CN102174497B - 一种微载体的回收方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种简便易行，低成本的微载体回收方法。本发明所述的微载体回收方法，是将微载体用碱溶液和高盐溶液冲洗以去除微载体表面的蛋白质成份，此方法在层析柱装置中处理微载体，可以减少冲洗液的用量，减少冲洗次数，操作简单；而且所回收微载体杂质含量符合要求，回收率高。

Description

一种微载体的回收方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种微载体的回收方法。

背景技术

近十多年来，随着市场对生物制品需求量的急增，产品供不应求，刺激了细胞大规模培养技术的研究快速发展，生产规模已放大到万升。

微载体的成功发展和应用使贴壁依赖型细胞的大规模培养成为可能。微载体系统提供的高培养表面积/体积比(例如1毫升中使用5毫克就得到30平方厘米表面积)，提供了高细胞产量而无需大容量的设备，相对于其他类型的单层培养而言，微载体培养需要较少的空间，就可产生一定量的细胞或细胞产物，提高了生产规模；另外，微载体系统的自动化控制能够使培养系统环境均一，保护细胞抵制物理和化学压力，与其他单层或浮技术相比，一定体积的培养基情况下，搅拌微载体培养的细胞产量能高出100倍；而且由于可以在小体积中培养大量的细胞(高于1亿个/毫升)，微载体培养可采用更小的培养容器，例如：一个技术工人每周能够处理900个用于疫苗生产的转瓶，微载体培养可以生产相当于50个转瓶(490平方厘米的转瓶)的细胞产量，这个微载体相关的简化过程减少了规模生产所需的劳动力；微载体培养减少了处理步骤。在单个微载体培养系统中与在几百个转瓶培养中生产大量的细胞相比，前者大大降低了污染的风险。

因此，目前应用微载体培养动物细胞在生物反应器生产生物制品的种类逐渐增加，在我国先后有辽宁成大生物技术股份有限公司，吉林迈丰药业，广州诺诚生物等企业，采用生物反应器微载体技术培养Vero细胞生产人用狂犬疫苗，并获得了国家食品药品监督管理局颁发的人用狂犬疫苗(Vero细胞)的新药证书和药品注册批件，北京百泰生物药是有限公司采用微载体技术生产治疗用抗体，年产能力高达8公斤。

目前，以微载体应用代表的生物技术的发展，使得产品的质量和数量有了很大的提升，同时微载体在生产中应用的成本也成为人们关注的问题，以每升溶液使用10克为例，每年每个厂家约需数百千克微载体，价值约1至2千万元。如能将生产过程中用过的微载体回收再利用，则能大大减低生产成本。

因此，本发明将提供一种微载体的回收方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便易行，低成本的微载体回收方法。

本发明所述的微载体回收方法，是将微载体用碱溶液溶液冲洗以去除微载体表面的蛋白质成份，此方法操作简单，回收率高。

具体的说，本发明所述的微载体回收方法，包括以下步骤：

1)浸泡：将微载体以高浓度碱溶液浸泡24-36小时；

2)冲洗：取柱长50-100厘米的层析柱空柱，将高浓度碱溶液处理后的微载体装入柱内，先以1.5-3倍体积的低浓度碱溶液冲洗，随后以1.5-3倍体积的高浓度碱溶液冲洗；再以1.5-3倍体积的缓冲液冲洗。

其中，所述高浓度碱溶液为0.5-1.0mol/L氢氧化钠溶液；所述低浓度碱溶液为0.1-0.4mol/L氢氧化钠溶液；所述缓冲溶液为pH值为7.4，浓度为0.01-0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液；

另外，步骤2)之后，本发明的方法还包括步骤3)保存：将冲洗完毕的微载体取出，保存在保存溶液中；其中所述保存溶液为pH值为7.4，浓度为0.01-0.2mol/L磷酸盐溶液。

本发明所述的方法中，所述微载体为实心微载体；

步骤1)中，高浓度碱溶液的量为可将微载体浸没即可；

浸泡过程中，每隔2-3小时，搅拌一次；

步骤2)中，每种溶液按量冲洗一次即可。

步骤2)中，所述的磷酸盐缓冲溶液优选生物技术领域常用的磷酸盐缓冲溶液，如pH值为7.4，浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液。

微载体是由葡聚糖，纤维素或胶原等物质制成的小颗粒。细胞培养用微载体大致可分为实心微载体和多孔微载体。实心微载体(如CYTODEX-1)表面光滑，培养细胞时，细胞贴于其表面生长，本发明适用于该类微载体。

本发明中，所述pH值为7.4，浓度为0.02mol/L磷酸缓冲溶液的配制方法如下：称取氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.21g、磷酸氢二钠3.6g，加注射用水搅拌溶解定容至1升备用；当然，也可以用生物领域常用的方法来配制。

所述碱溶液和盐溶液采用本领域常用的的配制方法即可，所用配制用水最好采用注射用水。

本发明技术方案的核心在于在类似层析柱装置中处理微载体。采用层析柱处理可以减少冲洗液的用量，减少冲洗次数，操作简单。所回收微载体杂质含量符合要求，回收率高。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取出刚下罐的3升微载体放入10升塑料桶中，加入0.5mol/L氢氧化钠溶液5升，将微载体浸没，浸泡24小时，期间每3小时将微载体搅拌一次。

取直径7cm左右长100cm层析柱，用注射用水冲洗干净，将微载体中多余的碱液弃去，留下相当于1个体积微载体的氢氧化钠溶液，将微载体连同碱液一同倒入柱中，层析柱顶部不封闭，打开下开口使微载体中的氢氧化钠溶液流出，沿柱壁向柱中缓缓加入5升0.1mol/L的氢氧化钠冲洗，待微载体中的氢氧化钠溶液全部流出后，沿柱壁向柱中缓缓注入5升，1.0mol/L氢氧化钠溶液冲洗，待氢氧化钠溶液全部流出，在沿柱壁向柱中缓缓注入约5升0.1mol/L磷酸盐缓冲液，待缓冲液流出后，取出微载体保存于0.01mol/L磷酸盐溶液中。微载体的回收率为99％。

实施例2

取出刚下罐的3升微载体放入10升塑料桶中，加入0.8mol/L氢氧化钠溶液5升，将微载体浸没，浸泡36小时，期间每3小时将微载体搅拌一次。

取直径7cm左右长100cm层析柱，用注射用水冲洗干净，将微载体中多余的碱液弃去，留下相当于1个体积微载体的氢氧化钠溶液，将微载体连同碱液一同倒入柱中，层析柱顶部不封闭，打开下开口使微载体中的氢氧化钠溶液流出，沿柱壁向柱中缓缓加入约7升左右0.4mol/L氢氧化钠冲洗，待微载体中的氢氧化钠溶液全部流出后，沿柱壁向柱中缓缓注入9升左右0.8mol/L氢氧化钠溶液冲洗，待氢氧化钠溶液全部流出，在沿柱壁向柱中缓缓注入4.5升0.2mol/L磷酸盐缓冲液，待缓冲液流出后，取出微载体保存于0.02mol/L磷酸盐溶液中。回收率99.5％。

实施例3

取出刚下罐的3升微载体放入10升塑料桶中，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液5升，将微载体浸没，浸泡30小时，期间每2小时将微载体搅拌一次。

取直径7cm左右长100cm层析柱，用注射用水冲洗干净，将微载体中多余的碱液弃去，留下相当于1个体积微载体的氢氧化钠溶液，将微载体连同碱液一同倒入柱中，层析柱顶部不封闭，打开下开口使微载体中的氢氧化钠溶液流出，沿柱壁向柱中缓缓加入9升左右，0.1mol/L氢氧化钠冲洗，待微载体中的氢氧化钠溶液全部流出后，沿柱壁向柱中缓缓注入4.5升左右，0.5mol/L氢氧化钠溶液冲洗，待氢氧化钠溶液全部流出，在沿柱壁向柱中缓缓注入0.1mol/L磷酸盐缓冲液约5升待缓冲液流出后，取出微载体保存于0.1mol/L磷酸盐溶液中。回收率98％。

实施例4

取实施例1-3处理过的微载体，放显微镜下观察，可见微载体表面光滑无蛋白及其它成份粘附，另分别取未处理过的微载体和实施例1处理过的微载体各1克加注射用水，利用功率频率20000赫兹超声波超声三次，每次5分钟。4000转/分钟离心，10分钟取上清测定蛋白含量，结果如下表：

Cytodex1微载体	蛋白质含量(mg/ml)
		未处理	15.90
实施例1处理	0.18
		实施例2处理	0.21
实施例3处理	0.15

实施例5

取2支工作种子批Vero细胞复苏后，培养传代2次后分别注入两个生物反应器中，按25克/升量加未用的微载体和实施例1处理过的微载体cytodex1进行对比试验。进行Vero细胞计数，结果见下表：

显然，经过上述处理回收的微载体表面光滑，无蛋白及其它成份粘附，可直接用于培养细胞。

Claims (3)

1.一种微载体回收方法，包括以下步骤：

1）浸泡：将微载体以高浓度碱溶液浸泡24-36小时；浸泡过程中，每隔2-3小时，搅拌一次；

2）冲洗：取柱长50-100厘米的层析柱空柱，将高浓度碱溶液处理后的微载体装入柱内，先以1.5-3倍体积的低浓度碱溶液冲洗，随后以1.5-3倍体积的高浓度碱溶液冲洗；再以1.5-3倍体积的缓冲液冲洗；所述缓冲溶液为pH值为7.4，浓度为0.01-0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液；

3）保存：将冲洗完毕的微载体取出，保存在保存溶液中；其中所述保存溶液为pH值为7.4，浓度为0.01-0.2mol/L磷酸盐溶液；

所述高浓度碱溶液为0.5-1.0mol/L氢氧化钠溶液，所述低浓度碱溶液为0.1-0.4mol/L氢氧化钠溶液。

2.如权利要求1所述的回收方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲溶液为pH值为7.4，浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲溶液；其配方如下：氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.21g、磷酸氢二钠3.6g，注射用水1升。

3.权利要求1或2所述的回收方法的应用，其特征在于，用于回收微载体。