CN100393368C

CN100393368C - 一种细胞培养和脱附用的智能膜及其制备方法

Info

Publication number: CN100393368C
Application number: CNB2006100153267A
Authority: CN
Inventors: 陈莉; 李世赓
Original assignee: Tianjin Polytechnic University
Current assignee: Tianjin Polytechnic University
Priority date: 2006-08-15
Filing date: 2006-08-15
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2026-08-15
Also published as: CN1911455A

Abstract

本发明涉及一种细胞培养和脱附用的智能膜及其制备方法。该智能膜为聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)共聚膜，质量百分比组分为：壳聚糖大单体与N-异丙基丙烯酰胺的比例为1∶1-5。其制备方法包括改性壳聚糖大单体制备和智能膜的制备两个步骤，是选用壳聚糖(CS)作为基本的生物材料，采用丙烯酸与其反应来制备CS-AAc大单体，再通过NIPA与大单体的共聚来制备所述的智能膜。本发明的智能膜与现有在细胞培养板上接枝PNIPA产品相比，克服了酶解法对细胞功能的损伤，更利于细胞在其表面的黏附、铺展和增殖，且可加快细胞自动脱附速率。

Description

一种细胞培养和脱附用的智能膜及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医用膜技术，具体为一种细胞培养和脱附用的特别是对温度敏感的智能膜及其制备方法，属于生物医用高分子材料领域，国际专利分类号拟为Int.Cl.A61L 27/00(2006.01)

背景技术

随着细胞生物学、分子生物学、材料科学、临床医学及生物工程等多学科的发展，出现了组织工程这一跨学科的新领域。组织工程领域以各种方法应用活细胞与生物材料和生长因子相结合来研制取代物，以修复、保持或维持生物组织和器官的功能。工程化组织常将种子细胞(培养细胞或干细胞)种植在能够提供力学和化学信号的生物活性降解支架上，以引导细胞分化与组装成三维组织。

材料科学的发展是组织工程的必要条件，也是组织工程学研究的一个重点内容。组织工程的发展对相关生物材料提出了新的挑战，期望生物材料能在分子水平激发特异的细胞响应，亦即构筑细胞或基因活化的第三代生物材料。

壳聚糖是生物相容性聚合物。这与其糖胺基团能与整连蛋白或受体相互作用有关。它植入生物体时，不会引起炎症或过敏反应，与角质形成细胞和成纤细胞相容性良好，且角质形成细胞增殖随脱乙酰浓度(DD)增大而改善，适宜的DD有利于成纤细胞粘连。壳聚糖也是生物活性聚合物。它具有抗血栓性，能刺激宿主抵御病毒和细菌感染的免疫系统。壳聚糖的毒性很低。壳聚糖对实验小鼠的半数致死量LD₅₀为16g/kg体重。此数值接近于盐和糖，对生物体无害。因此，壳聚糖可以促进创伤愈合以及软、硬组织的重建。另外，壳聚糖的高电荷密度使它能与许多水溶性聚阴离子糖胺聚糖(GAGs)如透明质酸、肝素和硫酸软骨素等形成聚电解质配合物而具有多重生物活性：如调控内皮细胞和平滑肌细胞在体外和体内的粘连、铺展和增殖。

壳聚糖和明胶溶液共混可形成聚电解质配合网络。以网络中的水为致孔剂，经冷冻干燥，可制备多孔海绵用于做组织工程支架。该类多孔海绵的平均孔径为30-100μm，孔隙率大于90％；其平均孔径可由冷冻温度调控，孔隙率可由溶液浓度调控。多孔海绵经戊二醛交联后，在1Hz下的动态压缩模量随壳聚糖含量增加而增加。该类多孔海绵组织工程支架适用于软骨细胞、角质形成细胞和成纤维细胞等的培养。

聚异丙基丙烯酰胺(PNIPA)是最典型的温敏高分子材料。它化学结构中具有亲水部分和疏水部分，两者之间适当的平衡使它具有适度的溶解度。PNIPA存在一个较低临界溶解温度(LCST)，在LCST以下，PNIPA呈亲水性，高分子链与水发生水合而溶于水；在LCST以上，则呈疏水性，高分子链脱水化，在水溶液中沉析。PNIPA的这一特点使其在生物医学方面具有广阔的开发应用前景。国内有关PNIPA的研究很多，但大多集中在药物释放、酶的固定化以及生物分离等方面，例如，张先正等使用丙烯酰胺(AAM)与NIPA共聚合成了具有快速温度敏感的水凝胶，并对其在开关阀和人工肌肉等方面的应用进行了展望(张先正，卓仁禧。快速温度敏感(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺)水凝胶的制备及性能研究，高等学校化学学报，2000，21：1309-1311)；琚正川等人用NIPA与DADMAC制备LCST＝31℃的P(NIPA-DADMAC)微凝胶，以这种微凝胶作为载体，在生物活体之外进行氟派酸分子的药物释放研究(琚正川，陈洁，肖智成.P(NIPAM-DADMAC)微凝胶的合成、表征及药物释放.同济大学学报，2003，31(10)：1256-1261)等等。而将PNIPA用于组织工程材料方面的研究就发明人所知目前尚未见有报道。

组织工程与干细胞生物技术的迅速发展与结合正在孕育着再生医学(regenerative medicine)。其发展有赖于建立组织重建的新技术平台。通常培养扩增细胞以蛋白酶如胰蛋白酶和分散酶采集。这些酶使细胞黏附分子如沉积细胞外基质(ECM)的降解，使培养细胞脱附，此时常损及细胞-细胞连接蛋白和细胞膜上表达的受体蛋白。为解决这一问题，科技工作者进行了广泛的研究。例如，日本的冈野光夫等研究者根据PNIPA的温度响应性在构筑三维组织方面提出了新方法(参见冈野光夫等，热响应高分子接枝表面细胞图案化与共培养，生物材料，2002；23：561-566，Yamato M，Konno C，UtsumiM，Kikuchi A，Okano T.Thermally responsive polymer-grafted surfacesfacilitate patterned cell seeding and co-culture.Biomaterials，2002；23：561-566)。他们将温敏性聚异丙基丙烯酰胺(PNIPA)接枝于组织培养用TCPS表面，形成约20nm的接枝聚合物层，利用温度改变调控细胞黏附/脱附，37℃时表面相对疏水，类似于商品化组织培养板；但在32℃下则呈现亲水性，因而在37℃时，适于各种细胞黏附/铺展和增殖；降温至32℃时，细胞会自动地从依附表面脱附，而无需使用蛋白酶，对酶敏感细胞如肝细胞和胶质细胞保持其分化的细胞功能。因此，利用此温度响应培养板，可用于回收溶合细胞片层，而不影响细胞-细胞连接和沉积。该二维细胞片层可在体外转移至其他培养板，或在体内转移至组织表面。但该项技术的缺陷是细胞脱附速率较低，且单独使用PNIPA时，其生物相容性不高。

对于已培养成的细胞片层，迅速脱附是保证构建三维组织功能的基础。目前的研究表明，细胞片层从PNIPA接枝TCPS自动脱附的过程较缓慢(细胞脱附速率较低)，大大制约了三维组织的构建。另外，PNIPA在生物相容性方面所表现的不足也限制了它的应用领域。细胞脱附速率主要取决于接枝在TCPS表面的PNIPA分子的水合过程。为加速疏水型PNIPA链段的水合速率，可将高亲水性基质引入到细胞和热响应性聚合物界面。

从以上分析可以看出，壳聚糖虽是很好的组织工程材料，但它不具有智能性，不能作为使细胞自动脱附的细胞培养基材；PNIPA虽显智能性，但在亲水性和生物相容性方面显示不足。优秀的智能性细胞培养基材，一方面应具有良好的生物相容性和细胞亲和性，以更好的调控细胞在其表面的黏附、铺展和增殖；另一方面要求其具有某方面(如温度)的智能性，以使细胞自动脱附；同时还要有较高的亲水性，以利于细胞自动脱附，并提高细胞脱附速率。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种细胞培养和脱附用的智能膜及其制备方法。该智能膜具有良好的温度敏感性、生物相容性、亲水性和细胞亲和性，用于细胞培养和脱附时，细胞脱附速率高，使用简单方便，并可避免传统的酶解法分离细胞造成的细胞功能损伤等特点。该智能膜制备方法具有工艺简单，对设备没有特殊要求，工业化实施容易，制备成本低廉，容易推广使用等优点。

本发明解决所述智能膜技术问题的技术方案是，设计一种细胞培养和脱附用的智能膜，该智能膜为聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)共聚膜，其质量百分比组分为：壳聚糖大单体与N-异丙基丙烯酰胺的比例为1∶1-5。

本发明解决所述智能膜制备方法技术问题的技术方案是，设计一种细胞培养和脱附用的智能膜制备方法，包括如下步骤：

1.改性壳聚糖大单体制备：将壳聚糖溶于浓度为1-3％的稀盐酸溶液中，按照壳聚糖中氨基摩尔数添加过量2-4倍的丙烯酸，在与氨基同摩尔数的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和0.5-1.5％N，N，N`，N`-四甲基乙二胺作用下，室温磁力搅拌30-40小时；用浓度为1-3％的氢氧化钠中和反应溶液中所剩盐酸和丙烯酸，析出壳聚糖大单体，水洗其至pH＝7，再用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥6-8小时，得到壳聚糖大单体；

2.智能膜的制备：将所得壳聚糖大单体与N-异丙基丙烯酰胺按1∶1-5的比例溶于1-3％的盐酸溶液中，再加入用量为0.02-0.10g的引发剂过硫酸铵或过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气10-20分钟，然后迅速加入用量为0.05-0.15ml的促进剂N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，密封，室温反应8-20小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥1-3天制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜1-3天，即可得所述细胞培养和脱附用的智能膜。

与现有技术相比，本发明的一种细胞培养和脱附用的智能膜，既具有温度敏感性，又具有良好的生物相容性、细胞亲和性以及亲水性等优点。使用传统的细胞培养板培养细胞后，需要使用蛋白酶使细胞脱附，此时常会损及细胞-细胞连接蛋白和细胞膜上表达的受体蛋白，而使用本发明的聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)智能膜培养细胞，可利用温度改变或调控细胞的黏附/脱附，37℃时表面相对疏水，类似于商品化组织培养板；但在其LCST以下则呈现亲水性，因而在37℃适于各种细胞黏附/铺展和增殖，降温后，细胞自动地从表面脱附，而无需使用蛋白酶，因此，工艺简化，资源节约，效率提高。由于引入了天然高分子的壳聚糖衍生物(CS)，所以具有现有技术没有的良好的生物相容性和亲水性，且CS的引入使本发明所述的智能膜具有-CONH键，利于细胞帖附，因此与现有在细胞培养板上接枝PNIPA产品相比，本发明智能膜更利于细胞在其表面的黏附、铺展和增殖，且可加快细胞自动脱附速率。本发明所述的智能膜制备方法与现有技术相比，方法简单，对设备无特殊要求，容易工业化实施，对环境没有污染，制备成本低廉，便于推广使用。

具体实施方式

下面结合实施例进一步叙述本发明：

本发明所述的细胞培养和脱附用的智能膜(简称智能膜)，是一种由N-异丙基丙烯酰胺和壳聚糖共聚制成的共聚膜，也可称为聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)共聚膜，其质量百分比的组分为：壳聚糖大单体与N-异丙基丙烯酰胺的比例为1∶1-5。该共聚膜可用于细胞培养和脱附，具有较高的细胞自动脱附速率，并且具有较好的温度敏感性，因此也可称为温度智能膜或智能膜。

本发明智能膜的设计原理是，利用CS的-NH₂与AAc的-COOH发生缩和反应，可在分子链上生成具有一定反应活性的C＝C双键，再与NIPA发生共聚反应，制备所述的智能膜。由于生物材料CS具有生物相容性，因此本发明产品不仅可改善CS的温度敏感性，同时共聚后的聚合物同时拥有温度敏感性和生物相容性，是一种新型的智能膜。由于本发明温度敏感的聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)智能生物膜是使CS-AAc与NIPA之间通过化学键相结合的方法制备出来的，从而使CS具有-CONH键，利于细胞黏附，同时，CS的引入增加了NIPA的亲水性和生物相容性，因此与现有在细胞培养板上接枝PNIPA产品相比，本发明产品更利于细胞在其表面的黏附、铺展和增殖，且可提高细胞的自动脱附速率。

本发明同时设计了所述智能膜的制备方法，包括如下步骤：

1.改性壳聚糖大单体制备：将壳聚糖溶于浓度为1-3％的稀盐酸溶液中，按照壳聚糖中氨基摩尔数添加过量2-4倍的丙烯酸，在与氨基同摩尔数的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)和0.5-1.5％N，N，N`，N`-四甲基乙二胺(TEMED)作用下，室温磁力搅拌30-40小时；用浓度为1-3％的氢氧化钠中和反应溶液中所剩盐酸和丙烯酸，析出壳聚糖大单体，水洗其至pH＝7，再用无水乙醇洗涤2-3次，以去除单体中残留的丙烯酸自聚体及壳聚糖中未溶解的高聚物杂质，真空干燥6-8小时，得到壳聚糖大单体；

2.智能膜的制备：将所得壳聚糖大单体与N-异丙基丙烯酰胺按1∶1-5的比例溶于1-3％的盐酸溶液中，再加入用量为0.02-0.10g的引发剂过硫酸铵或过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气10-20分钟，然后迅速加入用量为0.05-0.15ml的促进剂N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，密封，室温反应8-20小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥1-3天制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜1-3天，以去除未反应的催化剂和引发剂及其它小分子，即可得聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)共聚膜，也即所述的细胞培养和脱附用的智能膜。

简单说，本发明的智能膜制备方法是选用壳聚糖(CS)作为基本的生物材料，采用丙烯酸与其反应来制备CS-AAc大单体，再通过NIPA与大单体的共聚来制备所述的智能膜。

本发明未述及的适用于现有技术。

下面以具体实施例详细介绍本发明，但本发明不受具体实施例的限制：

实施例1：

将1g壳聚糖溶于100ml 1％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入0.5g1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)和0.10ml的N，N，N`，N`-四甲基乙二胺(TEMED)，搅拌均匀后，滴加丙烯酸(AAc)15ml，磁力搅拌下室温反应36小时；用1％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍，使其呈中性pH＝7，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥6小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g所得壳聚糖大单体与0.3g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 1％的盐酸溶液中，再加入0.02g过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气10分钟，然后迅速加入0.15ml的TEMED，密封，室温反应10小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜3天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)智能膜。

实施例2：

将1g壳聚糖溶于100ml 2％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入0.5gEDC和0.15mlTEMED，搅拌均匀后，滴加AAc15ml，磁力搅拌下室温反应38小时；用1％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥6小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与0.3g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 2％的盐酸溶液中，再加入0.05g过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气15分钟，然后迅速加入0.10mlTEMED，密封，室温反应15小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜一天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例3：

将1g壳聚糖溶于100ml 1％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入0.8gEDC和0.10mlTEMED，搅拌均匀后，滴加AAc20ml，磁力搅拌下室温反应30小时；用1％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥7小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与0.3g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 1％的盐酸溶液中，再加入0.08g过硫酸铵，将所得混合溶液充N₂气20分钟，然后迅速加入0.05mlTEMED，密封，室温反应20小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥1天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜2天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例4：

将1g壳聚糖溶于100ml 1％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入1.0gEDC和0.15ml TEMED，搅拌均匀后，滴加AAc25ml，磁力搅拌下室温反应35小时；用1％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥8小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与0.6g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 3％的盐酸溶液中，再加入0.02g过硫酸铵，将所得混合溶液充N₂气10分钟，然后迅速加入0.15ml的TEMED，密封，室温反应15小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜2天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例5：

将1g壳聚糖溶于100ml 2％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入1.2gEDC和0.10ml TEMED，搅拌均匀后，滴加AAc30ml，磁力搅拌下室温反应30小时；用1％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥8小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与0.6g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 2％的盐酸溶液中，再加入0.04g过硫酸铵，将所得混合溶液充N₂气20分钟，然后迅速加入0.15ml的TEMED，密封，室温反应15小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜3天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例6：

将1g壳聚糖溶于100ml 1％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入1.2gEDC和0.05ml的TEMED，搅拌均匀后，滴加AAc30ml，磁力搅拌下室温反应35小时；用2％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥7小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与0.9g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 1％的盐酸溶液中，再加入0.02g过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气15分钟，然后迅速加入0.15mlTEMED，密封，室温反应20小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜3天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例7：

将1g壳聚糖溶于100ml 3％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入0.8gEDC和0.12ml的TEMED，搅拌均匀后，滴加AAc20ml，磁力搅拌下室温反应40小时；用1％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥8小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与0.9g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 1％的盐酸溶液中，再加入0.10g过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气10分钟，然后迅速加入0.15ml的TEMED，密封，室温反应20小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜2天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例8：

将1g壳聚糖溶于100ml 1％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入0.5gEDC和0.10ml的TEMED，搅拌均匀后，滴加AAc15ml，磁力搅拌下室温反应40小时；用1％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥8小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与1.2g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 3％的盐酸溶液中，再加入0.06g过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气20分钟，然后迅速加入0.05ml的TEMED，密封，室温反应20小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥3天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜2天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例9：

将1g壳聚糖溶于100ml 2％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入1.0gEDC和0.15ml的TEMED，搅拌均匀后，滴加AAc25ml，磁力搅拌下室温反应35小时；用3％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥8小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与1.2g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 1％的盐酸溶液中，再加入0.05g过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气10分钟，然后迅速加入0.10ml的TEMED，密封，室温反应15小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜1天，以去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

实施例10：

将1g壳聚糖溶于100ml 1％的盐酸溶液中，待壳聚糖全部溶解后，加入1.2gEDC和0.10ml的TEMED，搅拌均匀后，滴加AAc30ml，磁力搅拌下室温反应30小时；用2％氢氧化钠中和反应溶液中的盐酸和丙烯酸，析出的产物水洗3遍使呈中性，再用无水乙醇洗2遍，真空干燥8小时，得到壳聚糖大单体；

将0.3g壳聚糖大单体与1.5g N-异丙基丙烯酰胺溶于30ml 1％的盐酸溶液中，再加入0.02g过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气20分钟，然后迅速加入0.10ml的TEMED，密封，室温反应15小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥2天，制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜3天，去除未反应催化剂和引发剂及其它小分子，即得到所述智能膜。

Claims

1.一种细胞培养和脱附用的智能膜，该智能膜为聚(壳聚糖-N-异丙基丙烯酰胺)共聚膜，其质量百分比组分为：壳聚糖大单体与N-异丙基丙烯酰胺的比例为1∶1-5。

2.一种细胞培养和脱附用的智能膜的制备方法，包括如下步骤：

(1).改性壳聚糖大单体制备：将壳聚糖溶于浓度为1-3％的稀盐酸溶液中，按照壳聚糖中氨基摩尔数添加过量2-4倍的丙烯酸，在与氨基同摩尔数的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺和0.5-1.5％N，N，N`，N`-四甲基乙二胺作用下，室温磁力搅拌30-40小时；用浓度为1-3％的氢氧化钠中和反应溶液中所剩盐酸和丙烯酸，析出壳聚糖大单体，水洗其至pH＝7，再用无水乙醇洗涤2-3次，真空干燥6-8小时，得到壳聚糖大单体；

(2).智能膜的制备：将所得壳聚糖大单体与N-异丙基丙烯酰胺按1∶1-5的比例溶于1-3％的盐酸溶液中，再加入用量为0.02-0.10g的引发剂过硫酸铵或过硫酸钾，将所得混合溶液充N₂气10-20分钟，然后迅速加入用量为0.05-0.15ml的促进剂N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，密封，室温反应8-20小时后，将溶液倒入细胞培养板中，室温自然干燥1-3天制备膜，最后用去离子水浸泡所得膜1-3天，即可得所述细胞培养和脱附用的智能膜。