화학적 방법(예, 공유 결합)에 따라 담지시켜 3차원 형태로 성형시킬 수 있다.
세포 배양 물질을 3차원 형태로 성형시키는 경우, 당쇄를 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자와 일반 당쇄고분자(당쇄를 측쇄로서 결합시키지 않은 당쇄고분자)의 혼합물로 된 세포 배양 물질을 성형시킬 수도 있다.
본 발명의 전술한 3차원 세포 배양 물질을 사용하여 세포 배양을 수행하는 데 있어서, 현재까지 통상 사용하는 세포 배양 방법을 그대로 채용할 수 있다. 예를 들면, 겔 형태의 비드로 이루어진 3차원 세포 배양 물질을 사용하는 경우, 세포 배양 물질의 용액 중에 세포 현탁 용액을 혼합해 두고, 여기에 칼슘을 첨가하여 비드를 성형시킴으로써 세포를 내포한 겔 비드를 제조할 수 있고, 이 비드를 액체 배지 중에서 배양할 수 있다.
또한, 미리 제조한 스폰지 형태의 3차원 세포 배양 물질에 세포 현탁액을 파종하여 스폰지내로 세포를 도입하여 내포시킨 후, 이것을 통상의 방법에 따라 배양할 수도 있다.
이와 같이 세포를 배양하면, 세포가 갖는 특이적 당쇄 인식성에 기인하여 세포의 생착 및 증식을 촉진시키고, 세포 기능을 유지하여 향상시키고, 세포 형태를 생체내와 유사한 형태로 유지할 수 있다.
또한, 전술한 세포 배양시 본 발명에 의한 3차원 세포 배양 물질 중의 1종류만을 사용해도 되고, 또는 2종류 이상을 혼합해서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 3차원 배양 물질뿐만 아니라, 필요에 따라 당쇄고분자, 접착 단백질(예, 콜라겐) 및 다양한 천연 고분자 등과, 본 발명의 3차원 세포 배양 물질을 조합하여 세포 배양에 제공할 수 있다.
실시예 1. LA-AG(화학식 1)의 합성
(a) 1-N-[O-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루콘아미드]메틸-2-N'-메틸아민 (이하, LA-ED로 약기함)의 합성:
하기 반응식에 따라 LA-ED를 합성하였다.
먼저, 문헌[M. Goto 등,J. Controlled Release,28, 223∼233(1994)]에 기재된 방법으로 락토오스의 락톤화 반응을 수행하였다. 이것을 요약하면 다음과 같다. 락토오스를 증류수에 분산시키고 메탄올로 희석시켰다. 희석된 분산물을 가온한 요오드의 메탄올 용액에 첨가하였다. 교반한 후, 수산화칼륨/메탄올 용액을 요오드 색상이 사라질 때까지 적가하였다. 이후, 반응 용액을 얼음으로 냉각시켜서 얻은 침전물을 여과하였다. 침전물을 세척하고 재결정하여 산의 칼륨염 형태로 얻었다. 이렇게 얻은 칼륨 염은 이온 교환 수지를 통과시켜 산 형태로 전환시킨 산 형태의 분류물에 메탄올을 첨가하였다. 뒤이어, 감압하에서 농축시켜 결정을 얻었다. 결정을 소량의 메탄올에 녹이고, 에테르를 첨가하여 침전시키는 조작을 수차례 반복한 후, 침전물을 동결 건조시켜 락토오스 락톤을 얻었다.
이렇게 얻은 락토오스 락톤 5 g을 DMSO 50 ml에 녹이고, 여기에 에틸렌디아민 20 g을 첨가한 후, 4시간 동안 환류하에서 반응시켰다. 이것을 냉각시켜 침전물을 여과로 제거한 후, 반응 용액을 클로로포름 300 ml에 첨가하여 백색 침전물 결정을 여과하였다. 이것을 에테르와 소량의 냉각 메탄올로 세척하여 LA-ED 5g을 얻었다.
(b) LA-AG의 합성:
알긴산을 TEMED 완충 용액(pH 4.7) 50 ml에 녹이고 수용성 카르보디이미드(WSC) 0.97 g을 축합제로서 첨가한 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 상기 제조된 LA-ED 2 g을 이 용액에 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하면서 반응시켰다. 순수 20 L에 대해 상기 용액을 투석하였다. 투석이 종료된 후, 동결 건조를 하여 목적하는 생성물을 얻었다. 이 생성물의1H-NMR 스펙트럼에서, 에틸렌디아민의 CH2CH2가 2.69 ppm, 아미드의 NH가 3.25 ppm, 락토오스 및 알긴산의 당쇄는 3.5∼4.5 ppm에서 관찰되었고, 이 생성물이 LA-AG라는 것을 확인하였다. 당쇄의 도입량은 약 15%로 계산되었다.
실시예 2. LA-AG 비드를 사용한 간실질세포의 배양
(a) 간실질세포의 채취:
문헌[A. Kobayashi, M. Goto, K. Kobayashi, T., Akaike,J. Biomater. Sci. Polymer Edn, 6, 325∼342(1994)]에 기재된 방법에 따라 마우스의 간에서 간실질세포를 채취하여 분리하였다. 이 분리한 간실질세포는 5% 소 태아 혈청을 함유하는 윌리엄 배지 E(Willium's medium E)로 희석시켜서 사용하였다.
(b) 세포 함유 LA-AG 비드의 제조 방법:
생리 식염수내 알긴산(1% w/v) 및 LA-AG(1% w/v)의 혼합 생리 식염수 용액에 소 혈청(FCS, 5% v/v), 상피 세포 성장 인자(EGF, 20 ng/ml) 및 인슐린(Ins., 10-8M)을 각각 괄호안에 표시된 농도가 되도록 첨가한 후, 세포 농도가 ml 당 800,000 세포가 되도록 간실질세포를 혼합하였다. 상기 세포 용액을 주사기에 넣고 26(G x 1/2")의 바늘을 사용하여 100 mM의 염화칼슘 수용액 중에 적가하자 마자, 겔 비드가 형성되었다. 이와 같은 방법으로, 평균 입경이 약 3 mm인 겔 비드를 제조하였다. 이 비드를 5분 이상 배양기에서 겔화시켰다.
그 다음, CHES 완충 용액(pH 5.0)으로 수차례 세척한 후, 생리 식염수로 수차례 더 세척하였다. 이후, 겔 비드의 표면을 0.05% 폴리-L-리신의 생리 식염수 용액으로 5분 동안 처리한 후, 생리 식염수로 수차례 세척하였다. 이후, 겔 비드의 표면을 0.15%의 알긴산 수용액으로 5분간 코팅한 후, 생리 식염수로 수차례 세척하였다. 상기 비드를 50 mM 시트르산나트륨 수용액으로 5분간 처리한 후, 생리 식염수로 3회 세척하여 세포 함유 LA-AG 비드를 제조하였다.
LA-AG로 도입된 당쇄의 함량에 따라, LA-AG를 알긴산과 혼합하지 않고 LA-AG 단독으로 비드로 성형시킬 수도 있다.
비교를 위해, 전술한 알긴산과 LA-AG의 혼합 생리 식염수 용액 대신에 알긴산만의 생리 식염수 용액(2% w/v)을 사용하여 전술한 것과 동일한 방법으로 처리하여, 세포 함유 알긴산 비드를 제조하였다.
(c) 세포 함유 LA-AG 비드의 배양
이렇게 얻은 세포 함유 LA-AG 비드를, FCS (5% v/v), EGF (20 ng/ml) 및Ins.(10-8M)을 첨가한 L15 배지에서 배양하여 비드에 내포된 간실질세포의 기능을 평가하였다. 비교를 위해, 세포 함유 알긴산 비드에 대해서도 동일한 방식으로 배양하고, 비드에 내포된 간실질세포의 기능을 평가하였다.
(e) 간실질세포의 기능 평가
간실질세포로부터 생성되는 알부민의 양으로 겔 비드내 간실질세포의 기능을 평가하였다. 알부민 측정용 키트(미국 Bio-Rad의 제품)를 사용하여 통상의 방법으로 알부민을 측정하였다.
알부민 생성량을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. LA-AG 겔 비드로 배양한 간실질세포의 경우, 배양 8일째 알부민 생성량은 1 ml 당 0.0158 ㎍이었지만, 알긴산만의 겔 비드로 배양한 것은 1 ml 당 0.00765 ㎍이었다. 이것으로부터, LA-AG 겔 비드로 배양한 쪽이 간실질세포의 기능을 유지하고 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, LA-AG 겔 비드내에서 간실질세포를 배양하는 경우, 배양 3일째부터 수개의 세포들로 이루어진 구상체가 관측되어 세포의 이동 및 증식이 촉진되었음을 알 수 있다.
또한, 간실질세포의 현미경 관찰에서, 간실질세포를 2차원 형태의 콜라겐 코팅 배양 접시에서 배양한 경우에 볼 수 있는 확장된 형태(도 2의 현미경 사진 참조)와는 달리 3차원 형태의 LA-AG 겔 비드로 배양한 경우에는 구상 형태(도 3의 현미경 사진 참조)를 보이는 것이 명백해졌다. 이것으로부터, LA-AG 겔 비드내에서 간실질세포를 배양한 경우에는 생체내에서의 간실질세포의 형태를 유지할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 3. LA-AG 스폰지를 사용한 간실질세포의 배양
(a) LA-AG 스폰지의 제조 방법
문헌[L. Shapiro, S. Cohen,Biomaterials, 18, 583∼590(1997)]에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 즉, LA-AG(1% v/v) 및 알긴산(1% w/v)의 혼합 수용액 1 ml를 24 홀 다중 플레이트에 첨가한 후, 0.01% (w/v) 염화칼슘 수용액을 동량으로 적가하였다. 이것을 균질화기(6 G, 31,800 rpm)로 3분간 혼합한 후, -18℃의 냉동기에서 동결시킨 다음, 동결 건조시켜 LA-AG 스폰지를 제조하였다.
비교용으로, LA-AG와 알긴산의 혼합 수용액 대신 알긴산만의 수용액(2% w/v)을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 처리하여 알긴산 스폰지를 제조하였다.
(b) 스폰지 상에서의 간실질세포 배양
실시예 2에 기재된 방법에 따라 마우스의 간실질세포를 채취하여 분리한 세포를, FCS(5% v/v), EGF (20 ng/ml) 및 Ins. (10-8M)을 각각 괄호안에 표시된 농도로 함유하는 윌리엄 배지 E에 첨가하고, 세포 농도가 1 ml 당 800,000 세포가 되도록 스폰지에 파종하였다. 이것을 소정의 시간 동안 항온 처리하고, 스폰지 상에서 배양한 간실질세포의 기능을 알부민 생성량의 측정으로 평가하였다.
LA-AG 스폰지에서 배양한 간실질세포는 배양 8일째 0.0144 ㎍/ml의 알부민을 생성하는 반면, 알긴산만의 스폰지에서는 생성량이 0.00544 ㎍/ml이었다.
실시예 4. LA-HA 스폰지를 사용한 간실질세포의 배양
(a) LA-HA의 합성:
실시예 1의 LA-AG 합성 방법에 따라 수행하였다. 즉, 히알루론산을 TEMED 완충 용액 (pH 4.7) 50 ml에 녹이고, 축합제로서 WSC 0.97 g을 첨가한 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 이 용액에 실시예 1에서 얻은 LA-ED 2 g을 첨가하고 실온에서 3일 동안 교반하면서 반응시켰다. 상기 용액을 순수 20 L에 대해 투석하고, 투석 종료 후, 동결 건조시켜 목적하는 생성물을 얻었다. 생성물의1H-NMR 스펙트럼에서, 히알루론산의 CH3는 2.0 ppm, 아미드의 NH는 3.30 ppm, 락토오스 및 알긴산 당쇄는 3.3∼4.6 ppm에서 관측되었으며, 이 목적하는 생성물이 LA-HA임을 확인하였다. 당쇄의 도입량은 약 13%로 계산되었다.
(b) LA-HA 스폰지의 제조 방법
문헌[J. R. Glass 등,Biomaterials, 17, 1101∼1108(1997)]에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 즉, LA-AH(1% w/v) 및 히알루론산 (1% w/v)을 혼합하여 0.5% 수산화나트륨 수용액에 분산시켰다. 이 분산물에 1,4-부탄디에탄올 디글리시딜 에테르(가교제) 0.5 ㎕를 첨가한 후, 16시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 용액을 투석한 후, -20℃의 냉동기에서 동결시킨 후, 동결 건조시켜 LA-HA 스폰지를 제조하였다.
비교용으로, LA-HA 및 히알루론산 대신 히알루론산만을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 처리하여 히알루론산 스폰지를 제조하였다.
(c) 스폰지상에서의 간실질세포 배양
실시예 2에 기재된 방법에 따라 마우스의 간실질세포를 채취하여 분리한 세포를, FCS (5% v/v), EGF (20 ng/ml) 및 Ins.(10-8M)을 각각 괄호안에 표시된 농도로 함유하는 윌리엄 배지 E에 첨가하고, 세포 농도가 1 ml 당 800,000 세포가 되도록 스폰지에 파종하였다. 이것을 소정의 시간 동안 항온 처리하고, 스폰지 상에서 배양한 간실질세포의 기능을 알부민 생성량의 측정으로 평가하였다.
LA-HA 스폰지에서 배양한 간실질세포는 배양 8일째 0.0166 ㎍/ml의 알부민을 생성하는 반면, 히알루론산만의 스폰지에서는 생성량이 0.00483 ㎍/ml이었다.
본 발명의 3차원 세포 배양 물질은 세포에 따라 특이 인식성을 갖는 당쇄를 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자를 포함하기 때문에, 이러한 세포 배양 물질을 사용하여 세포를 배양함으로써 세포와 당쇄 사이의 특이적 상호 작용에 기인하여 세포의 생착 및 증식을 촉진시키고, 세포 기능을 유지하여 향상시키고, 세포 형태를 생체내의 형태와 근접한 형태로 유지할 수 있다. 따라서, 생체내와 동일한 증식성 및 기능성을 유지하는 임의 형태의 세포를 얻는 것이 가능하며, 예를 들면 하이브리드 형태의 인공 간 등에 응용할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포 배양 물질은, 당쇄를 결합시키지 않은 알긴산염 및 히알루론산 등의 당쇄고분자와 마찬가지로 쉽게 3차원 형태를 제공할 수 있다. 특히, 알긴산, 히알루론산, 펙틴 및 이들의 유도체를 포함하는 당쇄고분자를 사용하면, 당쇄를 쉽게 측쇄로서 도입할 수 있다. 또한, 제조 비용도 비교적 저렴하므로 일회용품을 제조할 수 있다.

Claims (10)

1종류 이상의 당쇄를 스페이서 분자를 통해 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자를 포함하는 세포 배양 물질을, 3차원 형태로 제조한 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
1종류 이상의 당쇄를 스페이서 분자를 통해 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자와, 당쇄를 측쇄로서 결합시키지 않은 당쇄고분자의 혼합물을 포함하는 세포 배양 물질을 3 차원 형태로 제조한 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 당쇄고분자는 카르복실기를 갖는 당쇄고분자 또는 이것의 유도체인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
제3항에 있어서, 상기 당쇄고분자는 알긴산 또는 이것의 유도체인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
제3항에 있어서, 상기 당쇄고분자는 히알루론산 또는 이것의 유도체인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
제3항에 있어서, 상기 당쇄고분자는 펙틴산 또는 이것의 유도체인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 당쇄고분자는 2종류 이상의 당쇄를 측쇄로서 결합시킨 당쇄고분자인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 스페이서 분자는 디아민인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 물질.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 의한 3차원 세포 배양 물질을 사용하여 세포를 배양함으로써 세포의 증식성, 형태 및 기능을 유지하고 향상시키는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 의한 3차원 세포 배양 물질 중 2종 이상을 혼합한 세포 배양 물질을 사용하여 세포를 배양함으로써 세포의 증식성, 형태 및 기능을 유지하고 향상시키는 것을 특징으로 하는 세포 배양 방법.
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