CN112771150B - 包含含有天然油的微胶囊的细胞培养用载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养用载体，更详细地，涉及包含含有明胶、天然高分子、油及油性增稠剂且机械物性得到提高的微胶囊的细胞培养用载体及包含其的细胞培养基组合物。本发明的含有天然油的微胶囊显著提高机械物性及保持度。在将上述微胶囊用作细胞培养用载体来培养细胞的情况下，提高细胞的附着及存活，具有能够诱导经培养的细胞的成熟化的效果，可以多种多样地用于利用载体的细胞培养、共同培养系统及人工细胞结构体制备领域。

Description

包含含有天然油的微胶囊的细胞培养用载体
技术领域
本发明涉及细胞培养用载体，更详细地，涉及包含含有明胶、天然高分子、油及油性增稠剂且机械物性得到提高的微胶囊的细胞培养用载体及包含其的细胞培养培养基组合物。
背景技术
明胶虽然不是天然存在的，但可以通过水解存在于生物组织的作为蛋白质的胶原蛋白来获得。接近无色，几乎无味无香，多种多样地用作各种食品添加剂。分子量在35000～40000左右，甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酸为其主要成分。作为生物相容性突出的生物材料，是无毒性、在体内可生物降解、不易引起抗体诱导的天然高分子。用于人工皮肤、隐形眼镜、药物传递体等多种目的，此外还是能够应用于其他多种领域的材料。并且，作为代表性的热可逆性凝胶，在特定温度以上时，以溶胶状态存在，而在该温度以下则恢复凝胶形态。即使没有特别的交联剂，也可以形成物理性的凝胶，但与水凝胶一样，具有强度弱的问题。通过低温形成的明胶凝胶作为物理性凝胶，是通过弱键合形成的。为了补充强度而使用交联剂，已知明胶的化学性交联是与胺基相关的。
另一方面，微胶囊是指由形成外部(wall)的高分子物质等包裹以几微米至几百微米的大小形成的内部(core)的液态或固态物质的超微小粒子。这样的微胶囊能够用于防止内部物质由于外部环境(例如氧或水分)而引起的变性，或者用于在一定程度上保持缓释型药物或芳香剂之类物质的传递速度，或者用于将用作内部物质的材料由液体形态转变为固体形态。微胶囊是在医药品、涂料、电子产业及化妆品等多种领域使用的基础技术，尤其在用于医药品及化妆品的情况下，被用作能够很好地保持药物最初效价的工具。
发明内容
技术问题
于是，本发明人开发显著提高机械物性的含有天然油的微胶囊，并确认其用途，从而完成本发明。
因此，本发明的目的在于，提供包含微胶囊的细胞培养用载体及包含其的细胞培养基组合物，上述微胶囊包含明胶、天然高分子、油以及油性增稠剂。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种细胞培养用载体，包含微胶囊，上述微胶囊包含明胶、天然高分子、油以及油性增稠剂。
并且，本发明提供一种包含细胞培养用载体的细胞培养基组合物。
发明的效果
本发明的含有天然油的微胶囊显著提高机械物性及保持度。在将上述微胶囊用作细胞培养用载体来培养细胞的情况下，提高细胞的附着及存活，具有能够诱导培养细胞的成熟化的效果，可以多种多样地用于利用载体的细胞培养、共同培养系统及人工细胞结构体的制备领域。
附图说明
图1a、图1b示出本发明的明胶油胶囊的制备方法(A：未添加油性增稠剂时，B：添加油性增稠剂时)。
图2示出本发明的明胶油胶囊的弹性系数检测结果。
图3及图4为示出在将本发明的明胶油胶囊与心肌细胞共同培养后通过光学显微镜、扫描电子显微镜(SEM)及透射电子显微镜(TEM)观察培养的细胞的图。
图5为示出通过存活/凋亡分析来确认与本发明的明胶油胶囊共同培养的心肌细胞的细胞存活率的结果的图。
图6为示出在将本发明的明胶油胶囊与从间充质干细胞分化的心肌细胞共同培养后通过共聚焦显微镜进行观察的结果的图。
图7为示出在将本发明的明胶油胶囊与海拉(Hela)细胞共同培养后通过显微镜进行观察的结果的图。
图8为示出通过透射电子显微镜观察使用以往的方法培养的心肌细胞的结果的图。
图9为示出通过透射电子显微镜及荧光显微镜观察将本发明的明胶油胶囊与心肌细胞共同培养的结果的图。
图10为示出根据是否添加油性增稠剂来比较本发明的明胶油胶囊的保持度的结果的图。
图11及图12为示出确认本发明的人工心肌结构体的心搏率及搏动间隔的结果的图。
图13及图14为示出验证本发明的人工心肌结构体功能的结果的图。
图15为示出利用本发明的人工心肌结构体的基于收缩力的心脏毒性评价结果的图。
图16为示出本发明的明胶油胶囊与多种细胞共同培养的结果的图。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。
根据本发明的实施方式，本发明提供一种细胞培养用载体，包含微胶囊，上述微胶囊包含明胶、天然高分子、油以及油性增稠剂。
在本发明中，“载体”是指对贴壁依赖性细胞的附着及成长有用的粒子，上述载体可具有用于悬浮培养的足够小的约10μm至800μm的大小，但不限定于此。
在本发明中，“天然高分子”是指天然存在或通过生物生产的高分子物质，在微胶囊内起到防止油的氧化及稳定化的作用。
上述天然高分子的例有阿拉伯胶、透明质酸、关华豆胶、果胶、黄原胶、槐豆胶、罗望子多糖胶、黄芪胶、茄替胶、刺槐豆胶、魔芋胶、琼脂、卡拉胶、角叉菜胶以及结冷胶等，但不限定于此。
在本发明的一具体例中，优选地，明胶及天然高分子以1∶0.1至1∶1的重量比混合。
根据本发明的优选具体例，优选地，上述天然高分子为阿拉伯胶，更优选地，可以为阿拉伯胶及透明质酸的混合物，更加优选地，上述阿拉伯胶及透明质酸的混合物以1∶9至9∶1的重量比混合。
在本发明中，油可以为选自由橄榄油、山茶油、蓖麻油、棕榈油、荷荷巴油、扁桃仁油、葡萄籽油、草本油、玫瑰油、椰油、辣木油、米糠油、杏仁油、葵花籽油、白池花籽油、阿比西尼亚油以及角鲨烷组成的组中的一种以上，但不限定于此。在本发明的一具体例中，优选地，上述油为角鲨烷。上述角鲨烷可以为植物性角鲨烷。
在本发明中，“植物性角鲨烷”为替代动物性角鲨烷的天然角鲨烷，通过向从植物性油脂提取的角鲨烷添加氢来制备。植物性角鲨烷具有防止水分蒸发的功能，添加其来制备的微胶囊具有长期保持胶囊水分的优点。
在本发明中，“增稠剂”作为增加溶液粘度的物质，成为增稠剂或增稠稳定剂。并且，在溶液中添加增稠剂的情况下会显出粘乎乎的性状，看似被浓缩，因此也被标记作浓化剂。在本发明中，使用上述增稠剂是为了提高包含于微胶囊内部的油的粘度。
在本发明的另一具体例中，油性增稠剂可以为选自膨润土凝胶(Bentone gel)、氢化聚异丁烯(Hydrogenated Polyisobutene)、糊精棕榈酸酯/乙基己酸酯以及糊精棕榈酸酯(dextrin palmitate)的一种以上，更优选地，可以为糊精棕榈酸酯。上述油性增稠剂也可以为选自市面上出售的膨润土凝胶、Versagel ME750、Rheopearl TT以及Rheopearl KL的一种以上。
在本发明中，相对于油的重量，可以包含1重量百分比至15重量百分比的上述油性增稠剂，优选地，可以包含2重量百分比至10重量百分比的上述油性增稠剂，更优选地，可以包含4重量百分比至6重量百分比的上述油性增稠剂，最优选地，可以包含5重量百分比的上述油性增稠剂，但不限定于此。
在本发明的具体例中，优选地，上述微胶囊由图1b所示的制备方法制备。具体地，制备上述微胶囊的步骤包括：步骤(a)，制备包含明胶、油及油性增稠剂的明胶溶液；步骤(b)，制备天然高分子溶液；步骤(c)，混合上述明胶溶液及天然高分子溶液；步骤(d)，调节步骤(c)中制备的混合物的pH；以及步骤(e)，冷却已调解pH的混合物。
相对于油的重量，可以包含1重量百分比至15重量百分比的上述步骤(a)的油性增稠剂，优选地，可以包含2重量百分比至10重量百分比的上述步骤(a)的油性增稠剂，更优选地，可以包含4重量百分比至6重量百分比的上述步骤(a)的油性增稠剂，最优选地，可以包含5重量百分比的上述步骤(a)的油性增稠剂，但不限定于此。
优选地，上述步骤(b)的天然高分子溶液可以为阿拉伯胶及透明质酸以1∶9至9∶1的重量比混合的混合物，但不限定于此。
优选地，在上述步骤(d)中，明胶溶液及天然高分子溶液混合物的pH调节为3.1至3.6。
并且，优选地，在上述步骤(e)中，向已调解pH的混合物添加达3倍至5倍的蒸馏水后进行搅拌并冷却至5℃至15℃。
在本发明的具体例中，优选地，上述细胞为贴壁依赖性细胞，更优选地，为选自心肌细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、上皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、宫颈细胞、癌细胞及间充质干细胞的一种以上，但不限定于此。
上述间充质细胞可以源自骨髓、脂肪、脐带血、羊水或羊膜，但不限定于此。
上述癌细胞是指源自所有种类癌症的细胞，例如，上述癌症包括胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部癌、皮肤或眼球内的黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、大肠癌、小肠癌、直肠癌、肛门周围癌、输卵管肿瘤、子宮内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、食管癌、小肠癌、淋巴腺癌、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉芽肿、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、脑癌等，但不限定于此。
本发明的细胞培养用载体提高细胞的附着及存活，具有能够诱导培养细胞的成熟化的优秀的效果。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述细胞培养用载体的细胞培养基组合物。
在本发明中，“细胞培养”是指对从生物体的组织中分离的细胞进行培养，根据细胞的种类，培养基的种类、温度条件、培养液等由公知的方法为依据。
在利用本发明的包含明胶油胶囊的细胞培养用载体培养细胞的情况下，提高细胞的附着及存活，具有诱导培养细胞的成熟化的效果。
在本发明中，“培养基(culture media)”是指能够在体外培养条件下支持干细胞成长及存活的培养液，包括所有适当的在相关领域中用于干细胞培养的普通的培养基。并且，可以根据细胞的种类选择培养基和培养条件。优选地，用于培养的培养基作为细胞培养最低培养基(CCMM，cell culture minimum medium)，通常包含碳元素、氮元素及微量元素成分。这样的细胞培养最低培养基有例如达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Dulbecco'sModified Eagle's Medium)、最低必需培养基(MEM，Minimal essential Medium)、基础伊格尔培养基(BME，Basal Medium Eagle)、洛斯维·帕克纪念研究所1640培养基(RPMI1640)、F-10、F-12、最低必需培养基、格拉斯哥最低必需培养基(GMEM，Glasgow'sMinimal essential Medium)、伊斯科夫改良达尔伯克培养基(Iscove's ModifiedDulbecco's Medium)等，但不限定于此。
本发明的细胞培养基组合物可以在细胞培养时可以单独使用，或者可以作为市面出售的细胞培养基的添加物形态来使用，但不限定于此。
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，本发明的范围不以这些实施例为限制是显而易见的。
实施例1.明胶油胶囊的制备
1-1.实验组1
使用图1所示的方法制备包含明胶、天然高分子以及油的微胶囊。
具体地，明胶溶液为将1.5g的明胶(pig，300bloom，type A)及50ml的三次蒸馏水混合后，将上述混合物加热至70℃使明胶完全溶解来制备。天然高分子溶液为将1.5g的阿拉伯胶及50ml的三次蒸馏水混合后，使上述混合物保持70℃的温度使阿拉伯胶完全溶解来制备。向上述明胶溶液添加24g的作为油的角鲨烷(hydrogenated poly1-decen，puresyn4)后，在40℃以上的温度下利用搅拌机以100rpm至150rpm的转速搅拌5分钟。向已搅拌的明胶溶液添加上述天然高分子溶液后，使用酸溶液(乙酸或盐酸)调节pH至3.1至3.6。即，明胶及阿拉伯胶以1∶1的重量比混合。在35℃以上的温度下搅拌已调节pH的溶液1小时，之后慢慢降温至25℃进行冷却。进一步地，添加4倍于已冷却的溶液的量的水后搅拌并降温至10℃以下。使用分液漏斗转移冷却的溶液后，分离出上层的明胶油胶囊。向分离的明胶油胶囊添加0.5％的聚戊二醛水溶液并搅拌1小时。使用分裂漏斗转移明胶油胶囊所包含的搅拌物后，使用三次蒸馏水洗涤6次。将完成的明胶油胶囊(明胶∶阿拉伯胶∶透明质酸＝1∶1∶0，实验组1)放在三次蒸馏水中保管。
1-2.实验组2至实验组4
混合明胶、阿拉伯胶及透明质酸来制备明胶油胶囊。更详细地，实验组2至实验组4的明胶油胶囊以与实施例1-1相同的方法制备，以表1所示的重量比混合阿拉伯胶及透明质酸来制备天然高分子溶液。
表1
实验组1 实验组2 实验组3 实验组4
明胶 1 1 1 1
阿拉伯胶 1 0.9 0.5 0.1
透明质酸 0 0.1 0.5 0.9
1-3.实验组5至实验组11
添加油性增稠剂来制备明胶油胶囊，油性增稠剂的种类及浓度如表2所示。
表2
具体地，明胶溶液为将3g的明胶(pig，300bloom，type A)及100ml的三次蒸馏水混合后，将上述混合物加热至70℃使明胶完全溶解来制备。天然高分子溶液为将3g的阿拉伯胶及100ml的三次蒸馏水混合后，使上述混合物保持70℃的温度使阿拉伯胶完全溶解来制备。与24.54g的作为油的角鲨烷(hydrogenated poly 1-decen,puresyn4)一起向上述明胶溶液添加表2所示重量百分比(浓度)的各实验组的相关油性增稠剂后，在45℃以上的温度下利用搅拌机以100rpm至150rpm的转速搅拌5分钟。向已搅拌的明胶溶液添加上述天然高分子溶液后，使用酸溶液(乙酸或盐酸)调节pH至3.1至3.6。在35℃以上的温度下搅拌已调节pH的溶液1小时，之后慢慢降温至25℃进行冷却。进一步地，添加4倍于冷却溶液的量的水后搅拌并降温至10℃以下。使用分液漏斗转移冷却的溶液后，分离出上层的明胶油胶囊。向分离的明胶油胶囊添加0.5％的聚戊二醛水溶液并搅拌1小时。使用分裂漏斗转移明胶油胶囊所包含的搅拌物后，使用三次蒸馏水洗涤6次。将完成的明胶油胶囊放在三次蒸馏水中保管。
实施例2.明胶油胶囊的弹性系数检测
检测实验组1至实验组4的明胶油胶囊的弹性系数。具体地，将明胶油胶囊配置于间隔1000μm、半径为20mm的两个平板之间。弹性系数利用旋转流变仪(rotatingrheometer)(TA Instruments公司，AR 1500ex型)在常温下将压力(strain)固定在0.01，在0.01～5Hz的范围内分析。明胶油胶囊弹性系数的检测结果如图2所示。
如图2所示，制备明胶油胶囊时，在由透明质酸替代阿拉伯胶的一部分的情况下，确认明胶油胶囊的弹性增加。尤其，确认以1∶1的重量比混合阿拉伯胶及透明质酸的实验组3及以1∶9的重量比混合的实验组4的弹性显著增加。
实施例3.明胶油胶囊及心肌细胞的共同培养
将实施例1中制备的实验组4的明胶油胶囊和源自人类的心肌细胞(iCellCardiomyocytes，CMC-100-010-001，美国，Cellular Dynamics International)共同培养。具体地，为了将明胶油胶囊用作细胞培养体，将上述胶囊浸泡在磷酸盐缓冲溶液(PBS)后搅拌5分钟。搅拌结束后更换磷酸盐缓冲溶液后继续搅拌，反复此过程2次至3次。搅拌结束后，去除磷酸盐缓冲溶液后，将明胶油胶囊移至平板培养基(Plating Medium)(平板培养基：50％的平板培养基，10％的胎牛血清(Hyclone公司，SH30919.03，美国))，在4℃的温度下储存24小时。
为了共同培养，使用胰蛋白酶处理心肌细胞来使单一细胞悬浮。使用含有血清的培养基使胰蛋白酶灭活后，通过离心分离获得心肌细胞。获得的细胞在添加新的培养基使其再次悬浮后进行计数。将计数的细胞以高浓度包含于200μl的培养基中的方式来准备。将作为细胞培养体的明胶油胶囊移至15ml的离心管，添加能够润湿细胞培养体程度的培养基。将准备好的心肌细胞接种于含有细胞培养体及培养基的离心管后进行培养。上述培养在保持37℃及5％的CO2的条件的培养器中进行一晚(overnight)，为了使沉淀的细胞再次悬浮起来，以15分钟至30分钟的间隔进行轻扣(tap)。将培养完毕的心肌细胞-细胞培养体移到细胞附着力低的培养容器后，使用光学显微镜、扫描电子显微镜及透射电子显微镜进行观察。实验组2至实验组4的明胶油胶囊也通过上述方法观察心肌细胞-细胞培养体。心肌细胞-细胞培养体的观察结果如图3及图4所示。
如图3所示，确认实验组1至实验组4的心肌细胞以作为细胞培养体的明胶油胶囊为中心密集。相反，在没有使用细胞培养体的对照组中，观察到细胞散布于培养板。
如图4所示，确认心肌细胞附着于实验组1至实验组4的细胞培养体，培养的细胞形成球体(sphere)。尤其，确认在制备细胞培养体时使用明胶、阿拉伯胶及透明质酸的实验组2至实验组4的心肌细胞显出与成熟肌细胞相似的形态。
实施例4.共同培养的心肌细胞的细胞存活率分析
为了利用实施例1中制备的实验组4来确认共同培养的心肌细胞的存活率，从第4天开始以间隔一周的方式培养至第42天后，通过存活/凋亡分析(Live-dead assay)(abcam公司，ab65470)进行确认。存活/凋亡分析根据生产公司的说明书进行，其结果如图5所示。
如图5所示，绿色荧表示存活的细胞，红色荧光表示死去的细胞，与接种数量或培养时间无关地，确认大部分细胞都存活下来了。
实施例5.明胶油胶囊及从间充质干细胞分化的心肌细胞的共同培养
将在实施例1中制备的实验组10的包含油性增稠剂的明胶油胶囊与心肌细胞(FUJIFLIM公司，Cellular Dynamics，iCell Cardiomuyocytes)进行共同培养。具体地，为了将明胶油胶囊用作细胞培养体，将上述胶囊浸泡在磷酸盐缓冲溶液(PBS)搅拌5分钟。搅拌结束后更换磷酸盐缓冲溶液后继续搅拌，反复此过程2次至3次。搅拌结束后，去除磷酸盐缓冲溶液后，将明胶油胶囊移至平板培养基(平板培养基：50％的平板培养基，10％的胎牛血清(Hyclone公司，SH30919.03，美国))，在4℃的温度下储存24小时。
将心肌细胞接种于上述含有细胞培养体及培养基的离心管后进行培养。上述培养在保持37℃及5％的CO2的条件的培养器中进行一晚(overnight)。为了确认接种的细胞是否均匀地涂敷于细胞培养体表面，使用细胞膜橙色荧光探针(DiI)及细胞膜红色荧光探针(DiD)染色心肌细胞后，经过两次接种后，使用共聚焦显微镜进行观察。其结果如图6所示。
如图6所示，确认心肌细胞全部均匀地附着于实验组10的包含作为油性增稠剂的Rheopearl KL(糊精棕榈酸酯)的明胶油胶囊，没有空出的部分。
实施例6.明胶油胶囊及宫颈癌细胞共同培养
共同培养在实施例1中制备的实验组10的包含油性增稠剂的明胶油胶囊与海拉细胞(ATCC公司)。实验过程以与实施例3相同的方式进行。细胞附着2天后，使用显微镜进行观察，其结果如图7所示。
如图7所示，确认海拉细胞正常附着于实验组10的包含作为油性增稠剂的Rheopearl KL的明胶油胶囊。
通过以上实验可以确认，本发明的包含油性增稠剂的明胶油胶囊可以有用地用作用于多种细胞培养的载体。
实施例7.利用透射电子显微镜对共同培养的心肌细胞的观察
利用透射电子显微镜观察在实施例1中制备的实验组4的共同培养的心肌细胞。具体地，实验组以与实施例3-1相同的方法共同培养并准备心肌细胞，对照组以现有已知的方法来培养心肌细胞。使用透射电子显微镜观察培养的心肌细胞，其结果如图8及图9所示。
如图8及图9所示，对照组观察到多数未成熟的心肌细胞。相反，实验组观察到多数成熟的肌细胞，确认培养的细胞形成球体。通过上述结果不仅可以确认将明胶油胶囊用作细胞培养体可以形成球体，还可以通过心肌细胞的成熟，来确认就行的心肌细胞可以用作人工心肌结构体。
接着，为了确认共同培养的心肌细胞的细胞器的成熟程度，使用透射电子显微镜进行观察。具体地，使用2.5％的聚戊二醛(在磷酸盐缓冲溶液内)在4℃的低温环境中进行固定。使用0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)冲洗固定的细胞10分钟～20分钟。作为后固定，使用1％的锇酸(OsO4，osmic acid)进行约1小时的反应后，再次使用0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)冲洗。为了去除样品内的水分，分别使用50％、70％、80％、95％、100％的乙醇，按照从低浓度到高浓度的顺序，在5分钟内进行脱水。使用超薄切片机(Ultra Microtome)切片为1μm后，移到载玻片上，在加热板(80℃)上一边伸展一边附着及固定。经过电子染色后进行观察，其结果如图9所示。
如图9所示，培养2周后观察到少量肌原纤维(myofibriles)和线粒体，第5周与第2周相比，观察到成熟的线粒体及肌原纤维。并且，确认形成可以在成熟的心肌细胞中看到的多核细胞和坚固的连接(Junction)。
实施例8.根据添加油性增稠剂的明胶油胶囊的特性比较
比较实验组5至实验组11的明胶油胶囊的粘性、形态及乳浊液形成与否，其结果如表3所示。
表3
如表3所示，可知明胶油胶囊的特性随着油性增稠剂的添加而变化。尤其可知，将5％浓度的Rheopearl KL(糊精棕榈酸酯)用作油性增稠剂的实验组10的明胶油胶囊在常温下的粘性高，不仅形成灰白坚硬的凝胶，还形成乳浊液。
实施例9.根据是否添加油性增稠剂的明胶油胶囊的保持度比较
对在物理条件下未添加油性增稠剂的实验组4和添加油性增稠剂的实验组10的保持度进行比较。具体地，利用针向上述各个明胶油胶囊施加局部压力。观察施加压力的明胶油胶囊的保持程度。明胶油胶囊的保持度比较结果如图10所示。
如图10所示，确认添加油性增稠剂的实验组10即使施加局部压力，仍保持柔软的状态且不破裂。不仅如此，确认在持续刺激下破裂后，明胶油胶囊内部的油也不扩散，仍保持原有的模样。相反，可知未添加油性增稠剂的实验组4在施加压力后破裂，确认明胶油胶囊内部的油流出并扩散。上述结果表明在制备明胶油胶囊时添加油性增稠剂提高胶囊的保持度。并且，添加油性增稠剂的明胶油胶囊在胶囊破裂后，内部的油仍保持原有形态，利用这种现象，可知在培养细胞时，即使明胶油胶囊受损，也仍能够向培养中的细胞持续提供氧。
实施例10.人工心肌结构体的心搏率及搏动间隔确认
确认将明胶油胶囊和心肌细胞共同培养的情况下，细胞能够成熟化，确认形成球体的心肌细胞可以用作人工心肌结构体。为了证明制备的心肌细胞可以用作人工心肌结构体，对利用在实施例1中制备的实验组4共同培养的心肌细胞的心搏率及搏动间隔进行确认。具体地，从培养第4天开始每隔一周直到第42天，通过视频拍摄对人工心肌结构体的每分钟心搏率和搏动间隔进行检测。心搏率及搏动间隔确认结果如图11所示。
如图11所示，在培养初期，搏动间隔或多或少地在2秒至4秒之间，搏动不规律，并且搏动迟缓，从培养第21天起，可以确认搏动有规律。
接着，利用包含在实施例1中制备的实验组10的油性增稠剂的明胶油胶囊以相同的方法培养心肌细胞后，确认是否搏动。其结果如图12所示。
如图12所示，对培养第21天及第43天的心肌细胞的搏动进行确认的结果，确认表现出规律且稳定的搏动间隔。尤其，在不包含油性增稠剂的情况下，发生了在实验中间明胶胶囊破裂的情况(培养第43天的收率为约35％)，但在本发明的包含油性增稠剂的明胶油胶囊的情况下，确认直到培养第43天未发现破裂的现象而稳定地保持原有状态。
实施例11.人工心肌结构体的功能验证
为了验证通过上述实验过程确立的本发明的包含明胶、天然高分子、油以及油性增稠剂的明胶油胶囊与心肌细胞共同培养来制备的人工心肌结构体的功能，确认最大去极化速度(Vmax)、心搏率(Beat rate)、复极化时间(APD90)、全振幅(Total amplitude)。
具体地，通过膜片钳方法分析根据二维(2D)或明胶油胶囊培养环境的hiPSC-CM的电生理学成熟度。为了膜片钳记录，将在二维或明胶油胶囊培养环境中培养1周、3周及5周的hiPSC-CM移到16mm的盖玻片保持2天至3天后，移到设置于倒置显微镜的膜片钳用记录腔室来检测动作电位。上述动作电位检测是在将电阻为2MΩ至3MΩ的玻璃微电极紧密贴合于细胞膜后，在全细胞记录条件(conventional whole-cell patch configuration)下检测动作电位，并选择在保持生理学温度(37℃)的环境中表现出自发收缩的细胞。用于记录动作电位的腔室溶液的组合与玻璃微电极溶液的组合如下：
-腔室溶液：3.5mM的氯化钾(KCl)、10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、145mM的氯化钠(NaCl)、1mM的氯化镁(MgCl2)、1.8mM的氯化钙(CaCl2)、5mM的葡萄糖(glucose)，用氢氧化钠(NaOH)调节pH至7.4。
-玻璃微电极溶液：25mM的氯化钾、120mM的K-天冬氨酸(K-aspartate)、5mM的氯化钠、10mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.1mM的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、1mM的氯化镁、3mM的MgATP，用氢氧化钾(KOH)调节pH至7.2。
利用膜片钳放大器(Axopatch 1D型，Axon Instrument公司、加利福尼亚，美国)及模拟数字转换器(Digidata-1550型，Axon Instrument公司)和pCalmp11(Axon Instrument公司)程序来记录动作电位。动作电位的特性通过利用Clampfit 11(Axon Instrument公司)程序来分析最大去极化速度(Vmax)、心搏率(Beat rate)、复极化时间(APD90)、全振幅(Total amplitude)，其结果如图13所示。进一步地，分析心搏率及复极化时间的结果如图14所示。
如图13所示，可知与本发明的明胶油胶囊共同培养的心肌细胞的最大去极化速度比通过现有的二维方法培养的细胞低，而且有规律。并且，通过观察与本发明的明胶油胶囊共同培养的心肌细胞的心搏率、复极化时间及全振幅，可知已实现了上述细胞的成熟化。
如图14所示，虽然与本发明的明胶油胶囊共同培养的心肌细胞在培养1周时，其复极化时间短、心搏率不均匀，但在培养第3周时，心搏率及复极化时间都有所增加。与此相比，确认通过现有的二维方法培养的细胞在培养开始第1周及第3周时几乎没有变化。上述结果表明，若与本发明的明胶油胶囊共同培养心肌细胞，则可使培养的心肌细胞成熟化。因此，通过利用明胶油胶囊共同培养心肌细胞来制备的人工心肌结构体，构成其的各个细胞都具有相似的心搏率及复极化速度，与实际的心脏结构非常相似，可知其可以发挥心脏类器官的功能。
并且，在通过共同培养明胶油胶囊和心肌细胞来制备的人工心肌结构体进一步处理多种药物后确认收缩力。其结果如图15所示。
如图15所示，在药物反应条件下观察心脏搏动的结果，在使用125nM的维拉帕米(verapamil)处理的组中可以确认心脏搏动变缓且多少有些不规律，在使用10nM的异丙肾上腺素(Isopreterenol)处理的组中可以观察到心脏搏动变快，收缩力变强。并且，在使用100nM的硝苯地平(Nifedipine)处理的组中可以确认心脏搏动变缓，收缩力也变弱。通过此，可以在人工制备的本发明的人工心肌结构体(心脏类器官)中也可以检测到在人体中表现的药物效果之类的反应，确认可以更加准确地预测药物的心脏毒性反应。
实施例12.利用多种细胞的人工细胞结构体的制备
将明胶油胶囊与多种细胞共同培养来制备人工细胞结构体。更详细地，利用新生大鼠心肌细胞(Rat neonatal cardiomyocyte)、人脂肪干细胞(human adipose derivedstem cell)、人脐血内皮祖细胞(human cord blood derived endothelial progenitorcell)以及兔软骨细胞(Rabbit chondrocyte)制备各人工细胞结构体。使用透射电子显微镜观察制备的新生大鼠心肌细胞、人脂肪干细胞、人脐血内皮祖细胞的人工细胞结构体，通过免疫组织化学染色观察兔软骨细胞的人工细胞结构体。制备的人工细胞结构体如图16所示。
如图16所示，确认新生大鼠心肌细胞、人脂肪干细胞、人脐血内皮祖细胞以及兔软骨细胞都附着在明胶油胶囊来培养，最终形成球形的人工细胞结构体。
综上所述，本发明人开发出微胶囊，在制备上述微胶囊时，在混合明胶、天然高分子、油以及油性增稠剂来制备的情况下，确认机械物性显著提高。并且，在利用上述微胶囊培养细胞的情况下，确认提高细胞的附着及存活，诱导培养细胞的成熟化。因此，本发明的微胶囊可以多种多样地用于利用载体的细胞培养、共同培养系统及人工细胞结构体制备领域。

Claims (7)

1.一种细胞培养用载体，其特征在于，包含微胶囊，所述微胶囊包含明胶、天然高分子、油以及油性增稠剂；其中天然高分子为阿拉伯胶，油性增稠剂为基于油5％重量比的糊精棕榈酸酯，其中明胶及天然高分子以1：0.1至1：1的重量比混合。
2.根据权利要求1所述的细胞培养用载体，其特征在于，所述天然高分子进一步含有透明质酸。
3.根据权利要求2所述的细胞培养用载体，其特征在于，在阿拉伯胶及透明质酸的混合物中，所述阿拉伯胶及透明质酸以1：9至9：1的重量比混合。
4.根据权利要求1所述的细胞培养用载体，其特征在于，上述油为选自由橄榄油、山茶油、蓖麻油、棕榈油、荷荷巴油、扁桃仁油、葡萄籽油、草本油、玫瑰油、椰油、辣木油、米糠油、杏仁油、葵花籽油、白池花籽油、阿比西尼亚油以及角鲨烷组成的组中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的细胞培养用载体，其特征在于，上述细胞为贴壁依赖性细胞。
6.根据权利要求5所述的细胞培养用载体，其特征在于，上述贴壁依赖性细胞为选自由心肌细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、上皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、宫颈细胞、癌细胞、间充质干细胞组成的组中的一种以上。
7.一种细胞培养基组合物，其特征在于，包含权利要求1至6中任一项所述的细胞培养用载体。
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