CN110628699B - 一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，包括将鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基分别按不同体积比混合，置于第一多孔板中；将鼠尾I型胶原、DMEM基础培养液及CM‑LV‑LOXL2‑OE按1：10：5体积比混合，置于第二多孔板中；将第一多孔板和第二多孔板放入37℃温箱静置；将成胶后的基底置于4℃冰箱中10～14h，形成不同基底硬度体外细胞培养平台。本发明能够较好地模拟体内<1KPa低硬度脏器组织硬度变化，为寻找实体肿瘤发生肺转移的共性分子特征，探讨转移靶器官重塑改造成“适宜土壤”的相关病理机制提供一种新型体外研究平台。

Description

一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种细胞培养技术，具体涉及一种模拟体内肺组织硬度的体外细胞培养平台的制备方法及其在研究肿瘤肺转移过程中预转移龛形成机制中的应用。
背景技术
大量临床数据显示，许多实体肿瘤包括肝癌、食管癌、乳腺癌等均易发生肺转移。寻找实体肿瘤发生肺转移的共性分子特征，以及探讨转移靶器官在肿瘤定植转移前重塑改造成“适宜土壤”的相关病理机制逐渐成为当前肿瘤转移研究的新增长点，故能否建立起可反映肺组织硬度特征的理想体外研究平台无疑对上述研究方向的推动将是显著的。
在对肿瘤转移认识的历史进程中，曾出现过三个经典的肿瘤转移学说，包括Paget的“种子土壤学说”，Ewing的“解剖机制学说”，以及Bross和Blumenson的“转移瀑布学说”。上述三个学说分别从转移非随机性，转移途径，转移的多因素、多阶段三个不同角度对实体肿瘤转移进行解释，极大地促进人类对转移机制的认识及转移研究的深入。但鉴于经典理论缺乏将原发瘤和靶器官转移灶联系起来的“桥梁”，始终无法回答原发瘤如何选择转移靶器官，影响转移灶形成。2005年预转移龛学说(Premetastatic niche)的提出，将三种经典转移学说进行了较好的汇集与融合，使原发瘤与转移靶器官有机地联系了起来，显示出较强的理论创新与生命力，逐渐成为当前肿瘤转移研究的新方向。该学说认为，原发瘤细胞分泌的部分可溶性因子TDSF或外泌体囊泡(exosome)作为“信使”，经体循环到达转移靶器官，在靶器官募集骨髓来源的骨髓衍生细胞BMDCs，被募集的BMDCs细胞与TDSF、组织固有间质细胞在靶器官组织相互作用，使靶器官组织“土壤环境”重塑改造，形成有利于血液循环肿瘤细胞粘附与定植的预转移龛，加速转移在靶器官的最终实现。目前，“预转移龛”已在一些肿瘤动物模型如乳腺癌、结肠癌，胰腺癌，黑色素瘤等中获得证实。我们课题组前期也发现基质硬度可激活integrinβ1/α5/JNK/c-JUN信号通路上调肝癌细胞LOXL2表达分泌，加速肝癌肺预转移龛形成，为从肺预转移龛形成阐明肝癌转移机制提供了新视角(J Exp ClinCancer Res.2018；37(1):99.IF 6.217)。
研究已经证实，肿瘤微环境的细胞组分(成纤维细胞、肝星状细胞、血管内皮细胞、浸润的免疫细胞、巨噬细胞、MSCs，DC等)与非细胞组分(生长因子、趋化因子、基质蛋白、exosome等)均参与肿瘤侵袭转移的调控。除此之外，肿瘤周边的物化因素包括缺氧、温度、硬度、酸碱等参与肿瘤侵袭转移的研究近年也逐渐增多。胞外基质硬度是细胞微环境的一个重要物理参数，其变化可改变锚着细胞所处的机械力学环境，使细胞形态特征、粘着斑装配、细胞骨架状态有很大变化，这些变化可显著影响参与体内多种病理生理过程如组织发育、纤维化、肿瘤转移等。作为实体肿瘤的显著物理特征，基质硬度与肿瘤发生发展密切关联已获得临床大量数据的支撑，但其如何调控肿瘤发生进展的相关分子机制研究目前却依然处于起步阶段，缺乏理想体外硬度相关实验平台是制约硬度相关研究开展的最主要障碍。
人体不同脏器组织硬度的差异较大，硬度跨度从<100Pa到>100KPa，最高硬度组织与最低组织硬度几乎相差106。目前为止，尚未见能跨越人体组织全部硬度范围的体外细胞培养平台的报道。前期我们课题组曾发明了不同基底硬度体外细胞培养平台(国家发明专利，ZL201410025039.9，授权)，该发明将聚丙烯酰胺凝胶硬度的可调性与基质蛋白包被巧妙地进行结合，制成既有生物界面又有硬度变化的不同基底硬度的体外细胞培养平台，可较好地模拟正常肝组织至肝硬化硬度变化状态，是一种新型硬度关联体外细胞培养平台。该发明同时也获得第31届上海市优秀发明选拔赛银奖。利用该硬度研究平台，我们发现LOXL2在基质硬度增加诱导肝癌肺预转移龛形成中的重要作用(J Exp Clin CancerRes.2018；37(1):99)。上述基底硬度细胞培养平台可较好地模拟和再现>1KPa实体脏器组织硬度变化(包括肝脏，心脏，软骨，骨组织等)，
然而，对于<1KPa的低硬度脏器组织(如肺、乳腺等)的硬度模拟，由于低浓度聚丙烯酰胺凝胶的交联筛孔大且稀疏，吸水膨胀会影响基底胶硬度，故该体系在模拟<1KPa低硬度脏器组织上有一定的局限，主要原因与低浓度聚丙烯酰胺凝胶的交联筛孔大且稀疏，吸水膨胀会导致硬度的不稳定有关，该体系在模拟<1KPa低硬度脏器组织上有一定的局限。而临床上低硬度组织肺是许多实体瘤常见转移靶器官，许多实体肿瘤如乳腺癌、胶质瘤、肺癌等也常发生于低硬度脏器组织，因此，构建能够模拟低硬度脏器组织硬度(<1KPa)的基底细胞培养平台对解析转移机制显得至关重要，特别在预转移龛学说提出，转移靶器官肺组织重塑改造导致的硬度“土壤”改变研究成为热点的当下。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，所述的这种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法要解决现有技术中的体外细胞培养平台在模拟<1KPa低硬度脏器组织上不理想的技术问题。
本发明提供了一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，包括如下步骤：
1)将鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基分别按不同体积比混合，置于第一多孔板中；
2)将鼠尾I型胶原、DMEM基础培养液及CM-LV-LOXL2-OE(LOXL2过表达肝癌细胞无血清培养上清)按1：10：5体积比混合，置于第二多孔板中；
3)将步骤1)和2)的上述第一多孔板和第二多孔板放入37℃温箱静置1～2小时；
4)将步骤3)成胶后的基底置于4℃冰箱中10～14h，形成不同基底硬度体外细胞培养平台。
进一步的，步骤1)中，所述的鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基分别按1：1，1：2，1：3，1：4，1：15或者1：20系列体积比混合(在系列体积中，所述的鼠尾I型胶原的终浓度范围在170-1790ug/mL之间)，置于第一多孔板中。
具体的，步骤1)中，混合前，所述的鼠尾I型胶原的浓度为3.58mg/mL。
进一步的，步骤2)中，所述的鼠尾I型胶原的终浓度为223.75ug/mL；所述的CM-LV-LOXL2-OE的终浓度为96.875ng/mL。
具体的，可以采用物性测试仪(TA.XTPLUSC，英国SMS质构仪)对每孔所成凝胶硬度进行检测，检测所设参数为：Pre-Test Speed:1.00mm/sec；Test Speed:0.50mm/sec；Target Mode:Strain；Strain:90％；Trigger Force:1.0/2.0g。
具体的，可以依据低硬度脏器组织的临床数据，在上述不同基底硬度细胞培养平台中，选取与低硬度脏器组织(肺)于正常及病理状态下硬度值接近的硬度基底平台，模拟低硬度脏器组织(肺)的硬度环境。
进一步的，所述的CM-LV-LOXL2-OE的制备方法如下：
采用慢病毒介导过表达技术形成慢病毒包装LOXL2过表达质粒(LV-LOXL2-OE)，感染肝癌细胞MHCC97H，先以含3ug/mL嘌呤霉素、体积百分比浓度为10％的FBS和体积百分比浓度为1％的青链霉素的DMEM培养液进行感染细胞阳性筛选，至细胞无明显死亡，再用含体积百分比浓度为10％FBS和体积百分比浓度为1％青链霉素的DMEM换液培养，细胞生长至85～95％密度，收集细胞确定LOXL2过表达程度，随后将85～95％密度LOXL2过表达肝癌细胞以DMEM无血清培养液培养24小时，收取培养上清，获得CM-LV-LOXL2-OE，离心后分装冻存。
具体的，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，为市售产品，在此不再赘述。
鼠尾I型胶原(CollagenⅠ，3.58mg/mL，Corning)是一种天然培养基，它能促进体外培养细胞(特别是上皮细胞)贴壁，同时也是一种天然黏附剂。将其与细胞基础培养DMEM按一定比例混合，可凝固形成薄层厚度凝胶作为生物基底，且其硬度随二者比例(或I型胶原的浓度)不同而改变，同时利用LOXL2具有促I型胶原交联成束特征以及LOXL2在肺预转移龛形成的诱导作用，加入LOXL2(CM-LV-LOXL2-OE，过表达LOXL2肝癌细胞无血清培养上清)可明显增加凝胶硬度，形成接近肺预转移龛形成时肺组织硬度。本发明的方法所形成基底凝胶培养平台亲水性强、透气性和生物兼容性良好及弹性硬度可调，能模拟体内<1KPa低脏器组织硬度变化，为研究低脏器组织硬度影响细胞生物学行为，提供了较好的硬度基底细胞培养平台。
本发明既巧妙解决硬度基底可调以模拟组织硬度变化问题，又满足细胞生长良好生物基质界面需求，能够较好地模拟体内<1KPa低硬度脏器组织(肺)硬度变化，为寻找实体肿瘤发生肺转移的共性分子特征，探讨转移靶器官重塑改造成“适宜土壤”的相关病理机制提供一种新型体外研究平台。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的优点如下：
1)提供了一种新型的细胞培养平台，与传统细胞培养容器相比，本发明利用LOXL2在肝癌肺预转移龛形成及其交联基质蛋白的独特作用，结合I型胶原易黏附成胶、促细胞贴壁性质，将LOXL2、Ι型胶原和DMEM基础培养基以不同比例混合凝固形成薄层厚度凝胶，获得<1KPa系列硬度基底的细胞培养平台，可较好模拟<1KPa低硬度脏器组织硬度改变，解决低硬度脏器组织硬度研究缺少理想细胞培养平台问题，为研究低组织硬度影响细胞生物学行为，寻找实体肿瘤发生肺转移的共性分子特征，探讨转移靶器官重塑改造成“适宜土壤”的相关病理机制提供了较好的实验平台。
2)本发明与我们前期发明(>1KPa基底硬度平台)互补，基本可模拟全部脏器组织硬度范围，为硬度相关体外细胞培养研究的开展奠定了较好基础。
3)本实验平台与同样模拟细胞外基质硬度变化的matrigel相比成本低、批次间质量差异小，操作简便，用时少，可广泛应用于低硬度组织细胞培养、生物工程及医药领域抗肿瘤药物的高通量筛选，具有较好的经济效益和社会效益。
附图说明：
图1为制备模拟不同肺硬度基底细胞培养平台的凝胶装置俯视图。
图2A为制备不同肺硬度基底细胞培养平台凝胶配方及利用质构仪所测相应硬度值；图2B为I型胶原和DMEM基础培养基按1：20比例混合凝固成低硬度基底L所测硬度值；图2C为I型胶原、DMEM基础培养基及LOXL2三者按1:10:5比例混合凝固成高硬度基底H。
图3为人肺成纤维细胞HELF在低硬度基底L(202.434Pa，模拟正常肺组织硬度)和高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)培养24小时后细胞形态变化。
图4A为生长在低硬度基底L(202.434Pa，模拟正常肺组织硬度)和高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)表面的人肺成纤维细胞HELF，经CM-NC及CM-LV-LOXL2-OE刺激作用24小时后，肺成纤维细胞中MMP9基因表达情况；图4B为上述处理条件下，肺成纤维细胞中MMP2基因表达情况；图4C为上述处理条件下，肺成纤维细胞中Fibronectin基因表达情况；图4D为上述处理条件下，肺成纤维细胞中CXCL12基因表达情况；图4E为上述处理条件下，肺成纤维细胞中MMP9，MMP2蛋白表达情况；图4F为生长在低硬度基底L(202.434Pa，模拟正常肺组织硬度)和高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)表面的人肺成纤维细胞HELF，经CM-NC及CM-LV-LOXL2-OE刺激作用24小时后，Fibronectin蛋白表达情况及相关信号通路活化情况。
图5A为生长在低硬度基底L、高硬度基底H表面的人肺成纤维细胞HELF，经rhLOXL2纯品处理培养24小时，成纤维细胞FN1蛋白表达及相应通路改变；图5B为在高硬度基底H表面上培养人肺成纤维细胞HELF，经CM-NC或CM-LV-LOXL2-OE，及Akt信号通路抑制剂处理后，Fibronectin及信号通路蛋白水平的变化情况。
图6为人肺成纤维细胞HELF在低硬度基底L(202.434Pa，模拟正常肺组织硬度)和高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)培养24小时，加入带有绿色荧光的肝癌细胞MHCC97H，24小时后于荧光显微镜下观察肝癌细胞黏附情况。
具体实施方式：
实施例1不同肺硬度基底体外细胞培养平台的构建
具体步骤如下：
1、采用慢病毒介导过表达技术形成慢病毒包装LOXL2过表达质粒(LV-LOXL2-OE)，感染肝癌细胞MHCC97H，先以含3ug/mL嘌呤霉素、体积百分比浓度为10％FBS和体积百分比浓度为1％青链霉素的DMEM培养液进行感染细胞阳性筛选，至细胞无明显死亡，再用含体积百分比浓度为10％FBS和体积百分比浓度为1％青链霉素的DMEM换液培养，细胞生长至90％左右密度。收集细胞确定LOXL2过表达程度。随后，90％密度LOXL2过表达肝癌细胞，以DMEM无血清培养液培养24小时，收取上清(CM-LV-LOXL2-OE)；
具体的，所述的高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97H来自复旦大学肝癌研究所。
2、取两个无菌六孔板；
3、依1：20体积比将鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基混合凝固成低硬度基底L(I型胶原终浓度：170.48ug/mL)，以每孔4ml加入一个六孔板。另外以1：10：5体积比将鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基及CM-LV-LOXL2-OE混合凝固成高硬度基底H(I型胶原的终浓度：223.75ug/mL；LOXL2的终浓度：96.875ng/mL)，以每孔4ml加入另外一个六孔板；
4、将上述的两个六孔板放入37℃温箱静置1.5小时；(切忌使用含体积百分比浓度为5％的二氧化碳细胞培养箱)；
5、将成胶后的基底置于4℃冰箱中12h，形成不同基底硬度体外细胞培养平台。
图2A为制备不同肺硬度基底细胞培养平台凝胶配方及利用质构仪所测相应硬度值；
图2B为I型胶原和DMEM基础培养基按1：20比例混合凝固成低硬度基底L(I型胶原终浓度：170.48ug/mL)所测硬度值；
图2C为I型胶原、DMEM基础培养基及LOXL2三者按1:10:5比例混合凝固成高硬度基底H(I型胶原终浓度：223.75ug/mL；LOXL2终浓度：96.875ng/mL)所测硬度值；其中，图2B所测硬度值为202.434Pa，触发力为1.0g；图2C所测实际硬度为926.18Pa，触发力为2.0g。
实施例2利用不同肺基底硬度细胞培养平台培养人肺成纤维细胞HELF细胞
人肺成纤维细胞HELF购于中科院生化细胞所，用含体积百分比浓度为10％的FBS、体积百分比浓度为0.5％的青链霉素的DMEM培养液进行培养，细胞生长至90％左右密度，用质量百分比浓度为0.25％的胰酶消化收集细胞。
在上述制备的不同肺硬度基底平台培养人肺成纤维细胞的具体步骤如下：
1、将收集的细胞制成细胞混悬液约3×106细胞/ml培养液；
2、分别吸取2ml细胞混悬液，轻轻滴加在细胞培养平台上；
3、细胞培养箱37℃，5％二氧化碳环境培养24小时；
4、观察细胞形态变化。
实验结果(如图3)表明，肺成纤维细胞在高、低两种肺硬度基底L和H表面均能生长、增殖，且呈不同细胞形态。在低肺硬度基底L表面生长的肺成纤维细胞多呈圆性，细胞铺展面积较小。而在高肺硬度基底H表面生长的肺成纤维细胞伸展面积较大，细胞多呈类纤维状。说明由LOXL2形成的不同肺硬度基底细胞培养平台，能够对肺组织定植细胞进行培养，并影响细胞形态结构。
实施例3高、低肺硬度基底对肺成纤维细胞细胞基质重塑关联基因表达影响
收集实施例2培养的人肺成纤维细胞，检测肺成纤维细胞中基质重塑关联基因(MMP2、MMP9，Fibronectin)、趋化因子CXCL12的表达及相关通路的活化。结果发现(如图4A,4B,4C,4E)，LOXL2可明显上调肺成纤维细胞中基质重塑关联基因表达，LOXL2与基底硬度联合作用可进一步增强肺成纤维细胞中基质重塑关联基因表达，提示LOXL2具有重塑肺转移靶器官基质的能力。
同时，CM-LV-LOXL2-OE上清和LOXL2纯品均可激活AKT通路并促进Fibronectin表达，抑制AKT磷酸化水平下调成纤维细胞AKT信号通路活性和Fibronectin表达(如图4F，如图5A,5B)。
另外，LOXL2刺激明显上调肺成纤维细胞中趋化因子CXCL12表达(如图4D)。
如图6显示，高硬度基底表面培养人肺成纤维细胞HELF经LOXL2刺激后，更加有利于带有绿色荧光的肝癌细胞MHCC97H的粘附定植，进一步提示LOXL2对基质重塑改造(预转移龛)促进肝癌细胞的粘附定植。
图4A为生长在低硬度基底L(202.434Pa，模拟正常肺组织硬度)和高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)表面的人肺成纤维细胞HELF，经CM-NC及CM-LV-LOXL2-OE刺激作用24小时后，肺成纤维细胞中MMP9基因表达情况。
图4B为上述处理条件下，肺成纤维细胞中MMP2基因表达情况。
图4C为上述处理条件下，肺成纤维细胞中Fibronectin基因表达情况。
图4D为上述处理条件下，肺成纤维细胞中CXCL12基因表达情况。
图4E为上述处理条件下，肺成纤维细胞中MMP9，MMP2蛋白表达情况。
图4F为生长在低硬度基底L(202.434Pa，模拟正常肺组织硬度)和高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)表面的人肺成纤维细胞HELF，经CM-NC及CM-LV-LOXL2-OE刺激作用24小时后，Fibronectin蛋白表达情况及相关信号通路活化情况。
图5A为生长在低硬度基底L(202.434Pa，模拟正常肺组织硬度)、高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)表面的人肺成纤维细胞HELF，经rhLOXL2纯品处理培养24小时，成纤维细胞Fibronectin蛋白表达及相应通路改变。
图5B：在高硬度基底H(926.18Pa，模拟病理肺组织硬度)表面上培养人肺成纤维细胞HELF，经CM-NC或CM-LV-LOXL2-OE，及Akt信号通路抑制剂(LY294002)处理后，成纤维细胞Fibronectin及相应信号通路改变情况。

Claims (5)

1.一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基分别按不同体积比混合，置于第一多孔板中，所述的鼠尾I型胶原的终浓度范围在170-1790ug/mL之间；
2)将鼠尾I型胶原、DMEM基础培养液及LOXL2过表达肝癌细胞无血清培养上清CM-LV-LOXL2-OE按1：10：5体积比混合，置于第二多孔板中；
3)将步骤1）和2）的上述第一多孔板和第二多孔板放入 37℃温箱静置1~2小时；
4)将步骤3）成胶后的基底置于4℃冰箱中10~14h，形成不同基底硬度体外细胞培养平台。
2.根据权利要求1所述的一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述的鼠尾I型胶原和DMEM基础培养基分别按1：1，1：2，1：3，1：4，1：15或者1：20系列体积比混合，置于第一多孔板中。
3.根据权利要求1所述的一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述的鼠尾I型胶原的终浓度为223.75ug/mL；所述的LOXL2的终浓度为96.875ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，其特征在于：可以采用物性测试仪对步骤4）每孔所成凝胶硬度进行检测，检测所设参数为：Pre-TestSpeed:1.00mm/sec；Test Speed:0.50 mm/sec；Target Mode: Strain； Strain:90%；Trigger Force:1.0/2.0g。
5.根据权利要求1所述的一种肺硬度基底体外细胞培养平台的制备方法，其特征在于：所述的CM-LV-LOXL2-OE的制备方法如下：采用慢病毒介导过表达技术形成慢病毒包装LOXL2过表达质粒，感染肝癌细胞MHCC97H，先以含3 ug/mL嘌呤霉素、体积百分比浓度10%的FBS和体积百分比浓度1%的青链霉素的DMEM培养液进行感染细胞阳性筛选，至细胞无明显死亡，再用含体积百分比浓度10% FBS和体积百分比浓度为1%青链霉素的DMEM换液培养，细胞生长至85~95%密度，收集细胞确定LOXL2过表达程度，随后将85~95%密度LOXL2过表达肝癌细胞以DMEM无血清培养液培养24小时，收取培养上清，获得CM-LV-LOXL2-OE，离心后分装冻存。
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