CN113025570A - 一种t细胞增殖方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种T细胞增殖方法及其用途，属于生物医学领域。所述方法包括：获取细胞纤维丝，所述细胞纤维丝包含内芯和包裹所述内芯的纤维外层；其中，所述内芯源自于含有T细胞的细胞悬液，所述纤维外层源自于高分子材料；对所述细胞纤维丝进行培养，获取含有纤维外层的所述T细胞。本发明提供的T细胞增殖方法，提高了T细胞体外增殖的能力，并且提高了T细胞生存率，为体外培养T细胞提供了新思路，为过继性免疫治疗提供新的细胞培养方法。

Description

一种T细胞增殖方法及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域或生物三维打印领域，具体涉及一种三维生物打印的T细胞增殖方法及其用途。
背景技术
同轴挤出式生物打印是构建模拟细胞三维微环境的一种新颖方法。同轴通道可有多层，制造出由多种材料和细胞共同组成的线样结构。基于同轴打印技术，构建了用于组织工程、药物筛选和组织器官体外模型研究的载细胞的壳-芯结构，使细胞处于三维环境，并由形成“壳”的细胞外基质材料提供相应微环境，使细胞处于与体内相似的微环境中，有利于发挥细胞的生物学功能。
近年来，基于T细胞的免疫治疗在临床治疗中取得了重大突破。国内外很多团队进行的过继性免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy，ACT)，是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。目前进行较多的是TIL、TCR-T和CAR-T三种过继性免疫疗法，在急性B系淋巴细胞白血病、大B细胞非霍奇金淋巴瘤、难治恶性淋巴瘤等疾病中已有明确的治疗效果，且在一些实体肿瘤，如肝癌、胃癌、神经胶质母细胞瘤患者的临床试验中也有十分可喜的治疗效果。这种疗法目前也存在很多的问题，例如在一些年幼或老年患者及肿瘤高负荷的患者体内很难获得足量的T细胞，且CAR-T细胞制备成本高，生产制备时间长，无法短时间内培养增殖得到足量的T细胞，细胞的衰竭程度偏高及细胞坏死凋亡偏高。
因此，基于现有技术存在的缺陷，现在迫切需要提供一种促进T细胞增殖的方法，使得T细胞能够在体外快速扩增的同时，还能够进一步保证T细胞的存活率。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的之一在于，提供一种T细胞增殖方法，使得T细胞能够在体外快速扩增的同时，还能够进一步保证T细胞的存活率。
本发明的目的之一还在于，提供一种前述T细胞增殖方法的用途
用于解决问题的方案
本发明涉及的技术方案如下。
(1)一种获取T细胞的方法，包括如下步骤：
获取细胞纤维丝，所述细胞纤维丝包含内芯和包裹所述内芯的纤维外层；其中，所述内芯源自于含有T细胞的细胞悬液；所述纤维外层源自于溶解有高分子材料的溶液，并且具有孔结构；对所述细胞纤维丝进行培养，获取含有纤维外层的所述T细胞。
(2)根据(1)所述方法，其中，所述方法进一步包括如下步骤：
纤维外层溶解步骤：将所述纤维外层进行溶解，获取不含有纤维外层的所述T细胞；
可选的，所述纤维外层溶解步骤中使用的溶解液为柠檬酸-EDTA溶液。
(3)根据(1)-(2)任一项所述方法，其中，所述含有T细胞的细胞悬液中的T细胞是激活的T细胞；可选的，所述激活的T细胞选自以下(i)-(ii)中的至少一种：
(i)所述T细胞通过抗CD3和CD28的抗体刺激被激活；
(ii)所述T细胞通过与包被抗-CD3/CD28的磁珠孵育被激活。
在一个具体的实施方式中，所述细胞悬液中的T细胞来源于外周血单个核细胞。
(4)根据(1)-(3)任一项所述方法，其中，所述高分子材料包括可降解的天然高分子聚合物或者合成高分子聚合物；可选的，所述材料包括选自聚丙烯腈、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸、聚酰亚胺、聚乙烯醇、明胶、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、丝素蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、普朗尼克酸中的一种或两种以上的组合。
(5)根据(1)-(4)任一项所述方法，其中，利用三维同轴打印设备制备所述内芯和包裹所述内芯的纤维外层。
(6)根据(5)所述方法，其中，所述纤维外层通过高分子材料溶液制备得到，其中，所述高分子材料溶液的浓度为0.5％-6％(w/v)。
(7)根据(1)-(6)任一项所述方法，其中，所述细胞纤维丝成形于介质中，所述介质含有能够促使所述高分子材料发生交联的溶液。
(8)根据(5)所述方法，其中，所述三维同轴打印设备包括内轴和外轴，所述高分子材料溶液在外轴的挤出速度为10～15mL/h，所述细胞悬液在内轴的挤出速度为3～5mL/h。
(9)根据(1)-(8)任一项所述方法制备得到的T细胞。
(10)根据(1)-(8)任一项所述方法制备得到的T细胞或根据(9)所述的T细胞在制备用于过继性免疫治疗的试剂中的应用。
发明的效果
在一个技术方案中，本发明利用了三维同轴打印技术，构建了壳-高分子材料/芯-T细胞的同轴细胞线，作为T细胞增殖模型，用于制备T细胞。
在一个技术方案中，通过本发明记载的T细胞增殖模型制备得到的T细胞，提高了T细胞体外增殖的能力。
在一个技术方案中，通过本发明记载的T细胞增殖模型制备得到的T细胞，进一步提高了T细胞生存率。
在一个技术方案中，本发明的技术方案为体外培养T细胞提供了新思路，为过继性免疫治疗提供新的细胞培养方法。
附图说明
图1示出了三维同轴打印T细胞的原理示意图(左)和打印结果示意图(右)。
图2示出了三维同轴打印T细胞扫描电镜图。
图3示出了三维同轴打印T细胞在第3天(左)和第7天(右)的显微镜照片。
图4示出了悬浮培养T细胞组和三维同轴打印T细胞组的增殖指数比较。
图5示出了悬浮培养T细胞组(上)和三维同轴打印T细胞组(中)的凋亡流式图，其中，左下角的第三象限代表存活比例。存活率对比图(下)示出了不同组的T细胞存活率。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
在本发明的权利要求和/或说明书中，除非上下文中另有说明，否则例如“一个/种(a,an)”、“所述(said)”或“所述(the)”等指示对象旨在支持单数和/或复数情况二者。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
如本发明所使用的，术语“约”表示：一个数值包括测定该数值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。示例性的，前述标准偏差一般为原始数值相差5％的范围之内。
虽然本发明的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本发明所使用的，术语“外周血单个核细胞(PMBC)”是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞。
在一个实施方式中，本发明提供了一种获取T细胞的方法，包括如下步骤：获取细胞纤维丝，所述细胞纤维丝包含内芯和包裹所述内芯的纤维外层；其中，所述内芯源自于含有T细胞的细胞悬液，所述纤维外层源自于高分子材料；对所述细胞纤维丝进行培养，获取含有纤维外层的所述T细胞。
在一个实施方式中，本发明所涉及的细胞悬液中，T细胞的数量为0.2*106个/mL-5*108个/mL。在一个具体的实施方式中，细胞悬液中所述细胞的数量为1*107个/mL。
在一个实施方式中，本发明所涉及的T细胞是激活的T细胞。
在一个具体的实施方式中，所述激活的T细胞选自以下(i)或(ii)，或(i)和(ii)的组合：
(i)所述T细胞通过抗CD3和CD28的抗体刺激被激活；
(ii)所述T细胞通过与包被抗-CD3/CD28的磁珠孵育被激活。
作为本发明实施方案之一，所述细胞悬液中的T细胞来源于外周血单个核细胞。
在本发明中，所述三维同轴挤出技术是通过装置挤出同心或同轴的纤维丝。在本发明中，对纤维丝的层数没有特别限定。优选的，基于能够成为同轴结构的要求，纤维丝的层数是大于等于两层的。
在本发明中，对所述三维同轴挤出技术所使用的装置没有特别的限定，能够满足挤出同心或同轴的纤维丝即可。
在本发明中，对所述高分子材料的种类没有特别限定，所述高分子材料能够满足三维同轴挤出技术所使用的装置的工作需求即可，即能够被挤出，包裹细胞成形；优选的，所述高分子材料对细胞生长无毒无害；进一步优选的，所述高分子材料具有半透性。
在本发明中，所述高分子材料包括但不限于水凝胶，因为天然的细胞外基质在细胞的存活、增殖、分化以及迁移中均扮演着重要的角色，而不同成分的水凝胶被认为是用来模拟不同天然细胞外基质的较为理想的材料。三维培养所用的水凝胶由具有高保水性的相互连接的孔组成，其中包含了各种细胞生长所需的营养物质和气体。水凝胶由铰链或复杂的天然或者合成蛋白质分子组成的网络结构，由于含有大量的水，水凝胶具有和天然组织非常相似的生物物理学特性，因而可以作为三维细胞培养的基质。
在本发明中，所述高分子材料可以由上述天然凝胶基质构成，也可以由上述天然凝胶基质和其他成分组成。
在本发明中，所述高分子材料包括但不限于动物细胞外基质提取物水凝胶、蛋白质水凝胶、肽水凝胶、聚合物水凝胶、纤维素水凝胶胶原、层纤连蛋白、纤维蛋白、琼脂糖、透明质酸、壳聚糖、海藻酸钠等基质等天然凝胶基质，由于这些成分来源于天然成分，因而这些凝胶基质生物相容性和生物活性较好。
在本发明中，所述高分子材料包括可降解的天然高分子聚合物或者合成高分子聚合物；可选的，所述材料包括选自聚丙烯腈、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸、聚酰亚胺、聚乙烯醇、明胶、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、丝素蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、普朗尼克酸中的一种或两种以上的组合。
作为本发明实施方式之一，所述高分子材料源自于可降解的天然高分子聚合物。在一个具体的实施方式中，所述天然高分子聚合物包括明胶、海藻酸钠、透明质酸、丝素蛋白中一种或两种以上的组合。在一个具体的实施方式中，所述天然高分子聚合物选自海藻酸钠。
作为本发明实施方案之一，所述高分子材料为海藻酸钠溶液；可选的，所述高分子材料的含量为0.5％-6％(w/v)。在一种可选的实施方式中，所述高分子材料为海藻酸钠。在一种可选的实施方式中，所述海藻酸钠溶液的浓度为2％(w/v)。
海藻酸钠是从褐藻类的海带或马尾藻中提取碘和甘露醇之后的副产物，其分子由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic，G)按(1→4)键连接而成。海藻酸钠的水溶液具有较高的黏度，且无毒。海藻酸钠可以在极其温和的条件下快速形成凝胶，海藻酸钠与多价阳离子结合能力的顺序依次为Pb2+＞Cu2+＞Cd2+＞Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞Co2+＞Ni2+＞Zn2+＞Mn2+，当有Ca2+、Sr2+等阳离子存在时，G单元上的Na+与二价阳离子发生离子交换反应，G单元堆积形成交联网络结构，从而形成水凝胶。海藻酸钠形成水凝胶的条件温和，这可以避免敏感性药物、蛋白质、细胞和酶等活性物质的失活。
在本发明中，通过三维同轴挤出装置挤出高分子材料和细胞悬液，在溶液中形成包裹细胞的纤维丝。当高分子材料为海藻酸钠溶液时，所述溶液可以为任何能够使海藻酸钠形成凝胶的溶液，例如上述Pb2+、Cu2+、Cd2+、Ba2+、Sr2+、Ca2+等多价阳离子溶液，但考虑到离子的生物毒性和螯合能力，当选用海藻酸钠作为高分子材料时，所述溶液为Ca2+溶液。
作为本发明实施方案之一，所述纤维丝成形于介质中；所述介质为细胞培养液和/或能够促使高分子材料成形的溶液。在一个具体的实施方式中，所述介质中含有Ca2+溶液。在另一个具体的实施方式中，所述Ca2+溶液为CaCl2溶液。在一个具体的实施方式中，所述Ca2+溶液为CaCl2溶液。在一个具体的实施方式中，所述CaCl2溶液的浓度为0.5％-5％。在一个更具体的实施方式中，所述CaCl2溶液的浓度为3％。
在本发明中，对三维同轴挤出技术中，挤出所述纤维丝的外轴和内轴中的高分子材料和细胞悬液的挤出速度没有特别限定，能够在溶液中形成完整的包裹细胞的纤维丝即可。
作为本发明的实施方案之一，所述高分子材料溶液在外轴的挤出速度为10～15mL/h，所述细胞悬液在内轴的挤出速度为3～5mL/h。在一种可选的实施方式中，所述高分子材料溶液在外轴的挤出速度为15mL/h，所述细胞悬液在内轴的挤出速度为5mL/h。
作为本发明实施方式之一，所述T细胞观察步骤包括可调电阻式脉冲传感技术、扫描电镜中的一种或两种。
在本发明中，上述T细胞观察步骤，其中，电子显微镜检测包括但不限于扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)和透射电镜(Transmission ElectronMicroscope，TEM)。其中，SEM可获得T细胞表面微观形貌，TEM可获得T细胞内部结构和形貌。
作为本发明实施方式之一，所述T细胞观察步骤包括可调电阻式脉冲传感定量步骤、电镜扫描步骤中的一种或两种。
作为本发明实施方式之一，所述扫描电镜的步骤包括将打印的同轴细胞纤维模型在2.5％戊二醛中于4℃固定过夜。吸出固定剂后，将模型在丙酮/乙酸异戊酯(1：1)中浸泡10分钟。然后将模型置于乙酸异戊酯中30分钟。为了脱水，将样品在每种浓度下分别置于分级乙腈溶液(50％，70％，80％，90％，95％，100％)中放置30分钟。随后，将样品通过临界点干燥器(LEICA，EM CPD300)进行临界点干燥。将样品溅射涂有铂并通过ULTRA55扫描电子显微镜(德国蔡司)进行扫描。
在本发明的另一个实施方式中，本发明提供了一种利用前述方法制备得到的T细胞。
在本发明的另一个实施方式中，本发明提供了一种利用前述方法制备得到的T细胞的用途。作为本发明实施方式之一，本发明的T细胞可以用于制备过继性免疫治疗的试剂。
实施例
本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本发明的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
除非有特别说明，否则本发明中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
在本发明中，具体使用的材料和仪器厂家及型号或来源如下：
CD3/CD28刺激磁珠厂家：Gibco，货号：11161D
CD3免疫磁珠厂家：Miltenyi，货号：130111551
CD3抗体厂家：Thermo Fisher Scientific，货号：160037
CD28抗体厂家：Thermo Fisher Scientific，货号：160289
CFSE厂家：Thermo Fisher Scientific货号：65085084
Ficoll分离液厂家：索莱宝，货号：P4350
rIL-2厂家：BioLegend，货号：589104
Annexin-V/PI试剂盒厂家：BD，货号：556570
EDTA厂家：sigma，货号：798681
柠檬酸厂家：sigma，货号：791725
健康人血由广东省血液中心提供
3D同轴打印装置厂家：淘宝商城型号：21G+15G
X-VIVO 15培养基购自于Lonza
培养细胞培养基组成：X-VIVO 15培养基+10～50ng/ml CD3抗体和10～50ng/mlCD28抗体+30U/ml rIL-2
实施例1：三维同轴打印获得T细胞
实验方法：
抽取健康人血20mL，加入肝素抗凝管中，加入20mLPBS稀释，缓慢加入10mL的Ficoll分离液，使用离心机2000r/min离心20分钟；吸取离心后的乳白色层，即PBMC，后加入适量PBS洗涤，最后加入适量的PBS计数。
接下来，使用适量的MACS缓冲液洗涤PBMC，并继续使用MACS缓冲液重悬，加入CD3免疫磁珠(20μL/107PBMC)混匀，4℃孵育15min；使用MACS缓冲液再次洗涤细胞，重悬之后加入洗涤过的MS分离柱，流出的细胞即为CD3-T细胞，MACS缓冲液洗涤分离株3次，最后加入1mL洗脱细胞，洗脱液即为CD3+T细胞，计数后使用X-VIVO 15培养基重悬。
接下来，使用加入30ng/ml CD3和CD28抗体的X-VIVO15培养基培养提取出的CD3+T细胞，培养基中另需加入30U/ml的rIL-2，培养3天后，在显微镜下可明显看到增殖成团的T细胞，表明T细胞已被激活；此时离心收集T细胞，进行CFSE标记染色，准备进行下一步的同轴打印或悬浮培养。
在同轴打印前，配制质量体积比为2％的海藻酸钠溶液，高温高压灭菌，作为同轴打印纤维的外壳。
接下来，如图1所示，将收集到的T细胞以1×107/ml的密度重悬，并加入与T细胞数目相同的CD3/CD28免疫刺激磁珠，作为同轴打印的内芯。同轴打印装置(购自淘宝)由可拆卸的鞘芯和喷头组成，打印喷头外层直径为21G，内层为15G。打印时将配制好的壳液和芯液分别装入10ml注射器内，置于微量注射泵上，并分别连接好外接延长管接到同轴打印进口处，设定外壳液体流出速度为15ml/h，内芯液体流出速度为5ml/h，控制外壳-内芯体积比为3：1。在打印喷头的下方放置一培养皿，培养皿中加入适量质量体积比为3％的CaCl2溶液进行交联。打印完成后，将得到的同轴壳-海藻酸钠/芯-T细胞和CD3/CD28免疫刺激磁珠水凝胶纤维在37℃，5％CO2培养箱中培养，每三天换一次液，所述T细胞的培养密度为106/ml。
将得到的同轴打印的同轴壳-海藻酸钠/芯-T细胞和CD3/CD28免疫刺激磁珠水凝胶纤维，通过扫描电镜(SEM)进行观察。
实验结果：
如图2所示，表明成功获得通过三维同轴打印方式获得的T细胞。
实施例2：悬浮培养方式获得T细胞
在打印之前的处理方式均与实施例1中的处理方式相同。将T细胞以1×106/ml的密度接种在T25的培养瓶中，每三天换一次液。
实施例3：三维同轴打印获得的T细胞和悬浮培养获得的T细胞的增殖能力比较
实验方法：
为评价同轴生物打印的载T细胞的水凝胶纤维中T细胞的增殖能力，我们采用流式细胞仪(Beckman，CytoFlex flow cytometer)分析T细胞中CFSE的荧光强度(荧光强度减半，细胞分裂一次)，也就代表了T细胞的分裂代数。我们在打印之后的第3、7、10天分别应用柠檬酸-EDTA溶液溶掉同轴纤维的海藻酸钠外壳，收集定量细胞上机进行CFSE荧光强度的检测。
实验结果：
实验结果如图3和图4所示。
如图3所示，通过观察三维同轴打印T细胞第3天(左)和第7天(右)显微镜照片，发现T细胞明显增殖并充满了整个同轴空间。
如图4所示，同轴纤维中的T细胞CFSE衰减程度最大，将结果用ModFit LT 5.0软件进行定量分析，表明T细胞在两组中前7天差异不大，在同轴纤维中的第10天增殖效率远高于普通悬浮培养。
实施例4：三维同轴打印获得的T细胞和悬浮培养获得的T细胞的存活能力比较
实验方法：
为评价同轴生物打印的载T细胞的纤维中T细胞的存活能力，我们不再添加磁珠，而是直接在培养基中加入CD3和CD28抗体各30ng/ml，在打印之后第10天溶解海藻酸钠外壳，进行了Annexin-V/PI染色。由于早期凋亡细胞的细胞膜外翻，标记了FITC的Annexin-V可与外翻细胞膜中的磷脂酰丝氨酸结合而检测到细胞的早期凋亡；PI可以透过凋亡中晚期和坏死细胞的细胞膜，进而与细胞核结合呈现红色，检测到晚期凋亡和坏死细胞。上机进行流式检测。
实验结果：
实验结果如图5所示。结果表明，在同轴纤维(61.03％)中的T细胞存活率相较于普通悬浮培养(51.40％)，明显更高。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种获取T细胞的方法，包括如下步骤：
获取细胞纤维丝，所述细胞纤维丝包含内芯和包裹所述内芯的纤维外层；
其中，所述内芯源自于含有T细胞的细胞悬液；
所述纤维外层源自于溶解有高分子材料的溶液，并且具有孔结构；
对所述细胞纤维丝进行培养，获取含有纤维外层的所述T细胞。
2.根据权利要求1所述方法，其中，所述方法进一步包括如下步骤：
纤维外层溶解步骤：将所述纤维外层进行溶解，获取不含有纤维外层的所述T细胞；
可选的，所述纤维外层溶解步骤中使用的溶解液为柠檬酸-EDTA溶液。
3.根据权利要求1-2任一项所述方法，其中，所述含有T细胞的细胞悬液中的T细胞是激活的T细胞；可选的，所述激活的T细胞选自以下(i)-(ii)中的至少一种：
(i)所述T细胞通过抗CD3和CD28的抗体刺激被激活；
(ii)所述T细胞通过与包被抗-CD3/CD28的磁珠孵育被激活。
4.根据权利要求1-3任一项所述方法，其中，所述高分子材料包括可降解的天然高分子聚合物或者合成高分子聚合物；可选的，所述材料包括选自聚丙烯腈、聚乙二醇、聚己内酯、聚乳酸、聚酰亚胺、聚乙烯醇、明胶、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、丝素蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、普朗尼克酸中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述方法，其中，利用三维同轴打印设备制备所述内芯和包裹所述内芯的纤维外层。
6.根据权利要求5所述方法，其中，所述纤维外层通过高分子材料溶液制备得到，其中，所述高分子材料溶液的浓度为0.5％-6％(w/v)。
7.根据权利要求1-6任一项所述方法，其中，所述细胞纤维丝成形于介质中，所述介质含有能够促使所述高分子材料发生交联的溶液。
8.根据权利要求5所述方法，其中，所述三维同轴打印设备包括内轴和外轴，所述高分子材料溶液在外轴的挤出速度为10～15mL/h，所述细胞悬液在内轴的挤出速度为3～5mL/h。
9.根据权利要求1-8任一项所述方法制备得到的T细胞。
10.根据权利要求1-8任一项所述方法制备得到的T细胞或根据权利要求9所述的T细胞在制备用于过继性免疫治疗的试剂中的应用。
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