CN102099462B - 用于提供细胞微载体的组装体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于提供细胞微载体组装体的方法，所述方法包含以下步骤：提供具有两面的平面的二维物体（“薄片”），其中这些物体含有在施加外来刺激时从平面状态转变成卷曲状态的材料，在所述薄片的一个面（“细胞承载面”）上提供细胞，通过施加所述外来刺激将所述薄片从平面状态转变成卷曲状态（“细胞包裹”），和使至少一种类型的连接剂结合到所述薄片。
Description
技术领域
本发明涉及用于提供细胞微载体的组装体的方法。所述方法涉及组织和/或器官工程以及细胞疗法应用中培养的细胞的处理、细胞操作、细胞递送和/或细胞靶向。
背景技术
再生医学是医疗科学领域内即将来临的新兴学科。再生医学中使用许多方法和方式。
在体外组织工程中，利用支架和细胞使组织在身体之外生长。工程化的组织随后植入患者以替换受损或缺损组织。
在体内组织工程中，将支架置于受损组织区域，目的是诱导细胞从周围健康组织的生长以修复受损组织。
细胞疗法是基于将细胞，尤其是干细胞，递送至受损组织区域以恢复组织功能。
有一些疗法利用生长因子，例如细胞因子和趋化因子，以将内源性细胞补充至受损组织区域。生长因子可以直接递送到感兴趣区，例如通过注射。
细胞在体外组织工程和细胞疗法中都起着关键作用，其中首先从合适的细胞源收集细胞，即从患者(“自体”)或从供体(异体)，和随后经历几个不同步骤，直到它们最终再次导入患者而替换或修复受损组织。尽管细胞疗法和组织工程前几年取得了巨大发展，但是基本并且必需的步骤，例如细胞操作、在支架中的细胞（向内）生长，细胞分化，细胞递送和细胞停留仍旧是疑难问题，并且在再生医学变得适合临床上使用前需要进一步改进。
在EP07101104中，细胞操作和细胞递送问题通过将细胞包裹到含有水凝胶的多层薄片中得以解决。最初，细胞在平面薄片上生长，在那里为了优化生长它们被暴露于培养环境，而细胞操作和细胞递送时所述平面薄片转变成卷曲状态（在此称为“微载体”或“细胞包裹”）。
所述薄片为包裹细胞和保护它们不受环境影响提供了有效的方式。在细胞生长过程中，所述薄片与表面结合。所述薄片可以是具有内在应力的单层、双层或多层。当转变成卷曲状态时，所述薄片将包裹所述细胞并从而产生细胞包裹，这也是本发明的主题。
但是，所述方式并没有为所述细胞包裹向适当的靶向组织的特异性递送或靶向提供解决方法。然而，这是关键的，因为被递送到体内错误位置的细胞可能会导致这些细胞在不希望的位置中的不受控制的生长。
而且，经证实所述细胞包裹对目标组织的粘附，以及相似和不同细胞包裹之间的粘附是严重的问题。
最后，已经显示组织和器官的设计，或受损组织和器官的修复是复杂的问题，其在所述细胞和/或细胞包裹的空间布置，以及所述细胞和/或细胞包裹结合过程的时间次序方面需要高度的控制，尤其是当其涉及高度复杂的组织和/或器官的设计和/或修复时。然而，上述方式没有提供符合这些要求的任何解决方案。
发明内容
本发明的一个目的是提供克服了上述缺点的方法、物体和组装体。
这个目的是通过独立权利要求所阐述的方法和二维物体实现的。从属权利要求提出优选的实施方案。在这方面，值得提及的是下面给出的所有范围将理解为它们包括限定这些范围的值。
根据本发明，提供了用于提供细胞微载体（cell microcarriers）的组装体（assembly）的方法，其包括步骤：
a) 提供具有两个面的平面的二维物体(“薄片（flakes）”)，其中这些物体包含在施加外来刺激（extrinsic stimulus）时由平面状态转变为卷曲状态的材料，
b) 在所述薄片的一面上提供细胞（“细胞承载面”），
c) 通过施加所述外来刺激，使所述薄片从平面状态转变为卷曲状态，和
d）在步骤a）-c）的任意一步之前或之后将至少一种类型的连接剂(binding agent)结合到所述薄片。
通过这样做，对于本发明内各种各样的应用可以实现下列优点至少之一：
-通过所述“细胞包裹性”技术，可以保护细胞，例如在贮存期间。
-所述“薄片”允许构建复杂结构；如稍后将描述的那样。
-由于所述外来刺激，可以把将细胞提供于薄片上的步骤和“包裹”步骤分开，而不是被迫在拓扑（topological）不利的环境中生长和/或提供细胞。
所述将至少一种类型的连接剂结合到所述薄片的步骤可以在它们的平面状态（即步骤c之前）进行，也可以在它们的卷曲状态（即步骤c之后）进行。此外，所述步骤可以在所述细胞结合到所述薄片之前（即步骤b之前）进行，也可以在所述细胞结合到所述薄片之后（即步骤b）之后进行。
如这里使用的术语“将至少一种类型的连接剂结合到所述薄片”，是指：
（i）具有连接剂能力的独立实体（entities）对所述薄片的字面含义(literal)结合，例如通过将它们共价或非共价地结合到所述薄片，和/或
（ii）已经形成所述薄片的一部分的化合物物质的改性，即通过所述薄片的表面分子的化学官能化或活化。
关于选项（i），一个优选的实施方案确实包括交联剂的使用。交联剂是能够在彼此间建立共价键的分子。同双官能交联剂（homobifunctional）具有两个相同的反应性基团，而异双官能交联剂（heterobifunctional）具有两个允许顺序（两阶段）连接的不同的反应性基团。交联剂含有至少两个反应性基团。用于交联的目标基团包括伯胺、巯基（sulfhydryls）、羰基（carbonyls）、碳水化合物和羧酸（表1）。
| 反应基团 | 目标 | 反应基团 | 目标 |
| 芳基叠氮化物 | 非选择性的 | 马来酰亚胺 | 巯基 |
| 碳二亚胺 | 胺/羧基 | NHS-酯 | 胺 |
| 酰肼 | 碳水化合物 (氧化的) | PFP-酯 | 胺 |
| 羟甲基膦 | 胺 | 补骨脂素 | 胸腺嘧啶 |
| 亚氨酸酯 | 胺 | 吡啶二硫醚（pyridyl disulfide） | 巯基 |
| 异氰酸酯 | 羟基(非水性的) | 烯基砜 | 巯基、胺、羟基 |
表1
上述情况中交联的一个例子是基于蛋白质的连接剂（例如抗体、或生物素等）对薄片的结合，采用EDC/NHS-化学（即N-（3-二甲基氨基丙基）-N’-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS））。
其它可能包括通过连接反应（ligation reactions）（尤其是在所述连接剂是核酸的情况下，见下文）、通过环氧化物（其形成所述薄片的部分）与胺的反应、通过胺与双键的迈克尔（Michaels）加成或通过非共价结合，例如多重氢键键合（multiple hydrogen bonding）、寡核苷酸杂交(oligonuclutide hybridization)和/或甲基-配体络合，的连接剂结合。
关于选项（ii），可以在所述薄片的形成过程中加入所述连接剂，例如通过用反应性基团改性所述连接剂和在水凝胶单体混合物聚合之前将其与水凝胶单体混合物混合。
在一个优选实施方案中，根据本发明的方法特征在于所述连接剂被结合到与所述细胞承载面相反的所述薄片的面。所述方法因此提供了含有细胞的卷曲薄片，在下文中也称为“细胞包裹”，其在它们的外面上承载有能够与其它实体建立结合的连接剂。
在本发明的又一优选实施方案中，提供的是所述方法含有以下额外步骤：
e）通过至少一种所述连接剂将如此得到的至少一个细胞包裹连接到至少一个其它实体。
这种其它实体包括：
（i）其它细胞包裹（cell wraps），
（ii）所述细胞包裹将要连接到其上的非细胞化合物，例如三维基质，如被用于体外组织工程的固体多孔支架，例如含有可生物降解的物质和/或胶原，
（iii）生命物质(living matter)，例如细胞外基质、细胞、组织和/或器官，
（iv）循环材料（circulating materials），例如病毒、抗体、细菌、孢子，和/或
（v）手术器械、植入物、培养皿和/或培养皿的图案化表面。
或可能想要连接所述细胞包裹的任何其它实体。
关键的是这些其它实体至少带有
（i）一种互补的连接剂，或
（ii）含有与所述连接剂互补的部分（“内在结合部分（intrinsic binding moiety）”）。
这里使用的术语“互补的连接剂”应该是指能够与另一连接剂建立结合的连接剂。优选地，所述互补的连接剂以高特异性与后者结合。通过这种方式，可以建立所述细胞包裹与相应其它实体之间的组装体。如果使用不同的连接剂和互补连接剂的对，能够如此制备高复杂性的组装体。
此外，可以如此制备自组装复合体(complex)，即仅仅通过将不同的实体结合到所述细胞包裹。
选项（i）是优选的选项，而选项（ii）可以在一些情况下使用，在这些情况下第二实体具有与所述连接剂互补的内在部分。这种部分可以例如是抗原（在这种情况下所述连接剂是抗体）、组织特异性标志物（在这情况下所述连接剂可以是识别所述标志物的蛋白质）或糖（在这种情况下所述连接剂可以是例如凝集素）。
重要的是指出，抗原、组织特异性标志物和糖也充当互补连接剂，即当它们不是所述其它实体的组成部分或内在部分时。
这意味着连接剂是否能够作为广义的连接剂或作为上述情况下内在结合部分是其是否是所述实体的组成部分或内在部分的问题。
在一个优选的实施方案中，可以将多于一种的连接剂添加到细胞包裹。例如，一种连接剂类型可以以其连接到三维基质的方式选择，而另一种连接剂以其可以连接其它细胞包裹，携带互补的连接剂，的方式选择。根据该实施方案，可以将第一细胞包裹用作锚固装置(anchoring device)，然后其它细胞包裹类型可以与其连接。
所提及的连接剂能够形成共价键或非共价键。
在本发明的一个优选实施方案中，提供的是所述连接剂选自由蛋白质和多肽、核酸、分子标签、配体、磁性实体和/或带电基团组成的组。
值得注意的是，上述连接剂能够与其它连接剂建立非共价键。
所述非共价键尤其包含氢键、蛋白质蛋白质相互作用、离子键、疏水相互作用、范德华力和偶极-偶极键(dipole-dipole bond)。
存在许多蛋白质和寡肽对给定的目标呈现特异性的结合性能是众所周知的事实。这些蛋白质的非限定性的例子尤其是抗体（尤其是单克隆抗体）、胶原结合蛋白、锚蛋白重复序列、整合素、链霉亲和素、亲和素和生物素。
胶原结合蛋白是结合胶原的蛋白质。此类蛋白质的例子例如是CbpA（化脓隐秘杆菌(A. pyogenes)的胶原结合蛋白）、CNE（马链球菌(Streptococcus equi)的胶原结合蛋白）、KINDLIN-3、嗜肺性军团菌的胶原结合蛋白Mip、I-IV型胶原结合蛋白、整合蛋白(integrin proteins)等。
胶原结合蛋白的例子在Svensson L, Oldberg A, Heinegard D. Collagen binding proteins. Osteoarthritis Cartilage 2001; 9:S23-8. 4中给出，其内容通过引用并入本文。
这里使用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”尤其是指RNA、DNA、LNA、PNA、Morpholino和其它核酸类似物的单体、低聚物和聚合物。肽核酸（PNA）是与DNA或RNA类似的人工合成的聚合物，其共同特征(cofeatures)是由通过肽键连接的重复N-（2-氨基乙基）-甘氨酸单元组成的主链。锁核酸（LNA）是改性的RNA核苷酸，其中核糖部分用连接2’和4’碳的额外桥改性。Morpholinos是DNA的合成类似物，其与DNA的结构差异在于虽然Morpholinos具有标准的核酸碱基，但那些碱基是与吗啉环而非脱氧核糖环连接并通过磷二酰胺(phosphorodiamidate)基团而非磷酸酯连接。
所述寡核苷酸可以是单链的，或至少部分是双链的。在后一种情况下，为了在连接剂和它的互补连接剂之间实施结合，所述寡核苷酸可以具有所谓的“粘性末端(sticky ends)”，其以单链悬臂(single strand overhangs)为特征。悬臂是DNA分子末端中不成对的核苷酸的延伸。这些不成对的核苷酸可以位于任一个链中，生成3’或5’悬臂。此类粘性末端可以例如如如下所示：
5'-ATCTGACTATTTCG-3'
3'-TAGACTGA-5'
所述寡核苷酸将与以下序列的另一个粘性末端的寡核苷酸互补：
5'-ATCTGACTCGAAAT -3'
3'-TAGACTGA-5'
当使用双链的寡核苷酸作为连接剂时，为了获得双链变性，另一选择是将所述细胞包裹加热到高于所述双链的寡核苷酸的熔融温度的温度。这通常通过将所述混合物加热到高于85℃的温度实现。
确定所述熔融温度的一个方式是所谓的Wallace法，其适合长度小于18mers的寡核苷酸。其通过计算各个核苷酸碱基的频率实现。所述方法的原理是，因为与腺苷和胸腺嘧啶之间的两个氢键相比，胞嘧啶-鸟嘌呤对形成三个氢键，它们对双螺旋稳定性的贡献更大
T m = 2(A + T) + 3(G + C)
由于所述方式仅通过将温度升高到高于熔融温度的点，就允许装备有双链寡核苷酸连接剂的细胞包裹的受控结合，因此所述方式是高度有益的。
因此，能够简单地开始和停止不同细胞包裹的结合过程。当然，该方式只有当所述细胞允许这种过程（即如果它们是耐热的）时才是可能的。但是，可以获得能够降低所述核苷酸熔融温度的试剂，例如二糖海藻糖。
这些试剂帮助提高所述方式与活细胞的相容性。
使用该方式但不损害包含在所述细胞包裹中的细胞的另一方法是应用局部加热技术，如超声，尤其是高聚焦超声（HIUF）或光（例如双光子红外激发(two photon infrared excitation)、光子针(photonic needle)等），或使用磁性颗粒，所述磁性颗粒通过聚焦的交变电磁场被置于高频振动下，从而产生局部聚焦的温度增加。
本文中使用的术语“配体”是指能够与分子结合并形成络合物以服务生物学目的（例如实施细胞信号过程等）的物质。
这里使用的术语“磁性实体”是指具有抗磁、顺磁、铁磁、亚铁磁和/或超顺磁性能的实体，从而它们在其它材料上施加吸引或排斥力。所述磁性实体可以例如采用拴系磁性珠的形式。
这里使用的术语“带电基团”是指带有负、正和/或中性电电荷（包括部分电荷）的物质。这些基团能够在细胞包裹和另一实体（例如带有互补电荷的另一细胞包裹）之间形成离子键。此类可以结合到所述薄片的带电基团的例子可以尤其选自由带电氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、hististine、赖氨酸）、有机酸和碱、磺酸盐基团和/或吡啶基团组成的组。
术语“互补核酸”和“互补寡核苷酸”是指具有含有任何碱基胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）、腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）的碱基序列的核酸、多核苷酸和/或寡核苷酸，或是指能够根据Watson-Crick碱基配对机理杂交到其它核酸、多核苷酸和/或寡核苷酸的次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、异鸟嘌呤和异胞嘧啶。
术语“抗体”和“单克隆抗体”是指对给定的抗原呈现结合亲和力的免疫球蛋白分子，其通过经免疫的哺乳动物或通过重组微生物(recombinant microorganisms)制备。
凝集素是糖结合蛋白，其对于它们的糖部分是高度特异性的。它们典型地在涉及细胞和蛋白质的生物识别现象中发挥作用。例如，在感染过程中一些细菌使用凝集素来把它们自己结合到宿主生物的细胞上。
锚蛋白重复序列衍生自天然锚蛋白重复序列蛋白，其实质上用作具有各种功能（如细胞信号、激酶抑制或受体结合，这仅仅例举一小部分）的通用结合蛋白。这些锚蛋白重复序列例如在EP 1332209中描述。
链霉亲和素是从细菌链霉菌提纯的53kD蛋白，其对维生素生物素呈现强亲和力；所述生物素-链霉亲和素络合物的离解常数（Kd）在大约～10-15mol/l。亲和素是类似的蛋白质，其对生物素也具有强亲和力。
术语“分子标签”（有时也称为“亲和标签”）是指例如被用于蛋白质纯化的分子。这些标签尤其包含：
· 固定的金属离子，如Ni-NTA
· His-标签（六聚组氨酸）
· 甲壳质结合蛋白（CBP）
· 麦芽糖结合蛋白（MBP）
·rProtein L
·Cκ域(domain)
·Flag-标签（DYKDDDDK）
·Strep-标签
·Arg-标签
· HA-标签
· myc-标签
· GST（谷胱甘肽-S-转移酶）
· V5-标签
· BCCP标签
·钙调素标签
·S-标签
· GFP-标签（绿色荧光蛋白）
· 蛋白质A-标签
本领域技术人员将在以上列表中发现全面教导，这使得他无需额外的创造性步骤也能够发现
（i）与上述分子标签互补的连接剂，和/或
（ii）在此未提及的其它分子标签。
出于所述目的，技术人员可以参考相应的教科书、文献数据库、目录等。
如从上文已经显而易见的那样，连接剂可以具有其可以结合的互补连接剂，以将根据本发明的一个薄片与另一薄片连接。表2给出对一些优选的连接剂对的概述。
| 连接剂 1 | 连接剂 2 (互补的) |
| His标签 | 金属离子 (例如Ni-NTA) |
| 抗体 | 抗原* |
| 凝集素 | 糖、 糖蛋白、 糖脂* |
| 生物素 | 链霉亲和素、亲和素 |
| 胶原结合蛋白 | 胶原* |
| 寡核苷酸 | 互补的寡核苷酸 |
| 组织特异性配体 | 组织特异性受体* |
| 磁性珠 | 互补极性的磁性珠 |
| 带电基团 (例如 “+”) | 互补的带电基团 (例如“–“) |
| 亲水性基团 | 亲水性基团* |
| 疏水性基团 | 疏水性基团* |
表2
一些互补连接剂（尤其用星号*标记的那些）也可以作为内在结合部分，取决于它们是否是各个实体的组成部分或内在部分。
在本发明的又一优选实施方案中，提供的是以以下方式选择所述连接剂：它们赋予所述薄片或赋予前者的分区（subsections）疏水和/或亲水性能。
在该优选实施方案中，术语“连接剂”不被理解为形成与另一实体的共价或非共价键。
如果，例如薄片被提供有交替模式的疏水性和亲水性连接剂，那么如此制备的不同细胞包裹当混合时将以有序的方式自组装，以不同细胞包裹的亲水区域彼此接触，而不同细胞包裹的疏水区域也彼此接触的方式（例如参见图6）。
在本发明的又一优选实施方案中，提供的是所述连接剂能够构建共价键。
在一个优选实施方案中这些共价键是生物正交的(bio-orthogonal)，即
（i）它们必须对在所述薄片上生长的细胞的存活没有不利影响（它们必须是生物相容的），
（ii）为了提供特异性结合行为它们需要具有选择性反应性，和
（iii）它们必须对其中发生反应的组织或机体的存活和功能没有不利影响。
能够建立这样的键的结合机理包含例如所谓的“施陶丁格（Staudinger）反应”（即叠氮化物与膦或磷酸酯组合以产生膦亚胺(iminophosphorane)）、“施陶丁格连接（Staudinger ligation）”（即通过膦在叠氮化物的末端氮原子的亲核加成形成膦亚胺并排出氮气）、或所谓的“点击反应”（即所谓的“应力促进的[3+2]叠氮化物-炔环加成”）。
所述结合机理和能够实施这种机理的连接剂例如在US20080075661A1、WO2007110811A2和WO2007039864中公开。
在本发明的另一优选实施方案中，提供的是以图案化的方式向所述薄片添加至少两种不同类型的连接剂。
在这种情况下，术语“图案化的方式”是指不同连接剂的成员以这种方式彼此分离：所述薄片的给定部分只包含单一类型的连接剂。如此获得的图案可以例如是规则图案，例如格栅、条带阵列、网格、点或圆的二维阵列等。该定义还包括不均匀图案和不规则图案。
所述图案可以例如通过微印刷（例如微接触印刷、喷墨印刷）或平板印刷和/或照相平板印刷技术获得。
而且，在本发明的一个优选实施方案中提供的是步骤b）包含以下子步骤：
b1) 在所述薄片上接种细胞；和
b2) 使所述细胞生长。
在所述转变之后，从前的平面薄片可以例如采取圆柱形状，末端开放或基本上关闭。对于这种形状的实例，参见图2或3。所述薄片典型的尺寸大约是细胞的尺寸或比其稍大。这意味着根据本发明的一个优选实施方案，所述平面水凝胶薄片的大小或长度是≥10μm和≤100mm，更优选≥10μm和≤10mm，和更优选≥20μm和≤1mm，和最优选≥50μm和≤500μm。
根据本发明另一个优选实施方案，平面薄片的厚度是≥100nm和≤1mm，更优选≥500nm和≤500μm，和最优选≥1μm和≤100μm。
根据本发明又一个实施方案，卷起状态的薄片(包括细胞)的内径是≥1μm和≤5mm，更优选≥5μm和≤500μm，最优选≥10μm和≤100μm。
除起码的细胞生长之外，在薄片转变为卷曲状态前，细胞可以保留在平面薄片上进行分化。这意味着在步骤b)和c)之间，可以加入分化步骤。同样地，可以在步骤b)和c)之间促进细胞分裂、细胞生长和细胞增殖(cell profilation)。本领域技术人员根据他的知识或适当的参考文献可以容易地选择为了实现如上提及的细胞分化将要应用的条件。
大多数情况下，将使用标准细胞培养条件。哺乳动物细胞，包括例如人细胞，优选在37℃、5% CO2-气氛下培养，以保持pH处于生理范围内。可以使用标准生长培养基例如用FCS (胎牛血清)补充的合成培养基，和如有必要，可以添加生长因子、抗生素等等。然而，同样落在本发明范围内的昆虫细胞、植物细胞和原核细胞将以不同条件处理，其本身是本领域所熟知的。
此外应理解薄片的形状可以类似正方形、矩形或平行四边形。然而为了实现更复杂的包裹状态，可以使用更复杂的形状。例如，为了实现螺旋状包裹状态，薄片应具有类似拉长平行四边形的形状。同样地，薄片也可以具有圆形、椭圆形、梯形，六边形、多边形或三角形形状，其在每种情况下将引起不同的包裹状态。拓扑地、机械地或以组合方式结构化的表面，和薄片内更复杂的分层也可有助于实现更复杂的包裹状态。
在这方面，值得提及的是卷起状态可以包括两种情况，即至少部分多层化的圆筒，如图2中可见，或仅基本上闭合的圆柱体。后者意味着两个接触边缘基本上没有重叠，这也将允许薄片闭合侧边之间更尖锐的角度(sharper angles)。
通常，期望细胞仅仅存在于薄片上，不存在于薄片之间的基底上。为了避免细胞安置在薄片之间的间质(interstitium)中，可以改性下面的基底表面使得细胞不粘附于它，或使得细胞具有明显的偏好，生长在薄片上而不是基底上。然而，有时候即使细胞也生长在基底上也无关紧要。一旦薄片被释放和卷起，就可以丢弃具有剩余细胞的基底。
在一些特殊情况下，薄片之间的间质中有细胞甚至可能有益。例如，一些困难的细胞类型需要共饲养细胞(co-feeder cells)来生长，即为了产生适当的生长因子。这些饲养细胞可以接种在薄片之间，而感兴趣的细胞生长在薄片上。
在又一实施方案中，不仅各种细胞包裹可以彼此结合，容器或含有细胞包裹的容器也可以与细胞包裹结合。这些容器可以例如用于递送帮助控制细胞的生长因子（例如控制细胞分化的生长因子）。术语“容器”还包含含有所述物质的水凝胶制品，并且其被用于这些物质的受控释放。所述释放也通过本文提到的任何外部刺激进行诱导。上述极大的多面性可以用于控制不同生长因子的空间和时间释放。
在许多情况下为了获得适当的分化，必须以特定的顺序在精确规定的时间递送数种生长因子/细胞因子。通过本实施方案，可以递送含有细胞的第一组细胞包裹，之后递送含有生长因子“A”的细胞包裹。在一定时间之后，可以再次移除含有生长因子“A”的容器并且可以递送含有生长因子“B”的另一容器。从而，不同的生长因子可以以协同作用的方式对首先递送的细胞起作用。在此之后，可以例如递送另一组细胞并以类似或不同的方式处理。
根据本发明方法的一个优选实施方案，所述刺激选自由以下组成的组：
·诱导的pH变化，
·诱导的温度变化，
·诱导的暴露于电磁波，
·诱导的暴露于离子、特定的盐或有机化合物，或暴露于其给定浓度，
·施加电场，
·施加磁场，
·施加声音，
·施加振动，
·诱导的暴露于酶和其它生物分子或诱导的抑制酶和其它生物分子，
·诱导的从所述基底释放，和/或
·诱导的暴露于溶剂组合物。
至于热刺激，优选例如当加热(例如≥36℃)时，薄片处于平面状态，而冷却(例如≤35℃)时，它们转变为卷曲状态。这特别有益，因为通过冷却薄片(以及其中包含的细胞)，细胞将停止生长，和它们的代谢速度下降。因而细胞可以储存用于运输或准备用于各个应用，没有损伤或不利影响。同样优选选择施加的刺激，从而不损害细胞的生理机能(physiology)。
此外，在一个优选实施方案中，提供的是薄片包含具有可逆溶胀性能等等的刺激响应性材料，即所述刺激可以施加多次。
应理解术语“电磁波”包括可见光、紫外线和红外光、X射线、微波、无线电波等等。还应理解术语“声音”包括超声和次声，以及可听声。
从基底的诱导释放（其可以导致薄片转变成卷曲状态）可以例如通过温度变化和/或pH变化完成。
将理解的是，也可以提供的是在它们的卷曲状态的薄片可以对上述类型的外部刺激有响应，并因此当提供正确的刺激时能够再次转变成平面状态，从而将细胞暴露于环境。为了该目的，例如可以提供的是通过降低或升高pH或温度使所述薄片转变成卷曲状态，并通过升高或降低pH或温度再次转变成平面状态。
在薄片转变为卷曲状态之前或期间，优选它们从它们所粘附的基底被释放出来。在一个优选实施方案中，薄片的释放和卷曲都由所述薄片的溶胀启动。在这个实施方案中，释放和转变为卷曲状态同时发生。在非溶胀状态下，薄片中具有极少应力到没有应力，并且尽管薄片对基底的粘附不是最佳的，但薄片也将粘附到基底。在溶胀状态下，积累的应力和水凝胶层亲水性的改变将引起薄片释放。培养的细胞包括干细胞和分化的细胞，例如人和非人来源的成年间充质干细胞、成年造血干细胞、脂肪来源的成年干细胞、胚胎干细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、成肌细胞、心肌细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、树突状细胞、红细胞、淋巴祖细胞、骨髓祖细胞等等。然而，为了研究目的，或为了生产随后用于生产生物物质(biological matter)的细胞，甚至可以使用无限增殖化细胞，即杂交瘤细胞等等。
这也意味着在使用全能干细胞的情况下，步骤c)将在细胞开始分化前进行。在使用多能细胞的情况下，可在诱导步骤c)之前进行分化(至少一部分)，如以上阐述的那样。
在一个另外的优选实施方案中，薄片包含标记物或标志物。这样的标记化例如可以通过使用染料、磁性珠、X射线标志物、MRI标志物或靶向部分如抗原、凝集素、反应基团等等实现。
标记薄片比标记细胞本身是更好的方式，因为这种标记可能不利地影响细胞器，包括细胞核和核酸，以及细胞生理、细胞酶、细胞代谢等等。
这种标记例如确实允许设计由多于一种细胞类型组成的组织，因为各个薄片可以例如通过它们的标记化被识别、选择和在支架中定位。这种定位还可以自动进行，例如通过专用机器人，在这种情况下由机器人自动探测各种标记物或标志物(例如荧光标志物)。
此外所述标记化确实允许生长因子的细胞类型特异性应用，这在包括不同细胞类型的组织工程中非常有益。同样，移液机器人可以用于这个目的。
当在细胞疗法中使用时，可以用组织特异性抗原标记不接触细胞的层。从而支持将薄片及其内容物递送至靶位点。
在这方面，X射线标记物和MRI标记物也可以促进卷曲的薄片的靶向。为了这个目的，可以使用X射线断层摄影机(tomograph)或MRI断层摄影机。此外，各标记物可分别用于控制靶生物体内部薄片的包裹和打开，或它们的完整性或降解。
这个方式有助于减少细胞疗法中所需细胞的数量，例如这引起降低成本和资源，因为培养的细胞很昂贵，并且它们的生产是时间和劳动密集型的。更重要的是，不保留在治疗区域内的细胞数量被降低。这再次减少了自由漂浮在靶体内并可能因此引起癌症或其它疾病的细胞的任何不需要的副作用。
此外，优选薄片含有提高生物相容性的试剂。例如，不接触细胞的层可以包括抗凝剂(anticoagulat)，例如肝素部分，以避免血液凝固。本领域技术人员将根据特殊需要选择提高生物相容性的其它试剂。例如，可以用特定锚固分子、生长因子等等改性接触细胞的层。
特别优选的是根据的薄片含有由水凝胶组成的材料。
这里使用的术语“水凝胶”意味着相应材料的至少一部分包含在水中形成水溶胀网络的聚合物和/或水溶性的聚合物链的网络。优选地，水凝胶渗透层在溶胀状态包含 
50%的水和/或溶剂，更优选
70%和最优选80%，其中优选的溶剂包括有机溶剂，优选有机极性溶剂和最优选链烷醇例如乙醇、甲醇和/或(异)丙醇。
特别优选响应性水凝胶。在本发明的意义上，术语“响应性”意思是和/或包括尤其是水凝胶是以这样的方式响应：在特定参数改变，如靶分子的添加或施加特定刺激时，其经历形状和总体积的改变，所述特定刺激的性质上面有进一步说明(例如诱导的pH改变、诱导的温度变化、诱导暴露于电磁波、诱导暴露于特定的盐或有机化合物或其给定浓度、施加电场、施加磁场、施加声音、施加振动)。其它刺激包括专用分析物例如酶或其它生物分子的存在或浓度。(见上述评论)。
已知水凝胶形状对pH、离子浓度、温度、溶剂组成和电势敏感。这些参数可以引起物相(phase)、形状、机械学(mechanics)、折射率、识别率或渗透率的改变，其之后可以逆转以将材料回复其原始状态。刺激敏感性水凝胶也已经与酶、蛋白模拟物和抗体集成以设计可控的制动器(actuators)。这些水凝胶已经被示出当添加靶分子(target molecule)时溶胀或收缩。这些水凝胶的溶胀(或收缩)量归因于聚合物网络内部非共价相互作用的改变。水凝胶还可以被设计成在靶分子存在下溶胀或收缩；甚至可以以溶胀（或收缩）大小与存在的配体的浓度成比例的方式构建它们。
根据本发明的一个实施方案，水凝胶材料包括选自包含聚(甲基)丙烯酸类材料、取代的乙烯基材料或其混合物的组的材料，以及包括epoxydes、氧杂环丁烷类和硫醇烯类(thiolenes)。
根据本发明的另一个实施方案，水凝胶材料包括由至少一种(甲基)丙烯酸类单体和至少一种多官能(甲基)丙烯酸类单体聚合制成的聚(甲基)丙烯酸类材料。
根据本发明的又一个实施方案，所述(甲基)丙烯酸类单体选自包含以下的组：(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸羟乙基酯、 (甲基)丙烯酸乙氧基乙氧基乙基酯或其混合物。
根据本发明的又一个实施方案，所述多官能(甲基)丙烯酸类单体是双(甲基)丙烯酰基和/或三(甲基)丙烯酰基和/或四(甲基)丙烯酰基和/或五(甲基)丙烯酰基单体。
根据本发明的一个实施方案，所述多官能(甲基)丙烯酸类单体选自包含以下的组：二(甲基)丙烯酰胺、二甘醇二 (甲基)丙烯酸酯、三甘醇二 (甲基)丙烯酸酯、四甘醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、乙氧基化双酚-A－二(甲基)丙烯酸酯、己二醇二(甲基)丙烯酸酯或其混合物。
在发明人所进行的测试中被证明适于上述目的的其它材料包括丙烯酸乙基己基酯、甲基丙烯酸羟乙酯、PNIPAA-co-甲基丙烯酸异丁酯(80:20)、PMMA、PMMA-co-三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、TMPTA、DEGDA、DEGDMA、聚苯乙烯、PMMA-co-DEGDA (2:1)、PMMA-co-DEGDMA (2:1)、PS-co-TMPTA (2:1)、PS-co-DEGDA (2:1)、PS-co-DEGDMA (2:1) 和三2-羟乙基异氰脲酸酯三丙烯酸酯(tris 2-hydroxyethyl isocyanurate triacrylate)。
根据本发明的一个实施方案，水凝胶材料包括阴离子聚(甲基)丙烯酸类材料，优选选自包括以下的组：(甲基)丙烯酸类、芳基磺酸、尤其是苯乙烯磺酸、衣康酸、巴豆酸、磺酰胺类或其混合物，和/或阳离子聚(甲基)丙烯酸类材料，优选选自包含以下的组：乙烯基吡啶、乙烯基咪唑、(甲基)丙烯酸氨基乙基酯或其混合物，与选自中性单体组的至少一种单体共聚，优选选自下组：醋酸乙烯酯、(甲基)丙烯酸羟乙基酯、(甲基)丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸乙氧基乙氧基乙基酯或其混合物，或它们的混合物。
已知很多这些共聚物作为pH或温度的函数改变它们的形状，和响应施加的电场和/或电流。因此这些材料可能对本发明内的各种各样的应用有用。
根据本发明的一个实施方案，水凝胶材料包括被取代的乙烯基材料，优选乙烯基己内酰胺和/或被取代的乙烯基己内酰胺。
根据本发明的一个实施方案，水凝胶材料是基于热响应性单体，选自包含以下的组：N-异丙基酰胺、二乙基丙烯酰胺、羧基异丙基丙烯酰胺、羟甲基丙基甲基丙烯酰胺、丙烯酰基烷基哌嗪，和其与选自亲水性单体组的单体的共聚物，亲水性单体包括(甲基)丙烯酸羟乙基酯、(甲基)丙烯酸、丙烯酰胺、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯或其混合物，和/或与选自疏水性单体组的单体共聚，疏水性单体包括(甲基)丙烯酸(异)丁基酯、甲基丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯或其混合物。已知这些共聚物已知是热响应性的，因此可以用在本发明中的各种各样的应用中。
这些响应性水凝胶的一个优选实例是聚-n-异丙基丙烯酰胺 (PNIPAA)。
上述水凝胶对低分子化合物，即盐、糖类、类脂类、生长因子、氧气等等是高度可渗透的。因此，包括这些凝胶的薄片将为细胞提供合适的生长条件，甚至在包裹状态下。
在另一个实施方案中，与细胞接触的层不是水凝胶材料。在这些情况下，优选接触层被如此构建以使它含有允许营养成分和代谢物运输的洞或微孔。然而，也可以通过包裹物(wrap)的“开口侧”进行运输。
此外，优选薄片包含双层结构。通过为不同层选择合适材料，在给定的刺激可以实现两层的不同溶胀，例如由于不同的热膨胀系数、水吸收等等。这个差异提供了薄片运动即卷曲所需的驱动力，其导致卷曲状态。在前者的一个优选实施方案中，薄片由非响应性层和由响应性水凝胶制成的层组成。
薄片也可以包括三或更多层结构或梯度结构，即溶胀或胶凝组分的垂直浓度梯度，其可以引起类似的行为。上述梯度可以用本领域技术人员熟知的方法产生。例如，通常用于产生用于电泳的梯度凝胶的梯度混合器可以用于这个目的。产生组成梯度的另一个方法是通过利用聚合速度垂直梯度来引起后者(例如通过使用UV吸收剂的强度梯度)。
在这方面，值得提及的是上述层中的至少一个可以包含结构化的表面。
三层的实施方案例如可以包含非常薄的顶层，从而不影响引起卷曲运动的应力机械学(stress mechanics)，但是它包含与细胞生长非常相容或甚至促进细胞生长的组成。
然而，在其中在薄片上生长具有高融合的粘附细胞片的情况下，也可使用单层薄片，即无梯度或分层设置的薄片。在这些情况下，细胞片本身作为第二层并且单层薄片和粘附细胞片之间的膨胀行为的差异引起薄片卷曲成包裹状态。这个特征对本发明的另一个优选实施方案特别有用，其中细胞的粘附被用于确定细胞所处的细胞周期状态，因为在一些状态下，细胞比在其它状态下对其粘附点施加更大的拉力。
在又一个优选实施方案中，提供的是薄片包含结构化的细胞接触表面。这可以刺激细胞粘附，或有助于特定地引导细胞的生长和定向。在这些情况下，结构化的细胞接触层或结构化的非接触层可以诱导薄片的优选卷曲方向。
此外，优选在细胞培养过程中施加外部刺激以影响细胞生长或细胞分化。
这种刺激例如可以选自由以下组成的组：施加生长因子、施加机械应力或施加电或磁场。特别是，根据细胞类型和各自的应用，这些刺激可以增强或阻止细胞分化，以及可以控制细胞生长的方向和形状。
为了提供在细胞已被包裹后仍然刺激细胞生长，还可以向接触细胞的层中添加生长因子。
此外，优选在接种细胞前，薄片被安置或产生在支撑结构上。
在一个优选实施方案中，薄片包含可生物降解的和/或生物学上安全的材料。这对于组织工程和对于在细胞疗法中使用所述薄片都是重要的特征。例如，使用可生物降解材料在某些情况下允许薄片被直接给予对象。同样地，当使用所述薄片进行体外组织工程时，可以选择所述材料从而缓慢分解，其中分解速度对应于细胞生长的速度以及由生长细胞产生胞外基质(extra cellular matrix)的速度。在这个实施方案中，胞外凝胶基质逐步被活细胞物质替代。
例如Gunatillake P和Adhikari R, European Cells and Materials (5) 2003, 1-16描述了合适的可生物降解材料，其全部内容引入这里作为参考。这些当中是聚(羟基乙酸) (PGA)，聚(乳酸) (PLA)和它们的共聚物和衍生物，如聚(d,1-乳酸-co-羟基乙酸)，聚内酯如聚(己内酯) (PCL)和它们的衍生物，聚(反丁烯二酸丙二醇酯) (PPF)和它的衍生物，聚酸酐如聚[1,6-二(羧基苯氧基)己烷]，酪氨酸衍生的聚碳酸酯和它们的衍生物，聚原酸酯(POE)和它们的衍生物，具有无毒降解产物的聚氨酯(PU)如赖氨酸二异氰酸酯(LDI, 2,6-二异氰酸根合己酸酯)及其它脂肪族二异氰酸酯如六亚甲基二异氰酸酯(HDI)和1,4-丁烷二异氰酸酯，例如聚(乙交酯-co-γ-己内酯)、聚磷腈如甘氨酸乙酯聚磷腈和它们的衍生物，等等。
其它可生物降解的聚合物包括聚(马来酸)、聚对二氧环己酮(poly(p-dioxanone))、聚(碳酸三亚甲基酯)、聚(3-羟基丁酸酯)(poly(3-hydroxibutarate))、聚(3-羟基戊酸酯)(poly(3-hydroxyvalorate))和它们的共聚物。一类合适的响应性可生物降解聚合物是聚(N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺一/二乳酸盐/酯)，如Soga O等人, Biomacromolecules 2004 (5) 818-821中所描述，其全部内容引入这里作为参考。
其它合适的可生物降解材料包括藻酸盐、透明质酸、脱乙酰几丁质、胶原、明胶、蚕丝(silk)或它们的组合。
这些可生物降解材料可以使用它们本身，或它们与交联剂一起在网络中来使用。产生的网络将在一定时间之后分解，并且假定交联剂具有小分子量，后者将被洗掉。在另一个实施方案中，可生物降解材料被固定在由不能生物降解的物质组成的网络中。
在另一个优选实施方案中，提供的是薄片包含在施加外来刺激时分解的材料。这个特征例如可用于细胞疗法中，以便提高细胞在靶部位的释放。这可以例如通过施加超声或红外光实现，因为二者均显示良好穿透进入人体或动物体。
为了这个目的，卷曲的薄片被注入并通过在卷曲的薄片外侧的靶向部分靶向，并且当施加外部刺激时，后者可以打开并由此使细胞暴露于感兴趣区域。作为选择，薄片不被靶向，而是在整个身体均匀分布，而外部刺激仅仅集中于感兴趣区域。只有在那里卷曲的薄片才将会打开并释放它们的细胞内容物。
优选地，在根据本发明的过程中使用的细胞是贴壁细胞(adhering cells)。然而，也可以使用悬浮细胞。在这些情况下，可以提供的是包含悬浮细胞的液体由于毛细力而保持在卷曲的薄片中。
用上述方法生产的薄片的一个优选应用包括在薄片由平面状态转变为卷曲状态后，将卷曲的薄片以预定空间图案分布，以便产生三维组织。这种方式同样可以用于体外和体内组织工程。为了实现这个目的，可以使用支架，其分别预先决定待生产的组织或器官的形状，和其中沉积有根据本发明的细胞包裹。
采用这种方式，可以得到不同细胞类型的不均匀分布，这些细胞类型已经在不同的细胞培养中培养并且进行特殊处理并随后包裹在不同薄片中。用这种方式可以精确控制新生长组织中哪种细胞类型在哪个地方。作为选择，一种单一的全能或多能细胞类型(干细胞或祖细胞)可以在含有刺激分化为不同细胞类型的不同因子的不同薄片上培养。然后包裹物可以以预定方式分配和细胞将在组织工程期间成熟为不同的组织类型。因此，例如可以获得骨-软骨界面结构体。
薄片的另一个优选应用提供在薄片由平面状态转变为卷曲状态后，卷曲的薄片被调整为它们的开放末端彼此对准(the rolled flakes are being aligned with their open ends to one another)。通过这种方式，可以形成脉管或连续神经元。可以通过外部因素刺激卷曲的薄片的这种排列，外部因素例如几何限制、外部磁场或电场、流动和剪切，等等。
然而，当使用转变后采取如上所述的螺旋状形状的薄片时，可以获得相同类型的脉管状组织。
薄片的又一个优选应用提供的是承载生长的细胞的不同薄片在薄片由平面状态转变为卷曲状态前被叠加（superimposed）。通过将叠加的薄片转变为卷曲状态，获得可能具有不同来源的细胞的同轴排列。这使得能够使用不同细胞（如内皮、结缔组织、血管平滑肌细胞和外膜(包含神经)）的分层排列生产管状组织，如血管。
然而通过使卷起的薄片沉淀和排列到具有图案化的承载有细胞的平面薄片的基底上可以获得相同结果。当施加上述刺激时，这些薄片将由平面状态转变为卷曲状态薄片，由此包裹在沉积的卷起的薄片周围。同样，当使用转变后采取如上所述的螺旋状形状的薄片时，可以获得相同类型的脉管状组织。
所述薄片的另一个优选应用提供卷曲的薄片被深度冷冻。用这种方式，它们可以保存以备将来使用，后者在说明书中另外的地方详细说明。
在本发明的又一优选实施方案中，提供的是将如此制备的细胞包裹和/或细胞微载体的组装体递送到
i）体外组织-和/或器官－工程环境，和/或
ii）人类或动物的受损组织和/或器官。
这里使用的术语“体外组织-和/或器官－工程环境”应该是指为了形成组织和/或器官或它们的至少一个或多个部分，设想细胞在其中增殖的培养环境。
这种培养环境可以包含悬浮细胞培养体系、二维细胞培养体系和/或三维细胞培养体系，如固体多孔支架或基质，其例如含有可生物降解的物质和/或胶原。
在后一实施方案中，优选使用帮助修复受损组织的组织功能的干细胞。这种方法对于治疗神经变性疾病像阿尔茨海默氏病或帕金森症，以及修补坏死组织，例如由心脏中风(cardiac stroke)引起，很有前景。
在这里同样，根据本发明的细胞包裹提供了将细胞直接靶向给受损部位的方式。这引起成本降低和资源节约，和此外减少不保留在治疗区域内并最终可以引起癌症等等的细胞的数量。在该实施方案中，所述连接剂可以以它们与组织特异性试剂互补的方式进行选择。
在这两种情况下，根据本发明的连接剂为细胞包裹的位置特异性靶向和为不同细胞包裹彼此的受控偶联提供了有用的工具，任选提供自组装方法。
此外，另一个优选实施方案提供口服给予对象的包含细胞的薄片，即它们被吞咽。可以选择所述薄片的组成以便是抗唾液、胃液和酶和/或抗小肠、胰腺或胆的酶的。用这种方式，可以实现薄片保持完整无损，以便保护细胞直至它们到达肠内预定部位，这通过所述连接剂以上述方式进行支持。在那里薄片可以由于局部pH或特定试剂例如酶的存在而各自打开或分解，并让细胞发挥它们的作用。
又一个优选实施方案包括通过注入或手术将卷曲的薄片植入对象中，以便接管内分泌功能。在这种情况下，薄片含有内分泌细胞，即胰腺细胞，或产生内分泌试剂如胰岛素的细胞。通过所述连接剂薄片的靶向是可能的，如上面所描述的那样。
由于薄片的渗透性，营养成分进入内腔并由此饲养细胞。同样地，可以分泌内分泌试剂。同时，T细胞和巨噬细胞被保持在外，由此防止免疫反应。
此外，提供了用于制造根据上述权利要求任意一项的二维物体（“薄片”）和/或细胞包裹的方法，所述方法包含以下步骤：
a) 提供包括栅格的模具，其产生限定薄片形状的池(wells)；
b) 将前体材料浇铸到所述模具中，其一旦施加外来刺激就从平面状态转变成卷曲状态；
c）固化浇铸的材料以获得薄片；
d）任选地，通过施加所述外部刺激使所述薄片从平面状态转变为卷曲状态（“细胞包裹”）；
e）在步骤a）-c）任一之前或之后将至少一种类型的连接剂结合到所述薄片。
优选在固化后，从模具释放薄片，并然后根据上面描述的方法使用。然而，薄片也可以保留在模具中。在这个实施方案中，模具可以例如充当支撑结构用于随后的细胞培养。
可提供的是这个方法被用于提供二、三或多层薄片。在这种情况下，将要重复浇铸和固化步骤。通过使用用于不同层的不同前体材料，如上所述，可以实现产生的薄片可通过施加外来刺激由平面状态转变为卷曲状态。合适的材料已在上面详细描述。所述固化例如可以通过应用紫外线、电子束、热或专用固化剂实现。然而，也可以使用自固化材料。
在这个方法的一个优选实施方案中，提供的是几个层被浇铸入模具中以便获得多层薄片。这意味着首先浇铸和固化第一层。其后浇铸和固化第二层，等等。同样地，可以提供的是在整个浇铸过程中，在薄片中获得梯度结构，例如溶胀或胶凝组分的垂直浓度梯度。例如所述梯度可以通过在固化期间在层上施加光强度梯度而形成。
此外，可以提供的是下列任何添加剂被添加到前体材料中：
（i） 提高生物相容性的试剂；
（ii）可生物降解的和/或生物学上安全的材料：
（iii）标记物或标志物；和/或
（iv） 生长因子；
（v）抗生素。
在又一个优选实施方案中，提供的是在固化之前或之后，在薄片中实现结构化的表面。这例如可以通过使用压在薄片表面上的结构化的模板来进行。也可以光聚合所述水凝胶层，例如使用吸收剂以得到厚度方向上的梯度。在这方面，例如可以使用两次(或更多次) UV曝露。优选地，步骤之一可包括使用掩模以获得表面图案。
另一个选择是使用偏振光以产生结构化的表面。在这种情况下，通过在偏振面中选择性固化或光解（photolysation）可以获得线性化的结构。通过用不同偏振面重复这个过程，可以在表面上产生栅格图案等等。
根据本发明的另一个方面，提供了二维物体(“薄片”)，具有在上述方法中阐述的结构和/或材料性质，或用上述制备方法制备。
上述部件，以及要求保护的部件和根据本发明在描述的实施方案中要使用的部件在它们的大小、形状、材料选择和技术概念方面没有任何特殊例外，从而相关领域中已知的选择标准可以不受限制地应用。
本发明进一步的目的是：
·根据本发明使用的或使用根据本发明的方法制造的二维物体（“薄片”）和/或细胞微载体（“细胞包裹”）。
·使用根据本发明的方法制造的细胞微载体（“细胞包裹”）的组装体，和/或
·含有使用根据本发明的方法制造的细胞微载体的细胞微载体（“细胞包裹”）的组装体
·由承载细胞并通过施加外部刺激转变成卷曲状态的二维物体组成的细胞微载体（“细胞包裹”）的组装体，其中至少两个细胞微载体通过至少一种连接剂彼此连接。
附图说明
在从属权利要求、附图和各个附图和实施例的下列描述中公开了本发明目的的另外细节、特征、特点和优点，其中实施例以示例方式展示了根据本发明的方法和薄片的优选实施方案。
图1示出了根据本发明方法的第一步骤，
图2示出了根据本发明方法的后续步骤，
图3示出了根据本发明的两个细胞包裹的显微照片，包括含有响应性水凝胶材料的双层结构。
图4示出了将连接剂连接到所述薄片的原理；
图5示出了所述连接剂如何可以用于将所述细胞-细胞包裹连接到其它实体；
图6演示了基于含有具有不同结合性能的不同区域的细胞包裹的细胞组装体形成；
图7说明了其中给定的细胞包裹类型含有基质特异性连接剂的方法；
图8示出了本发明的一个实施方案，其中使用了多种不同连接剂；
图9示出了本发明的一个实施方案，其中细胞包裹仅仅暂时与其它细胞包裹结合；和
图10示出了其中使细胞包裹与另一细胞包裹结合并之后通过断裂再次移除的实施方案。
具体实施方式
在下文中，通过实施例的方式说明本发明，所述实施例不应被理解为限制本发明的范围。
图1示出了根据本发明方法的第一步骤。其中，提供支撑结构10，在其上设置或制造具有两个面的二维物体11（“薄片”）。
所述薄片含有一旦施加外部刺激即从平面状态转变成卷曲状态的材料。然后将细胞12接种到所述薄片的一个面上（“细胞承载面”），和将基底保持在能够使细胞生长的条件下。在对薄片进行另外的处理之前，从支撑结构释放它们。薄片典型的尺寸是大约细胞的尺寸或比其稍大，例如100 x 100 μm。
由图1明显看出细胞仅仅存在于薄片上，不在薄片之间的基底上。为了避免细胞安置在薄片之间的间质中，可以改性下面的基底表面使得细胞不粘附于它，或使得细胞具有明显的偏好，生长在薄片上而不是基底上。然而，有时候即使细胞也生长在基底上也无关紧要。一旦薄片被释放和卷起，就可以丢弃具有剩余细胞的基底。
在这里未显示的一些特殊情况下，薄片之间的间质中有细胞甚至可能有益。例如，一些困难的细胞类型需要共饲养细胞来生长，即为了产生适当的生长因子。这些饲养细胞可以接种在薄片之间，而感兴趣细胞生长在薄片上。
图2显示了根据本发明方法的后续步骤。具有细胞21的薄片20暴露于外来刺激，用波浪形箭头表示。
所述刺激可以包括例如热、pH改变，或暴露于电磁波(更多细节参见说明书)。暴露于所述刺激在薄片中引起响应，即前者被由平面状态转变成卷曲状态（“细胞包裹“），如相应箭头指出的那样。用这样的方式，生产了如上定义的细胞包裹。
图3示出了根据本发明的两个细胞包裹的显微照片，其包含含有响应性水凝胶材料的双层结构。所述细胞包裹尺寸为700×1400μm，当卷起时它们具有约500μm的直径。用于将所述薄片从平面状态转变成细胞包裹状态的刺激是热刺激。为了诱导细胞包裹性运动，将所述薄片置于室温的水浴中。在室温，所述响应性水凝胶在水中呈现强烈的溶胀，结果所述图案化的薄片从所述基底释放并卷曲。一旦将所述水浴加热到高于33℃，水凝胶塌陷(PNIPAA具有33℃的低临界溶液温度(LCST))和水凝胶层收缩。结果，当加热水浴高于33℃时，所述双层打开。
图4示出了将连接剂结合到所述薄片的原理，在该实施例中，其由两个层2和3组成。为了简单起见，在本申请中示出的薄片和细胞包裹只描绘成具有一个或两个层，尽管它们也可具有三个或更多的层。
细胞1在所述薄片的上层2上生长。所述连接剂4用箭头表示，其已经被结合到所述薄片的下层3，即结合到与细胞承载面相反的面。一旦所述薄片被转变成它们的卷曲状态（“细胞包裹“），所述连接剂就被配置在这些细胞包裹的外面，然后如上所述能够用于将如此获得的细胞包裹连接到至少一个其它实体。
还要提到的是，作为图4中所示的方法的变体，可以在所述薄片已经转变成它们的卷曲状态之后将所述连接剂结合到所述薄片。连接剂和它们的互补对应物的例子在表1中给出。
图5示出了所述连接剂如何可以用于将所述细胞-细胞包裹连接到其它实体。根据图5A，具有不同连接剂4和5（其是互补的）的细胞包裹被用于将两个不同的或相似的细胞包裹在共价键或非共价键6（其是特异性的并具有高亲和力）形成的情况下彼此结合。
根据图5B，也可以将所述连接剂用于将细胞包裹结合到不同于细胞－细胞包裹的实体8，如器官、组织、人工支架等。所述互补的连接剂7可以例如用于将所述细胞包裹靶向到特定的器官8。为了该目的，所述互补的连接剂7可以例如是与所述细胞包裹的连接剂互补的组织特异性的标志物。
同样地，所述实体8也可以是三维基质的一部分，如用于体外组织工程的固体多孔支架，例如含有可生物降解的物质和/或胶原。
图6演示了基于含有具有不同结合性能的不同区域的细胞包裹的细胞组装体的形成。在该实施例中所述细胞包裹的外层由六个交替区域组成，其中3个含有连接剂A（14）而另3个含有连接剂B（15）。重要的是，在该实施例中，使用的所有细胞包裹都具有相同的连接区域图案。然后，取决于它们的化学特性，所述连接剂A和B将共价或非共价地彼此结合，并且从而能够形成细胞包裹的网络。重要的是，在某些情况下，所述结合过程无需任何额外步骤即可发生，即其因此是自组装过程。
图7说明了一种方法，其中给定的细胞包裹类型除了之前所述的连接剂A（14）和B（15）之外，还含有基质特异性的连接剂C（“归巢分子（homing molecule）”；16），其用于将所述细胞包裹连接到携带互补连接剂D（17）的三维基质8（例如人类的器官、组织、支架等）。一旦所述细胞包裹已经连接到所述基质，携带与A和B互补的连接剂的其它细胞包裹就与该第一细胞包裹连接，其在该实施方案中也充当锚固装置。通过这种方式，可以设计结构化的人造组织。因此，连接剂C可以用于将细胞包裹特异性地引导向体内的目标组织，而随后连接剂A和B可以用于以结构化的方式建立新的人工组织。
虽然在图7A中，连接到第一细胞包裹（“锚固装置”）的细胞包裹是相同的，但是图7B示出了所述方法的变型，其中前者是不相同的。例如，在左边示出的细胞包裹只携带类型B的连接剂。这些不同的细胞包裹使更复杂的组织得以制备，而在某些情况下所述方法仍可以是自组装方法。
图8A示出了本发明的另一实施方案，其中使用了多种不同的连接剂19-22以结合各自含有特定细胞类型的多种不同的细胞包裹13、23。在该实施方案中，所述连接剂是寡核苷酸，其中细胞包裹13连接到细胞包裹23（其可以例如含有与前者不同的细胞）。寡核苷酸连接剂20（TTAG）与寡核苷酸连接剂21（AATC）互补，而寡核苷酸连接剂22（GCCA）与下面的细胞包裹的寡核苷酸连接剂互补，诸如此类。
尽管寡核苷酸当然可以更长，和/或是双链的（见上文），但图8A的寡核苷酸连接剂含有单链四聚体（quadramers）。
由于寡核苷酸以高特异性（根据它们的序列）彼此结合，因此能够实现结合组合的高多样性。含有4个核苷酸的寡核苷酸因此可以产生44 = 256种变化，而具有6个核苷酸的寡核苷酸因此可以产生46 = 4096种变化。这意味着寡核苷酸越长，连接剂的多样性越高，而且结合强度和特异性越高。
图8B示出了不同细胞包裹的高特异性结合原理与在一个细胞包裹中使用不同结合分子的组合。通过这种方式，可以构建复杂的细胞包裹网络，允许将几种细胞类型带入将要构建的人工组织内的特定位置。
图9A示出了本发明的另一实施方案。这里，细胞包裹仅仅暂时地结合到其它细胞包裹。这可以通过断裂特定的键6，或通过断裂特别的连接体24实现，其仅仅为了该目的而被引入所述连接剂之一之中。通过所述断裂过程，所述连接体然后分成两部分25和26。
为了实现这一点，所述连接体可以：
（i）是能够通过肽酶或蛋白酶特异性地水解的肽，或
（ii）所述连接体能够由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸可以通过限制性内切酶（如EcoRI）特异性地切割，如图9B中所描绘，或所述连接体可以由寡核苷酸组成，所述寡核苷酸一旦加热（见上文，尤其是在局部加热过程和/或降低熔融温度的试剂的帮助下）就熔融，如图9C中所描绘。
在所述方法的过程中，移除细胞包裹的可能性使得能够进行不同细胞包裹的顺序结合和移除，如图10中所描绘。
在图10A中，示出细胞包裹与另一细胞包裹结合并在后面通过断裂再次移除，然后加入另一细胞包裹。根据图10B，加入一类型的细胞包裹，随后加入另一类型，并且然后通过断裂移除第一细胞包裹。所述方法至少在理论上可以无限地变化和延续。
Claims (12)
1.用于提供细胞微载体，即细胞包裹，的组装体的方法，其包含以下步骤：
a）提供具有两个面的平面的二维物体，即薄片，其中这些物体包含在施加外来刺激时由平面状态转变为卷曲状态的材料，
b）在所述薄片的一个面，即细胞承载面，上提供细胞，
c）通过施加所述外来刺激将所述薄片从平面状态转变成卷曲状态，即细胞包裹，
d）在步骤a）-c）中的任何步骤之前或之后将至少一种类型的连接剂结合到所述薄片，和
e）通过至少一种所述连接剂将至少一个如此得到的细胞包裹连接到至少一个另外的实体，
其中所述连接剂选自由蛋白质和多肽、核酸、分子标签、配体和/或带电基团组成的组，和/或以以下方式选择所述连接剂：它们赋予所述薄片或赋予前者的分区疏水和/或亲水性能。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于将所述连接剂结合到与所述细胞承载面相反的所述薄片的面上。
3.根据上述权利要求任意一项的方法，其特征在于所述连接剂能够构成共价键。
4.根据权利要求1和2任意一项的方法，其特征在于以图案化的方式向所述薄片添加至少两种不同类型的连接剂。
5.根据权利要求1和2任意一项的方法，其特征在于步骤b）包含以下子步骤：
b1）在所述薄片上接种细胞，和
b2）使所述细胞生长。
6.根据权利要求1和2任意一项的方法，其特征在于所述刺激选自由以下组成的组：
·诱导的pH变化，
·诱导的温度变化，
·诱导的暴露于电磁波，
·诱导的暴露于离子、特定的盐或有机化合物，或暴露于其给定浓度，
·施加电场，
·施加磁场，
·施加声音，
·施加振动，
·诱导的暴露于酶和其它生物分子或诱导的抑制酶和其它生物分子，
·诱导的从基底释放，和/或
·诱导的暴露于溶剂组合物。
7.根据权利要求1和2任意一项的方法，其特征在于所述薄片含有由水凝胶组成的材料和/或所述薄片含有双层结构、三层结构、多层结构和/或梯度结构。
8.根据权利要求1和2任意一项的方法，其特征在于在所述薄片由平面状态转变为卷曲状态前承载已生长的细胞的不同薄片被叠加。
9.用于在培养环境中增殖细胞的方法，其特征在于根据前述权利要求制备的所述细胞微载体的组装体和/或细胞包裹被递送到
i）体外组织和/或器官工程环境中。
10.用于制造根据上述权利要求任意一项的二维物体即薄片和/或细胞包裹的方法，其包含以下步骤：
a) 提供包含栅格的模具，其产生限定所述薄片的形状的池；
b) 将前体材料浇铸到所述模具中，其一旦施加外来刺激就从平面状态转变成卷曲状态；
f) 固化浇铸的材料以获得薄片；
g）任选地，通过施加所述外来刺激将所述薄片从平面状态转变成卷曲状态，即细胞包裹，
h）在步骤a）-c）中的任何步骤之前或之后将至少一种类型的连接剂结合到所述薄片，
其中所述连接剂选自由蛋白质和多肽、核酸、分子标签、配体和/或带电基团组成的组，和/或以以下方式选择所述连接剂：它们赋予所述薄片或赋予前者的分区疏水和/或亲水性能。
11.用根据权利要求10的方法制造的二维物体，即薄片，和/或细胞微载体，即细胞包裹。
12.细胞微载体，即细胞包裹，的组装体，含有用权利要求10的方法制造的细胞微载体，或由承载有细胞并通过施加外来刺激转变成卷曲状态的二维物体组成，其中至少两个细胞微载体通过至少一种连接剂彼此结合。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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