CN112852738B - 一种前列腺癌细胞膜片的制备方法 - Google Patents

一种前列腺癌细胞膜片的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种前列腺癌细胞膜片的制备方法，所述前列腺癌细胞膜片是采用细胞膜片技术将前列腺癌细胞与细胞外基质连接并构建而成的三维肿瘤膜片状组织；采用本发明提供的制备方法所制备的前列腺癌细胞膜片，不仅有效保留了细胞外基质成分，从而保留了细胞生长微环境和微结构，更能模拟真实的前列腺癌细胞生长环境，在具备可供操作的机械性能同时，能够高表达前列腺癌特异性蛋白，可用于前列腺癌动物荷瘤实验及抗前列腺癌药物筛选。

Description

一种前列腺癌细胞膜片的制备方法
技术领域
本发明涉及生物科学技术领域，具体涉及一种前列腺癌细胞膜片及其制备方法。
背景技术
世界范围内，前列腺癌发病率在男性所有恶性肿瘤中位居第二。根据国家癌症中心的数据，前列腺癌自2008年起成为男性泌尿系统中发病率最高的肿瘤，2014年的发病率达到9.8/10万，在男性恶性肿瘤发病率排名中排第6位；死亡率达到4.22/10万，在所有男性恶性肿瘤中排第9位。从发病年龄来看，我国城市地区自60岁开始出现前列腺癌的发病高峰。由于人均寿命的延长，可以预见前列腺癌的绝对发病数将出现井喷性增长。体外培养前列腺癌细胞表型的差异性和对前列腺癌生物学行为理解的有限性是限制制定有效的前列腺癌治疗策略的关键所在。
利用体外培养的前列腺癌细胞系一直是初步检测肿瘤基因表型、研发抗肿瘤药物以及识别癌症的预后标志物等的主要方式，但是这种体外癌症研究方式仍有一些局限性难以克服；肿瘤细胞、细胞外基质及各种细胞因子是构成肿瘤细胞微环境的主要成分；通常，当肿瘤细胞贴壁生长接近100％时，需要采用酶消化使其分散形成细胞悬液进行研究或者继续传代。正常情况下，贴壁肿瘤细胞呈单层生长只会分泌少量的细胞外基质，通常在消化的过程中被分解丢失，这样不可避免影响癌细胞活性和信号通路的传导，以至于改变癌细胞基因/蛋白的表达和表型特征；最终造成体外培养的肿瘤细胞与体内肿瘤在血管生成和侵袭转移潜能方面的差异；由于这些局限性造成了肿瘤体外研究结果在向临床转化应用时困难重重。
然而，现有技术中，在前列腺癌细胞领域，常规的方法是利用胰酶消化成前列腺癌细胞悬液，而采用这种方法获得前列腺癌细胞悬液的过程会让细胞损失所分泌的细胞外基质，导致所获得的前列腺癌细胞悬液中都是游离的单个细胞，不仅使得细胞活性损失，而且不能保留相关的生长因子、细胞生长微环境和微结构等，非常不利于后续前列腺癌细胞的深入分析和研究，如更精准的进行肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发等；此外，细胞膜片技术是通过刺激细胞外基质大量分泌并连接细胞形成一种细胞密度高、细胞分布均匀、质地均一的膜片状组织的技术，该技术目前主要应用于组织工程重建与修复领域；而现有技术中，国内外尚未有关于利用细胞膜片技术制备前列腺癌细胞膜片的文献及专利，利用细胞膜片技术制备前列腺癌细胞膜片的技术手段亟待开发。
发明内容
为解决现有技术所存在的不足，本发明提供了一种前列腺癌细胞膜片及其制备方法，本方法在体外将前列腺癌细胞与细胞外基质连接成膜片样组织，有效保留了细胞外基质成分，从而保留了细胞生长微环境和微结构，更能模拟真实的前列腺生长环境，有助于揭示前列腺癌细胞真实的生物学行为，从而可以有效解决现有技术存在的不足。
本发明所采用的技术方案是：
一种前列腺癌细胞膜片，所述前列腺癌细胞膜片是采用细胞膜片技术将前列腺癌细胞与细胞外基质连接并构建而成的三维肿瘤膜片状组织。本方案中，将细胞膜片技术应用到前列腺癌细胞技术领域，使得制备前列腺癌细胞膜片的过程不需要胰酶消化细胞，可以避免细胞外基质的损失，从而使得所制备的前列腺癌细胞膜片中，保留了相关的生长因子、细胞生长的微环境和微结构等，有利于建立体外前列腺癌细胞研究模型，从而更有助于揭示前列腺癌真实的生物学行为。
优选的，所述前列腺癌细胞采用的是前列腺癌DU-145细胞。
优选的，所述前列腺癌细胞膜片为圆形，直径为1.5cm-6cm，厚度为5-100μm。
一种前列腺癌细胞膜片的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：对温度敏感型细胞培养皿进行预先包被处理；
步骤二：将人前列腺癌细胞接种于所述温度敏感型细胞培养皿中；
步骤三：向温度敏感型细胞培养皿中的培养液中添加用于促进细胞外基质生成的细胞因子；
步骤四：获取温度敏感型细胞培养皿中成形的前列腺癌细胞膜片。
在本方法中，采用温度敏感型细胞培养皿培养前列腺癌细胞，可以根据精确控制和调节温度，从而可以获得完整且具有一定厚度的前列腺癌细胞膜片；对温度敏感型细胞培养皿进行预先包被处理，以便在温度敏感型细胞培养皿内形成一层基底膜，从而有效模拟出体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，既有利于接种于温度敏感型细胞培养皿中前列腺癌细胞的培养和分化，又可以联合后续加入的细胞因子更好的模拟出肿瘤细胞的微环境，从而促进肿瘤细胞粘附增殖，并通过二者的相互作用有效调控肿瘤细胞行为，且在整个制备过程中，不需要胰酶消化细胞，不存在细胞外基质的损失问题，完整地保留了肿瘤细胞生长的微环境和微结构，避免细胞活性损失，从而构建出了完整的前列腺癌细胞膜片，不仅可以用于前列腺癌细胞悬液所适用的一切基础实验研究，而且有利于应用在更精准的肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发等领域。
优选的，所述温度敏感型细胞培养皿的直径为35mm～90mm。
较优的，所述温度敏感型细胞培养皿的直径为35mm。
优选的，在所述步骤一中，采用基质胶、I型胶原、黏连蛋白、明胶、动物血清或自体血清进行所述预先包被处理，以便在温度敏感型细胞培养皿中形成基底膜。
优选的，所述步骤一中，所述预先包被处理过程为：
(1)将基质胶、I型胶原、黏连蛋白、明胶、动物血清或自体血清加入所述温度敏感型细胞培养皿中；
(2)将所述温度敏感型细胞培养皿置于4℃的环境中，静置至少12小时；
(3)吸弃温度敏感型细胞培养皿中的多余液体后置于超净台中风干。
进一步的，所述预先包被处理过程(1)中，加入温度敏感型细胞培养皿中的是基质胶。基质胶是一种可溶性的基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下，基质胶可用来包被培养皿聚合形成具有生物学活性的三维基质，能够有效模拟出体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能、迁移、侵染和基因表达的研究。
优选的，所述基质胶的浓度为500μg/cm2。
优选的，所述步骤二中，所述前列腺癌细胞的种类是DU-145细胞株。
优选的，所述步骤二中，所述前列腺癌细胞的接种密度为5×104～4×105个/cm2。
较优的，所述前列腺癌细胞的接种密度为2×105个/cm2。
优选的，所述步骤三中，所述细胞因子采用的是TGF-β细胞因子。采用TGF-β细胞因子作为促进细胞外基质生成的细胞因子，在肿瘤细胞外基质形成过程中起着关键作用，可以显著促进细胞胶原的合成，并形成细胞-基质连接以及细胞间连接三维立体结构；此外，TGF-β细胞因子在促进前列腺癌细胞膜片形成的同时，既可以联合基底膜(基质胶)更好的模拟出肿瘤细胞的微环境，从而促进肿瘤细胞粘附增殖，又可以与基底膜间的相互作用有效调控肿瘤细胞行为，有利于完整地保留肿瘤细胞生长的微环境，从而构建出所述前列腺癌细胞膜片，有利于应用在更精准的肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发等领域。
进一步的，所述TGF-β细胞因子的浓度为5～100ng/mL，培养时间为3～14天。
较优的，所述TGF-β细胞因子的浓度为10ng/mL，培养时间为5天。
进一步的，所述步骤四中，在获取前列腺癌细胞膜片之前，还包括对前列腺癌细胞膜片进行洗涤，所采用的洗涤液为无血清培养基、PBS、D-HBSS+-液及生理盐水中的一种或多种的组合。洗涤过程既可以去除杂质，又有利于后续前列腺癌细胞膜片脱离温度敏感型细胞培养皿。
优选的，所述步骤四中，获取前列腺癌细胞膜片的过程为：
(1)将所述温度敏感型细胞培养皿置于操作台上或冰上；
(2)利用镊子或枪头游离前列腺癌细胞膜片边缘一周；
(3)加入预冷后的无血清培养基，并利用移液枪吹打以促进前列腺癌细胞膜片完整脱离温度敏感型细胞培养皿。采用这样的方式从温度敏感型细胞培养皿取出前列腺癌细胞膜片，不仅操作方便，而且有利于前列腺癌细胞膜片完整的脱落，以方便后续分析、研究使用。
优选的，所述无血清培养基的预冷温度为4度。
与现有技术相比，使用本发明提供的一种前列腺癌细胞膜片及其制备方法，具有以下有益效果：
1、采用本方法制备的前列腺癌细胞膜片，有效保留了细胞外基质成分，从而保留了细胞生长微环境和微结构，更能模拟真实的前列腺生长环境，在具备较佳的机械性能同时，能够阳性表达前列腺癌细胞标志蛋白，可用于肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发。
2、在本方法中，采用TGF-β细胞因子作为促进细胞外基质生成的细胞因子，在肿瘤细胞外基质形成过程中起着关键作用，可以显著促进细胞胶原的合成，并形成细胞-基质连接以及细胞间连接三维立体结构。
3、在本方法中，预先包被获得的基底膜联合后续加入的细胞因子，可以更好的模拟出肿瘤细胞的微环境，从而促进肿瘤细胞粘附增殖，并通过二者的相互作用有效调控肿瘤细胞行为，有利于完整地保留肿瘤细胞生长的微环境，从而构建出完整的前列腺癌细胞膜片，有利于应用在更精准的肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发等领域。
4、采用本方法制备的前列腺癌细胞膜片，膜片表面平整、质地均一，细胞外基质含量丰富、厚度大，具备较佳抗牵拉特性，且不易破裂，具有肿瘤应用研究的可操作性的同时，也完整地保留了肿瘤细胞生长微环境，有利于应用在更精准的肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发等。
5、采用本方法制备的前列腺癌细胞膜片，应用范围更广，例如，可以有效用于基因组学及蛋白质组学表达差异分析、体外药物筛选、建立前列腺癌原位模型或皮下种植瘤模型、建立前列腺癌脏器转移模型、建立前列腺癌血液循环模型等场合。
6、采用本方法制备的前列腺癌细胞膜片，可成团、可碎片化、可折叠、可叠加。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为DU-145细胞膜片镜下和大体形态观察图；
图2为DU-145细胞膜片HE和MASSON观察图；
图3为免疫组化分析DU-145细胞膜片中Collagen typeⅠ、E-cadherin和Vimentin蛋白分布图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、前列腺癌DU-145细胞培养
前列腺癌DU-145细胞(购于上海富衡生物科技有限公司)用含10％(体积分数)胎牛血清的DMEM低糖培养基置于37℃含5％CO2(体积分数)的培养箱中培养；每2-3天更换培养液，细胞密度达到80％时传代或用于实验研究，前列腺癌DU-145细胞形态如图1中的A所示。
前列腺癌DU-145细胞的细胞培养基组成：450ml低糖DMEM培养基、50ml胎牛血清、100U/ml青霉素以及100mg/ml硫酸链霉素。
2、预包被温度敏感型培养皿
采用基质胶作为基底膜基质，所采用的温度敏感型培养皿是24孔温度敏感型培养板。
使用不同浓度的基质胶(Corning)包被24孔温度敏感型培养板(Thermo FisherScientific)以提高前列腺癌DU-145细胞的粘附性；具体做法是：
从-20℃冰箱内取出基质胶，冰上解冻后，用预冷的移液枪头混匀基质胶成匀浆状；
根据使用需要，采用无血清培养基稀释基质胶，且浓度梯度可以设置为0μg/cm2、50μg/cm2、125μg/cm2、250μg/cm2、500μg/cm2、1000μg/cm2，每个浓度设置3个重复孔；
将各组稀释的基质胶包被于所需的培养皿中，包被量刚好覆盖整个孔的生长表面；
室温下孵育1小时后置于4℃的环境中静置至少12个小时；
最后，吸弃多余液体后，将培养皿置于超净台中风干待用。
3、前列腺癌DU-145细胞浓度筛选
将前列腺癌DU-145细胞以5×104个/cm2，1×105个/cm2，2×105个/cm2，4×105个/cm2接种于所述细胞培养板(即温度敏感型培养皿)中，第二天更换细胞膜片培养基继续培养，并每天更换细胞培养液，连续培养5天。
前列腺癌DU-145细胞膜片培养基组成：450ml低糖DMEM培养基、50ml胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml硫酸链霉素以及10ng/mL TGF-β细胞因子。
将上述不同的浓度的基质胶与上述不同浓度的前列腺癌DU-145细胞自由组合，筛选构建前列腺癌膜片的最佳培养条件，培养5天后；通过对比发现，采用浓度为500μg/cm2的基质胶包被温度敏感型培养皿，并接种浓度为2×105个/cm2前列腺癌DU-145细胞的方案效果最优，可以收获完整、具有一定厚度的膜片状物，且其表面平滑、半透明外观、质地均匀，能用镊子提起，便于后续研究适用。
4、前列腺癌DU-145细胞膜片的制备
前列腺癌细胞膜片的制备方法，主要包括如下步骤：
步骤1：对温度敏感型细胞培养皿进行预先包被处理；温度敏感型细胞培养皿的直径可以优先采用35mm～90mm；在本实施例中，温度敏感型细胞培养皿的直径为35mm；并利用浓度为500μg/cm2的基质胶进行包被处理；
步骤2：将前列腺癌细胞接种于所述温度敏感型细胞培养皿中；在本实施例中，所述前列腺癌细胞采用的是上述浓度为2×105个/cm2的DU-145细胞；
步骤3：向温度敏感型细胞培养皿中的培养液中添加用于促进细胞外基质生成的细胞因子；在本实施例中，所述细胞因子采用的是上述浓度为10ng/mL的TGF-β细胞因子；
步骤4：获取温度敏感型细胞培养皿中成形的前列腺癌细胞膜片。在获取前列腺癌细胞膜片之前，还包括对前列腺癌细胞膜片进行洗涤，所采用的洗涤液为无血清培养基、PBS、D-HBSS+-液及生理盐水中的一种或多种的组合。获取前列腺癌细胞膜片的过程可以为：
(1)将所述温度敏感型细胞培养皿置于操作台上或冰上；
(2)利用镊子或枪头游离前列腺癌细胞膜片边缘一周；
(3)加入预冷后的无血清培养基，并利用移液枪吹打以促进前列腺癌细胞膜片完整脱离温度敏感型细胞培养皿。采用这样的方式从温度敏感型细胞培养皿取出前列腺癌细胞膜片，不仅操作方便，而且有利于前列腺癌细胞膜片完整的脱落，以方便后续分析、研究使用。
所制备的前列腺癌DU-145细胞膜片的细胞形态和大体形态如图1中的B和C所示。
5、前列腺癌DU-145细胞膜片组织学检测
1)HE和MASSON染色分析DU-145细胞膜片的层次结构
DU-145细胞膜片从培养板上分离后，使用4％多聚甲醛固定24小时，石蜡包埋以及切片，层厚5μm。分别用苏木精-伊红(HE)和马松三色染色法(MASSON)染色观察。平均厚度用Image J软件计算，每个样品测量重复三次。
如图2所示，HE染色显示，DU-145细胞膜片由3-5层细胞构成，厚度约40μm，细胞之间紧密连接形成致密片状整体。如图2所示，MASSON染色显示，细胞膜片内部有大量胶原分布，并与DU-145细胞连接形成致密整体。
2)免疫组化分析DU-145细胞膜片Collagen typeⅠ、E-cadherin和Vimentin蛋白表达
依照上述方法获得DU-145细胞膜片后，石蜡切片脱蜡入水，柠檬酸钠(PH6.0)溶液水浴煮沸30min抗原修复，5％BSA封闭常温30min，一抗(Collagen typeⅠ1:1000稀释，E-cadherin 1:1000稀释和Vimentin 1:1000稀释)4℃孵育过夜(即大于12小时)，PBS清洗5遍，HRP-二抗37℃孵育30min，DAB(1:50)显色15分钟，终止后利用苏木紫复染，酒精梯度脱水后中性树胶封片，各组设置阴性对照。
如图3所示，与对照组相比，DU-145细胞膜片中Collagen typeⅠ，E-cadherin和Vimentin蛋白免疫组化染色强阳性表达，呈现棕黄色广泛分布。
由此可见，本发明所制备的前列腺癌DU-145细胞膜片，在具备较好的力学性能同时，能够高表达DU-145细胞标志蛋白E-cadherin和Vimentin，可用于肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发。当DU-145细胞以高密度接种到预先包被有基质胶的温度敏感的培养皿中时，细胞过度融合(超过100％)，当培养温度下降至20℃时，它们可以作为一个完整而坚固的细胞膜被剥离下来。该细胞膜片具有较好的力学强度，可以保证在整个操作过程中保持完整。由此可见，细胞过度融合是一个重要的条件，没有这种融合，DU-145细胞膜片很容易破碎而难以收获，而当细胞密度过高时，大量细胞死亡而无法形成膜片；为了提高DU-145细胞膜片的力学性能，我们在35mm的温度敏感型细胞培养皿中预先包被了薄层基质胶，以促进更多的DU-145细胞相互粘附。
TGF-β细胞因子在促进肿瘤细胞分泌细胞外基质过程中起着重要作用，可显著促进细胞胶原合成，从而形成细胞-基质连接以及细胞间连接三维立体结构，因此，在本发明中使用经过适宜浓度的基质胶包被的温度敏感型细胞培养皿培养，并在培养基中添加TGF-β细胞因子促进DU-145细胞膜片形成，最终构建出一种前列腺癌细胞膜片；该膜片外观平整、质地均一、细胞外基质胶原含量丰富，具备较好抗牵拉特性，不易破裂，具有较好的可操作性，有望用于肿瘤细胞分子遗传学研究、肿瘤模型及药物研发。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述前列腺癌细胞膜片是采用细胞膜片技术将前列腺癌细胞与细胞外基质连接并构建而成的三维肿瘤膜片状组织，包括如下步骤：
步骤一：对温度敏感型细胞培养皿进行预先包被处理；
步骤二：将人前列腺癌细胞接种于所述温度敏感型细胞培养皿中；
步骤三：向温度敏感型细胞培养皿中的培养液中添加用于促进细胞外基质生成的细胞因子，所述细胞因子采用的是TGF-β细胞因子；
步骤四：获取温度敏感型细胞培养皿中成形的前列腺癌细胞膜片。
2.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述前列腺癌细胞膜片为圆形，直径为1.5cm-6cm，厚度为5-100μm。
3.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述前列腺癌细胞采用的是前列腺癌DU-145细胞。
4.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述步骤一中，采用基质胶、I型胶原、黏连蛋白、明胶、动物血清或自体血清进行所述预先包被处理，以便在温度敏感型细胞培养皿中形成基底膜。
5.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，所述预先包被处理过程为：
(1)将基质胶、I型胶原、黏连蛋白、明胶、动物血清或自体血清加入所述温度敏感型细胞培养皿中；
(2)将所述温度敏感型细胞培养皿置于4℃的环境中，静置至少12小时；
(3)吸弃温度敏感型细胞培养皿中的多余液体后置于超净台中风干。
6.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述预先包被处理采用的是基质胶，且所述基质胶的浓度为500μg/cm2、所述前列腺癌细胞的接种密度为2×105个/cm2。
7.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述TGF-β细胞因子的浓度为5～100ng/mL，培养时间为3～14天。
8.根据权利要求1所述的前列腺癌细胞膜片的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，获取前列腺癌细胞膜片的过程为：
(1)将所述温度敏感型细胞培养皿置于操作台上或冰上；
(2)利用镊子或枪头游离前列腺癌细胞膜片边缘一周；
(3)加入预冷后的无血清培养基，并利用移液枪吹打以促进前列腺癌细胞膜片完整脱离温度敏感型细胞培养皿。
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