CN114849601B - 蛋白修饰微球及其应用 - Google Patents

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Abstract

提供了一种蛋白修饰微球和用于体外培养细胞的方法。所述蛋白修饰微球以水凝胶微球作为主体，并且在水凝胶微球表面接枝有与细胞特别是干细胞相互作用的生物活性蛋白。该蛋白修饰微球有效地模拟干细胞体内天然微环境中支持细胞与干细胞的相互作用，实现了稳定且有效地体外扩增干细胞。

Description

蛋白修饰微球及其应用
技术领域
本公开涉及生物医学工程领域，具体地涉及一种蛋白修饰微球以及一种用于体外培养细胞的方法。
背景技术
近年来细胞治疗行业飞速发展，干细胞体外培养的需求高涨。
在相关技术中，研究者们在造血干细胞体外培养中引入各种细胞因子比如干细胞因子、促血小板生成素等、小分子(如UM171、SR1)等以促进造血干细胞的体外增殖。然而，经体外培养后的造血干细胞在移植后维持或提升重建的造血功能仍不尽人意。将干细胞体内天然微环境中的支持细胞直接与造血干细胞共培养，虽然可以一定程度上提高体外培养的造血干细胞的造血重建效果，却存在微环境支持细胞的提取复杂、培养操作繁琐、培养批次差异的现象，导致可重复性差、支持细胞在传统二维细胞培养板中难以保持其在体内的天然表型等问题。
目前干细胞体外培养技术仍存在许多缺陷，包括扩增效率低、易过度分化并伴随干细胞干性(自我更新能力及多项分化潜能)的丢失。因此，需要开发能够有效扩增干细胞并且保持干细胞干性的方式。
发明内容
本公开旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本公开的实施方案提出一种蛋白修饰微球，所述蛋白修饰微球以水凝胶微球作为主体，在水凝胶微球的表面上接枝有与干细胞相互作用的生物活性蛋白。
由此，本公开的蛋白修饰微球能够以易于使用、稳定可控、灵活控制单一变量的方式模拟干细胞体内天然微环境中支持细胞与干细胞的相互作用，并模拟细胞间通过配体受体连接进行信号通讯的过程向干细胞提供固定化的蛋白信号。所述蛋白修饰微球实现了稳定且有效地体外扩增干细胞，且维持或提升扩增干细胞的自我更新能力及分化潜能。
在一个方面，本公开的实施方案提供了一种蛋白修饰微球，包含：
水凝胶微球，所述水凝胶微球具有活性连接单元，
第一连接单元，所述第一连接单元具有第一链接元件，所述第一链接元件与所述活性连接单元共价连接以嵌入至所述水凝胶微球；和
第二连接单元，所述第二连接单元包含嵌合第二链接元件的生物活性蛋白，其中所述第二链接元件结合至所述第一链接元件以将所述生物活性蛋白接枝至所述水凝胶微球的表面。
在一些实施方案中，所述蛋白修饰微球还包含基质蛋白，其中所述基质蛋白附着于所述蛋白修饰微球的表面。
在一些实施方案中，所述水凝胶微球的直径为5至40微米。在一些实施方案中，所述水凝胶微球的直径为12至17微米。
在一些实施方案中，所述第一链接元件和所述第二链接元件选自以下的组合：蛋白G和可结晶区域片段(Fc)、蛋白A和Fc、生物素和亲和素、以及叠氮和环炔。
在一些实施方案中，所述生物活性蛋白包括Notch配体Delta Like CanonicalNotch Ligand 1(DLL1)、Notch配体Delta Like Canonical Notch Ligand 4(DLL4)、Jagged1、Jagged2、干细胞因子、促血小板成长因子、结粘连分子B、结粘连分子C、内皮细胞粘附分子中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述基质蛋白包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述水凝胶微球经由连续相溶液和分散相溶液形成。
所述分散相溶液包含活性连接单元、主体成胶基质和交联剂。
在一些实施方案中，所述活性连接单元选自聚乙二醇-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、2-氨基乙硫醇、二硫苏糖醇、甲叉双丙烯酰胺、甲基丙烯酸酐、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、活性酯-聚乙二醇-马来酰亚胺、丙烯酰-聚乙二醇-氨基及其组合。
在一些实施方案中，所述主体成胶基质选自聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、琼脂、基质胶、透明质酸及其组合。
在一些实施方案中，所述交联剂选自过硫酸铵(APS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、戊二醛、硫酸钙、氯化钙、硫酸锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及其组合。
所述连续相溶液包含表面活性剂和极性溶液。
在一些实施方案中，所述表面活性剂选自司盘80、ABA型嵌段共聚物PFPF-PEG-PFPE、极压氟油脂Krytox 157系列、全氟三丁胺及其组合。
在一些实施方案中，所述极性溶液选自正十八烷、正十六烷、正十三烷、正己烷、环己烷、氟碳油HFE系列、矿物油、橄榄油、花生油及其组合。
在另一方面，本公开的实施方案提供了用于体外培养细胞的方法，包括：
(1)将待培养的细胞与第一方面描述的蛋白修饰微球混合，和
(2)将所述细胞与所述蛋白修饰微球的混合液置于培养容器中在培养箱中培养一段时间，从而获得经体外培养的所述细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一个实施方案中，所述干细胞为造血干细胞。
在一些实施方案中，所述细胞与所述蛋白修饰微球的含量比率为0.1至5。在一个实施方案中，所述细胞与所述蛋白修饰微球的含量比率为1:1。
附图说明
本公开上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1示出根据本公开实施方案的用微流控聚焦型液滴发生芯片制备蛋白修饰微球的示意图。
图2示出根据本公开实施方案的FITC荧光标记的蛋白修饰微球的显微照片图。
图3示出根据本公开实施方案的蛋白修饰微球的尺寸分布统计图。
图4示出根据本公开实施方案的微球可制备的不同尺寸实物图及统计图。
图5示出根据本公开实施方案的在不同原料配比下蛋白修饰微球的弹性模量统计图。
图6示出根据本公开实施方案的蛋白修饰微球共培养组(MP DLL1组)、传统二维培养组(2D组)、二维生物活性蛋白培养组(plate组)和水凝胶微球共培养组(MP F+P组)的造血干细胞移植重建造血效果的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本公开的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本公开，而不能理解为对本公开的限制。
本公开是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的：相关技术中的干细胞体外培养技术存在扩增效率低、易过度分化并伴随干细胞干性(自我更新能力及多项分化潜能)丢失的缺陷。本公开提取体内天然微环境中支持细胞上的关键作用蛋白，开发了一种蛋白修饰微球，其中以水凝胶微球作为主体，在所述水凝胶微球的表面上接枝有与干细胞相互作用的关键作用蛋白(在本文中称为生物活性细胞)，从而模拟干细胞体内天然微环境中支持细胞与干细胞的相互作用效果，并且证明所述蛋白修饰微球能够增强造血干细胞的体外培养，实现稳定且有效地体外扩增干细胞，且维持或提升干细胞的自我更新能力及分化特性。
在一个方面，本公开的实施方案提供了一种蛋白修饰微球，包含：
水凝胶微球，所述水凝胶微球具有活性连接单元，
第一连接单元，所述第一连接单元具有第一链接元件，所述第一链接元件与所述活性连接单元共价连接以嵌入至所述水凝胶微球；和
第二连接单元，所述第二连接单元包含嵌合第二链接元件的生物活性蛋白，其中所述第二链接元件结合至所述第一链接元件以将所述生物活性蛋白接枝至所述水凝胶微球的表面。
所述蛋白修饰微球以水凝胶微球作为主体，在水凝胶微球的表面上接枝有与干细胞相互作用的生物活性蛋白，从而模拟干细胞体内天然微环境中支持细胞与干细胞的相互作用效果。
在一些实施方案中，所述蛋白修饰微球还包含基质蛋白，其中所述基质蛋白附着于所述蛋白修饰微球的表面，因而提供粘附位点以便于细胞与蛋白修饰微球接触。
在一些实施方案中，所述水凝胶微球的直径为5至40微米。在一些实施方案中，所述水凝胶微球的直径为12至17微米。采用具有这种直径范围的水凝胶微球，能够有效地模拟体内天然微环境中的支持细胞与干细胞的相互作用，以及有效地模拟体内细胞间通过配体受体连接进行信号通讯的过程向干细胞提供固定化的蛋白信号。
在一些实施方案中，所述第一链接元件和所述第二链接元件选自以下的组合：蛋白G和可结晶区域片段(Fc)、蛋白A和Fc、生物素和亲和素、以及叠氮和环炔。在一个实施方案中，所述第一链接元件是蛋白G，所述第二链接元件是可结晶区域片段(Fc)。
在一些实施方案中，所述生物活性蛋白包括Notch配体Delta Like CanonicalNotch Ligand 1(DLL1)、Notch配体Delta Like Canonical Notch Ligand 4(DLL4)、Jagged1、Jagged2、干细胞因子、促血小板成长因子、结粘连分子B、结粘连分子C、内皮细胞粘附分子中的一种或多种。在一个实施方案中，所述生物活性蛋白是Notch配体DLL1。
在一些实施方案中，所述基质蛋白包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白中的一种或多种。所述基质蛋白附着于所述蛋白修饰微球的表面以提供粘附位点，从而促进待培养细胞与蛋白修饰微球的接触。在一个实施方案中，所述基质蛋白是纤连蛋白。
在一些实施方案中，所述水凝胶微球经由连续相溶液和分散相溶液形成。所述分散相溶液包含活性连接单元、主体成胶基质和交联剂。所述连续相溶液包含表面活性剂和极性溶液。在水凝胶微球形成后，所述活性连接单元与第一链接元件共价连接，从而将第一链接元件嵌入至所述水凝胶微球中。随后经由第一链接元件与第二链接元件结合，将生物活性蛋白接枝至所述水凝胶微球的表面。由此，形成以水凝胶微球为主体、接枝有生物活性蛋白的蛋白修饰微球。
在一些实施方案中，所述活性连接单元选自聚乙二醇-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、2-氨基乙硫醇、二硫苏糖醇、甲叉双丙烯酰胺、甲基丙烯酸酐、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、活性酯-聚乙二醇-马来酰亚胺、丙烯酰-聚乙二醇-氨基及其组合。在一个实施方案中，所述活性连接单元是聚乙二醇-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)。
在一些实施方案中，所述主体成胶基质选自聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乙二醇衍生物、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、明胶、明胶衍生物、藻酸盐、藻酸盐衍生物、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、琼脂、基质胶、透明质酸及其组合。在一个实施方案中，所述主体成胶基质是聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA575)。
具体参见图5，根据本公开的一个实施方案，分散相溶液中PEGDA575的含量比率为20％时，制备得到的蛋白修饰微球的弹性模量约为40kPa。根据本公开的另一个实施方案，分散相溶液中PEGDA575的含量比率为10％时，制备得到的蛋白修饰微球的弹性模量约为20kPa。
在一些实施方案中，所述交联剂选自过硫酸铵(APS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、戊二醛、硫酸钙、氯化钙、硫酸锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及其组合。在一个实施方案中，所述交联剂是过硫酸铵(APS)。
在一些实施方案中，所述表面活性剂选自司盘80、ABA型嵌段共聚物PFPF-PEG-PFPE、极压氟油脂Krytox 157系列、全氟三丁胺及其组合。在一个实施方案中，所述表面活性剂是司盘80(span80)。
在一些实施方案中，所述极性溶液选自正十八烷、正十六烷、正十三烷、正己烷、环己烷、氟碳油HFE系列、矿物油、橄榄油、花生油及其组合。在一个实施方案中，所述极性溶液是正十六烷。
根据本公开的一个实施方案，采用聚乙二醇-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA575)和过硫酸铵(APS)作为分散相溶液。采用司盘80(span80)和正十六烷作为连续相溶液。由此制备得到聚乙二醇-NAS的水凝胶微球。通过聚乙二醇-NAS的水凝胶微球表面的NAS连接蛋白G，再通过蛋白G与Fc嵌合的生物活性蛋白DLL1中的Fc片段连接，从而将生物活性蛋白DLL1接枝至水凝胶微球表面，形成DLL1蛋白修饰的微球，用于特定地提供DLL1蛋白以激活细胞Notch信号。
在另一方面，本公开的实施方案提供了用于体外培养细胞的方法，包括：
(1)将待培养的细胞与第一方面描述的蛋白修饰微球混合，和
(2)将所述细胞与所述蛋白修饰微球的混合液置于培养容器中在培养箱中培养一段时间，从而获得经体外培养的所述细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一个实施方案中，所述干细胞为造血干细胞。
在一些实施方案中，所述细胞与所述蛋白修饰微球的含量比率为0.1至5。在一个实施方案中，所述细胞与所述蛋白修饰微球的含量比率为1:1。
通过以上实施方案，本公开提出的蛋白修饰微球具有如下技术效果：
本公开的蛋白修饰微球模拟了体内细胞的形状尺寸并且表面接枝有生物活性蛋白，能够模拟体内细胞间通过细胞膜表面配体及受体结合进行相互通讯的模式向共培养的细胞提供固定式的蛋白信号；
本公开的蛋白修饰微球中的生物活性蛋白的种类和含量可根据使用者需求进行灵活地调整，可以灵活地用于探究信号蛋白的剂量效应、不同蛋白的组合效果或筛选最佳信号蛋白修饰；
本公开的蛋白修饰微球用于细胞共培养使用方便，投入量灵活可控，不存在传统细胞共培养存在的支持细胞随体外培养时间延长而发生过生长或表型变化等问题，并可兼容动态培养、自动化或规模化等培养系统；
本公开的蛋白修饰微球的特定类型与特定干细胞共培养后经证明能够提高干细胞移植到实验动物模型的体内疗效。
提供以下实施例以说明本公开。它们无意以任何方式进行限制。
实施例1
在该实施例中，通过模拟细胞形状尺寸，制备了直径约为7～15微米、主体材质为聚乙二醇-NAS的水凝胶微球以用于细胞培养。
所述水凝胶微球的制备方法包括：
(1)配制含10％聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA575)、0.1％N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)和0.8％过硫酸铵(APS)的溶液，作为分散相溶液，0.22um针式滤器过滤除杂质；
(2)配制含25％司盘80(span80)的正十六烷溶液，作为连续相溶液，0.22um针式滤器过滤除杂质；
(3)用2支10ml精密玻璃进样器吸取相同体积的连续相溶液，将这两支精密玻璃进样器固定到Harvard精密双通道注射泵卡槽中；用1支1ml精密玻璃进样器吸取适当体积的分散相溶液，将该精密玻璃进样器固定到另一台Harvard精密双通道注射泵卡槽中；
(4)将购置于苏州汶颢微流控技术股份有限公司的聚焦型液滴发生玻璃芯片按产品说明书的操作指南与夹具组装，并通过鲁尔锁紧接头与上述进样器连接；其中与中间微流道连接的导管与1ml进样器连接，与两侧微流道连接的导管分别与两支10ml进样器连接；
(5)通过调节上述两台Harvard精密双通道注射泵的推注速度，获得能够稳定生成均匀微液滴的流速条件，将上述芯片的流出管插入到含1％v/v N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)的正十六烷溶液中，收集产生的微液滴；
(6)将上述收集管中的微液滴在室温静置2小时以上后用1微米孔径的聚四氟乙烯滤膜进行减压过滤；过滤完成后将滤膜倒扣在含75％酒精的培养皿中，轻轻摇晃30秒，取出滤膜后收集培养皿中的微球溶液至新的试管中并静置2小时；
(7)弃掉上述静置后的试管中的上清，将沉淀用PBS重悬洗涤，以15000g离心力、4℃离心15分钟浓缩微球。
实施例2
在本实施例中，以与实施例1相似的方法制备了另一种水凝胶微球。与实施例1相比，区别仅在于采用含5％四臂聚乙二醇二丙烯酸酯(4-arm PEGAc)、0.5％二硫苏糖醇(DTT)和0.1％N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)的溶液作为分散相溶液，以及采用含25％司盘80(span80)的正十六烷溶液作为连续相溶液。
实施例3
在本实施例中，以与实施例1相似的方法制备了另一种水凝胶微球。与实施例1相比，区别仅在于采用含3％明胶(Gelatin)的水溶液作为分散相溶液，以及采用含25％司盘80(span80)的正十六烷溶液作为连续相溶液。
实施例4
在本实施例中，以与实施例1相似的方法还制备了另一种水凝胶微球。与实施例1相比，区别仅在于采用含3％海藻酸钠(Alginate)的水溶液作为分散相溶液，以及采用含2％司盘80(span80)的矿物油溶液作为连续相溶液。
实施例5
在本实施例中，通过用实施例1获得的聚乙二醇-NAS水凝胶微球，制备了接枝有生物活性蛋白Notch配体Delta Like Canonical Notch Ligand 1(DLL1)的蛋白修饰微球。
所述蛋白修饰微球的制备方法包括：
(1)将灭菌的聚乙二醇-NAS水凝胶微球以15000g离心力、4℃离心15分钟进行浓缩，去除上清，用1ml PBS缓冲液将所述水凝胶微球重悬至106个微球/ml；
(2)向聚乙二醇-NAS水凝胶微球悬浊液中加入蛋白G和纤连蛋白，使其终浓度均为5μg/ml，充分混匀，装入混匀仪在4℃下混匀孵育12小时；
(3)孵育结束后向悬浊液中加入200μl乙醇胺，装入混匀仪在4℃下混匀孵育2小时，以封闭未完全反应的NAS；
(4)封闭结束后，以15000g离心力、4℃离心15分钟浓缩所述水凝胶微球，去除上清，用1ml PBS缓冲液将水凝胶微球再次重悬至106个微球/ml；
(5)向水凝胶微球悬浊液中加入Fc嵌合的DLL1蛋白，使其终浓度为0.5μg/ml以便制备蛋白修饰微球MP DLL1，充分混匀，装入混匀仪在4℃下混匀孵育12小时，后以15000g离心力、4℃离心15分钟浓缩微球，去除上清，用细胞培养基将微球重悬至106个微球/ml。
在该实施例中，聚乙二醇-NAS水凝胶微球表面的NAS首先与蛋白G共价连接，然后蛋白G再与Fc嵌合的DLL1蛋白中的Fc片段连接，从而实现将生物活性蛋白Notch配体DLL1接枝至所述水凝胶微球的表面。由此制备的蛋白修饰微球可特定地提供DLL1蛋白以激活细胞Notch信号。
实施例6
在本实施例中，以与实施例5相似的方法制备了另一种蛋白修饰微球。与实施例5相比，区别仅在于在步骤(2)中加入蛋白G和胶原蛋白，在步骤(5)中加入Fc嵌合的Jam2蛋白。
实施例7
在本实施例中，以与实施例5相似的方法还制备了另一种蛋白修饰微球。与实施例5相比，区别仅在于在步骤(2)中加入生物素和纤连蛋白，在步骤(5)中加入链霉亲和素嵌合的Jagged1蛋白。
实施例8
在该实施例中，采用实施例5制备的接枝有DLL1的蛋白修饰微球MP DLL1以体外培养干细胞。该用于体外培养干细胞的方法包括：
(1)根据细胞表面标志物Lineage阴性、cKit阳性分选提取C57BL/6-CD45.1小鼠骨髓造血干细胞，收集至干细胞缓冲液中，以500g离心力，4℃离心5分钟，去除上清，用造血干细胞培养基将造血干细胞重悬至106个细胞/ml，将上述细胞悬液与106个蛋白修饰微球MPDLL1/ml分别等体积均匀混合；
(2)在24孔细胞培养板每孔中加入900μl造血干细胞细胞培养液，后取100μl充分混合的造血干细胞与蛋白修饰微球的混合液缓慢均匀旋转地加入细胞培养液中；
(3)将接种好细胞与蛋白修饰微球的24孔细胞培养板放置在37℃、5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养，隔两天更换细胞培养液，小心地沿细胞培养板小孔的一边吸出800μl细胞培养液，再沿孔壁缓慢加入800μl新的细胞培养液，持续培养一周。
实施例9
在该实施例中，将实施例8制备的经蛋白修饰微球共培养的干细胞移植至实验小鼠体内以评估疗效，从而验证蛋白修饰微球对体外培养的造血干细胞移植重建造血效果以及功能的维持或提升的效果。参见图6，其中2D对应二维培养组，plate对应二维生物活性蛋白培养组，MP F+P对应不接枝生物活性蛋白的水凝胶微球共培养组，以及MP DLL1对应接枝0.5μg/ml DLL1的蛋白修饰微球共培养组。
实验组为按照实施例8方法得到的蛋白修饰微球MP DLL1分别与C57BL/6-CD45.1小鼠骨髓造血干细胞共培养一周后的培养物，即MP DLL1组。
本实施例的方法还包括设置传统二维培养组(即2D组)、二维生物活性蛋白培养组(即plate组)、不接枝生物活性蛋白的水凝胶微球共培养组(即MP F+P组)作为对照，以与蛋白修饰微球共培养组进行比较。
对于传统二维培养组(2D组)，在24孔细胞培养板每孔中加入900μl造血干细胞细胞培养液，取50μl 106个细胞/ml的C57BL/6-CD45.1小鼠骨髓造血干细胞悬液缓慢均匀旋转地加入细胞培养液中，并将接种好细胞的24孔细胞培养板放置在37℃、5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养，隔两天更换细胞培养液，持续培养一周。
对于二维生物活性蛋白培养组(plate组)，在24孔细胞培养板中加入0.5ml PBS缓冲液，纤连蛋白及DLL1蛋白，使其终浓度均为5μg/ml，充分混匀后将细胞培养板放置4℃孵育12小时，孵育结束后沿孔壁小心吸去上清，加入灭菌水轻摇洗涤两次，吸去液体，每孔中加入900μl造血干细胞细胞培养液，后取50μl 106个细胞/ml的C57BL/6-CD45.1小鼠骨髓造血干细胞悬液缓慢均匀旋转地加入细胞培养液中，在37℃、5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养，隔两天更换细胞培养液，持续培养一周。
对于水凝胶微球共培养组(MP F+P组)，在24孔细胞培养板每孔中加入900μl造血干细胞细胞培养液，取50μl 106个细胞/ml的C57BL/6-CD45.1小鼠骨髓造血干细胞悬液和50μl106个水凝胶微球/ml，缓慢均匀旋转地加入细胞培养液中，在37℃、5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养，隔两天更换细胞培养液，持续培养一周。
将以上实验组和对照组的经培养一周的各个培养物进行如下步骤：
分别用移液枪轻轻吹打并收集细胞培养板中一个孔内的细胞与微球，并补充干细胞缓冲液润洗孔板以完全收集孔内的所有细胞与微球；
将收集的细胞与微球以500g离心力，4℃离心5分钟，去除上清，每孔收集的细胞与微球用500μl PBS缓冲液重悬；
用流式分选仪根据颗粒度值分选圈除细胞与微球混合液中的微球，仅收集细胞至500μlPBS缓冲液中，再次以500g离心力，4℃离心5分钟，去除上清，每孔收获的细胞用200μlPBS缓冲液重悬；
提取C57BL/6-CD45.1.2小鼠的全骨髓细胞，收集至干细胞缓冲液中，以500g离心力，4℃离心5分钟，去除上清，用PBS缓冲液将CD45.1.2全骨髓细胞稀释至107个细胞/ml，取50μl CD45.1.2全骨髓细胞悬液与每孔收获的200μl CD45.1细胞充分混合；
准备移植前，用X射线辐照C57BL/6-CD45.2小鼠清髓以作为移植受体小鼠，共计辐照9Gy X射线，分两次照射，每次辐照4.5Gy，中间间隔3小时，辐照完等待3小时后准备移植；
每只辐照受体CD45.2小鼠经尾静脉注射150μl前述CD45.1.2全骨髓细胞与经体外培养收获的CD45.1细胞混合液，即每只受体小鼠注射由初始3万个CD45.1造血干细胞经体外培养获得的所有细胞及30万个CD45.2全骨髓细胞；以及
移植后每4周进行一次外周血分析，统计受体小鼠的外周血全血、B细胞、T细胞及髓系细胞中供体CD45.1细胞所占比例，以持续评估移植干细胞重建受体小鼠血液系统的效果。
参见图6，实验结果表明，接枝有DLL1的蛋白修饰微球组实现显著优于传统二维培养组和二维生物活性蛋白培养组的干细胞体外培养效果。经过蛋白修饰微球与造血干细胞共培养，由此扩增的造血干细胞在移植后能够表现出更强的干细胞分化特性。
在本公开中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本公开中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本公开的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本公开的限制，本领域的普通技术人员在本公开的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (12)

1.一种蛋白修饰微球，其特征在于，包含：
水凝胶微球，所述水凝胶微球具有活性连接单元；
第一连接单元，所述第一连接单元具有第一链接元件，所述第一链接元件与所述活性连接单元共价连接以嵌入至所述水凝胶微球；和
第二连接单元，所述第二连接单元包含嵌合第二链接元件的生物活性蛋白，其中所述第二链接元件结合至所述第一链接元件以将所述生物活性蛋白接枝至所述水凝胶微球的表面，
其中所述第一链接元件和所述第二链接元件选自以下的组合：蛋白G和可结晶区域片段（Fc）、生物素和亲和素、以及叠氮和环炔。
2.根据权利要求1所述的蛋白修饰微球，其特征在于，所述蛋白修饰微球还包含基质蛋白，其中所述基质蛋白附着于所述蛋白修饰微球的表面。
3.根据权利要求1所述的蛋白修饰微球，其特征在于，所述水凝胶微球的直径为5至40微米。
4.根据权利要求1所述的蛋白修饰微球，其特征在于，所述水凝胶微球的直径为12至17微米。
5.根据权利要求1所述的蛋白修饰微球，其特征在于，所述生物活性蛋白包括Notch配体Delta Like Canonical Notch Ligand 1（DLL1）、Notch配体Delta Like CanonicalNotch Ligand 4（DLL4）、Jagged1、Jagged2、干细胞因子、促血小板成长因子、结粘连分子B、结粘连分子C、内皮细胞粘附分子中的一种或多种。
6.根据权利要求2所述的蛋白修饰微球，其特征在于，所述基质蛋白包括纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、玻连蛋白中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的蛋白修饰微球，其特征在于，所述水凝胶微球经由连续相溶液和分散相溶液形成，
其中所述分散相溶液包含所述活性连接单元、主体成胶基质和交联剂，
所述活性连接单元选自聚乙二醇-N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺（NAS）、2-氨基乙硫醇、二硫苏糖醇、甲叉双丙烯酰胺、甲基丙烯酸酐、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐、活性酯-聚乙二醇-马来酰亚胺、丙烯酰-聚乙二醇-氨基及其组合；
所述主体成胶基质选自聚酸酐、聚酰胺、聚氨基酸、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚乳酸、聚羟基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚吡咯、聚甲基丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯、明胶、藻酸盐、胶原、蛋白多糖、糖蛋白、琼脂、基质胶、透明质酸及其组合；以及
所述交联剂选自过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）、戊二醛、硫酸钙、氯化钙、硫酸锌、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及其组合；和
其中所述连续相溶液包含表面活性剂和极性溶液，
所述表面活性剂选自司盘80、ABA型嵌段共聚物PFPF-PEG-PFPE、极压氟油脂Krytox157系列、全氟三丁胺及其组合，以及
所述极性溶液选自正十八烷、正十六烷、正十三烷、正己烷、环己烷、氟碳油HFE系列、矿物油、橄榄油、花生油及其组合。
8.一种用于体外培养细胞的方法，包括：
（1）将待培养的细胞与权利要求1至7中任一项所述的蛋白修饰微球混合，和
（2）将所述细胞与所述蛋白修饰微球的混合液置于培养容器中在培养箱中培养一段时间，从而获得经体外培养的所述细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞是干细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述干细胞为造血干细胞。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞与所述蛋白修饰微球的含量比率为0.1至5。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞与所述蛋白修饰微球的含量比率为1:1。
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