CN1641017A - 一种用于大规模培养细胞的微载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于大规模培养细胞的微载体。该微载体是将壳聚糖和明胶按下述步骤制得：首先将壳聚糖醋酸水溶液和明胶水溶液按一定比例混合均匀，制备成复合的壳聚糖—明胶水溶液；然后在搅拌下加入一定司班的矿物油，形成稳定的壳聚糖—明胶油包水剂；再加入戊二醛交联剂固化；用100/280μm孔径的筛网过滤，收集实心微载体，或是用450/600μm孔径的筛网过滤，再冻干，收集多孔微载体；最后用甘氨酸处理以封闭未反应的醛基；再用NaOH处理以去除残留的醋酸，即可得到该微载体。该微载体既有助于细胞的粘附，又能长期维持细胞功能。而且，本发明提供的方法可根据需要在较宽的范围内控制微载体的各项参数，成本低廉，适宜大规模培养，有利于工业化生产。

Description

一种用于大规模培养细胞的微载体

技术领域

本发明涉及培养细胞用的微载体，特别是涉及一种用于大规模培养细胞的微载体。

技术背景

在各种原因导致的急、慢性肝衰竭患者的治疗中，以培养肝细胞为核心的生物人工肝支持系统正日益受到医学界的重视。生物人工肝的疗效取决于其中肝细胞的数量和质量，即只有当体外培养肝细胞的数量达到被治疗患者肝脏重量的20～30％，并且细胞在体外保持高代谢活性时，人工肝才能挽救患者的生命。微载体是实现细胞大规模培养的支撑条件之一，细胞的活性和功能与微载体的表面性质密切相关。

过去曾采用以壳聚糖制成的微载体，如文献1：Nilson K，Mosbach K.Preparation ofimmobilized animal cells.FEBS Lett.1980；118：145-150中所述。但这种单纯的壳聚糖微载体的细胞亲和性差，使得细胞在其上的粘附率较低，所以应用较少。

目前已有的微载体大多以胶原及其衍生物作为包被材料，如文献2：Wissemann KW，Jacobson BS.Pure gelatin microcarriers：synthesis and use in cell attachment and growth offibroblast and endothelial cells.In Vitro Cell Dev Biol.1985；21：391-401中所述。这种微载体虽有助于细胞的粘附，但不能长期维持细胞的功能。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的微载体不能兼顾细胞的亲和性和长期维持细胞功能的缺陷，从而提供一种既具有细胞的亲和性，有助于细胞的粘附，支持大量细胞生长；又能长期维持细胞功能，保持细胞代谢活性且成本低廉的用于大规模培养细胞的微载体。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供的用于大规模培养细胞的微载体，其为如下方法得到：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖-明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用100/280μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为100～280μm的微载体，得到的实心微载体用表面活性剂Tween、石油醚或丙酮洗涤，以去除载体表面的油相；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

所述司班为司班40、60、80或85。

本发明提供一种上述用于大规模培养细胞的微载体的制备方法，包括如下步骤：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖-明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用100/280μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为100～280μm的微载体，得到的实心微载体用表面活性剂Tween、石油醚或丙酮洗涤，以去除载体表面的油相；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

所述的司班为司班40、60、80或85。

本发明提供另一种用于大规模培养细胞的微载体，其为如下方法得到：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖-明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用450/600μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为450～600μm的微载体，将此微载体于-20～-80℃冷冻48～96小时，再冻干48～96小时，形成多孔微载体；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

所述的司班为司班40、60、80或85。

本发明提供一种上述用于大规模培养细胞的微载体的制备方法，包括如下步骤：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖一明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用450/600μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为450～600μm的微载体，将此微载体于-20～-80℃冷冻48～96小时，再冻干48～96小时，形成多孔微载体；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

所述的司班为司班40、60、80或85。

本发明提供的用于大规模培养细胞的微载体与已有技术相比，其优益之处在于：该微载体既具有细胞的亲和性，有助于细胞的粘附，支持大量肝细胞生长；又能长期维持细胞功能，保持肝细胞代谢活性；另一方面，用本发明提供的方法制备的微载体，其大小、比重和弹性随搅拌速率、组分的起始浓度和比例变化，从而可根据需要在较宽的范围内控制微载体的各项参数；而且，构成复合微载体的两种组分——壳聚糖和明胶之间在水溶液中可自然形成氢键，戊二醛的加入进一步交联肽链和糖链残基，使得微载体的机械性能得到了改善；使用本发明提供的方法得到的微载体成本低廉，适宜大规模培养，有利于工业化生产。

附图说明

图1-A为实施例1实心微载体I在显微镜下(200×)的形态；图中标尺为50μm；

图1-B为实施例4多孔微载体IV在显微镜下(100×)的形态；图中标尺为50μm；

图1-C为实施例7在显微镜下(200×)大鼠肝细胞在实心微载体I上生长的形态；其中，粘附在微载体上的小球粒即为大鼠肝细胞；图中标尺为50μm；

图1-D为在多孔微载体IV上生长的大鼠肝细胞的扫描电镜图；其中，粘附在微载体上的小球粒即为大鼠肝细胞；

图2-A、2-B、2-C和2-D分别为培养在三种微载体及壳聚糖-明胶膜上，肝细胞上清中乳酸脱氢酶浓度、白蛋白浓度、尿素浓度和7-羟基香豆素浓度的变化；其中，“●”代表实心微载体I，“▲”代表多孔微载体IV，“○”代表对照组二Cytodex 3，“△”代表对照组一的1∶1混合的壳聚糖-明胶膜。

具体实施方式

实施例1、实心微载体I的制备

配制1w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3体积比于50℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；在300rpm机械搅拌下，将此溶液中加入3倍体积含0.5w/v％司班40的矿物油中，搅拌5分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；边搅拌边加入0.1w/v％戊二醛，继续搅拌0.5小时，再静止0.5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；用100/280μm孔径的筛网过滤，收集直径为100～280μm的微载体，得到实心微载体；用表面活性剂Tween洗涤，以去除载体表面的油相；然后用0.01M甘氨酸处理30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1w/v％NaOH处理10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的实心微载体I。

实施例2、实心微载体II的制备

配制5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和5w/v％明胶水溶液，将二者按3∶1体积比于70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；在500rpm机械搅拌下，将此溶液中加入10倍体积含5w/v％司班60的矿物油中，搅拌30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；边搅拌边加入10w/v％戊二醛，继续搅拌5小时，再静止5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；用100/280μm孔径的筛网过滤，收集直径为100～280μm的微载体，得到实心微载体；用石油醚洗涤，以去除载体表面的油相；然后用0.5M甘氨酸处理2小时，以封闭未反应的醛基；再用10w/v％NaOH处理0.5小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的实心微载体II。

实施例3、实心微载体III的制备

配制3w/v％壳聚糖醋酸水溶液和3w/v％明胶水溶液，将二者按1∶1体积比于60℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；在400rpm机械搅拌下，将此溶液中加入8倍体积含2.5w/v％司班85的矿物油中，搅拌20分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；边搅拌边加入5w/v％戊二醛，继续搅拌2小时，再静止2小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；用100/280μm孔径的筛网过滤，收集直径为100～280μm的微载体，得到实心微载体；用丙酮洗涤，以去除载体表面的油相；然后用0.2M甘氨酸处理15小时，以封闭未反应的醛基；再用4w/v％NaOH处理5小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的实心微载体III。

实施例4、多孔微载体IV的制备

配制1w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3体积比于50℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；在100rpm机械搅拌下，将此溶液中加入3倍体积含0.5w/v％司班40的矿物油中，搅拌5分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；边搅拌边加入0.1w/v％戊二醛，继续搅拌0.5小时，再静止0.5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；用450/600μm孔径的筛网过滤，收集直径为450～600μm的微载体，将此微载体于-80℃冷冻96小时，再冻干72小时，形成多孔微载体；然后用0.01M甘氨酸处理30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1w/v％NaOH处理10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的多孔微载体IV。

实施例5、多孔微载体V的制备

配制5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和5w/v％明胶水溶液，将二者按3∶1体积比于70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；在300rpm机械搅拌下，将此溶液中加入10倍体积含5w/v％司班60的矿物油中，搅拌30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；边搅拌边加入10w/v％戊二醛，继续搅拌5小时，再静止5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；用450/600μm孔径的筛网过滤，收集直径为450～600μm的微载体，将此微载体于-20℃冷冻72小时，再冻干72小时，形成多孔微载体；然后用0.5M甘氨酸处理2小时，以封闭未反应的醛基；再用10w/v％NaOH处理0.5小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的多孔微载体V。

实施例6、多孔微载体VI的制备

配制3w/v％壳聚糖醋酸水溶液和3w/v％明胶水溶液，将二者按1∶1体积比于60℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；在200rpm机械搅拌下，将此溶液中加入8倍体积含2.5w/v％司班85的矿物油中，搅拌20分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；边搅拌边加入5w/v％戊二醛，继续搅拌2小时，再静止2小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；用450/600μm孔径的筛网过滤，收集直径为450～600μm的微载体，将此微载体于-30℃冷冻48小时，再冻干48小时，形成多孔微载体；然后用0.2M甘氨酸处理15小时，以封闭未反应的醛基；再用4w/v％NaOH处理5小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的多孔微载体VI。

实施例7、微载体的性能试验

为检验以上制备的微载体的性能，我们将其用于大鼠肝细胞的培养，并以1∶1混合的壳聚糖-明胶复合膜、胶原包被的微载体(Cytodex 3)和单纯的壳聚糖微载体(制备方法同实施例2)分别作为对照一、对照二和对照三。实验方法采用如下的步骤：

1)原代肝细胞分离：取150～200g Sprague-Dawley大鼠3只，在戊巴比妥钠麻醉下，于无菌状态下打开腹腔，从下腔静脉灌入氧饱和的无钙镁Earle’s平衡盐溶液(室温)，剪断肝门三体作为流出口，同时剪开胸腔，用止血钳夹住肝上下腔静脉，待冲尽肝内积血之后，将灌流液转换为氧饱和的含0.05％胶原酶和4mMCa²⁺的Earle’s平衡盐溶液(37℃)，继续灌流至肝脏肿大、肝被膜下出现积液，此时立即剪下肝脏，撕去肝被膜，在Hank’s液中缓慢摆动以游离肝细胞，细胞悬液经80μm筛网过滤，收集滤液。将细胞悬液50g×3min离心洗涤3次，最后的细胞沉淀悬浮于无血清DMEM培养液中，培养液组成为：DMEM培养基(不含酚红)补充0.1μMCuSO₄·5H₂O、3nM Na₂SeO₃、50pM ZnSO₄·7H₂O、0.2U/ml胰岛素、1μM地塞米松、20ng/ml表皮生长因子、4ng/ml胰高血糖素、6.25μg/ml转铁蛋白、50ng/ml亚油酸、0.2％牛血清白蛋白、15mMHEPES(Gibco BRL)、50μg/mg庆大霉素、2μg/ml二性霉素。调整细胞浓度为10⁶cells/ml。

2)肝细胞的微载体培养：将微载体用上述培养液浸泡过夜后，转入经二甲基二氯硅烷处理过的玻璃培养皿中。再将等体积的肝细胞悬液接种入培养皿中，置于CO₂孵箱中培养。在开始培养的3小时内，将各培养皿每隔30分钟轻轻晃动，使微载体和细胞充分接触。6小时后，洗去未粘附的细胞，将培养物置于新鲜培养液中继续培养。1天后收集培养上清冻存于-20℃，此后每2天收集一次。

3)肝细胞功能的测定：解冻后的培养上清中乳酸脱氢酶活性、白蛋白和尿素含量均采用试剂盒(乳酸脱氢酶试剂盒：Boehringer Mannheim；白蛋白试剂盒：BethylLaboratories；尿素试剂盒：Centronic GmbH)测定。测定细胞对7-乙氧基香豆素的转化能力时，往培养液中加入260μM底物，5小时后收集培养上清，与含100U/ml β-葡萄糖苷酶的醋酸盐缓冲液(PH5.0)37℃孵育过夜，加入甘氨酸缓冲液(pH10.3)终止反应，在荧光比色仪上(测试条件：360nm激发波长，460nm发射波长)测定产物7-羟基香豆素的含量。

实验结果列于表1。

表1、

微载体	乳酸脱氢酶活性(mU/μgDNA)	白蛋白含量(μg/μgDNA)	尿素含量(μg/μgDNA)	细胞对7-乙氧基香豆素的转化能力(pmol/μgDNA)	6小时贴壁率(％)
						实心微载体I	27.8	2.4	16.7	63.4	84.7
实心微载体II	20.3	3.3	21.0	73.7	70.8
						实心微载体III	23.6	2.7	17.8	68.2	75.9
多孔微载体IV	25.7	2.5	15.2	69.6	79.0
						多孔微载体V	19.5	3.1	18.5	77.0	72.2
多孔微载体VI	25.0	2.4	14.9	74.9	74.1
						对照组一	22.4	1.9	6.7	30.5	83.5
对照组二	54.9	1.3	5.1	16.3	90.6
						对照组三	16.5	4.1	22.1	78.3	13.6

对照组一的壳聚糖-明胶复合膜上贴附了83.5％的细胞，细胞略有铺展，呈多边型，细胞生长成单层。对照组二的胶原包被的微载体cytodex 3上贴附的细胞最多，达90.6％，细胞高度铺展并有伪足形成，微载体通过细胞连接形成聚集体。实施例I～III的实心微载体贴附了约80％的细胞，细胞呈圆形并将相邻微载体连接在一起。实施例IV～VI的多孔微载体贴附了近80％的细胞，细胞呈圆形分布于微载体表面和孔隙内。

从表1的实验结果也可以看出，在对照组三单纯的壳聚糖微载体上接种肝细胞后，虽然细胞的功能下降缓慢，但是贴附的细胞很少，仅有10～15％。在对照组二胶原包被的微载体(Cytodex 3)上虽能贴附大量细胞，6小时贴壁率可达90.6，但细胞的功能会很快丧失。对照组一是壳聚糖与明胶以1∶1相结合的复合膜，细胞的贴壁率基本未受显著影响，细胞功能比对照组二的Cytodex 3微载体却要好。而本发明提供的微载体I～VI，相对于对照组一，效果更好。不但细胞的贴壁率基本未受显著影响，仅比对照组二的Cytodex 3稍有减少，细胞铺展的速度和程度比在Cytodex 3表面略有降低；细胞功能也与单纯使用壳聚糖微载体的对照组三相当。

另外，将制成的微载体用于长期培养大鼠肝细胞。在连续15天的观察中，接种在实施例1～实施例6的壳聚糖-明胶复合微载体上的肝细胞呈三维生长，释放较少的乳酸脱氢酶，白蛋白合成量开始呈上升趋势，一星期后稳定在较高水平，尿素合成量和7-乙氧基香豆素代谢活性下降缓慢。实验结果如图2所示。壳聚糖-明胶微载体中的壳聚糖成分能模拟体内的细胞外环境，明胶成分有助于细胞的粘附，微载体支持的细胞三维生长方式加强了细胞之间的相互作用，因此，相对于细胞的结构和功能而言，复合微载体比单一成分构成的微载体和平面支持物更具优越性。

利用微载体大规模培养肝细胞，在人工肝脏支持系统中有着广阔的应用前景。后者的疗效取决于肝细胞的数量和功能，为了在有限的容积内装载数量尽可能多并且代谢活性高的肝细胞，有必要对系统内的细胞以支持物的体积为单位进行功能评价，即：肝功能/微载体体积＝功能/细胞×微载体上吸附的细胞数，例如：表1中实心微载体I样品的白蛋白含量＝2.4μg/μg DNA，因每个肝细胞的DNA含量约为14pg，故以支持物的体积为单位进行功能评价即为2.4×14×10^-6×100×84.7％＝2.85×10^-3μg/微载体体积。按此标准，本发明提供的壳聚糖-明胶复合微载体显示最好的支持功能。

通常情况下，肝细胞的培养是相当困难的，对于本发明提供的微载体能在大规模培养肝细胞上取得满意的结果，那么在用于其它种类的细胞的大规模培养时也可以获得理想的结果。

Claims (8)

1、一种用于大规模培养细胞的微载体，其为如下方法得到：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖-明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用100/280μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为100～280μm的微载体，得到的实心微载体用表面活性剂Tween、石油醚或丙酮洗涤，以去除载体表面的油相；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

2、如权利要求1所述的用于大规模培养细胞的微载体，其特征在于：所述步骤2)的司班为司班40、60、80或85。

3、一种权利要求1所述的用于大规模培养细胞的微载体的制备方法，包括如下步骤：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖-明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用100/280μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为100～280μm的微载体，得到的实心微载体用表面活性剂Tween、石油醚或丙酮洗涤，以去除载体表面的油相；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

4、如权利要求3所述的用于大规模培养细胞的微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的司班为司班40、60、80或85。

5、一种用于大规模培养细胞的微载体，其为如下方法得到：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖-明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用450/600μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为450～600μm的微载体，将此微载体于-80～-20℃冷冻48～96小时，再冻干48～96小时，形成多孔微载体；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

6、如权利要求5所述的用于大规模培养细胞的微载体，其特征在于：所述步骤2)的司班为司班40、60、80或85。

7、一种权利要求5所述的用于大规模培养细胞的微载体的制备方法，包括如下步骤：

1)配制1～5w/v％壳聚糖醋酸水溶液和1～5w/v％明胶水溶液，将二者按1∶3～3∶1体积比于50～70℃混合均匀，制备成复合的壳聚糖-明胶水溶液；

2)以100～500rpm的速率机械搅拌，将步骤1)得到的壳聚糖-明胶水溶液加入3～10倍体积含0.5～5w/v％司班的矿物油中，搅拌5～30分钟，形成稳定的壳聚糖-明胶油包水剂；

3)向步骤2)得到的壳聚糖-明胶油包水剂中边以100～500rpm的速率搅拌边加入0.1～10w/v％戊二醛，继续搅拌0.5～5小时，再静止0.5～5小时，得到用戊二醛作为交联剂固化的水相；

4)用450/600μm孔径的筛网过滤步骤3)得到的用戊二醛作为交联剂固化的水相，收集直径为450～600μm的微载体，将此微载体于-80～-20℃冷冻48～96小时，再冻干48～96小时，形成多孔微载体；

5)将得到的微载体用0.01～0.5M甘氨酸处理2～30小时，以封闭未反应的醛基；再用0.1～10w/v％NaOH处理0.5～10小时，以去除残留的醋酸；最后用蒸馏水洗涤至中性，高压灭菌后保存于磷酸缓冲液中，得到用于大规模培养细胞的微载体。

8、如权利要求7所述的用于大规模培养细胞的微载体的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的司班为司班40、60、80或85。

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