CN110050059A - 三维组织体及其制造方法、以及三维组织体的形成剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维组织体，其含有细胞和包含内源性胶原的胶原，所述细胞中的至少一部分与所述胶原粘附，其中，以所述三维组织体为基准，所述胶原的含有率为10重量％～90重量％。

Description

三维组织体及其制造方法、以及三维组织体的形成剂
技术领域
本发明涉及三维组织体及其制造方法、以及三维组织体的形成剂。
背景技术
近年来，开发了在活体外构建细胞的三维组织体的技术。例如，提出了通过培养培养细胞的表面整体被粘附膜覆盖的被覆细胞来制造三维组织体的方法(专利文献1)、通过在以聚乳酸等为材料的支架中接种细胞来制造三维组织体的方法(非专利文献1)等。另外，本发明者们在此之前提出了：包含将用含有胶原的被膜涂布的细胞三维地配置以形成三维组织体的制造三维组织体的方法(专利文献2)，包含形成在细胞的表面形成有覆膜的被覆细胞、及将被覆细胞三维地配置的三维组织体的制造方法(专利文献3)等，其中，被覆细胞的形成包含：使细胞浸渍于含有覆膜成分的液体中、以及使浸渍后的细胞和含有覆膜成分的液体通过透液性膜分离。
这样的三维组织体期待作为实验动物的替代品、移植材料等的用途。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-115254号公报
专利文献2：国际公开第2015/072164号
专利文献3：国际公开第2016/027853号
非专利文献
非专利文献1：Nature Biotechnology，2005，Vol.23，NO.7，p.879-884
发明内容
发明所要解决的课题
然而，由于生物体组织中的纤维性胶原等胶原的浓度为20～30重量％左右，因此在期望将三维组织体作为实验动物的替代品、移植材料等应用时，优选准备以接近生物体组织的浓度含有胶原的三维组织体。
但是，至今开发的三维组织体由于其制造方法的制约等，只限于细胞密度非常高的三维组织体，迄今为止尚未可知胶原的浓度接近生物体组织的三维组织体。
本发明正是鉴于上述情况而完成的，本发明的目的在于提供胶原的浓度接近生物体组织的三维组织体及其制造方法、以及能够在该三维组织体的制造中使用的形成剂。
用于解决课题的手段
本发明者们反复进行了深入研究，结果发现通过以下所示的发明能够解决上述课题。
[1]一种三维组织体，其含有细胞和包含内源性胶原的胶原，所述细胞中的至少一部分与所述胶原粘附，其中，
以所述三维组织体为基准，所述胶原的含有率为10重量％～90重量％。
[2]根据权利要求1所述的三维组织体，其中，所述细胞为包含胶原产生细胞的细胞。
[3]根据上述[1]或[2]所述的三维组织体，其中，以胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟进行胰蛋白酶处理后的所述三维组织体的残留率为70％以上。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的三维组织体，其厚度为10μm以上。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的三维组织体，其中，所述细胞还包含选自血管内皮细胞、癌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞及上皮细胞中的一种或多种细胞。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的三维组织体，其中，作为所述胶原，还包含外源性胶原来源的片段化胶原。
[7]一种三维组织体的制造方法，其包含：
(1)在水性介质中，使外源性胶原来源的片段化胶原与细胞接触的工序，以及
(2)对所述片段化胶原接触后的所述细胞进行培养的工序。
[8]根据上述[7]所述的制造方法，其中，所述细胞是包含胶原产生细胞的细胞。
[9]根据上述[7]或[8]所述的制造方法，其中，在工序(1)和工序(2)之间还包含使水性介质中的所述片段化胶原与所述细胞一起沉降的工序。
[10]根据上述[7]或[8]所述的制造方法，其中，工序(1)的工序通过在水性介质中形成细胞的层后使所述片段化胶原接触来进行。
[11]根据上述[7]～[10]中任一项所述的制造方法，其中，所述片段化胶原的平均长度为100nm～200μm。
[12]根据上述[7]～[11]中任一项所述的制造方法，其中，所述片段化胶原的平均直径为50nm～30μm。
[13]根据上述[7]～[12]中任一项所述的制造方法，其中，所述细胞还包含选自血管内皮细胞、癌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞及上皮细胞中的一种或多种细胞。
[14]根据上述[7]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，所述片段化胶原与所述细胞的质量比为900：1～9：1。
[15]一种三维组织体的形成剂，其包含片段化胶原，其中，
所述片段化胶原的平均长度为100nm～200μm，所述片段化胶原的平均直径为50nm～30μm。
发明效果
根据本发明，能够提供胶原的浓度接近生物体组织的三维组织体及其制造方法、以及能够在该三维组织体的制造中使用的形成剂。
附图说明
图1是表示通过进行2分钟均质化而得到的片段化胶原的照片(A)、以及表示通过进行5分钟均质化而得到的片段化胶原的长度的分布的直方图(B)。
图2为培养1周后的包含片段化胶原及正常人皮肤来源的成纤维细胞(NHDF)的三维组织体的相位差显微镜照片(A)、经苏木精-伊红(HE)染色的照片(B)、及经甲苯胺蓝(TB)染色的照片(C)。
图3是包含片段化胶原及NHDF的三维组织体经抗人胶原抗体免疫染色的照片。
图4是表示胰蛋白酶处理前(A)及胰蛋白酶处理后(B)的包含片段化胶原及NHDF的三维组织体的状态的照片。
图5是表示包含片段化胶原、NHDF和人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC)的三维组织体的制造工序的示意图(A)、和三维组织体经抗CD31抗体免疫染色的照片(B)。
图6是在96孔内(A)或24孔内(B)制造的包含片段化胶原及NHDF的非收缩性的三维组织体的经HE染色的照片及经TB染色的照片。
图7是观察包含含有片段化胶原的胶原凝胶及NHDF的三维组织体(A)、和包含胶原凝胶及NHDF的三维组织体(B)在培养中的收缩情况的照片。
图8是包含片段化胶原、NHDF和人结肠癌细胞(HT29)的三维组织体经HE染色的照片。
图9是包含片段化胶原、人心脏成纤维细胞(NHCF)及iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM)的三维组织体经HE染色的照片。
图10是包含通过同时添加细胞和片段化胶原的方法得到的片段化胶原和人主动脉平滑肌细胞(Arota-SMC)的三维组织体经HE染色的照片。箭头表示Arota-SMC所存在的部位的一个例子。
图11是通过底层法(Bottom Layer Method)制造的包含片段化胶原和人主动脉平滑肌细胞(Arota-SMC)的三维组织体经HE染色的照片。箭头表示Arota-SMC所存在的部位的一个例子。
图12是包含片段化胶原、人主动脉平滑肌细胞(Arota-SMC)和人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC)的双层结构的三维组织体经抗CD31抗体免疫染色的照片。放大图中的底部的黑色层为HUVEC层。
图13是包含片段化胶原和人牙龈成纤维细胞(HGF)的三维组织体经HE染色的照片。左栏表示使用了通过2分钟均质化得到的片段化胶原的结果，右栏表示使用了通过6分钟均质化得到的片段化胶原的结果。
图14是包含片段化胶原、人牙龈成纤维细胞(HGF)及永生化人牙龈上皮细胞(Epi4)的三维组织体经HE染色的照片。上一行表示使用了通过2分钟均质化得到的片段化胶原的结果，下一行表示使用了通过6分钟均质化得到的片段化胶原的结果。
图15是包含片段化胶原、人心脏成纤维细胞(NHCF)及iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM)的三维组织体经马松三色染色的照片。黑色部分实际上是染成蓝色的部位，表示胶原的存在。
具体实施方式
(三维组织体)
本实施方式的三维组织体是如下的三维组织体：其包含细胞和胶原，所述细胞包含胶原产生细胞，所述胶原包含内源性胶原，所述细胞中的至少一部分与所述胶原粘附。以往的三维组织体的胶原的浓度低且细胞密度高。因此，存在培养中或培养后由于细胞的牵引力而三维组织体收缩、或者培养中或培养后在细胞所产生的酶作用下三维组织体容易分解等问题。本实施方式的三维组织体的胶原浓度比以往的高，不易引起收缩，因而是稳定的。
“三维组织体”是指细胞介由纤维性胶原等胶原三维地配置的细胞的集合体，是通过细胞培养而人工制作的集合体。三维组织体的形状没有特别限制，可以举出例如片状、球体状、椭圆体状、长方体状等。这里，生物体组织包括血管、汗腺、淋巴管、脂腺等，构成比三维组织体复杂。因此，可容易地区别三维组织体和生物体组织。
本实施方式的细胞可以是培养细胞。例如，可以举出原代培养细胞、传代培养细胞或细胞系。
“胶原产生细胞”是指分泌纤维性胶原等胶原的细胞。作为胶原产生细胞，可以举出成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间质系细胞，优选为成纤维细胞。作为优选的成纤维细胞，可以举出例如人皮肤来源的成纤维细胞(NHDF)、人心脏成纤维细胞(NHCF)和人牙龈成纤维细胞(HGF)。
作为胶原，可以举出例如纤维性胶原或非纤维性胶原。纤维性胶原是指作为胶原纤维的主成分的胶原，具体而言，可以举出I型胶原、II型胶原、III型胶原等。作为非纤维性胶原，可以举出例如IV型胶原。
“内源性胶原”是指构成三维组织体的胶原产生细胞所产生的胶原。内源性胶原可以是纤维性胶原，也可以是非纤维性胶原。
三维组织体中的胶原的含有率以上述三维组织体(干燥重量)为基准为0.01～90重量％，优选为10～90重量％，优选为10～80重量％，优选为10～70重量％，优选为10～60重量％，优选为1～50重量％，优选为10～50重量％，更优选为10～30重量％，进一步优选为20～30重量％。这里，“三维组织体中的胶原”是指构成三维组织体的胶原，可以是内源性胶原，也可以是后述的外源性胶原。另外，“三维组织体中的胶原”中也包括后述的片段化胶原。即，三维组织体包含外源性胶原来源的片段化胶原时，构成上述三维组织体的胶原的浓度是指将内源性胶原和上述片段化胶原合并后的浓度。上述胶原的浓度可以根据得到的三维组织体的体积和脱细胞化后的三维组织体的质量算出。
作为对三维组织体中的胶原的量进行定量的方法，可以举出例如如下的定量羟基脯氨酸的方法。在溶解有三维组织体的溶解液中混合盐酸(HCl)，在高温下孵育规定的时间后回复至室温，将离心分离后的上清液稀释至规定的浓度，由此制备样品。将羟基脯氨酸标准溶液与样品同样地进行处理后，阶段性地稀释而制备标准品。分别用羟基脯氨酸分析缓冲液和检测试剂对样品和标准品进行规定的处理，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准品进行比较来算出胶原量。其中，也可以将通过使三维组织体直接悬浮于高浓度的盐酸而溶解得到的溶解液离心分离，回收上清，用于胶原定量。另外，溶解的三维组织体可以直接是从培养液回收的状态，也可以在回收后进行干燥处理、在除去了液体成分的状态下使其溶解。但是，将直接从培养液回收的状态的三维组织体溶解、进行胶原定量时，由于预想到因三维组织体所吸收的培养基成分、因实验手法问题所致的培养基的残留的影响而使三维组织体重量的测量值产生偏差，因此从稳定地测量组织体的重量以及每单位重量中所含的胶原量的观点出发，优选以干燥后的重量为基准。
更具体而言，可以举出例如如下的方法。
(样品的制备)
将进行了冷冻干燥处理的三维组织体的总量与6M HCl混合，用加热块在95℃孵育20小时以上后，回复到室温。以13000g离心分离10分钟后，回收样品溶液的上清液。在后述的测定中，按照结果收束于标准曲线的范围内的方式用6M HCl适当稀释后，将200μL用100μL的Milli-Q稀释，由此制备样品。样品使用35μL。
(标准品的制备)
在螺口试管中加入125μL的标准溶液(1200μg/mL的乙酸溶液)和125μL的12M HCl进行混合，用加热块在95℃下孵育20小时后，回复到室温。以13000g离心分离10分钟后，用Milli-Q稀释上清液，制作300μg/mL的S1，将S1阶段性地稀释而制作S2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)。也准备仅含4M HCl 90μL的S8(0μg/mL)。
(分析)
将35μL的标准品和样品分别加入到平板(QuickZyme Total Collagen Assay试剂盒附带、QuickZyme Biosciences公司)中。将75μL的分析缓冲液(上述试剂盒附带)加入到各个孔中。用密封盖盖住板，边摇晃边在室温下孵育20分钟。揭开密封盖，将75μL检测试剂(reagent A：B＝30μL：45μL、上述试剂盒附带)加入到各个孔中。用密封盖盖住板，通过摇晃混合溶液，在60℃下孵育60分钟。用冰冷却至室温，揭开密封盖，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准品进行比较来算出胶原量。
另外，也可以根据其面积比或体积比规定三维组织体中所含的胶原。“根据面积比或体积比规定”是指例如在使三维组织体中的胶原通过已知的染色方法(例如使用了抗胶原抗体的免疫染色或马松三色染色等)等成为与其他组织构成物区别的状态的基础上，使用肉眼观察、各种显微镜和图像分析软件等算出胶原在三维组织体整体中所占的存在区域的比率。利用面积比规定时，对于通过三维组织体中的怎样的截面或表面来规定面积比没有限定，例如在三维组织体为球状体等的情况下，利用从其大致中心部通过的截面图来规定，能够适当地反映组织整体的情况，是优选的。
例如，利用面积比规定三维组织体中的胶原时，其面积的比例以上述三维组织体的整体的面积为基准为0.01～99％，优选为1～99％，优选为5～90％，优选为7～90％，优选为20～90％，更优选为50～90％。“三维组织体中的胶原”如上所述。三维组织体包含外源性胶原来源的片段化胶原时，构成上述三维组织体的胶原的面积比例是指将内源性胶原和上述片段化胶原合并后的面积比例。上述胶原的面积比例例如可以以下述比例算出：将得到的三维组织体用马松三色染色，算出蓝色染色的胶原的面积与从三维组织体的大致中心部通过的截面的整体的面积的比例。
上述三维组织体优选以胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟进行胰蛋白酶处理后的残留率为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的三维组织体在培养中或培养后不易发生酶作用下的分解，是稳定的。上述残留率例如可以根据胰蛋白酶处理前后的三维组织体的质量来算出。
上述三维组织体优选以胶原酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟进行胶原酶处理后的残留率为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的三维组织体不易引起培养中或培养后的酶作用下的分解，是稳定的。
上述三维组织体的厚度优选为10μm以上，更优选为100μm以上，进一步优选为1000μm以上。这样的三维组织体具有更接近生物体组织的结构，适合作为实验动物的替代品和移植材料。厚度的上限没有特别限制，例如可以为10mm以下，也可以为3mm以下，也可以为2mm以下，也可以为1.5mm以下，也可以为1mm以下。
这里，“三维组织体的厚度”在三维组织体为片状或长方体状的情况下，是指与主面垂直的方向上的两端的距离。在上述主面存在凹凸的情况下，厚度是指上述主面的最薄部分的距离。
另外，在三维组织体为球体状的情况下，是指其直径。此外，在三维组织体为椭圆体状的情况下，是指其短径。在三维组织体为大致球体状或大致椭圆体状且表面存在凹凸的情况下，厚度是指从三维组织体的重心通过的直线与上述表面交叉的两点间的距离，即最短距离。
构成上述三维组织体的细胞还可以包含除胶原产生细胞以外的一种或多种其他细胞。作为上述其他细胞，可以举出血管内皮细胞(例如人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC))、结肠癌细胞(例如人结肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞(例如人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM))、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、角化细胞、淋巴管内皮细胞、神经细胞、肝细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人工多能性干细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Arota-SMC))等。优选构成上述三维组织体的细胞还包含选自由血管内皮细胞、癌细胞和心肌细胞组成的组中的一种或多种细胞。
上述三维组织体还可以包含外源性胶原来源的片段化胶原。关于“外源性胶原”和“片段化胶原”，在后面叙述。
上述三维组织体可以作为实验动物的替代品、移植材料等应用。
(三维组织体的制造方法)
本实施方式的三维组织体的制造方法包含：
(1)在水性介质中，使外源性胶原来源的片段化胶原与细胞接触的工序，以及
(2)对所述片段化胶原接触后的所述细胞进行培养的工序。
本实施方式的细胞可以是培养细胞。例如可以举出原代培养细胞、传代培养细胞或细胞系。另外，本实施方式的细胞可以是包含胶原产生细胞的细胞，也可以是包含除胶原产生细胞以外的细胞的细胞，还可以是包含胶原产生细胞和除胶原产生细胞以外的细胞这两者的细胞。
“胶原产生细胞”是指分泌纤维性胶原等胶原的细胞。作为胶原产生细胞，可以举出成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间质系细胞，优选为成纤维细胞。作为优选的成纤维细胞，可以举出例如人皮肤来源的成纤维细胞(NHDF)、人心脏成纤维细胞(NHCF)和人牙龈成纤维细胞(HGF)。
作为除胶原产生细胞以外的细胞，可以举出血管内皮细胞(例如人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC))、结肠癌细胞(例如人结肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞(例如人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM))、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、角化细胞、淋巴管内皮细胞、神经细胞、肝细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人工多能性干细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Arota-SMC))等。优选构成上述三维组织体的细胞还包含选自由血管内皮细胞、癌细胞和心肌细胞组成的组中的一种或多种细胞。
通过本实施方式的制造方法，能够得到稳定且细胞均匀地分布的三维组织体。
本实施方式的细胞优选为包含胶原产生细胞的细胞。通过使用包含胶原产生细胞的细胞，可以得到更稳定且更细胞均匀地分布的三维组织体。其理由推测如下。
在利用了以往的支架的三维组织体的制造方法中，由于向预先准备的支架注入目标细胞，因此难以使细胞均匀地分布到支架内部。通过本实施方式的制造方法，所得到的三维组织体稳定、细胞均匀地分布。得到这样的三维组织体的机理的详细情况并不清楚，但推测如下。首先，细胞与片段化胶原接触而粘附。之后，细胞自身产生构成细胞外基质(ECM)的蛋白(例如纤维性胶原等胶原)。所产生的蛋白与片段化胶原接触而粘附，由此作为片段化胶原间的交联剂起作用，在细胞均匀存在的环境下纤维化胶原等的结构化推进。其结果，可得到更稳定且细胞更均匀地分布的三维组织体。但是，上述推测并不是用于限定本发明。
另外，在专利文献1～3所记载的制造方法中，用于制造三维组织体的工序数多，需要1小时左右的作业时间。通过本实施方式的制造方法，能够以短的作业时间制造三维组织体。此外，通过本实施方式的制造方法，能够简便地制造三维组织体。
在专利文献2所记载的制造方法中，为了制造厚度为1mm左右的三维组织体，细胞至少需要106个细胞。根据本实施方式的制造方法，能够以较少的细胞数制造厚度为1mm以上、尺寸大的三维组织体。
“水性介质”是指以水为必须构成成分的液体。作为水性介质，只要片段化胶原和细胞能够稳定存在即可，没有特别限制。可以举出例如磷酸缓冲生理盐水(PBS)等生理盐水、Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)、血管内皮细胞专用培养基(EGM2)等液体培养基。液体培养基可以是将两种培养基混合而成的混合培养基。从减轻对细胞的负荷的观点出发，水性介质优选为液体培养基。
“外源性胶原”是指从外部供给的胶原，具体而言，可以举出纤维性胶原、非纤维性胶原等。关于外源性胶原，作为来源的动物种类可以与内源性胶原相同，也可以不同。对于作为来源的动物种类，可以举出例如人、猪、牛等。另外，外源性胶原也可以是人工的胶原。外源性胶原优选为纤维性胶原。作为上述纤维性胶原，可以举出例如I型胶原、II型胶原、III型胶原，优选为I型胶原。上述纤维性胶原也可以使用市售的胶原，作为其具体例，可以举出日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原冷冻干燥物。作为外源性非纤维性胶原，可以举出例如IV型胶原。
在外源性胶原中，所来源的动物种类可以与细胞不同。另外，细胞包含胶原产生细胞时，外源性胶原中，所来源的动物种类可以与胶原产生细胞不同。即，外源性胶原可以是异种胶原。
“片段化胶原”是指将纤维性胶原等胶原片段化而得到的胶原，是维持了三股螺旋结构的胶原。片段化胶原的作为来源的胶原可以是一种，也可以并用多种胶原。以往，纤维性胶原等胶原溶解于酸性的水溶液等中，但浓度为0.1～0.3重量％左右、无法大量溶解。因此，在以往的方法中，难以增加三维组织体中的纤维性胶原等胶原的量。推测本实施方式的片段化胶原几乎不溶解于水，但通过分散在水性介质中而变得容易在水性介质中与细胞接触，从而促进三维组织体的形成。片段化胶原的平均长度优选为100nm～200μm，更优选为22μm～200μm，进一步优选为100μm～200μm。片段化胶原的平均直径优选为50nm～30μm，更优选为4μm～30μm，进一步优选为20μm～30μm。
对纤维性胶原等胶原进行片段化的方法没有特别限制，例如可以使用超声波式均质机、搅拌式均质机、以及高压式均质机等均质机来将纤维性胶原等胶原片段化。使用搅拌式均质机时，可以将纤维性胶原等胶原直接均质化，也可以在生理盐水等水性介质中进行均质化。另外，通过调整均质化的时间、次数等，还可以得到毫米尺寸、纳米尺寸的片段化胶原。
片段化胶原的直径和长度可以通过利用电子显微镜对各个片段化胶原进行分析来求出。
水性介质中，作为使外源性胶原来源的片段化胶原与细胞接触的方法，没有特别限制。例如可以举出：在含有细胞的培养液中加入片段化胶原的分散液的方法、在片段化胶原的培养基分散液中加入细胞的方法、或在预先准备的水性介质中加入片段化胶原和细胞的方法。
在工序(1)中，可以使用包含胶原产生细胞和除胶原产生细胞以外的其他细胞的细胞。作为胶原产生细胞和除胶原产生细胞以外的其他细胞，可以分别使用上述的细胞。通过同时使用胶原产生细胞和除胶原产生细胞以外的其他细胞来制造三维组织体，能够制造各种组织模型。例如，在使用了NHCF和HUVEC的情况下，能够得到在内部具有毛细血管的三维组织体。在使用了NHCF和结肠癌细胞的情况下，能够得到结肠癌的组织模型。另外，在使用了NHCF和iPS-CM的情况下，能够得到显示同步脉动的心肌的组织模型。
工序(1)中的水性介质中的片段化胶原的浓度可以根据目标三维组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当确定。例如，工序(1)中的水性介质中的片段化胶原的浓度可以为0.1～90重量％，也可以为1～30重量％。
工序(1)中的片段化胶原的量相对于1×105个细胞，可以为0.1～100mg，也可以为1～50mg。
工序(1)中的片段化胶原与细胞的质量比优选为1000：1～1：1、更优选为900：1～9：1、进一步优选为500：1～10：1。
在同时使用胶原产生细胞和其他细胞的情况下，工序(1)中的胶原产生细胞：其他细胞的比率(细胞数)可以为99：1～9：1，也可以是80：20～50：50，也可以是20：80～50：50，还可以是10：90～50：50。
在工序(1)和工序(2)之间还可以包含使水性介质中的片段化胶原和细胞共沉淀的工序。通过进行这样的工序，三维组织体中的片段化胶原及细胞的分布变得更均匀。作为具体的方法，没有特别限制，可以举出例如对含有片段化胶原和细胞的培养液进行离心操作的方法。
工序(1)的工序可以在水性介质中形成细胞的层后、通过使上述片段化胶原接触来进行。通过在使其与片段化胶原接触之前形成细胞的层，能够制作下层部的细胞密度高的三维组织体。另外，通过在使其与片段化胶原接触之前形成包含胶原产生细胞的细胞的层，可以制作包含胶原产生细胞的细胞的下层部的细胞密度高的三维组织体。利用所使用的细胞的种类(例如主动脉平滑肌细胞)，通过该方法，能够制作更接近生物体的组织。
在本实施方式中，三维组织体的制造方法在工序(2)之后也可以包含作为工序(3)的进一步使细胞接触、对细胞进行培养的工序。上述细胞可以与工序(1)中使用的细胞相同，也可以不同。例如，工序(1)中使用的细胞包含除胶原产生细胞以外的细胞时，工序(3)中使用的细胞可以包含胶原产生细胞。另外，例如在工序(1)中使用的细胞包含胶原产生细胞时，工序(3)中使用的细胞可以包含除胶原产生细胞以外的细胞。工序(1)中使用的细胞和工序(3)中使用的细胞这两者可以包含胶原产生细胞，工序(1)中使用的细胞和工序(3)中使用的细胞这两者可以包含除胶原产生细胞以外的细胞。通过上述工序(3)，能够制作双层结构的三维组织体。例如，在使用了主动脉平滑肌细胞和血管内皮细胞的情况下，以及在使用了人皮肤来源的成纤维细胞和人表皮角化细胞的情况下，通过该方法，能够制作更接近生物体的组织。另外，例如，在使用了人牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞的情况下，通过该方法，能够制作无组织收缩、组织破裂的双层结构的三维组织体。
对片段化胶原所接触的细胞进行培养的方法没有特别限制，可以根据所培养的细胞的种类采用适当的培养方法进行。例如，培养温度可以为20℃～40℃，也可以为30℃～37℃。培养基的pH可以为6～8，也可以为7.2～7.4。培养时间可以为1天～2周，也可以为1周～2周。
培养基没有特别限制，可以根据所培养的细胞的种类选择适当的培养基。作为培养基，可以举出例如Eagle’s MEM培养基、DMEM、Modified Eagle培养基(MEM)、MinimumEssential培养基、RPMI以及GlutaMax培养基等。培养基可以是添加有血清的培养基，也可以是无血清培养基。培养基可以是将两种培养基混合而成的混合培养基。
工序(2)中的培养基中的细胞密度可以根据目标三维组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当确定。例如，工序(2)中的培养基中的细胞密度可以为1～108个细胞/ml，也可以为103～107个细胞/ml。另外，工序(2)中的培养基中的细胞密度可以与工序(1)中的水性介质中的细胞密度相同。
上述三维组织体在培养中的收缩率优选为20％以下，更优选为15％以下，进一步优选为10％以下。上述收缩率例如可以通过以下的式子算出。式中L1表示培养后第1天的三维组织体的最长部分的长度，L3表示培养后第3天的三维组织体中的对应部分的长度。
收缩率(％)＝{(L1－L3)/L1}×100
通过上述的制造方法，可以制造例如包含细胞和外源性胶原来源的胶原且上述细胞中的至少一部分与上述胶原粘附的三维组织体，其中，上述胶原的含有率以上述三维组织体为基准为10重量％～90重量％。另外，上述外源性胶原来源的胶原也可以是片段化胶原。
(三维组织体的形成剂)
本实施方式的三维组织体的形成剂是含有片段化胶原的三维组织体的形成剂，其中，上述片段化胶原的平均长度为100nm～200μm，上述片段化胶原的平均直径为50nm～30μm。另外，关于片段化胶原的长度，片段化胶原整体中的95％可以在100μm～200μm的范围内。此外，关于片段化胶原的直径，片段化胶原整体中的95％可以在50nm～30μm的范围内。
“三维组织体的形成剂”是指用于制造三维组织体的试剂。三维组织体的形成剂可以是粉末的状态，也可以是在水性介质中分散有片段化胶原的分散液的状态。作为片段化胶原的制造方法及上述形成剂的使用方法，可以举出与上述(三维组织体的制造方法)中所示的方法同样的方法。
实施例
(实施例1：使用了I型胶原的片段化胶原的制造)
将日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原冷冻干燥物分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)中，使用均质机进行2分钟均质化，由此得到直径为约20～30μm、长度为约100～200μm的片段化胶原(图1的(A))。片段化胶原的直径和长度通过利用电子显微镜对各个片段化胶原进行分析来求出。用无血清培养基(DMEM)洗涤得到的片段化胶原，得到片段化胶原的培养基分散液。将得到的片段化胶原的培养基分散液在室温下保存1周。在后述的各三维组织体的制造中，使用通过同样的方法得到的片段化胶原。
另外，在上述方法中，当将进行均质化的时间变更为5分钟时，得到直径为约950nm～16.8μm、长度为约9.9μm～78.6μm的片段化胶原(表1、图1的(B))。由该结果可知，通过调整进行均质化的时间，能够控制片段化胶原的尺寸。
表1
进行了5分钟均质化时的片段化胶原的尺寸(样品数：391)
长度(μm) 直径(μm)
最小 9.9 0.95
最大 78.6 16.8
平均 22.5 4.4
标准偏差 11.0 2.6
(实施例2：使用了人皮肤来源的成纤维细胞的三维组织体的制造)
用含有血清的培养基(DMEM)分散片段化胶原，使浓度达到6.02mg/ml。片段化胶原使用了实施例1的进行2分钟均质化而得到的胶原。将得到的分散液166μL(相当于片段化胶原为约1mg)和1×105个细胞的正常人皮肤来源的成纤维细胞(NHDF)添加到非粘附96孔圆底平板中。在培养开始的同时，含有细胞和片段化胶原的混合物为圆形状，在培养1周后得到直径为约1.5mm的球体状的三维组织体(图2的(A))。用苏木精-伊红(HE)或甲苯胺蓝(TB)对得到的三维组织体进行染色，结果确认到片段化胶原及NHDF分别均匀地分布(图2的(B)及(C))。计算得到的三维组织体中的胶原的含有率，结果为约30重量％。
由于所使用的NHDF为人来源，因此通过使用抗人胶原抗体进行免疫染色，可以将细胞所产生的人胶原与猪I型胶原来源的片段化胶原(外源性胶原来源的片段化胶原)相区别地进行染色。预研究的结果是，在三维组织体的内部，确认到NHDF所产生的人来源的胶原(内源性胶原)的染色(图3)。根据该结果可知，在内源性胶原和外源性胶原分别来源于不同种类的情况下，能够将三维组织体中的内源性胶原与外源性胶原来源的片段化胶原相区别。
对所得到的三维组织体以胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟进行胰蛋白酶处理，结果几乎未观察到由胰蛋白酶进行的分解(图4，残留率为90％)。该结果启示，得到的三维组织体对胰蛋白酶等酶是稳定的。
(实施例3：使用了人皮肤来源的成纤维细胞和人脐带静脉来源的血管内皮细胞的三维组织体的制造)
将NHDF和人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC)以80：20的比例(细胞数)混合，接种到非粘附96孔圆底平板上。此时，片段化胶原使用实施例1的进行2分钟均质化而得到的胶原，以接种的总细胞数(1.0×105个细胞)为基准，添加与实施例2同样的量。然后，通过在DMEM与血管内皮细胞专用培养基(EGM2、Lonza公司制)的1：1(体积比)的混合培养基中培养1周，得到三维组织体(图5的(A))。计算得到的三维组织体中的胶原的含有率，结果为约30重量％。用抗CD31抗体对得到的三维组织体进行染色，结果确认到三维组织体的内部染色(图5的(B))。由该结果可知，能够制造包含毛细血管的三维组织体。
(实施例4：使用了人皮肤来源的成纤维细胞的非收缩性的三维组织体的制造)
将10mg的片段化胶原(实施例1的进行2分钟均质化而得到的胶原)和10×105个细胞的NHDF混合，分别接种于粘附性的96孔插入式平板及24孔插入式平板上进行培养时，得到了几乎观察不到三维组织体的收缩、约3mm和1mm厚的三维组织体(图6)。计算96孔插入式平板中得到的三维组织体中的胶原的含有率，结果为约30重量％。计算24孔插入式平板中得到的三维组织体中的胶原的重量％，结果为约30重量％。
另外，将含有30mg的片段化胶原的胶原凝胶100μL与10×105个细胞的NHDF混合，接种于粘附性的24孔插入式平板上进行培养，也几乎观察不到得到的三维组织体的收缩(图7的(A))。另一方面，使用不含有片段化胶原的胶原凝胶(胶原浓度为0.3重量％)而得到的三维组织体在培养第2天观察到收缩，在第6天观察到成为球体状(图7的(B))。
(实施例5：使用了人皮肤来源的成纤维细胞和人结肠癌细胞的三维组织体的制造)
也可以将NHDF和癌细胞混合来制造三维组织体。具体而言，将人结肠癌细胞HT29与NHDF以1：1的比例混合(总细胞数为1.0×105个细胞),接种到非粘附96孔圆底平板上，除此以外，在与实施例2同样的条件下制造三维组织体。将得到的三维组织体的HE染色照片示于图8。在直径为约2mm的三维组织体的内部观察到HT29和NHDF均匀地分布的情况。计算得到的三维组织体中的胶原的含有率，结果为约30重量％。
(实施例6：使用人心脏成纤维细胞和人iPS细胞来源的心肌细胞的三维组织体的制造)
用同样的方法，使用人心脏成纤维细胞(NHCF)和人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM)制造三维组织体(图9)。具体而言，将NHCF和iPS-CM以25：75的比例混合、接种于非粘附96孔圆底平板上，除此以外，在与实施例2同样的条件(总细胞数为1.0×105个细胞)下制造三维组织体。计算得到的三维组织体中的胶原的含有率，结果为约30重量％。得到的三维组织体在培养1～2周后也在一分钟内显示30～40次左右的同步脉动。该实验结果启示，三维组织体中的iPS-CM处于接近生物体内的心肌细胞的环境中。另外启示，本发明的三维组织体是适合作为实验动物的替代品和移植材料的组织体。
(实施例7：使用了人主动脉平滑肌细胞的三维组织体的制造)
将日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原冷冻干燥物分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)中，使用均质机进行2分钟均质化，得到片段化胶原。用含有血清的培养基(SmGM-2、Lonza公司制)分散片段化胶原，使浓度达到10mg/ml。将得到的分散液200μL(相当于片段化胶原为约2mg)和1×105个细胞的正常人主动脉平滑肌细胞(Arota-SMC)添加到24孔插入式细胞培养平板(Corning公司制)中。在培养开始的同时，包含细胞和片段化胶原的混合物为适于插入式平板的形状，在培养1周后得到厚度为约0.3mm的三维组织体。用10％多聚甲醛(PFA)固定得到的三维组织体，用苏木精-伊红(HE)进行染色，结果确认到片段化胶原及Arota-SMC分别均匀地分布(图10)。在使用了约3mg、4mg、8mg片段化胶原的情况下，虽然厚度不同，但也得到了同样的结果。
通过使用与上述相同的片段化胶原分散液和Arota-SMC、在形成Arota-SMC的层后使其与片段化胶原接触的方法(底层法，Bottom Layer Method)制造三维组织体。将SmGM-2(Lonza公司制)200μL和2.5×104个细胞的SMC添加到24孔插入式细胞培养平板(Corning公司制)中。培养24小时后，Arota-SMC粘附于插入式平板底面，形成细胞层。接着，将片段化胶原的分散液400μL(相当于片段化胶原为约8mg)添加到Arota-SMC的层中。培养1周后，得到厚度为约0.8mm的三维组织体。用10％多聚甲醛(PFA)固定得到的三维组织体，用苏木精-伊红(HE)进行染色，结果确认到SMC大量分布于下层部，形成了更接近生物体的组织(图11)。
如果将通过同时添加片段化胶原和Arota-SMC的方法得到的三维组织体与通过上述Bottom Layer Method得到的三维组织体进行比较，则三维组织体的厚度未见差别，有厚度依赖于任意方法中使用的Arota-SMC量地增加的倾向。通过前者的方法得到的三维组织体在下层部和上层部的密度上未见显著的差别。另一方面，通过后者的方法得到的三维组织体可见下层部的细胞密度高而上层部的细胞密度低的倾向，可确认为更接近生物体的主动脉平滑肌肉组织的结构。
(实施例8：使用了人主动脉平滑肌细胞和人脐带静脉来源的血管内皮细胞的双层结构的三维组织体的制造)
将与实施例7同样地将片段化胶原悬浮于培养基而得到的分散液200μL(相当于片段化胶原为约3mg)和5.0×105个细胞的Arota-SMC悬浮，在添加到96孔插入式平板(ACEABioscience公司制)中后，培养一周，构建三维组织体。此外，在构建的三维组织体上，将6×104个人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC)悬浮于培养基，通过自然沉降堆积在三维组织体上。将三维组织体用10％PFA固定后，切薄片，用CD31进行免疫染色。培养24小时后，一层内皮细胞的层构建在三维组织体上，得到更接近生物体的血管壁的组织体(图12)。
(实施例9：使用了人牙龈成纤维细胞的三维组织体的制造)
将日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原冷冻干燥物分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)中，使用均质机进行2分钟均质化，得到片段化胶原。用含有血清的培养基(DMEM)分散片段化胶原，使浓度达到10mg/ml。(2分钟时)将得到的分散液800μL(相当于片段化胶原为约8mg)和正常人牙龈成纤维细胞(HGF)(5.0×105个细胞、8.0×105个细胞、1.0×106个细胞)添加到24孔插入式细胞培养平板(Corning公司制)中。在培养开始的同时，包含细胞和片段化胶原的混合物为适于插入式平板形状的圆柱体，培养3天后得到直径为约1.5mm厚的三维组织体。尽管存在大量的胶原，但几乎未见组织的收缩。用苏木精-伊红(HE)对得到的三维组织体进行染色，结果确认到在使用了5.0×105个细胞、8.0×105个细胞及1.0×106个细胞的HGF中的任一种的三维组织体中，片段化胶原及HGF也均匀地分布(图13的“均质化：2分钟”)。
使用用均质机进行6分钟均质化而得到的片段化胶原，除此以外，通过同样的方法得到三维组织体。确认到在使用了分散液816μL(相当于片段化胶原为约8mg)和5.0×105个细胞、8.0×105个细胞及1.0×106个细胞中的任一HGF的三维组织体中，片段化胶原及HGF也均匀地分布(图13的“均质化：6分钟”)。
对使用上述进行2分钟均质化而得到的片段化胶原制造的三维组织体与使用进行6分钟均质化而得到的片段化胶原制造的三维组织体进行比较时，在任一情况下均得到了片段化胶原及HGF均均匀地分布的三维组织体，但使用进行6分钟均质化而得到的片段化胶原制造的三维组织体中更没有胶原的聚集块，变得更为均匀，但对于厚度，在相同量的胶原的情况下变得更薄。
(实施例10：使用了人牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞的三维组织体的制造)
下层(HGF层)的制作：将日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原8mg(进行2分钟均质化而得到的片段化胶原)和正常人牙龈成纤维细胞(HGF)1.0×106个细胞混合悬浮于D-MEM(和光纯药工业株式会社制)中，添加到24孔插入式平板(Corning公司制)中，在插入式平板外侧添加培养基，培养过夜。
上层(Epi4层)的制作：次日吸取插入式平板的培养基，调整永生化人牙龈上皮细胞(Epi4)以达到2.0×106个细胞/300μL/插入式平板，在HGF层上接种Epi4。在插入式平板的外侧加入1ml的以1:1混合有D-MEM和Humedia(仓敷纺织株式会社制)的混合培养基，在37℃孵育1小时后，在插入式平板的外侧追加1ml混合培养基，培养过夜。
Epi4的分化：除去插入式平板的内侧和外侧两处的培养基，将混合培养基加入到插入式平板的外侧，在每天进行培养基更换的情况下培养7天。培养后，切薄片、进行HE染色。
下层的制作时，除了使用进行6分钟均质化而片段化了的日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原以外，与上述同样地制造三维组织体，进行HE染色。
如图14所示，通过用进行2分钟均质化而得到的片段化胶原或进行6分钟均质化而得到的片段化胶原制作间质的基座，在其上层叠牙龈上皮细胞，能够制作没有组织收缩、组织开裂的双层结构的牙龈模型。
(实施例11：使用了人皮肤来源的成纤维细胞和正常人表皮角化细胞的双层结构的三维组织体的制造)
将日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原冷冻干燥物50mg分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)5mL中，使用均质机进行2分钟均质化，得到片段化胶原。用无血清培养基(DMEM)洗涤得到的片段化胶原，得到片段化胶原的培养基分散液。用含有血清的培养基(SmGM-2、Lonza公司制)分散片段化胶原，使浓度达到10mg/mL。
下层(NHDF层)的制作：用PBS(0.04μL/插入式平板)中的0.04mg/mL的纤连蛋白溶液(#F2006-5G、Sigma公司制)涂布24孔的插入式平板，在37℃孵育20分钟。然后，将片段化胶原分散液0.8mL(相当于片段化胶原为约8mg)和1×106个细胞的人皮肤来源的成纤维细胞(NHDF)在24孔板Transwell(IWAKI公司制)中混合。将平板放入培养箱中，培养24小时。
上层(NHEK层)的制作：在上述NHDF的胶原凝胶上，抽吸插入式平板中的培养基，用PBS(0.04μL/插入式平板)中的0.04mg/mL胶原IV溶液进行涂布，在37℃下孵育至少20分钟。抽吸NHDF的胶原凝胶上添加的胶原IV溶液，在NHDF的胶原凝胶上加入300μL的1×106个细胞的正常人表皮角化细胞(NHEK)(#KK-4009，1小瓶＝500000个细胞，KURABO公司制)。向插入式平板的外侧加入1mL的DMEM 5％FBS(#C-2517A，Invitrogen公司制)(1：1)培养基，1小时后再次向插入式平板的外侧加入1mL。
轻轻地抽吸内侧和外侧的培养基，在DMEM 5％FBS：EpiLife(1：1)培养基中将抗坏血酸稀释至100倍，在插入式平板的外侧加入500μL的分化培养基。在插入式平板的内侧未加入培养基。每天更换插入式平板外的培养基直至分化第7天。
所制作的皮肤模型中，包含成纤维细胞的层(真皮组织)、包含上部的角化细胞的层(表皮组织)中的细胞间的距离适当，是接近生物体内的皮肤组织的结构。通过用进行2分钟均质化而得到的片段化胶原和人皮肤来源的成纤维细胞制作基座，并在其上层叠正常人表皮角化细胞，能够制作接近生物体的双层结构的皮肤模型。
(实施例12：使用了人心脏成纤维细胞和人iPS细胞来源的心肌细胞的三维组织体的制造、以及胶原的面积比例的计算)
将日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原冷冻干燥物50mg分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)5mL中，使用均质机进行6分钟均质化，得到片段化胶原(CMF)。以3,500rpm离心分离3分钟后，加入无血清培养基(DMEM)洗涤1分钟，再次以3,500rpm离心分离3分钟，除去上清液。加入含有血清的培养基(DMEM)，使总量达到5mL，将片段化胶原分散。
将以25：75的比例混合有人心脏成纤维细胞(NHCF)和人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM)的细胞5×105个细胞与0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg的CMF混合，以总液量为300μL接种到非粘附96孔圆底平板上(溶液的浓度以6.5mg/mL计算)。以1,100g离心分离5分钟后，在培养箱中培养21天，得到三维组织体。
将得到的三维组织体整体用马松三色染色。用Image J(美国国立卫生研究所制)算出染色后的三维组织体的总面积(球状体的大致中心部的截面切片图)和染成蓝色的胶原的面积。将结果示于表2和图15。通过Image J计算胶原的面积的方法具体如下进行。(1)通过“Split Channel”指令将彩色的原图像进行RGB分割。(2)以图像整体进行观察时，当判断为能够区分“G”图像为组织整体的区域，“R”图像为被胶原染色的区域，通过“Threshold”指令，分别对“G”图像和“R”图像进行二值化。作为二值化时的阈值，通过指定“G”图像的阈值为0～75、“R”图像的阈值为0～130来进行。(3)在Selection tool(freehand)中，指定三维组织体的轮廓的范围，计算上述范围内的“G”图像和“R图像”各自的(二值化后的)面积，算出胶原染色区域在三维组织体截面整体中所占的面积比率。
表2
随着三维组织体的制作中使用的CMF(“加入CMF”)的量增加，胶原的面积相对于三维组织体的总面积的比例也增加，但加入CMF达到0.5mg以上时，显示胶原的面积的比例的增加幅度减小。其中，虽然认为面积率根据三维组织体中的染色方法、胶原的局部分布状态的不同而某种程度地上下浮动，但在基于上述步骤进行判断的情况下，在加入了0.5mg以上的胶原的情况下，显示胶原区域的面积至少相对于三维组织体的总面积为50％以上的可能性非常高。
(实施例13：使用了人心脏成纤维细胞和人iPS细胞来源的心肌细胞的三维组织体的制造、以及基于胶原定量的含有率的计算)
将日本NH Foods株式会社制的猪皮来源的I型胶原冷冻干燥物50mg分散于10倍浓度的磷酸缓冲生理盐水(×10PBS)5mL中，使用均质机进行6分钟均质化，得到片段化胶原(CMF)。以3,500rpm离心分离3分钟后，加入无血清培养基(DMEM)洗涤1分钟，再次以3,500rpm离心分离3分钟，除去上清液。加入含有血清的培养基(DMEM)，使总量达到5mL，将片段化胶原分散。
将以25：75的比例混合有人心脏成纤维细胞(NHCF)和人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM)的细胞5×105个细胞和1.0mg的CMF混合，以总液量为300μL接种到非粘附96孔圆底平板上(溶液的浓度以6.5mg/mL计算)。以1,100g离心分离5分钟后，在培养箱中培养3天或5天，得到三维组织体。培养3天得到的样品分别设为第3天-1、第3天-2、第3天-3、培养5天得到的样品分别设为第5天-1、第5天-2、第5天-5。
使用QuickZyme Total Collagen Assay(QuickZyme Biosciences公司制)，通过以下的方法对三维组织体中的胶原进行定量。
(样品的制备)
将上述样品第3天-1、第3天-2、第3天-3、第5天-1、第5天-2及第5天-5分别从非粘附96孔圆底平板回收后，通过FDU-2200型(东京理化器械制)进行冷冻干燥处理。在螺口试管中，将三维组织体的总量与6M HCl混合，用加热块在95℃孵育20小时以上后，回复到室温。以13000g离心分离10分钟后，用6M HCl将样品溶液的上清液稀释10倍，此外，将200μL用100μL的Milli-Q稀释，由此制备样品。样品使用35μL。
(标准品的制备)
在螺口试管中加入125μL的标准溶液(1200μg/mL的乙酸溶液)和125μL的12M HCl进行混合，用加热块在95℃下孵育20小时后，回复到室温。以13000g离心分离10分钟后，用Milli-Q稀释上清液，制作300μg/mL的S1，将S1阶段性地稀释而制作S2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)。还准备了仅含4M HCl90μL的S8(0μg/mL)。由此分别将35μL用于实验。
(分析)
将35μL的标准品和样品分别加入到平板(QuickZyme Total Collagen Assay试剂盒附带)中。将75μL的分析缓冲液(上述试剂盒附带)加入到各个孔中。用密封盖盖住平板，边摇晃边在室温下孵育20分钟。揭开密封盖，将75μL检测试剂(reagent A：B＝30μL：45μL、上述试剂盒附带)加入到各个孔中。用密封盖盖住平板，通过摇晃混合溶液，在60℃下孵育60分钟。用冰冷却至室温，揭开密封盖，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准品进行比较来算出胶原量。将结果示于表3。
表3
“无胶原”的样品除了不使用片段化胶原以外，表示在与第5天相同的条件下制作得到的组织体。
使用片段化胶原在培养时间3天或5天得到的三维组织体中的胶原的含有率相对于三维组织体的干燥重量为约20～66％。另一方面，在不使用片段化胶原制作的组织体中，胶原量为0.06μg，相对于三维组织体的含有率基本为零。
产业上的可利用性
根据本发明，能够使三维组织体一次性达到1mm以上的厚度。另外，本发明的三维组织体的制造方法是全层结构的再构成皮肤、并有可能能够作为毒性模型中的肝脏以及心脏的类器官(organoid)制作技术使用。另外，在使用较少数量的心肌细胞制造的三维组织体中，观察到心跳同步脉动，期待在心毒性评价等中的应用。另外，使用主动脉平滑肌细胞制造的三维组织体期待作为动脉硬化血管壁模型的应用。此外，使用牙龈成纤维细胞制造的三维组织体有可能能够用于牙周炎等体外(in vitro)分析。

Claims (15)

1.一种三维组织体，其含有细胞和包含内源性胶原的胶原，所述细胞中的至少一部分与所述胶原粘附，其中，
以所述三维组织体为基准，所述胶原的含有率为10重量％～90重量％。
2.根据权利要求1所述的三维组织体，其中，所述细胞为包含胶原产生细胞的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的三维组织体，其中，以胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟进行胰蛋白酶处理后的所述三维组织体的残留率为70％以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的三维组织体，其厚度为10μm以上。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的三维组织体，其中，所述细胞还包含选自血管内皮细胞、癌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞及上皮细胞中的一种或多种细胞。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的三维组织体，其中，作为所述胶原，还包含外源性胶原来源的片段化胶原。
7.一种三维组织体的制造方法，其包含：
(1)在水性介质中，使外源性胶原来源的片段化胶原与细胞接触的工序，以及
(2)对所述片段化胶原接触后的所述细胞进行培养的工序。
8.根据权利要求7所述的制造方法，其中，所述细胞是包含胶原产生细胞的细胞。
9.根据权利要求7或8所述的制造方法，其中，在工序(1)和工序(2)之间还包含使水性介质中的所述片段化胶原与所述细胞一起沉降的工序。
10.根据权利要求7或8所述的制造方法，其中，工序(1)的工序通过在水性介质中形成所述细胞的层后使所述片段化胶原接触来进行。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的制造方法，其中，所述片段化胶原的平均长度为100nm～200μm。
12.根据权利要求7～11中任一项所述的制造方法，其中，所述片段化胶原的平均直径为50nm～30μm。
13.根据权利要求7～12中任一项所述的制造方法，其中，所述细胞还包含选自血管内皮细胞、癌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞及上皮细胞中的一种或多种细胞。
14.根据权利要求7～13中任一项所述的制造方法，其中，所述片段化胶原与所述细胞的质量比为900：1～9：1。
15.一种三维组织体的形成剂，其包含片段化胶原，其中，
所述片段化胶原的平均长度为100nm～200μm，所述片段化胶原的平均直径为50nm～30μm。
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