CN102010601B

CN102010601B - 一种肝细胞特异性大孔微载体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN102010601B
Application number: CN2009100417678A
Authority: CN
Inventors: 龚独辉; 潘明新; 高毅; 周焕城; 张志�; 胡志伟
Original assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Current assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date: 2009-08-11
Filing date: 2009-08-11
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2029-08-11
Also published as: CN102010601A

Abstract

本发明提供一种以丝素蛋白、半乳糖基化壳聚糖为主要原料的肝细胞特异性大孔微载体及其制备方法和用途。该大孔微载体是由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下制得的球体，其中丝素蛋白的含量以重量百分数计占球体的50％-80％，半乳糖基化壳聚糖的含量以重量百分数计占球体的15％-40％，所述载体的直径为200-500μm，孔径为40-80μm。该微载体具有诱导和提高肝细胞在丝素/半乳糖基化壳聚糖(SF/GC)大孔微载体支架材料上的黏附性能，使其具有肝细胞特异性，适合于大规模培养肝细胞。

Description

一种肝细胞特异性大孔微载体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种细胞培养用大孔微载体、其制备方法和用途，具体涉及一种以丝素蛋白、半乳糖基化壳聚糖为主要原料的肝细胞特异性大孔微载体及其制备方法和用途。

背景技术

生物人工肝是20世纪80年代后期发展起来的体外人工肝支持系统，其核心部分生物反应器是由肝细胞与生物合成材料组合而成。如何建立具有质量高、数量足、安全性强的生物反应器培养系统是目前生物型人工肝研究领域最重要、也是最困难的核心技术问题。

肝细胞是具有极性的锚定依赖性细胞，需要一种不溶的细胞外基质才能获得生存、重组、增殖并发挥功能。体内肝细胞是处于一种三维环境之中，细胞间的相互作用有助于调节细胞的生长和功能分化。如果在体外培养时能为肝细胞提供一个类似于体内的三维环境，有利于促进肝细胞的生长和功能维持。因此模拟体内环境制备三维多孔网状结构支架用于肝细胞的培养，则有可能解决上述肝细胞组织化培养的问题。

大孔微载体具有完全连通的沟回，能最大限度地扩大比表面积。它将细胞固定在孔内生长，因而可为细胞提供了足够的生长空间和更大的附着面积，同时有利于营养成分的进入和代谢产物的排出，而不致引起细胞的生长抑制作用，提高细胞培养密度和代谢活性。与其他载体相比，大孔微载体具有一系列的优点，例如：比表面积大，是实心微载体的几倍甚至几十倍；细胞在孔内生长，受到保护，剪切损伤小；细胞三维生长，细胞密度是实心微载体的10倍以上，有的可达10⁸个/ml；微载体浓度高，实心微载体在培养液中浓度增大到一定时，细胞密度反而下降，而大孔微载体在浓度较高时，表面碰撞增加，能促使细胞在孔内生长；适用于长期维持培养，长期培养的细胞生长情况依然良好；适合于蛋白质生产和产物分泌。

但在肝细胞培养中，现存的大孔微载体均不具有肝细胞特异性，不能诱导和提高肝细胞在微载体上黏附性能，放大培养时细胞容易脱落，因而寻求一种理想的具有肝细胞特异性的大孔微载体对目前实现肝细胞体外规模化培养具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种新型大孔微载体，该大孔微载体既具有肝细胞亲和性，有助于细胞黏附、增殖，支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和细胞功能且成本低廉，能够用于大规模培养肝细胞的大孔微载体。

本发明的另一目的在于提供一种所述大孔微载体的制备方法。该方法所用原料简单易得，且价格便宜，步骤简单。

本发明的另一目的在于提供一种所述大孔微载体在体外细胞培养中的应用，特别是在肝细胞体外培养中的应用。

为实现上述目的，本发明的一个方面提供一种大孔微载体，其对肝细胞具有高度的亲和性，该大孔微载体是由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下制得的球体，其中丝素蛋白含量(重量％)占50％-80％，半乳糖基化壳聚糖含量(重量％)占15％-40％(在本发明中，丝素蛋白含量以及半乳糖基化壳聚糖含量的测定是通过首先测得丝素蛋白、半乳糖基化壳聚糖各自的浓度，然后按照预定的比例计算出需要的量(体积)，再进行共混而进行的)。扫描电镜观察显示，所述载体的直径为200-500μm，孔径为40-80μm，孔隙率可达95％。

在本发明的实施方式中，可通过下述方法制备所述大孔微载体，该方法包括：

(a)将丝素蛋白溶液与半乳糖基化壳聚糖溶液按比例混合，使得产生终浓度为4-7w/v％的丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液；

(b)将上述丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液滴入正在搅拌中的含乳化剂的油相中，得到白色乳液；并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化；

(c)将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的pH为9-10的极性溶剂中，并继续搅拌40-60分钟，过滤得到互不粘连的微球；

(d)固化所述微球并除去表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球；

(e)除去微球中的残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。

优选地，所述乳化剂为司班80，油相为液体石蜡。所述交联剂优选为戊二醛。所述极性溶剂优选为异丙醇、乙醇和/或丙酮。

在本发明的另一个实施方式中，在所述步骤(e)中的冷冻干燥之前还包括用高浓度蔗糖溶液浸泡所述微球的步骤。

在本发明的另一个实施方式中，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。所述消毒步骤优选为以钴60-γ射线辐照或浸泡在蒸馏水、PBS溶液中高压蒸汽灭菌。

本发明的大孔微载体在材料中引入了肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体、肝靶向基团——半乳糖基。因此，该微载体具有诱导和提高肝细胞在丝素/半乳糖基化壳聚糖(SF/GC)大孔微载体支架材料上的黏附性能，使其具有肝细胞特异性，适合于大规模培养肝细胞。

附图说明

图1是本发明的大孔微载体的¹HNMR谱图；

图2是本发明的大孔微载体的FITR谱图；

图3是本发明的大孔微载体在倒置显微镜下的形态学观察(40X)；

图4是本发明的大孔微载体的SEM图片；

图5是本发明的大孔微载体的内部结构的SEM图片；

图6显示CL-1细胞与SF/GC大孔微载体共培养第6天时在倒置显微镜下观察到的图像；

图7显示CL-1细胞与SF/GC大孔微载体共培养第8天时在扫描电镜(SEM)下观察到的图像；

图8显示CL-1细胞与SF/GC大孔微载体共培养第8天时在扫描电镜(SEM)下观察到的图像的进一步放大图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的方法，下面将通过实施例和实验证据进一步阐述本发明及其优势。在详细描述以下实施例和实验之前，首先需要定义和澄清一些术语。

丝素蛋白是一种无生理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们占蛋白总量的大概85％。丝素蛋白有良好的生物相容性，无毒，无刺激性；丝素蛋白有结晶区和非结晶区混合结构存在，整体上带负电，丝素非结晶区有许多碱性氨基酸，对细胞有一定程度的吸附作用，故能吸收细胞附着在其上面。正是由于具有上述性质，丝素蛋白在生物医用领域得到了日益广泛的应用。而将其用于细胞培养的基质，或对一些生物高分子进行修饰，改善它们的生物性能，使其适用于组织工程，更是近年来丝素蛋白研究的热点。上述优异的生物学特性为丝素蛋白成为细胞培养和组织工程支架材料的应用建立了坚实的基础。

壳聚糖是近年来在生物医药、组织工程领域得到广泛应用的一种天然生物高分子，不仅具有生物功能性、生物相容性、低毒性及几乎无过敏性等特性而且还具有高化学反应活性，易于被一些化学试剂修饰，可通过各种方法对其进行性质改良，而半乳糖基是肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体的特异性配体，具有诱导和提高肝细胞在细胞外基质支架材料上的黏附性能。在EDC和NHS的活化作用下，将半乳糖基引入到壳聚糖的结构中制备半乳糖基化壳聚糖，再与其他材料复合，可诱导和提高肝细胞在细胞外基质支架材料上的黏附和增殖行为。

下面通过具体的实施例来进一步详细地描述本发明。

实施例一：

1)丝素蛋白的制备：将75g生蚕丝在2L的5g/L的碳酸钠溶液中煮沸0.5小时，重复2次，然后用大量蒸馏水清洗以去除丝胶蛋白，60-70℃下烘干，获丝素蛋白。将适量丝素蛋白在80±2℃下溶解在氯化钙/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，在室温条件下蒸馏水透析3天，去除溶液中的盐和乙醇，过滤去除不溶的杂质，制备出丝素蛋白的水溶液。将丝素蛋白水溶液在50±2℃、50-60转/分搅拌浓缩，获得浓度约7-10w/v％的丝素蛋白溶液；

2)半乳糖基化壳聚糖(GC)的制备：称取2.2g壳聚糖，溶于30-40ml 2.0％的醋酸水溶液中，再加适量TEMED/HCl的缓冲溶液(pH 4.7)将壳聚糖溶液稀释至4w/v％，再分别加入0.14g NHS、0.6g EDC和2.2g乳糖酸(LA)，在室温下搅拌反应72h后，蒸馏水透析4天，即得到半乳糖基化壳聚糖(GC)溶液，蒸发部分水分浓缩至4w/v％。

3)配制40ml丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液，丝素蛋白、半乳糖基化壳聚糖质量比为6∶4，终浓度为4w/v％；在加入油相之前以4ml 0.5％戊二醛溶液预交联15-30分钟；

4)取一定量160ml的液体石蜡加入至500ml烧杯中，然后加入6.4ml司班80，混合均匀后以250转/分恒速搅拌，将上述预交联后的丝素-半乳糖基化壳聚糖混合溶液缓慢滴加到油相中，在室温下继续维持原转速搅拌约30分钟，得到白色乳液，向上述乳液中缓慢加入3ml 2.5％戊二醛溶液，继续搅拌3小时，使水相交联固化；

5)取100ml的异丙醇溶液，往其中加入相同体积的去离子水，再滴加NaOH稀溶液，调节PH至9-10；

6)将5)中溶液以250转/分搅拌，将4)中的白色乳液缓慢加入其中，继续搅拌45分钟。然后过滤，得到互不粘连的微球，将微球置于4℃冰箱中6小时，使微球充分固化；

7)将微球用如5)所述稀释过的异丙醇溶液、石油醚、去离子水洗涤，去除表面的油相；然后筛分出200-500μm的微球；

8)将筛分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡3小时，除去未反应的戊二醛；再用大量蒸馏水洗涤；将洗涤干净后的微球用40％蔗糖溶液浸泡3-5分钟，然后倒去多余的蔗糖溶液；将上述浸泡过蔗糖溶液的微球置于-20℃冰箱中，冷冻48小时，然后冷冻干燥48小时，得到大孔微载体；将大孔微载体分装后，钴60-γ射线辐照消毒，备用。

实施例二：

1)丝素蛋白的制备：将75g生蚕丝在4L的5g/L的碳酸钠溶液中煮沸0.5小时，重复2次，然后用大量蒸馏水清洗以去除丝胶蛋白，60-70℃下烘干，获丝素蛋白。将适量丝素蛋白在80℃下溶解在氯化钙/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，在室温条件下蒸馏水透析3天，去除溶液中的盐、乙醇以及其他小分子，再过滤去除不溶的杂质，制备出丝素蛋白的水溶液。将丝素蛋白水溶液在50±2℃、50-60转/分搅拌浓缩，获得浓度约7-10w/v％的丝素蛋白溶液；

2)半乳糖基化壳聚糖(GC)的制备：称取1.1g壳聚糖，溶于15-20ml 2.0％的醋酸水溶液中，再加适量TEMED/HCl的缓冲溶液(pH4.7)将壳聚糖溶液稀释至4w/v％，再分别加入0.07g NHS、0.3g EDC和1.1g乳糖酸(LA)，在室温下搅拌反应72h后，蒸馏水透析3天，即得到半乳糖基化壳聚糖(GC)溶液，蒸发部分水分浓缩至4w/v％。

3)配制40ml丝素-半乳糖基化壳聚糖-壳聚糖混合溶液，丝素蛋白、半乳糖基化壳聚糖、壳聚糖质量比为3∶1∶1，混合溶液终浓度为4w/v％，搅拌均匀；

4)取一定量160ml的液体石蜡加入至500ml烧杯中，然后加入6.4ml司班80，混合均匀后以200转/分恒速搅拌，将上述丝素-半乳糖基化壳聚糖-壳聚糖混合溶液缓慢滴加到不断搅拌的油相中，在室温下继续维持原转速搅拌30分钟，得到白色乳液，向上述乳液中缓慢加入4ml 2.5％戊二醛溶液，继续搅拌3小时，使水相交联固化；

5)取100ml的异丙醇溶液，往其中加入相同体积的蒸馏水，再滴加NaOH稀溶液，调节PH至9-10；

6)将5)中稀释过的异丙醇溶液以300转/分搅拌，将4)中的白色乳液缓慢加入其中，继续搅拌45分钟。然后过滤，得到互不粘连的微球，将微球置于4℃冰箱中6小时，使微球充分固化；

7)将微球用上述稀释过的异丙醇溶液、石油醚、去离子水洗涤，去除表面的油相；然后筛分出200-400μm的微球；

8)将筛分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡2小时，除去未反应的戊二醛；再用大量蒸馏水洗涤；将洗涤干净后的微球用40％蔗糖溶液浸泡3-5分钟，然后倒去多余的蔗糖溶液；将上述浸泡过蔗糖溶液的微球置于-20℃冰箱中，冷冻48小时，然后冷冻干燥48小时，即得到大孔微载体；将大孔微载体分装后，钴60-γ射线辐照消毒，备用。

实施例三：

2)半乳糖基化壳聚糖(GC)的制备：称取2.2g壳聚糖，溶于30-40ml 2.0％的醋酸水溶液中，再加适量TEMED/HCl的缓冲溶液(pH4.7)将壳聚糖溶液稀释至4w/v％，再分别加入0.14g NHS、0.6g EDC和2.2g乳糖酸(LA)，在室温下搅拌反应72h后，蒸馏水透析4天，即得到半乳糖基化壳聚糖(GC)溶液，蒸发部分水分浓缩至4w/v％。

3)配制30ml丝素-半乳糖基化壳聚糖-壳聚糖混合溶液，丝素蛋白、半乳糖基化壳聚糖、壳聚糖质量比为5∶3∶2，混合溶液终浓度为5w/v％，搅拌均匀；

4)取一定量150ml的液体石蜡加入至500ml烧杯中，然后加入6ml司班80，混合均匀后以250转/分恒速搅拌，将上述丝素-半乳糖基化壳聚糖-壳聚糖混合溶液缓慢滴加到不断搅拌的油相中，在室温下继续维持原转速搅拌30分钟，得到白色乳液，向上述乳液中缓慢加入3ml 2.5％戊二醛溶液，继续搅拌3小时，使水相交联固化；

8)将筛分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡4小时，除去未反应的戊二醛；再用大量蒸馏水洗涤；将洗涤干净后的微球用40％蔗糖溶液浸泡3-5分钟，然后倒去多余的蔗糖溶液；将上述浸泡过蔗糖溶液的微球置于-20℃冰箱中，冷冻48小时，然后冷冻干燥48小时，即得到大孔微载体；将大孔微载体分装后，钴60-γ射线辐照消毒，备用。

实施例四：

将上述实施例所得大孔微载体进行NMR分析和红外分析，分别得到如图1和图2所示的¹HNMR谱图和FITR谱图。将上述大孔微载体在倒置显微镜和扫描电镜下观察，得到如图3-5的图像。其中，图1半乳糖基化壳聚糖(GC)的¹HNMR谱分析，箭头所示为半乳糖基的特征峰，GC的¹HNMR归属如下：¹HNMR(300MHz，D₂O/F₃CCOOH)d：1.952(-COCH₃中的H)，4.755(H1)，4.131，4.415(H1′，Hc)，3.3-4.0(H3，H4，H5，H6，H2′，H3′，H4′，H5′，H6′，Ha，Hb，Hd，He)，3.066(H₂)，证实半乳糖基已经通过化学交联，共价结合到壳聚糖(CS)的分子链上；图2为SF/CS(蓝色)与SF/GC(红色)大孔微载体材料的FITR谱图，由于乳糖酸的羧酸基团和壳聚糖的氨基反应形成酰胺键，(右边箭头所示)从而酰胺键的吸收峰I和II发生了化学位移，且峰值增宽，1070.7cm-1为半乳糖糖基的C-O伸展骨架振动的吸收峰。另外，由于壳聚糖接枝半乳糖基后，使OH的数目大大增加，所以OH峰变宽变强(左边箭头所示)。图3为倒置显微镜下观察SF/GC大孔微载体：该大孔微载体为白色或淡黄色，呈半透明的球形；其内部疏松多孔，孔结构分布均匀；轻轻晃动时能清楚地观察到其三维立体结构。该大孔微载体内部疏松多孔的结构扩大了比表面积，并提供了较大的空体积，能将细胞固定在孔内生长，且便于观察，适合用于肝细胞高密度培养；图4a、4b为扫描电镜结果，可见微载体表面呈多孔结构，开口向外，呈喇叭状，孔结构分布较均匀。相比于市售的大孔微载体，该微载体孔径更大，且开口向外；利于细胞黏附生长，并有足够大的孔隙使细胞能够长入微载体内部；图5为较大的SF/GC大孔微载体的剖面图，可见其内部亦为疏松多孔结构，且孔与孔之间相互连通，细胞能够在其内部迁移生长，有利于内部的物质交换。

将本发明的大孔微载体灭菌后，以PBS洗涤3次，然后使用基础培养基浸泡过夜，充分溶胀；随后，将大孔微载体加入48孔培养板中，然后滴加肝细胞CL-1悬液，将CL-1细胞与上述大孔微载体材料共培养，隔日换液，换液时观察肝细胞在材料上的黏附、增殖及肝细胞形态变化等生长情况。图6显示CL-1细胞与SF/GC大孔微载体在多孔培养板中共培养第6天时在倒置显微镜下观察到的图像，可见细胞能够长入大孔微载体内部，呈多细胞聚集的团块，细胞呈球形体生长且很好地贴附在载体上；图7显示CL-1细胞与SF/GC大孔微载体共培养第8天时在扫描电镜(SEM)下观察到的图像，可见细胞呈球形，细胞能够黏附在大孔微载体上生长，呈多细胞聚集的团块，由于肝细胞表面ASGPR和支架上半乳糖基之间的分子识别功能，细胞附着牢固。且随着培养时间的延长微载体之间开始发生团聚，细胞密度高，分泌较多的细胞外基质；图8显示CL-1细胞与SF/GC大孔微载体共培养第8天时在扫描电镜(SEM)下观察到的图像的进一步放大图，可见细胞呈球形，表面可见大量微绒毛结构，细胞可进入微载体内部，聚集生长。

虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背本发明的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。

Claims

1.一种大孔微载体，其是由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖在交联剂的作用下制得的球体，其中丝素蛋白的含量以重量百分数计占球体的50％-80％，半乳糖基化壳聚糖的含量以重量百分数计占球体的15％-40％，所述载体的直径为200-500μm，孔径为40-80μm。

2.一种制备权利要求1所述的大孔微载体的方法，其包括：

(d)以适当稀释的异丙醇或/和石油醚有机溶剂除去所述微球表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球；

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳化剂为石蜡和油包水乳化剂。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂为异丙醇、乙醇和/或丙酮。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(e)中的冷冻干燥之前还包括用高浓度蔗糖溶液浸泡所述微球的步骤。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述消毒步骤为以钴60-γ射线辐照或浸泡在PBS溶液中高压蒸汽灭菌。

9.权利要求1所述的大孔微载体在肝细胞体外培养中的应用。