JP2024073646A - 細胞構造体及び細胞構造体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞間に血管網を有する細胞構造体及び細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法を提供すること。【解決手段】断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、細胞間に血管網を有する細胞構造体であって、上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。【選択図】なし
Description
本発明は、細胞構造体及び細胞構造体の製造方法、特に、細胞間に血管網を有する細胞構造体及び細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法に関する。
人工的に生体組織を模した構造体を作製する手法として、例えば、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法(特許文献1)、細胞をカチオン性物質および細胞外マトリックス成分と混合して混合物を得て、得られた混合物から細胞を集めて、基材上に細胞集合体を形成することを含む、立体的細胞組織の製造方法(特許文献2)等が知られている。また、本発明者らは、細胞と断片化された外因性コラーゲンを接触させることで、比較的少ない細胞数で、厚さが1mm以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造する方法(特許文献3)を提案している。これらのような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。
上述の三次元組織体の製造方法によれば、厚みのある三次元組織体を作製することができる。しかしながら、生体組織のように血管網が細胞間に形成されている脂肪組織を作製する方法については知られていなかった。
そこで、本発明は、細胞間に血管網を有する細胞構造体及び細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、例えば以下の各発明に関する。
〔1〕 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有する細胞構造体であって、
上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。
〔2〕 上記血管網が、上記脂肪細胞間に形成されている〔1〕に記載の細胞構造体。
〔3〕 上記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、〔1〕又は〔2〕に記載の細胞構造体。
〔4〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が、100nm以上400μm以下である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔5〕 細胞構造体における細胞外マトリックス成分含有率が、上記細胞構造体の乾燥重量を基準として0.01~90質量%である、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔6〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔7〕 フィブリンをさらに含む、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔8〕 移植用である、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔9〕 断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程であって、細胞が、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む工程と、
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程と
を含む、細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法。
〔10〕 上記細胞が、脂肪細胞、脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む、〔9〕に記載の方法。
〔11〕 上記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、〔9〕又は〔10〕に記載の方法。
〔12〕 上記接触工程における上記断片化された細胞外マトリックス成分の量が、1.0×106cellsの細胞に対して、0.1~100mgである、〔9〕~〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔13〕 上記接触工程おける幹細胞と血管内皮細胞の細胞数の比が、100/1~1/100である、〔9〕~〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、〔9〕~〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔15〕 上記接触工程、又は上記接触工程後かつ培養工程前に、フィブリノゲンを添加することをさらに含む、〔9〕~〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔16〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を移植物として有する、非ヒトモデル動物。
〔17〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトモデル動物の製造方法。
〔18〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を動物に移植することを含む、血管構造を有する細胞構造体の移植方法。
〔19〕 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有し、
支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体であって、
上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。
〔20〕 略球体状である、〔19〕に記載の細胞構造体。
〔21〕 断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程であって、細胞が、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む工程と、
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程と
を含み、
上記培養工程が、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を支持体に接着しない状態で培養することを含む、細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法。
〔22〕 上記培養工程が、支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すことを含む、〔21〕に記載の方法。
〔23〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を含み、上記血管網が、複数の細胞構造体間で接続している、細胞組織。
〔24〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を浮遊培養することを含む、細胞組織の製造方法。
〔25〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトモデル動物の製造方法。
〔26〕 細胞構造体を非ヒト動物に移植した後、30日以上生育することを含む、〔25〕に記載の方法。
〔27〕 細胞構造体を非ヒト動物に移植した後、90日以上生育することを含む、〔26〕に記載の方法。
〔1〕 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有する細胞構造体であって、
上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。
〔2〕 上記血管網が、上記脂肪細胞間に形成されている〔1〕に記載の細胞構造体。
〔3〕 上記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、〔1〕又は〔2〕に記載の細胞構造体。
〔4〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が、100nm以上400μm以下である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔5〕 細胞構造体における細胞外マトリックス成分含有率が、上記細胞構造体の乾燥重量を基準として0.01~90質量%である、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔6〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔7〕 フィブリンをさらに含む、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔8〕 移植用である、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔9〕 断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程であって、細胞が、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む工程と、
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程と
を含む、細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法。
〔10〕 上記細胞が、脂肪細胞、脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む、〔9〕に記載の方法。
〔11〕 上記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、〔9〕又は〔10〕に記載の方法。
〔12〕 上記接触工程における上記断片化された細胞外マトリックス成分の量が、1.0×106cellsの細胞に対して、0.1~100mgである、〔9〕~〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔13〕 上記接触工程おける幹細胞と血管内皮細胞の細胞数の比が、100/1~1/100である、〔9〕~〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、〔9〕~〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔15〕 上記接触工程、又は上記接触工程後かつ培養工程前に、フィブリノゲンを添加することをさらに含む、〔9〕~〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔16〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を移植物として有する、非ヒトモデル動物。
〔17〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトモデル動物の製造方法。
〔18〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を動物に移植することを含む、血管構造を有する細胞構造体の移植方法。
〔19〕 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有し、
支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体であって、
上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。
〔20〕 略球体状である、〔19〕に記載の細胞構造体。
〔21〕 断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程であって、細胞が、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む工程と、
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程と
を含み、
上記培養工程が、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を支持体に接着しない状態で培養することを含む、細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法。
〔22〕 上記培養工程が、支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すことを含む、〔21〕に記載の方法。
〔23〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を含み、上記血管網が、複数の細胞構造体間で接続している、細胞組織。
〔24〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を浮遊培養することを含む、細胞組織の製造方法。
〔25〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトモデル動物の製造方法。
〔26〕 細胞構造体を非ヒト動物に移植した後、30日以上生育することを含む、〔25〕に記載の方法。
〔27〕 細胞構造体を非ヒト動物に移植した後、90日以上生育することを含む、〔26〕に記載の方法。
本発明によれば、細胞間に血管網を有する細胞構造体を簡便に製造することができる。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
[細胞構造体]
本実施形態に係る細胞構造体は、断片化された細胞外マトリックス成分と、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む細胞とを含み、細胞間に血管網を有する。
本実施形態に係る細胞構造体は、断片化された細胞外マトリックス成分と、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む細胞とを含み、細胞間に血管網を有する。
人工的に作製した厚みのある三次元組織体は、血管が存在しない状態で維持することが難しく、外部から酸素等を供給する必要があるとされている。これに対して、本実施形態に係る細胞構造体は、生体組織のように細胞間に血管網が形成されているため、長期間維持できることが期待される。また、哺乳類等に移植した際に生着しやすくなることも期待される。
本明細書において「細胞構造体」とは、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体(塊状の細胞集団)であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。細胞構造体の形状は特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が細胞構造体より複雑である。そのため、細胞構造体と生体組織とは容易に区別可能である。また、細胞構造体は、支持体と接着した状態で塊状に集合したものであってもよく、支持体と接着していない状態で塊状に集合したものであってもよい。支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体を複数使用することで、後述するように、複数の細胞構造体間で血管網が接続した細胞組織を効率よく製造することができる。
(細胞)
本明細書において「細胞」は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
本明細書において「細胞」は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能及び多分化能を有する細胞を意味する。幹細胞には、任意の細胞種に分化する能力を持つ多能性幹細胞と、特定の細胞種に分化する能力を持つ組織幹細胞(体性幹細胞とも呼ばれる)が含まれる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞(ES細胞)、体細胞由来ES細胞(ntES細胞)及び人工多能性幹細胞(iPS細胞)が挙げられる。組織幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞(例えば、脂肪幹細胞、骨髄由来幹細胞)、造血幹細胞及び神経幹細胞が挙げられる。脂肪幹細胞としては、例えば、ヒト脂肪幹細胞(ADSC)が挙げられる。
本実施形態に係る細胞構造体において細胞は、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む。
本明細書において「脂肪細胞」とは、脂肪幹細胞を除くすべての脂肪細胞を意味する。脂肪細胞には、成熟脂肪細胞、及び脂肪幹細胞に含まれない脂肪細胞が含まれ、脂肪細胞は、成熟脂肪細胞を含むことが好ましく、脂肪細胞の全細胞数のうち90%以上が成熟脂肪細胞であることがより好ましく、全てが成熟脂肪細胞であることがさらに好ましい。脂肪細胞は、例えば、皮下脂肪組織及び心外膜由来脂肪組織等から採取した細胞を用いてもよく、採取した細胞(例えば、脂肪幹細胞)を分化誘導して用いてもよい。脂肪細胞は、特に限定されないが、脂肪細胞から構築した脂肪組織を、最終的に生体の特定箇所の組織に見立てて利用する場合には、当該箇所の組織に対応する組織由来のものを用いることが好ましい。
脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド(中性脂肪)、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の1重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質(ペリリピン等)の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が20μm以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
脂肪細胞の含有率は、細胞構造体における全細胞数に対して、例えば、5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、又は30%以上であってよく、95%以下、90%以下、80%以下又は75%以下であってよい。
本明細書において「血管内皮細胞」は、血管内腔の表面を構成する扁平状の細胞を意味する。血管内皮細胞としては、例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)が挙げられる。
血管内皮細胞の含有率は、細胞構造体における全細胞数に対して、例えば、5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上又は30%以上であってよく、95%以下、90%以下、80%以下、又は75%以下であってよい。
本実施形態において細胞は、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含むが、脂肪細胞及び血管内皮細胞以外の細胞を含んでいてもよい。脂肪細胞及び血管内皮細胞以外の細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、大腸がん細胞(例えば、ヒト大腸がん細胞(HT29))、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞、上皮細胞(例えば、ヒト歯肉上皮細胞)、リンパ管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、肝細胞、接着性細胞(例えば、免疫細胞)、平滑筋細胞(例えば、大動脈平滑筋細胞(Arota-SMC))、膵島細胞、角化細胞(例えば、ヒト表皮角化細胞)等が挙げられる。
本実施形態に係る細胞構造体における脂肪細胞と血管内皮細胞の細胞数の比(脂肪細胞/血管内皮細胞)は、特に制限されず、例えば、100/1~1/100であってよく、50/1~1/50であってよく、20/1~1/1であってよく、10/1~1/1であってよく、8/1~1/1であってよく、7/1~1.2/1であってよく、6/1~1.5/1であってよく、5/1~2/1であってよく、3/1~2/1であってもよい。
(細胞間の血管網)
本実施形態に係る細胞構造体は、細胞間に血管網を有する。「細胞間に血管網を有する」とは、生体組織と同様に、分岐した血管が細胞を取り囲むように細胞と細胞の間に延びた構造を有することを意味する。生体組織と同様の血管網が形成されているか否かについては、例えば、生体組織における血管の分岐数及び/又は血管の分岐間の長さ及び/又は血管の直径の多様性に基づき判断することができる。例えば、生体組織における血管の分岐数の平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、80%以上150%以下、85%以上130%以下、又は90%以上120%以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。また、例えば、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、2.5以上4.5以下、又は3.0以上4.2以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。例えば、生体組織における血管の分岐間の長さの平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐間の長さの平均値が、80%以上150%以下、85%以上130%以下、及び90%以上120%以下である場合に、生体組織における血管の分岐間の長さと類似していると判断してもよい。生体組織においては、太い血管及び細い血管の両方が観察される。そこで、例えば、生体組織と同様に直径の太いもの(例えば、10μm以上25μm未満)と細いもの(例えば、0μm超10μm未満)の両方が観察された場合には、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。また、例えば、0μm超25μm未満に血管直径全体の60%以上、70%以上又は80%以上が分布している場合に、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。本実施形態に係る細胞構造体は、脂肪細胞間に血管網を有することが好ましい。その場合、血管網を有するだけでなく、血管に取り囲まれる脂肪細胞も生体組織と近いことが好ましい。例えば、本実施形態に係る細胞構造体における脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、20μm~180μm、又は100μm~180μmである場合に、細胞構造体が生体組織における脂肪細胞と同様の脂肪細胞を有すると判断してもよい。上記生体組織及び細胞構造体の比較に際しては、同じ条件(例えば、一定体積当たり、画像解析であれば一定面積当たり、一定サンプル当たり等)にて生体組織と細胞構造体を比較する。
本実施形態に係る細胞構造体は、細胞間に血管網を有する。「細胞間に血管網を有する」とは、生体組織と同様に、分岐した血管が細胞を取り囲むように細胞と細胞の間に延びた構造を有することを意味する。生体組織と同様の血管網が形成されているか否かについては、例えば、生体組織における血管の分岐数及び/又は血管の分岐間の長さ及び/又は血管の直径の多様性に基づき判断することができる。例えば、生体組織における血管の分岐数の平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、80%以上150%以下、85%以上130%以下、又は90%以上120%以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。また、例えば、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、2.5以上4.5以下、又は3.0以上4.2以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。例えば、生体組織における血管の分岐間の長さの平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐間の長さの平均値が、80%以上150%以下、85%以上130%以下、及び90%以上120%以下である場合に、生体組織における血管の分岐間の長さと類似していると判断してもよい。生体組織においては、太い血管及び細い血管の両方が観察される。そこで、例えば、生体組織と同様に直径の太いもの(例えば、10μm以上25μm未満)と細いもの(例えば、0μm超10μm未満)の両方が観察された場合には、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。また、例えば、0μm超25μm未満に血管直径全体の60%以上、70%以上又は80%以上が分布している場合に、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。本実施形態に係る細胞構造体は、脂肪細胞間に血管網を有することが好ましい。その場合、血管網を有するだけでなく、血管に取り囲まれる脂肪細胞も生体組織と近いことが好ましい。例えば、本実施形態に係る細胞構造体における脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、20μm~180μm、又は100μm~180μmである場合に、細胞構造体が生体組織における脂肪細胞と同様の脂肪細胞を有すると判断してもよい。上記生体組織及び細胞構造体の比較に際しては、同じ条件(例えば、一定体積当たり、画像解析であれば一定面積当たり、一定サンプル当たり等)にて生体組織と細胞構造体を比較する。
(断片化された細胞外マトリックス成分)
本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらの1種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲン成分を含んでいてよく、コラーゲン成分であってもよい。本実施形態における細胞外マトリックス成分は、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。
本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらの1種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲン成分を含んでいてよく、コラーゲン成分であってもよい。本実施形態における細胞外マトリックス成分は、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。
「断片化」とは、細胞外マトリックス成分の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化された細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を含んでもよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である。例えば、解繊は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
コラーゲン成分等の細胞外マトリックス成分を断片化する方法は、特に制限はなく、物理的な力の印加によって断片化してよい。細胞外マトリックス成分を断片化する方法は、例えば、塊状の細胞外マトリックス成分を細かく砕く方法であってよい。細胞外マトリックス成分は、固相で断片化されてもよく、水性媒体中で断片化されてもよい。例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化された細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。
断片化された細胞外マトリックス成分の直径及び長さは、電子顕微鏡によって個々の断片化された細胞外マトリックス成分を解析することによって求めることが可能である。
断片化された細胞外マトリックス成分の平均長は、100nm以上400μm以下であってよく、100nm以上200μm以下であってよい。一実施形態において、断片化された細胞外マトリックス成分の平均長は、厚い組織が形成しやすくなる観点から、5μm以上400μm以下であってよく、10μm以上400μm以下であってよく、100μm以上400μm以下であってよい。他の実施形態において、断片化された細胞外マトリックス成分の平均長は、100μm以下であってよく、50μm以下であってよく、30μm以下であってよく、15μm以下であってよく、10μm以下であってよく、1μm以下であってよく、100nm以上であってよい。断片化された細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化された細胞外マトリックス成分全体のうち、50%以上の断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましく、95%の断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることがより好ましい。断片化された細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化されたコラーゲン成分であることが好ましい。
断片化された細胞外マトリックス成分の平均径は、50nm~30μmであってよく、4μm~30μmであってよく、5μm~30μmであってよい。断片化された細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化されたコラーゲン成分であることが好ましい。
断片化された細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡等によって個々の断片化された細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合、断片化された細胞外マトリックス成分は「断片化コラーゲン成分」とも称される。「断片化コラーゲン成分」とは、線維性コラーゲン成分等のコラーゲン成分を断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲン成分の平均長は、100nm~200μmであることが好ましく、22μm~200μmであることがより好ましく、100μm~200μmであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲン成分の平均径は、50nm~30μmであることが好ましく、4μm~30μmであることがより好ましく、20μm~30μmであることがさらにより好ましい。
断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を構成する細胞外マトリックス分子の分子内又は分子間で架橋されていてよい。
架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。細胞の生育を妨げない観点からは、物理架橋が好ましい。架橋(物理架橋及び化学架橋)は、共有結合を介した架橋であってよい。
細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、架橋は、コラーゲン分子(三重らせん構造)の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細繊維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋(熱架橋)であってよい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。コラーゲン成分の熱架橋を行う場合、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン分子のアミノ基が、同一又は他のコラーゲン分子のカルボキシ基とペプチド結合(-NH-CO-)を形成することにより、架橋されていてよい。
細胞外マトリックス成分は架橋剤を使用することによっても、架橋させることができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
架橋度の定量は、細胞外マトリックス成分の種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、1%以上、2%以上、4%以上、8%以上、又は12%以上であってよく、30%以下、20%以下、又は15%以下であってもよい。架橋度が上記範囲にあることにより、細胞外マトリックス分子が適度に分散することができ、また、乾燥保存後の再分散性が良好である。
細胞外マトリックス成分中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、非特許文献2等に記載されているTNBS法に基づき定量することが可能である。TNBS法による架橋度が、上述の範囲内であってもよい。TNBS法による架橋度は、細胞外マトリックスが有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合である。細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、TNBS法により測定される架橋度が上記範囲内であることが好ましい。
架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックス成分の場合、TBO(トルイジンブルーO)法により定量してもよい。TBO法による架橋度が、上述した範囲内であってもよい。
細胞構造体における細胞外マトリックス成分含有率は、上記細胞構造体(乾燥重量)を基準として0.01~90質量%であってよく、10~90質量%であることが好ましく、10~80質量%であることが好ましく、10~70質量%であることが好ましく、10~60質量%であることが好ましく、1~50質量%であることが好ましく、10~50質量%であることが好ましく、10~30質量%であることがより好ましく、20~30質量%であることがより好ましい。
ここで、「細胞構造体における細胞外マトリックス成分」とは、細胞構造体を構成する細胞外マトリックス成分を意味し、内因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよく、外因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよい。
「内因性の細胞外マトリックス成分」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックス成分を意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、例えば、上述した線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられる。内因性細胞外マトリックス成分は、線維性であってもよいし、非線維性であってもよい。
「外因性の細胞外マトリックス成分」とは、外部から供給される細胞外マトリックス成分を意味する。本実施形態に係る細胞構造体は、外因性の細胞外マトリックス成分である断片化された細胞外マトリックス成分を含む。外因性の細胞外マトリックス成分は、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックス成分と同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックス成分は、人工の細胞外マトリックス成分であってもよい。
細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合には、外因性の細胞外マトリックス成分は「外因性コラーゲン成分」とも称され、外部から供給されるコラーゲン成分を意味する「外因性コラーゲン成分」は、複数のコラーゲン分子によって形成されている、コラーゲン分子の集合体であり、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲン成分は、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲン成分を意味し、例えば、I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンが挙げられる。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲンが挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、IV型コラーゲンが挙げられる。
外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてもよい。つまり、外因性の細胞外マトリックス成分は、異種細胞外マトリックス成分であってよい。
すなわち、細胞構造体が内因性細胞外マトリックス成分及び断片化された細胞外マトリックス成分を含む場合、上記細胞構造体を構成する細胞外マトリックス成分含有率は、内因性細胞外マトリックス成分及び断片化された細胞外マトリックス成分の合計量を意味する。上記細胞外マトリックス含有率は、得られた細胞構造体の体積、及び脱細胞化した細胞構造体の質量から算出することが可能である。
例えば、細胞構造体に含まれる細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合、細胞構造体におけるコラーゲン成分量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。細胞構造体を溶解した溶解液に、塩酸(HCl)を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、570nmの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。なお、細胞構造体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン成分定量に用いてもよい。また、溶解させる細胞構造体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の細胞構造体を溶解してコラーゲン成分定量を行う場合、細胞構造体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、細胞構造体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン成分量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。
コラーゲン成分量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
(サンプルの調製)
凍結乾燥処理を行った細胞構造体の全量を6mol/L HClと混合し、ヒートブロックで95℃、20時間以上インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように6mol/L HClで適宜希釈した後、200μLを100μLの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは35μL用いる。
(サンプルの調製)
凍結乾燥処理を行った細胞構造体の全量を6mol/L HClと混合し、ヒートブロックで95℃、20時間以上インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように6mol/L HClで適宜希釈した後、200μLを100μLの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは35μL用いる。
(スタンダードの調製)
スクリューキャップチューブに125μLのスタンダード溶液(1200μg/mL in acetic acid)と、125μLの12mol/l HClを加え混合し、ヒートブロックで95℃、20時間インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して300μg/mLのS1を作製し、S1を段階的に希釈してS2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)を作製する。4mol/l HCl90μLのみのS8(0μg/mL)も準備する。
スクリューキャップチューブに125μLのスタンダード溶液(1200μg/mL in acetic acid)と、125μLの12mol/l HClを加え混合し、ヒートブロックで95℃、20時間インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して300μg/mLのS1を作製し、S1を段階的に希釈してS2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)を作製する。4mol/l HCl90μLのみのS8(0μg/mL)も準備する。
(アッセイ)
35μLのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート(QuickZyme Total Collagen Assayキット付属、QuickZyme Biosciences社)に加える。75μLのアッセイバッファ(上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、20分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、75μLのdetection reagent (reagent A:B=30μL:45μL、上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、60℃で60分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして570nmの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。
35μLのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート(QuickZyme Total Collagen Assayキット付属、QuickZyme Biosciences社)に加える。75μLのアッセイバッファ(上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、20分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、75μLのdetection reagent (reagent A:B=30μL:45μL、上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、60℃で60分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして570nmの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。
細胞構造体中に占めるコラーゲン成分を、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば細胞構造体中のコラーゲン成分を既知の染色手法(例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色)等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、細胞構造体全体に占めるコラーゲン成分の存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、細胞構造体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば細胞構造体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。
例えば、細胞構造体中のコラーゲン成分を面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記細胞構造体の全体の面積を基準として0.01~99%であり、1~99%であることが好ましく、5~90%であることが好ましく、7~90%であることが好ましく、20~90%であることが好ましく、50~90%であることがより好ましい。「細胞構造体におけるコラーゲン成分」については、上述したとおりである。細胞構造体を構成するコラーゲン成分の面積の割合は、内因性コラーゲン成分及び外因性コラーゲン成分を合わせた面積の割合を意味する。コラーゲン成分の面積の割合は、例えば、得られた細胞構造体をマッソントリクロームで染色し、細胞構造体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲン成分の面積の割合として算出することが可能である。
細胞構造体は、トリプシンの濃度0.25%、温度37℃、pH7.4、反応時間15分でトリプシン処理を行った後の残存率が70%以上であることが好ましく、80%以上であることがより好ましく、90%以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における細胞構造体の質量から算出できる。
上記細胞構造体は、コラゲナーゼの濃度0.25%、温度37℃、pH7.4、反応時間15分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が70%以上であってもよく、80%以上であることがより好ましく、90%以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
上記細胞構造体の厚さは10μm以上であることが好ましく、100μm以上であることがより好ましく、1000μm以上であることが更により好ましい。このような細胞構造体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。細胞構造体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、10mm以下であってもよいし、3mm以下であってもよいし、2mm以下であってもよいし、1.5mm以下であってもよいし、1mm以下であってもよい。
ここで、「細胞構造体の厚さ」とは、細胞構造体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
また、細胞構造体が球体状又は略球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、細胞構造体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径を意味する。細胞構造体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、細胞構造体の重心を通る直線と上記表面とが交差する2点間の距離であって最短の距離を意味する。
(フィブリン)
本実施形態に係る細胞構造体は、フィブリンを含んでいてもよい。フィブリンは、フィブリノゲンにトロンビンが作用してAα鎖、Bβ鎖のN末端からA鎖、B鎖を放出して生ずる成分である。フィブリンはポリマーであり、一般的に水に不溶である。フィブリンは、フィブリノゲンと、トロンビンとを接触させることにより形成される。
本実施形態に係る細胞構造体は、フィブリンを含んでいてもよい。フィブリンは、フィブリノゲンにトロンビンが作用してAα鎖、Bβ鎖のN末端からA鎖、B鎖を放出して生ずる成分である。フィブリンはポリマーであり、一般的に水に不溶である。フィブリンは、フィブリノゲンと、トロンビンとを接触させることにより形成される。
[細胞構造体の製造方法]
本実施形態に係る細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法は、断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程と、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程とを含む。上記接触工程において、細胞は、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む。
本実施形態に係る細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法は、断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程と、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程とを含む。上記接触工程において、細胞は、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む。
(接触工程)
本実施形態に係る製造方法において、接触工程は、断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる工程である。
本実施形態に係る製造方法において、接触工程は、断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる工程である。
接触工程における細胞は、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むものであるか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含むものである。細胞及び各細胞に関しては、上述したとおりである。(i)において脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞以外の細胞を含んでもよく、(ii)において脂肪幹細胞及び血管内皮細胞以外の細胞を含んでもよい。(i)における幹細胞は、脂肪幹細胞であることが好ましい。また、脂肪細胞は成熟脂肪細胞を含むことが好ましい。
断片化された細胞外マトリックス成分は、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、細胞構造体の形成を促進し得る。
接触工程では、水性媒体中において、細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる。接触工程としては、断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体と細胞を含有する水性媒体とを混合する方法、断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を添加する方法、細胞を含む培養液に細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体を加える方法、細胞外マトリックス細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を加える方法、予め用意した水性媒体に、細胞外マトリックス成分及び細胞をそれぞれ加える方法等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。
また、細胞を断片化された細胞外マトリックス成分に接触させる順番も特に制限されず、例えば、上記(i)の場合であれば、幹細胞及び血管内皮細胞を断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に添加した後に脂肪細胞を添加してもよく、幹細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞の順番に断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に添加してもよく、幹細胞、血管内皮細胞及び脂肪細胞を同時に断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に添加してもよく、幹細胞、血管内皮細胞及び脂肪細胞を含有する水性媒体に断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体を添加してもよい。上記各添加後に攪拌等により混合してもよく、混合しなくてもよい。また、接触工程には、断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させた後で、一定時間インキュベートする工程が含まれてもよい。
接触工程は、水性媒体中で細胞の層を形成させた後に行われるものであってもよい。つまり、接触工程は、水性媒体中で細胞の層を形成させた後、細胞外マトリックス成分を接触させることにより行われてもよい。細胞の層を細胞外マトリックス成分と接触させる前に形成することで、下層部の細胞密度が高い細胞構造体を作製することができる。
断片化された細胞外マトリックス成分は上述した方法により得ることができる。断片化された細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を水性媒体中で断片化することにより得られるものであってよい。すなわち、本実施形態に係る製造方法は、接触工程の前に、細胞外マトリックス成分を水性媒体中で断片化する工程(断片化工程)を備えていてよい。水性媒体は、上述の断片化された細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体と同様であってよい。
断片化された細胞外マトリックス成分は、上記例示したものであってよく、断片化されたコラーゲン成分を含んでいてよい。
本実施形態に係る製造方法は、さらに、断片化工程前に細胞外マトリックス成分を加熱して、細胞外マトリックス成分の少なくとも一部を架橋する工程を備えていてもよいし、断片化工程後かつ接触工程前に、細胞外マトリックス成分を加熱して、細胞外マトリックス成分の少なくとも一部を架橋する工程を備えていてよい。
架橋する工程において、細胞外マトリックス成分を加熱する際の温度(加熱温度)及び時間(加熱時間)は適宜定めることができる。加熱温度は、例えば100℃以上であってよく、200℃以下であってよく、220℃以下であってよい。加熱温度は、具体的には、例えば、100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃、220℃等であってよい。加熱時間(上記加熱温度で保持する時間)は、加熱温度により適宜設定することができる。加熱時間は、例えば、100℃~200℃で加熱する場合、6時間以上72時間以下であってよく、より好ましくは24時間以上48時間以下である。架橋する工程では、溶媒非存在下で加熱してよく、また、減圧条件下で加熱してもよい。
本実施形態に係る製造方法は、断片化工程後に、断片化された細胞外マトリックス成分を乾燥する乾燥工程を備えていてよい。
乾燥工程では、解繊された細胞外マトリックス成分を乾燥する。乾燥は、例えば、凍結乾燥法により実施してよい。解繊工程後に、乾燥工程を行うことで、断片化細胞外マトリックス成分及び水性媒体を含む液から、水性媒体が除去される。水性媒体が除去されるとは、断片化された細胞外マトリックス成分中に一切の水分が付着していないことを意味するものではなく、上述の一般的な乾燥手法により、常識的に達することができる程度に水分が付着していないことを意味する。
幹細胞の含有率が、接触工程における全細胞数に対して、5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、又は30%以上であってよく、95%以下、90%以下、80%以下、又は75%以下であってよい。
血管内皮細胞の含有率が、接触工程における全細胞数に対して、5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、又は30%以上であってよく、95%以下、90%以下、80%以下、又は75%以下であってよい。
接触工程における細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする細胞構造体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、接触工程における水性媒体中の細胞外マトリックス成分の濃度は、0.1~90質量%であってもよいし、1~30質量%であってもよい。
接触工程における断片化された細胞外マトリックス成分の量は、例えば、1.0×106cellsの細胞に対して、0.1~100mg、0.5~50mg、0.8~25mg、1.0~10mg、1.0~5.0mg、1.0~2.0mg、又は1.0~1.8mgであってよく、0.7mg以上、1.1mg以上、1.2mg以上、1.3mg以上又は1.4mg以上であってよく、7.0mg以下、3.0mg以下、2.3mg以下、1.8mg以下、1.7mg以下、1.6mg以下又は1.5mg以下であってもよい。
接触工程において、細胞外マトリックス成分と細胞との質量比(細胞外マトリックス成分/細胞)は、1/1~1000/1であることが好ましく、9/1~900/1であることがより好ましく、10/1~500/1であることがさらに好ましい。
接触工程おける幹細胞と血管内皮細胞の細胞数の比(幹細胞/血管内皮細胞)は、特に制限されず、例えば、100/1~1/100であってよく、50/1~1/50であってよく、20/1~1/1であってよく、10/1~1/1であってよく、8/1~1/1であってよく、7/1~1.2/1であってよく、6/1~1.5/1であってよく、5/1~2/1であってよく、3/1~2/1であってもよい。
接触工程、又は接触工程後かつ培養工程前に、フィブリノゲン及び/又はトロンビンを添加することを含んでもよい。フィブリノゲン及びトロンビンの両方を添加する場合には、例えば、フィブリノゲン及びトロンビンは同時に添加してもよく、先にフィブリノゲンを添加した後にトロンビンを添加してもよい。フィブリノゲン及び/又はトロンビンを添加するタイミングは特に制限されず、例えば、幹細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞及び細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に添加してもよく、幹細胞、血管内皮細胞及び細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に添加してもよい。また、例えば、幹細胞、血管内皮細胞及び細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体にフィブリノゲンを添加した後に脂肪細胞を添加し、その後トロンビンを添加してもよい。フィブリノゲン及び/又はトロンビンを添加することにより、後述する培養工程において生じ得るシュリンクを抑制し、細胞構造体の形状及び大きさを制御しやすくすることができる。また、細胞と細胞外マトリックス成分との懸濁液をゲル化することができるため、当該懸濁液を培養器(支持体)に滴下した後、培養器から剥離しやすくすることができる。また、細胞が成熟した脂肪細胞を含む場合、成熟した脂肪細胞内部の脂肪滴の影響で脂肪細胞が浮遊し、脂肪細胞とその他の細胞とが不均一になった状態で培養されてしまう可能性があるが、懸濁液をゲル化することにより、各細胞及び細胞外マトリックス成分が均一に混合した状態を維持し、細胞と細胞外マトリックス成分とを近接させた状態を維持しやすくなる。
接触工程後かつ培養工程前に、水性媒体中における細胞外マトリックス成分と細胞とを共に沈降させる工程を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、細胞構造体における細胞外マトリックス成分及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば細胞外マトリックス成分と細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
(培養工程)
本実施形態に係る製造方法において、培養工程は、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する工程である。
本実施形態に係る製造方法において、培養工程は、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する工程である。
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は20℃~40℃であってもよく、30℃~37℃であってもよい。培地のpHは、6~8であってもよく、7.2~7.4であってもよい。培養時間は、1日~2週間であってもよく、1週間~2週間であってもよい。
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞の培養に用いられる培養器(支持体)は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、U字やV字等の底面形状を有するプレートであってよい。上記細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、上記細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。上記細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するU字やV字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。
培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Eagle’s MEM培地、DMEM、Modified Eagle培地(MEM)、Minimum Essential培地、RPMI、及びGlutaMax培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
培養工程における培地中の細胞密度は、目的とする細胞構造体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養工程における培地中の細胞密度は、1~108cells/mLであってよく、103~107cells/mLであってよい。また、培養工程における培地中の細胞密度は、接触工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
本実施形態に係る製造方法により製造される細胞構造体は、培養中の収縮率が20%以下であることが好ましく、15%以下であることがより好ましく、10%以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中L1は、培養後1日目の細胞構造体のもっとも長い部分の長さを示し、L3は、培養後3日目の細胞構造体における対応する部分の長さを示す。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
上記の例では収縮率を、培養後1日目の細胞構造体と培養3日目の細胞組織体から算出しているが、培養の終了時点を含む培養期間の任意の時点での細胞構造体から算出してもよい。例えば、培養後1日目の細胞構造体と培養2日目の細胞構造体から算出してもよく、培養後1日目の細胞構造体と培養5日目の細胞構造体から算出してもよく、培養後1日目の細胞構造体と培養8日目の細胞構造体から算出してもよい。
上記培養工程(以下、「第1の培養工程」とも表す。また、最初の接触工程を「第1の接触工程」とも表す。)の後、さらに細胞を接触させる工程(第2の接触工程)、細胞を培養する工程(第2の培養工程)を含んでもよい。第2の接触工程及び第2の培養工程によける上記細胞は、第1の接触工程及び第1の培養工程で用いた細胞と同種であってよく、異種であってもよい。第2の接触工程及び第2の培養工程により、二層構造の細胞構造体を作製することができる。また、さらに、接触工程及び培養工程を繰り返し含むことで複数層の細胞構造体を作製することができ、より複雑な生体に近い組織を作製することもできる。
本実施形態に係る製造方法によれば、細胞間に血管網を有する細胞構造体を製造することができる。細胞間に血管網を有する細胞構造体については上述したとおりである。
上記培養工程は、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を支持体に接着しない状態で培養することを含んでもよい。これにより、支持体に接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体を製造することができる。上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞が支持体に接着している場合には、上記培養工程は、支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すことを含んでもよい。上記培養工程において上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞が最初から支持体に接着していない場合には、そのまま培養することで支持体に接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体を製造することができる。
支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離す方法は、特に制限されず、例えば、低接着性の支持体を使用し、培養液を追加することで細胞を支持体から引き離してもよく、器具等を利用して直接細胞を物理的に支持体から引き離してもよく、振動を与えることにより細胞を支持体から引き離してもよく、熱及び光等の刺激に反応することで支持体と細胞の結合が外れる機能性材料を表面に塗布した支持体を用い、刺激を与えることで細胞を支持体から引き離してもよい。培養液を追加することで細胞を支持体から引き離す場合の培養液には、上記に例示した培地等を使用することができる。
培養工程において、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を最初から支持体に接着していない状態で培養する方法としては、例えば、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を含む懸濁液をゲル化させ、培養液中にそっと滴下して培養する方法、及び高粘度の溶媒中において上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞の形状をある程度固定したのち、溶媒のみを取り除いて培養容器に移す方法が挙げられる。
上記培養工程において、支持体から前記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すタイミングは、特に制限されず、例えば、培養開始から1日~7日に行ってもよく、1時間~24時間に行ってもよく、1分~60分に行ってもよく、5分~30分に行ってもよく、10分~20分に行ってもよい。
支持体から前記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離した後の培養期間は、特に制限されず、1日以上であってよく、1日~21日であってよく、3日~14日であってよく、7日~14日であってよい。
[細胞組織及びその製造方法]
上述した支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体、すなわち、「断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、細胞間に血管網を有し、支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体であって、上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体」を複数用いて、上記血管網が、複数の細胞構造体間で接続している細胞組織を製造することができる。
上述した支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体、すなわち、「断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、細胞間に血管網を有し、支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体であって、上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体」を複数用いて、上記血管網が、複数の細胞構造体間で接続している細胞組織を製造することができる。
上記細胞組織の製造は、複数の支持体と接着していない上記細胞構造体を浮遊培養することを含む。複数の上記細胞構造体は浮遊培養の過程で互いに接着し、血管網が細胞構造体間で接続されるため、血管網が繋がっている大きな細胞組織を簡単に製造することができる。用いる細胞構造体の数及び大きさは、細胞組織の用途、細胞組織の所望の大きさ等により適宜選択することができる。また、浮遊培養に用いる培地(培養液)の種類、培養の条件についても適宜選択できるが、例えば、上記(培養工程)において例示したような培地、条件で行うことができる。
[細胞構造体の用途]
上述したように、本実施形態に係る細胞構造体は、生体組織のように細胞間に血管網が形成されており、哺乳類等の動物に移植した際に生着しやすくなることも期待されることから、移植用とすることができる。移植に用いる細胞構造体は、1つであってもよく、複数であってもよい。複数である場合には、例えば、1個~1000個、10個~500個、又は50個~200個用いることができる。
上述したように、本実施形態に係る細胞構造体は、生体組織のように細胞間に血管網が形成されており、哺乳類等の動物に移植した際に生着しやすくなることも期待されることから、移植用とすることができる。移植に用いる細胞構造体は、1つであってもよく、複数であってもよい。複数である場合には、例えば、1個~1000個、10個~500個、又は50個~200個用いることができる。
移植対象である動物は特に制限されないが、例えば、哺乳類であってよく、ヒトであってもよく、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス及びラット等の非ヒト動物であってよい。
本実施形態に係る移植方法は、本実施形態に係る血管構造を有する細胞構造体を動物に移植することを含む。移植することの前に、移植する動物を準備すること及び/又は上述した方法により細胞構造体を作製することをさらに含んでもよい。移植方法は特に制限されず、移植対象等に合わせて適宜公知の外科的方法等により行うことができる。外科的方法としては、例えば、移植対象の皮膚を切開し、直接皮膚下に移植すること、注射器等により移植対象の皮膚下に注入することが挙げられる。移植する細胞構造体は1つでもよく、複数であってもよく、また、複数の細胞構造体を含む細胞組織であってもよい。細胞構造体又は細胞組織は、培地中から採取したものを用いてもよく、移植の形態等に合わせ、細胞構造体又は細胞組織を、例えば、適宜ゲル化・半ゲル化させたもの(例えば、フィブリンゲル)を用いてもよく、複数の細胞構造体が分散する分散液を用いてもよい。また、培地中から採取した複数の支持体に接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体に、フィブリンを添加したものを移植に用いてもよい。脂肪細胞を含む本実施形態に係る細胞構造体は、例えば、外傷、腫瘍摘出により生じた軟部組織欠損及び乳房切除等の後の組織再構築に適用することができる。
移植された細胞構造体の血管網は、移植対象の移植部位周辺の移植対象自身の血管と接続される。支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体を複数用いた場合には、複数の細胞構造体間でも血管網が接続される。支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体を複数移植することで移植対象において形成された脂肪組織は、複数の細胞構造体間で血管網が接続される上、移植対象自身の血管とも接続するため、より定着性に優れる。
本実施形態に係る非ヒトモデル動物を製造する方法は、本実施形態に係る細胞構造体を非ヒト動物に移植することを含む。移植することの前に、移植する非ヒト動物を準備すること及び/又は上述した方法により細胞構造体を作製することをさらに含んでもよい。移植方法については、上述したとおりであり、移植する細胞構造体は1つでもよく、複数であってもよく、また、複数の細胞構造体を含む細胞組織であってもよい。本実施形態に係る非ヒトモデル動物を製造する方法は、細胞構造体を非ヒト動物に移植した後、例えば、7日以上、30日以上又は90日以上生育することを含んでもよい。本実施形態に係る非ヒトモデル動物は、動物実験に用いて得られたデータをヒトへ当てはめるために利用することができる。非ヒトモデル動物を製造するためには、移植物(移植片)に対する拒絶を抑制した非ヒト動物、例えば、免疫力が低下又は免疫不全である非ヒト動物を用いることが好ましい。非ヒトモデル動物は、例えば、脂肪組織に関連する炎症性疾患等の病理学的なインビトロモデルとして用いたり、糖尿病、肥満等に対する医薬品のスクリーニング及びセルライト、肥満等に対する化粧品のアッセイスクリーニングに用いたりすることができる。
本実施形態に係る細胞構造体自体も、実験動物の代替品、移植材料等として適用することができ、具体例としては、上述したような、組織再構築、病理学的なインビトロモデル、医薬品のスクリーニング(薬剤の評価)、化粧品のアッセイスクリーニング等に適用することができる。
<試験例1:解繊されたコラーゲン成分の作製>
ブタ皮膚由来コラーゲンI型スポンジ断片(日本ハム株式会社製)100mgを200℃で24時間加熱を行うことにより、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分(架橋コラーゲン成分)を得た。なお、200℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。架橋コラーゲン成分50mgを15mLチューブに入れ、5mLの超純粋を加え、ホモジナイザー(アズワン社 VH-10)を用いて6分間ホモジナイズすることで架橋コラーゲン成分を解繊した。
ブタ皮膚由来コラーゲンI型スポンジ断片(日本ハム株式会社製)100mgを200℃で24時間加熱を行うことにより、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分(架橋コラーゲン成分)を得た。なお、200℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。架橋コラーゲン成分50mgを15mLチューブに入れ、5mLの超純粋を加え、ホモジナイザー(アズワン社 VH-10)を用いて6分間ホモジナイズすることで架橋コラーゲン成分を解繊した。
21℃の条件下、10000rpmで10分間遠心した。上清を吸引し、コラーゲンペレットを5mLの新しい超純水と混合し、コラーゲン溶液を作製した。コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上に維持したまま、ソニケーター(Sonics and Materials社 VC50)を用いて100Vで20秒間超音波処理し、ソニケーターを取り出した後コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上で10秒間冷却することを100回繰り返した。超音波処理を100回行った後、コラーゲン溶液を孔径40μmのフィルターでろ過し、解繊されたコラーゲン成分(sCMF)を含む分散液を得た。分散液を常法によって凍結乾燥させることにより、乾燥体として、解繊コラーゲン成分(sCMF)を得た。sCMFの平均長(長さ)は、14.8±8.2μm(N=20)であった。
<試験例2:細胞構造体の作製及び評価(1)>
細胞構造体の作製において用いた細胞、試薬及び作成方法等は以下のとおりである。
(細胞及びコラーゲン)
・初代ヒト成熟脂肪細胞及びヒト脂肪幹細胞(ADSC)を得るためのヒト脂肪組織(太もも由来)(京都府立医科大学附属病院から提供)
・ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)(ロンザ社製 #C-2517A)
・解繊コラーゲン成分(sCMF)(試験1にて作製したもの)
細胞構造体の作製において用いた細胞、試薬及び作成方法等は以下のとおりである。
(細胞及びコラーゲン)
・初代ヒト成熟脂肪細胞及びヒト脂肪幹細胞(ADSC)を得るためのヒト脂肪組織(太もも由来)(京都府立医科大学附属病院から提供)
・ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)(ロンザ社製 #C-2517A)
・解繊コラーゲン成分(sCMF)(試験1にて作製したもの)
(試薬)
・ウシ膵臓由来インスリン(シグマ社 #I1882)
・ウシ血漿由来トロンビン凍結乾燥粉末(シグマ社 #T4648)
・クロストリジウム ヒストリチクム由来コラゲナーゼI型(シグマ社 #C0130)
・ウシ血漿由来フィブリノゲンI-S型(シグマ社 #F8630)
・DMEM(高グルコース、ナカライテスク社)
・EGM-2MV BulletKit with growth factors(ロンザ社製 #C-2517A)
・ウシ膵臓由来インスリン(シグマ社 #I1882)
・ウシ血漿由来トロンビン凍結乾燥粉末(シグマ社 #T4648)
・クロストリジウム ヒストリチクム由来コラゲナーゼI型(シグマ社 #C0130)
・ウシ血漿由来フィブリノゲンI-S型(シグマ社 #F8630)
・DMEM(高グルコース、ナカライテスク社)
・EGM-2MV BulletKit with growth factors(ロンザ社製 #C-2517A)
(培地及び各種溶液)
・EGM-2培地:500mLのEBM-2にEGM-2 supplement growth factorsと混合し、4℃で保存したもの
・10mg/mL インスリンストック溶液:上記ウシ膵臓由来インスリン100mgを水で希釈した1%氷酢酸溶液(pH≦2)10mLに溶かし、エッペンドルフチューブに等量分注し-20℃で保存したもの
・2mg/mL コラゲナーゼ溶液:BSA 2.5gをDMEM(0%FBS、1%抗生物質)50mLと混合しておく。6ウェルプレートすべての脂肪組織を消化するために、コラゲナーゼI型26mgをDMEM(0%FBS、5%BSA、1%抗生物質)13mLに混合し、孔径0.2μmのフィルターでろ過したものを使用。
・50mg/mL フィブリノゲンストック溶液:フィブリノゲン 50mgをエッペンドルフチューブに秤とり、DMEM(0%FBS、1%抗生物質)1mLをすぐに加える。手動でチューブを振って混合した後、37℃のウォーターバスに3~5分間置き、孔径0.2μmのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
・202U/mL トロンビンストック溶液:トロンビン 202Uをエッペンドルフチューブに秤とり、DMEM(0%FBS、1%抗生物質)1mLをすぐに加え、37℃のウォーターバスに3~5分間置いて溶解させる。その後、孔径0.2μmのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
・EGM-2培地:500mLのEBM-2にEGM-2 supplement growth factorsと混合し、4℃で保存したもの
・10mg/mL インスリンストック溶液:上記ウシ膵臓由来インスリン100mgを水で希釈した1%氷酢酸溶液(pH≦2)10mLに溶かし、エッペンドルフチューブに等量分注し-20℃で保存したもの
・2mg/mL コラゲナーゼ溶液:BSA 2.5gをDMEM(0%FBS、1%抗生物質)50mLと混合しておく。6ウェルプレートすべての脂肪組織を消化するために、コラゲナーゼI型26mgをDMEM(0%FBS、5%BSA、1%抗生物質)13mLに混合し、孔径0.2μmのフィルターでろ過したものを使用。
・50mg/mL フィブリノゲンストック溶液:フィブリノゲン 50mgをエッペンドルフチューブに秤とり、DMEM(0%FBS、1%抗生物質)1mLをすぐに加える。手動でチューブを振って混合した後、37℃のウォーターバスに3~5分間置き、孔径0.2μmのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
・202U/mL トロンビンストック溶液:トロンビン 202Uをエッペンドルフチューブに秤とり、DMEM(0%FBS、1%抗生物質)1mLをすぐに加え、37℃のウォーターバスに3~5分間置いて溶解させる。その後、孔径0.2μmのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
(作製方法)
ヒト脂肪組織断片を5%の抗生物質を含むPBSで洗浄した。4~6gの組織を6ウェルプレートの6ウェル分に分けた。2mg/mL コラゲナーゼ溶液2mL中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻んだ。37℃及び230rpmで1時間インキュベートした後、10mLピペットで30分間混合した。溶解物を孔径500μmの鉄メッシュフィルターでろ過し、1ウェル当たり2mLのDMEMを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温(15~25℃)下にて200gで3分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び10mLシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層及び上層と下層の間の媒体の3層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。二回の洗浄をした後、25mLのDMEMで洗浄した。
ヒト脂肪組織断片を5%の抗生物質を含むPBSで洗浄した。4~6gの組織を6ウェルプレートの6ウェル分に分けた。2mg/mL コラゲナーゼ溶液2mL中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻んだ。37℃及び230rpmで1時間インキュベートした後、10mLピペットで30分間混合した。溶解物を孔径500μmの鉄メッシュフィルターでろ過し、1ウェル当たり2mLのDMEMを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温(15~25℃)下にて200gで3分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び10mLシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層及び上層と下層の間の媒体の3層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。二回の洗浄をした後、25mLのDMEMで洗浄した。
成熟脂肪細胞を含む上層のみを採取し、エッペンドルフチューブに分注した。ヘキスト染色により核を染色し(1000倍希釈したヘキスト、15分間染色)、蛍光顕微鏡を用いて、Turker Burk血球計数器上で細胞数をカウントした。
ADSCを含むペレットをDMEM 10mLに懸濁し、10cmディッシュ内に播種し、継代培養した。トリプシン/EDTAを使用してADSCをディッシュから分離し、DMEM 1mLに懸濁し、細胞数をカウントした。
ロンザ社より購入したHUVECを、DMEM 10mLに懸濁し、10cmディッシュ内に播種し、継代培養した。トリプシン/EDTAを使用してHUVECをディッシュから分離し、DMEM 1mLに懸濁し、細胞数をカウントした。
1mgのsCMFを秤取り、DMEM 100μLを添加し、sCMFの小さな粒子のみが観察されるようになるまで穏やかに混合した。室温下にて10000rpmで1分間遠心し、上清を吸引し、sCMFペレットを得た。250000cellsのADSC及び125000cellsのHUVEC(ADSC:HUVEC=2:1)をsCMFペレット上に穏やかに添加し、混合せず室温下にて3500rpmで1分間遠心し、上清を吸引した。0.3mgのフィブリノゲン(50mg/mL フィブリノゲンストック溶液6μL)を添加し、細胞及びsCMFと穏やかに混合した。さらに300000cellsの成熟脂肪細胞を添加して穏やかに混合した。必要に応じて少量のDMEMを添加し、総量を70μLに調整した。すぐに0.15Uのトロンビン(202U/mL トロンビンストック溶液0.71μL)を添加し、混合した後、6ウェルプレート上の6ウェルアダプタ上に置いたトランスウェルに混合物をゆっくり播種した。
37℃のインキュベータ内で1時間インキュベートしてゲル化させ、最終濃度10μg/mLのインスリンを含むEGM-2培地12mLを添加した。12mLの培地を2~3日毎に培養7日目まで交換した。
細胞構造体の蛍光イメージングを次の手順で行った。得られた細胞構造体を含むトランスウェルを24ウェルプレートに移動させた。PBS 2mLの洗浄の後、4%PFA 2mLを使用して4℃の条件下で一晩組織を固定した。PBS 2mLを用いて3回洗浄した。0.05% Triton/PBSを用いて、室温条件下で7分間、細胞を透過処理し(トランスウェル内に500μL、トランスウェル外に500μL)、PBS 2mLを用いて3回洗浄した。
1% BSA/PBS溶液を用いて、室温条件下で1時間組織をブロック処理した(トランスウェル内に500μL、トランスウェル外に500μL)。BSA溶液を吸引し、一次抗体溶液(1% BSA/PBS溶液で100倍に希釈したCD31及びペリリピン)100μLを添加した(トランスウェル内に50μL、トランスウェル外に50μL)。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、4℃の条件下で一晩インキュベートした。PBS 2mLを用いて3回洗浄した後、二次抗体溶液(1% BSA/PBS溶液で200倍に希釈したAlexaFluor647標識抗マウス抗CD31抗体及びAlexaFluor488標識抗ウサギ抗ペリリピン抗体、1000倍希釈したヘキスト)100μLを添加した(トランスウェル内に50μL、トランスウェル外に50μL)。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、室温条件下で2時間インキュベートした後、PBS 2mLを用いて4回洗浄した。
トランスウェルのメンブレンを切断し、少量のPBSを含むガラスボトムディッシュの底に直接ゲルを配置し、染色した細胞構造体を共焦点レーザー走査型顕微鏡(FV3000、オリンパス株式会社製)を用い、レーザー励起光を640nm(AlexaFluor647)及び488nm(AlexaFluor488)として観察した。
作製した細胞構造体における脂肪滴の直径は電子顕微鏡を用いて測定した。血管の直径及び血管の分岐間の長さはImage Jにより測定した。
図1は、血管網を有する細胞構造体の蛍光観察結果(20倍拡大)を示す。(a)は生体から採取した脂肪組織をそのまま固定した生体組織、(b)が細胞構造体である。細胞構造体において、生体組織のように、成熟脂肪細胞(大きな丸い単眼形状の脂肪滴)を囲むように血管網が形成されていることが確認された。これらの血管網は細胞構造体の内部の方まで形成されていた。脂肪滴の直径の平均値は85μm(N=50)であり、生体組織における成熟脂肪細胞の直径の平均値(72μm(N=50))と近かった。また、形成された血管は、生体組織と同様に中空であり、生体組織と同様に直径の太いもの(例えば、10μm以上25μm未満)と細いもの(例えば、0μm超10μm未満)の両方が観察された。図2に示されるように、血管の分岐の数も生体組織における数と近いことが分かった。また、血管の分岐間の長さの分布は0~100μm:42.5%,100~200μm:39.4%,200μm~:18.1%(N=180)であり、生体組織における血管網の血管の分岐間の長さの分布(0~100μm:61.8%,100~200μm:24.7%,200μm~:13.5%(N=180))に近いことが分かった。試験例2では、血管の分岐間の長さが50μm~100μmであることが割合として多く、この値は、成熟脂肪細胞の大きさと近いものである。例えば、J. Silha et al., “Angiogenicfactorsareelevatedin overweight and obese individuals”,InternationalJournal of Obesity(2005) 29, 1308-1314で説明されているように、生体内の脂肪組織中では、血管が個々の脂肪細胞を取り囲み、脂肪細胞間に血管が形成されていることが知られている。血管の分岐間の長さが上記のように分布していることから、試験例2の細胞構造体が、忠実に実際の生体内の脂肪組織を模倣できている可能性が示唆された。
<試験例3:細胞構造体の作製及び評価(2)>
成熟脂肪細胞を500000cells、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、成熟脂肪細胞を囲むように血管網が形成された細胞構造体が作製できた。図3は、試験例2と同様に染色した細胞構造体の蛍光観察結果(10倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞の細胞数及びsCMFの量を変更しても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
成熟脂肪細胞を500000cells、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、成熟脂肪細胞を囲むように血管網が形成された細胞構造体が作製できた。図3は、試験例2と同様に染色した細胞構造体の蛍光観察結果(10倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞の細胞数及びsCMFの量を変更しても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
<試験例4:細胞構造体の作製及び評価(3)>
成熟脂肪細胞を使用せず、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg、トロンビンを0.3U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、血管網を有する細胞構造体が作製できた。図4は、抗CD31抗体を用いて血管のみを染色した細胞構造体の蛍光観察結果(4倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞を使用しなくても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
成熟脂肪細胞を使用せず、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg、トロンビンを0.3U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、血管網を有する細胞構造体が作製できた。図4は、抗CD31抗体を用いて血管のみを染色した細胞構造体の蛍光観察結果(4倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞を使用しなくても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
<試験例5:細胞構造体の作製及び評価(4)>
成熟脂肪細胞を使用せず、HUVECを50000cells(ADSC:HUVEC=5:1)、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg、トロンビンを0.3U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、血管網を有する細胞構造体が作製できた。図5は、抗CD31抗体を用いて血管のみを染色した細胞構造体の蛍光観察結果(4倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞を使用せず、ADSCとHUVECの割合を変更しても、血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
成熟脂肪細胞を使用せず、HUVECを50000cells(ADSC:HUVEC=5:1)、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg、トロンビンを0.3U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、血管網を有する細胞構造体が作製できた。図5は、抗CD31抗体を用いて血管のみを染色した細胞構造体の蛍光観察結果(4倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞を使用せず、ADSCとHUVECの割合を変更しても、血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
<試験例6:細胞構造体の作製及び評価(5)>
成熟脂肪細胞、ADSC及びHUVECに代えて、ヒトの太もも(生体組織)から脂肪吸引により得られた脂肪組織を使用し、播種前の総量を60μLに調整した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。脂肪組織は、採取した3gの生体組織をはさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻み、10mLシリンジを用いてゆっくり数回ピペッティングすることで液体状にした。液体状になった脂肪組織から60μLを取って、sCMFと混合した。なお、脂肪吸引により得られた脂肪組織には、成熟脂肪細胞、脂肪幹細胞及び血管内皮細胞が含まれている。図6は、試験例2と同様の方法により染色した細胞構造体の蛍光観察結果(10倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞、ADSC及びHUVECに代えて、生体組織から得られた脂肪組織を使用しても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。sCMFを2mg使用した場合にも同様に血管網を有する細胞構造体が作製できることを確認した。
成熟脂肪細胞、ADSC及びHUVECに代えて、ヒトの太もも(生体組織)から脂肪吸引により得られた脂肪組織を使用し、播種前の総量を60μLに調整した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。脂肪組織は、採取した3gの生体組織をはさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻み、10mLシリンジを用いてゆっくり数回ピペッティングすることで液体状にした。液体状になった脂肪組織から60μLを取って、sCMFと混合した。なお、脂肪吸引により得られた脂肪組織には、成熟脂肪細胞、脂肪幹細胞及び血管内皮細胞が含まれている。図6は、試験例2と同様の方法により染色した細胞構造体の蛍光観察結果(10倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞、ADSC及びHUVECに代えて、生体組織から得られた脂肪組織を使用しても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。sCMFを2mg使用した場合にも同様に血管網を有する細胞構造体が作製できることを確認した。
試験例2~6において、いずれも血管網を有する細胞構造体が作製できることが確認できたが、試験例2~6を比較すると、sCMFを1mg使用した場合の方がsCMFを2mg使用した場合よりもより生体組織に近い血管網を有する細胞構造体が作製できる傾向にあった。また、ADSCとHUVECの割合は、ADSC:HUVEC=2:1の場合の方が、ADSC:HUVEC=5:1の場合よりもより生体組織に近い血管網を有する細胞構造体が作製できる傾向にあった。
<比較例>
sCMFを使用せず、フィブリノゲンを1mg、トロンビンを0.5U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。作製した細胞構造体において血管の形成は観察されなかった。また、ADSCを含まない以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。作製した細胞構造体においては、ごくわずかな血管の形成しか観察されず、成熟脂肪細胞を囲む血管網の形成は確認できなかった。
sCMFを使用せず、フィブリノゲンを1mg、トロンビンを0.5U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。作製した細胞構造体において血管の形成は観察されなかった。また、ADSCを含まない以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。作製した細胞構造体においては、ごくわずかな血管の形成しか観察されず、成熟脂肪細胞を囲む血管網の形成は確認できなかった。
<試験例7:細胞構造体の作製及び評価(6)>
試験例2と同様に、細胞構造体の作製において用いる細胞、試薬、培地及び各種溶液を準備した。解繊コラーゲン成分(sCMF)も試験例1と同様の方法により作製したものを用いた。本試験例の概要を図7に示す。図7において、左の液滴中の円は成熟脂肪細胞を、白い菱形はADSCを、グレーの短棒はHUVECをそれぞれ示す。
試験例2と同様に、細胞構造体の作製において用いる細胞、試薬、培地及び各種溶液を準備した。解繊コラーゲン成分(sCMF)も試験例1と同様の方法により作製したものを用いた。本試験例の概要を図7に示す。図7において、左の液滴中の円は成熟脂肪細胞を、白い菱形はADSCを、グレーの短棒はHUVECをそれぞれ示す。
(作製方法)
ヒト脂肪組織断片を5%の抗生物質を含むPBSで洗浄した。4~6gの組織を6ウェルプレートの6ウェル分に分けた。2mg/mL コラゲナーゼ溶液2mL中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻んだ。37℃及び230rpmで1時間インキュベートした後、10mLピペットで30分間混合した。溶解物を孔径500μmの鉄メッシュフィルターでろ過し、1ウェル当たり2mLのDMEMを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温(15~25℃)下にて200gで3分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び10mLシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層及び上層と下層の間の媒体の3層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回の洗浄をした後、25mLのDMEMで洗浄した。
ヒト脂肪組織断片を5%の抗生物質を含むPBSで洗浄した。4~6gの組織を6ウェルプレートの6ウェル分に分けた。2mg/mL コラゲナーゼ溶液2mL中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻んだ。37℃及び230rpmで1時間インキュベートした後、10mLピペットで30分間混合した。溶解物を孔径500μmの鉄メッシュフィルターでろ過し、1ウェル当たり2mLのDMEMを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温(15~25℃)下にて200gで3分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び10mLシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層及び上層と下層の間の媒体の3層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回の洗浄をした後、25mLのDMEMで洗浄した。
成熟脂肪細胞を含む上層のみを採取し、エッペンドルフチューブに分注した。ヘキスト染色により核を染色し(1000倍希釈したヘキスト、10分間染色)、蛍光顕微鏡を用いて、Turker Burk血球計数器上で細胞数をカウントした。
ADSCを含むペレットをDMEM 10mLに懸濁し、10cmディッシュ内に播種し、継代培養した。トリプシン/EDTAを使用してADSCをディッシュから分離し、DMEM 1mLに懸濁し、細胞数をカウントした。
ロンザ社より購入したHUVECを、DMEM 10mLに懸濁し、10cmディッシュ内に播種し、継代培養した。トリプシン/EDTAを使用してHUVECをディッシュから分離し、DMEM 1mLに懸濁し、細胞数をカウントした。
最終的に直径約1mmの略球体状の細胞構造体(以下、「細胞ボール」ともいう)を1個得るために、16250cellsの成熟脂肪細胞、13750cellsのADSC、6875cellsのHUVEC、0.06mgのsCMF、0.04mgのフィブリノゲン、0.02Uのトロンビンを使用した。
sCMFを2.4mg秤取り、DMEM 1mLを添加し、sCMFの小さな粒子のみが観察されるようになるまで穏やかに混合した。室温下にて10000rpmで1分間遠心し、上清を吸引し、sCMFペレットを得た。220000cellsのADSC及び275000cellsのHUVECをsCMFペレット上に穏やかに添加し、室温下にて3500rpmで1分間遠心し、上清を吸引した。フィブリノゲン(50mg/mL フィブリノゲンストック溶液32μL)を添加し、細胞及びsCMFと穏やかに混合した。さらに650000cellsの成熟脂肪細胞を添加して穏やかに混合した。少量のDMEMを添加し、総量を200μLに調整した。すぐにトロンビン(202U/mL トロンビンストック溶液3.9μL)を添加し、少し混合した後、低接着96ウェルプレート(IWAKI #4860-800LP)上に混合物(細胞ボール40個分)を各ウェル5μL(細胞ボール1個分)ずつ播種した。
37℃のインキュベータ内で15分間インキュベートしてゲル化させ、最終濃度10μg/mLのインスリンを含むEGM-2培地300μLを添加した。
24時間培養した後、低接着24ウェルプレート(IWAKI #4820-800LP)に移し、2mLの上記EGM-2培地を添加することでプレートから引き離した。培地を2~3日毎に培養7日目まで交換した。
細胞構造体の蛍光イメージングを次の手順で行った。得られた細胞構造体を含むトランスウェルを24ウェルプレート(IWAKI #4820-800LP)に移動させた。PBS 200μLの洗浄の後、4%PFA 200μLを使用して4℃の条件下で一晩組織を固定した。PBS 200μLを用いて3回洗浄した。免疫染色のため、0.05% Triton/PBS 200μLを用いて、室温条件下で7分間、細胞を透過処理し、PBS 200μLを用いて3回洗浄した。
1% BSA/PBS溶液 200μLを用いて、室温条件下で1時間組織をブロック処理した。BSA溶液を吸引し、一次抗体溶液(1% BSA/PBS溶液で100倍に希釈したCD31及びペリリピン)100μLを添加した。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、4℃の条件下で一晩インキュベートした。PBS 200μLを用いて3回洗浄した後、二次抗体溶液(1% BSA/PBS溶液で200倍に希釈したAlexaFluor647標識抗マウス抗CD31抗体及びAlexaFluor488標識抗ウサギ抗ペリリピン抗体、1000倍希釈したヘキスト)を添加した。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、室温条件下で2時間インキュベートした後、PBS 200μLを用いて4回洗浄した。
共焦点定量イメージサイトメーターCQ1(横河電機製)のコンプリートプレート上に直接細胞ボールを配置し、染色した細胞構造体を上記共焦点定量イメージサイトメーターCQ1を用い、レーザー励起光を640nm(AlexaFluor647)及び488nm(AlexaFluor488)として観察した。
図8は、ナイルレッド染色及びCD31染色による、血管網を有する細胞ボールの蛍光観察結果を示す。CD31染色は試験例2と同様に行い、ナイルレッド染色は常法により行った。右の写真は、左の細胞ボールの一つをさらに拡大したものである。細胞ボールにおいて、生体組織のように、成熟脂肪細胞(大きな丸い単眼形状の脂肪滴)を囲むように血管網が形成されていることが確認された。これらの血管網は細胞ボールの内部の方まで形成されていた。
図9は、CD31の免疫組織染色による、血管網を有する細胞ボールの切片の観察結果を示す。この結果からも、細胞ボールにおいて、多くの管腔が観察され、血管網が細胞構造体の内部の方まで形成されていることが確認された。
図10は、本試験例の方法で作製した細胞ボールについて、7日間培養した後の平均直径(n=12 細胞ボール/量)を示す。5μLの細胞ボールの平均直径は1256μmであり、10μLの細胞ボールの平均直径は1857μmであった。
<試験例8:複数の細胞ボールを含む細胞組織の作製及び評価>
試験例7で作製した培養7日後の5μLの細胞ボール複数を隣接して接触させた状態で培養液10mL中で7日間浮遊培養した。試験例7と同様に染色して観察した。その結果、図11に示されるように、複数の細胞ボール(図11では5個)が凝集し、合体した細胞組織が得られた。5個の細胞ボールが合体した細胞組織は、各細胞ボール内で血管網が接続されているだけでなく、複数の細胞ボール間でも血管網が接続されていることが確認された(図11左及び右上)。
試験例7で作製した培養7日後の5μLの細胞ボール複数を隣接して接触させた状態で培養液10mL中で7日間浮遊培養した。試験例7と同様に染色して観察した。その結果、図11に示されるように、複数の細胞ボール(図11では5個)が凝集し、合体した細胞組織が得られた。5個の細胞ボールが合体した細胞組織は、各細胞ボール内で血管網が接続されているだけでなく、複数の細胞ボール間でも血管網が接続されていることが確認された(図11左及び右上)。
<試験例9:細胞ボールの移植試験及び評価>
免疫不全マウスを6個体準備し、背中の皮膚を切開し、切開箇所に以下の(1)~(3)をそれぞれ流し込み、縫合した後、3個体は30日間、3個体は90日間生育した。
(1)試験例7で作成した培養後の細胞ボール111個を2.5mgフィブリノゲン及び1.25Uのトロンビンを含む溶液100μLに懸濁した混合物
(2)HUVECを使用しない以外は(1)と同様に作製した細胞ボール111個を2.5mgフィブリノゲンおよび1.25Uのトロンビンを含む溶液100μLに懸濁した混合物
(3)試験例6にて、ヒトの太もも(生体組織)から脂肪吸引により得られた脂肪組織を使用し作製した細胞構造体(100μL)
免疫不全マウスを6個体準備し、背中の皮膚を切開し、切開箇所に以下の(1)~(3)をそれぞれ流し込み、縫合した後、3個体は30日間、3個体は90日間生育した。
(1)試験例7で作成した培養後の細胞ボール111個を2.5mgフィブリノゲン及び1.25Uのトロンビンを含む溶液100μLに懸濁した混合物
(2)HUVECを使用しない以外は(1)と同様に作製した細胞ボール111個を2.5mgフィブリノゲンおよび1.25Uのトロンビンを含む溶液100μLに懸濁した混合物
(3)試験例6にて、ヒトの太もも(生体組織)から脂肪吸引により得られた脂肪組織を使用し作製した細胞構造体(100μL)
30日間生育後の各個体の移植箇所から組織を採取した。上記(2)を移植した箇所には脂肪組織が形成されていたが、血管網の形成は認められなかった。上記(3)を移植した箇所には、脂肪組織が形成されており、組織表面にわずかに血管網も認められたものの、大きな油滴の存在も認められた。油滴の形成は脂肪細胞の死亡を意味する。一方で、試験例7で作製した細胞ボールを用いた上記(1)を移植した箇所には、組織表面に血管網が張り巡らされた脂肪組織の形成が認められた。また、上記(1)を移植した箇所の組織には、油滴の形成は認められず、移植後の定着性がより優れていることが示された。
30日間生育後の個体の上記(1)の移植箇所から組織を採取し、試験例2と同様にペリリピン染色及びDAPI染色した(図12)。DAPI染色は、常法により行った。なお、A:SFTは上記(3)の移植箇所から採取した組織を示し、C:3DVFTは上記(1)の移植箇所から採取した組織をそれぞれ示す。図12の上段は明視野で観察した結果、中央段はペリリピン染色による結果、下段はDAPI染色の結果を示す。移植箇所に形成された組織において、成熟脂肪細胞が形成されていることが確認された。
また、90日間生育後の個体の上記(1)の移植箇所から組織を採取し、試験例2と同様にペリリピン染色及びCD31染色した(図13)。図13の上段は明視野で観察した結果、中央段はCD31染色による結果、下段はDAPI染色の結果を示す。移植箇所に形成された組織において、成熟脂肪細胞が形成されているだけでなく、血管網も形成されていることが確認された。
以上により、本実施形態に係る細胞構造体は、移植後の定着性に優れ、移植用に適していることが示された。
Claims (1)
- 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有する細胞構造体であって、
前記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。
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