CN118202037A - 组织体的制造方法和来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化促进方法 - Google Patents

组织体的制造方法和来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化促进方法 Download PDF

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松崎典弥
F·路易斯
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Abstract

本发明涉及一种包含血管内皮细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。

Description

组织体的制造方法和来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细 胞的分化促进方法
技术领域
本发明涉及组织体的制造方法和来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化促进方法。
背景技术
作为人工制作模仿生物体组织的结构体的方法，例如已知有下述方法等：一种制造三维组织体的方法(专利文献1)，其包含三维地配置由含有胶原蛋白的被膜涂敷的细胞、形成三维组织体的工序；一种立体性细胞组织的制造方法(专利文献2)，其包含将细胞与阳离子性物质和细胞外基质成分混合而得到混合物，从得到的混合物收集细胞，在基材上形成细胞集合体的工序。另外，本发明者们还提出了下述方法(专利文献3)：通过使细胞与经片段化的外源性胶原蛋白接触，以较少的细胞数制造厚度为1mm以上的尺寸大的三维组织体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2015/072164号
专利文献2：国际公开第2017/146124号
专利文献3：国际公开第2018/143286号
发明内容
发明所要解决的课题
根据上述制造方法，能够得到作为通过细胞培养而人工制作的细胞的集合体的组织体。特别是，包含血管内皮细胞的组织体期待用作实验动物的替代品、移植材料等。在此，在人工制造组织体时，虽然大多使用以牛等其他生物种类为来源的脂肪来源干细胞、虽同是人但从不同个体采集的同种异体的细胞等，但例如在制造移植到人的移植材料时，设想使用该人的自体细胞来制造移植材料。因此，特别是在使用来自人的脂肪来源干细胞制造组织体时，期望有促进该脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化的方法。
本发明是鉴于上述情况而完成的，其目的在于提供一种在包含血管内皮细胞的组织体的制造中促进来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化的方法。
用于解决课题的手段
本发明者们反复进行了深入研究，结果发现，通过将来自人的脂肪来源干细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育，脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化得到促进，从而完成了本发明。
即，本发明例如包含以下的发明。
[1]
一种包含血管内皮细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
[2]
根据[1]所述的方法，其中，至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞不包含血管内皮细胞。
[3]
根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，在上述TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育是在含有上述TGFβ型I受体抑制剂的培养基中进行孵育，培养基中的上述TGFβ型I受体抑制剂的含量为1μM以上且10μM以下。
[4]
根据[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，孵育进行96小时以上且288小时以下。
[5]
根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其包含将上述细胞与片段化细胞外基质成分一起在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
[6]
根据[5]所述的制造方法，其中，在上述组织体中，上述片段化细胞外基质成分配置于上述细胞彼此的间隙中。
[7]
根据[5]或[6]所述的制造方法，其中，上述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。
[8]
根据[5]～[7]中任一项所述的制造方法，其进一步包含在孵育前、在水性介质中使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分接触的工序。
[9]
一种脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化促进方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
[10]
根据[9]所述的方法，其中，在上述TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育是在含有上述TGFβ型I受体抑制剂的培养基中进行孵育，培养基中的上述TGFβ型I受体抑制剂的含量为1μM以上且10μM以下。
[11]
根据[9]或[10]所述的方法，其中，孵育进行96小时以上且288小时以下。
[12]
根据[9]～[11]中任一项所述的方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
[13]
根据[12]所述的方法，其中，上述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。
[14]
根据[12]或[13]所述的方法，其进一步包含在孵育前、在水性介质中使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分接触的工序。
发明效果
根据本发明，来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化得到促进。通过促进向血管内皮细胞的分化，能够在短时间内制造包含血管内皮细胞的组织体。
附图说明
图1是表示基于CD31染色和Hoechst染色的制造例1中制作的组织体的观察结果的照片。(a)是在不含有ALK5抑制剂(ALK5i)的EGM-2中培养的组织体，(b)是在含有5μM ALK5抑制剂的EGM-2中培养的组织体，(c)是在含有10％FBS的DMEM培养基中培养的组织体。白色的点表示核(Hoechst染色)。
图2是表示基于CD31染色的制造例2中制作的组织体的观察结果的照片。
图3是表示通过流式细胞仪分析分析制造例3中制作的组织体中的血管内皮细胞的比率的结果的图表及其比率的表。(a)表示使用所制造的组织体的结果，(b)表示直接使用组织消化后分离的细胞的结果。
图4是表示对在制造例4中制作的组织体(细胞球)进行比较的结果的照片。上行的照片表示所制造的细胞球(多个)，中行的照片表示CD31染色分析中使用的细胞球，下行的照片表示基于CD31染色的具有血管网的细胞球的荧光观察结果。
图5是表示通过流式细胞仪分析分析制造例5中制作的组织体中的血管内皮细胞的比率的结果的图表及其比率的表。
图6是表示在制造例6中制作的组织体(细胞球)中，通过vWF染色比较血管网的形成的结果的照片。
图7是表示制造例7中制作的组织体(细胞球)的观察结果的照片。
具体实施方式
以下，详细说明用于实施本发明的方式。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
作为一个实施方式，本发明提供一种包含血管内皮细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
在本说明书中，“组织体”是指通过细胞培养而人工制作的细胞的集合体。其中，“三维组织体”是指通过细胞培养而人工制作的、细胞三维地配置的细胞的集合体(块状的细胞集团)。在三维组织体包含后述的细胞外基质成分的情况下，细胞介由细胞外基质成分三维地配置。组织体的形状没有特别限制，例如可举出片状、球体状、大致球体状、椭圆体状、大致椭圆体状、半球状、大致半球状、半圆状、大致半圆状、长方体状、大致长方体状等。在此，生物体组织包含汗腺、淋巴管、脂腺等，构成比组织体复杂。因此，能够容易地区分组织体和生物体组织。
在本说明书中，“细胞”没有特别限定，例如可以是人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等哺乳类动物来源的细胞。细胞的来源部位也没有特别限定，可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等来源的体细胞，也可以是生殖细胞。此外，细胞可以是干细胞，另外，可以是原代培养细胞、传代培养细胞及细胞株细胞等培养细胞。
在本说明书中，“干细胞”是指具有自我复制能力及多分化能力的细胞。干细胞中包括具有分化为任意的细胞种类的能力的多能性干细胞、和具有分化为特定的细胞种类的能力的组织干细胞(也称为体干细胞)。作为多能性干细胞，例如可举出胚胎干细胞(ES细胞)、体细胞来源ES细胞(ntES细胞)及人工多能性干细胞(iPS细胞)。作为组织干细胞，例如可举出间充质干细胞(例如脂肪来源干细胞、骨髓来源干细胞)、造血干细胞及神经干细胞。作为脂肪来源干细胞，例如可举出人脂肪来源干细胞(ADSC)。
细胞至少包含来自人的脂肪来源干细胞。来自人的脂肪来源干细胞可以使用人的生物体组织，例如从人的皮下脂肪组织和心外膜来源的脂肪组织等采集的干细胞。在将通过本实施方式的方法制造的包含血管内皮细胞的组织体最终选择用于人的生物体的特定部位的组织的情况下，优选使用与该部位的组织对应的组织来源的组织体。
在本实施方式中，细胞至少包含来自人的脂肪来源干细胞，但也可以进一步包含除脂肪来源干细胞以外的细胞。作为除脂肪来源干细胞以外的细胞，例如可举出成熟脂肪细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞、大肠癌细胞(例如人大肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、淋巴管内皮细胞、神经细胞、树突状细胞、肝细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Aorta-SMC))、胰岛细胞、角化细胞(例如人表皮角化细胞)等。
来自生物体组织的脂肪来源干细胞和/或成熟脂肪细胞的采集可以通过常规方法进行，例如可以如下采集。将脂肪组织片段清洗和切断，用胶原酶消化(例如37℃下孵育1小时)。然后，通过过滤等回收消化后的细胞，进行离心，分离成含有成熟脂肪细胞的上层的黄色的油性层、含有脂肪干细胞和血细胞的下层的颗粒。通过仅回收上层，能够采集成熟脂肪细胞，通过仅回收颗粒，能够采集ADSC。
在本说明书中，“血管内皮细胞”是指构成血管内腔的表面的扁平状的细胞。作为血管内皮细胞，例如可举出人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC)。脂肪干细胞是否分化为血管内皮细胞例如可以通过使用了血管内皮细胞的标记物CD31、血管性血友病因子(vonWillebrand factor，vWF)和VE-钙黏着蛋白等的免疫染色或流式细胞仪分析等来确认。
组织体中的血管内皮细胞的含有率相对于组织体中的总细胞数例如可以为5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上或30％以上，且可以为95％以下、90％以下、80％以下或75％以下。从使本发明的效果变得更显著的观点出发，至少包含脂肪来源干细胞的细胞、即孵育前的细胞中的血管内皮细胞的含有率相对于孵育前的总细胞数可以为10％以下、5％以下或1％以下。
组织体可以在细胞间具有血管网。当在细胞间形成有血管网时，可期待能够长期维持组织体、以及在将组织体移植到哺乳类等时变得容易植入。
“在细胞间具有血管网”是指与生物体组织同样地具有按照分支的血管包围细胞的方式在细胞与细胞之间延伸的结构。关于是否形成有与生物体组织同样的血管网，例如可以基于生物体组织中的血管的分支数和/或血管的分支间的长度和/或血管的直径的多样性来判断。例如，在组织体中的血管的分支数的平均值相对于生物体组织中的血管的分支数的平均值为80％以上且150％以下、85％以上且130％以下、或90％以上且120％以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支数类似。另外，例如，在组织体中的血管的分支数的平均值为2.5以上且4.5以下、或3.0以上且4.2以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支数类似。例如，在组织体中的血管的分支间的长度的平均值相对于生物体组织中的血管的分支间的长度的平均值为80％以上且150％以下、85％以上且130％以下、以及90％以上且120％以下的情况下，可以判断为与生物体组织中的血管的分支间的长度类似。在生物体组织中，可观察到较粗的血管及较细的血管这两者。因此，例如，在与生物体组织同样地观察到直径较粗的血管(例如10μm以上且小于25μm)和较细的血管(例如超过0μm且小于10μm)这两者的情况下，可以判断为具有与生物体组织中的血管的直径同样的多样性。另外，例如，就超过0μm且小于25μm而言，分布有血管直径整体的60％以上、70％以上或80％以上的情况下，可以判断为具有与生物体组织中的血管的直径同样的多样性。包含血管内皮细胞的组织体优选在血管内皮细胞间具有血管网。在该情况下，不仅具有血管网，被血管包围的血管内皮细胞也优选与生物体组织接近。在对上述生物体组织和组织体进行比较时，以相同的条件(例如单位规定体积，当为图像分析时为单位规定面积，单位规定样品等)对生物体组织和组织体进行比较。
组织体还可以包含除血管内皮细胞以外的细胞。作为除血管内皮细胞以外的细胞，例如可举出成熟脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质系细胞、大肠癌细胞(例如人大肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、淋巴管内皮细胞、神经细胞、树突细胞、肝细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Aorta-SMC))、胰岛细胞、角化细胞(例如人表皮角化细胞)等。但是，由于本发明发挥促进脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化的效果，因此本发明的效果变得更显著，因此在孵育后的组织体中，脂肪来源干细胞相对于组织体中的总细胞数优选为10％以下，更优选为5％以下，进一步优选不包含脂肪来源干细胞。
作为表示脂肪细胞的成熟度的指标，可以使用脂肪滴的大小。脂肪滴是指储存甘油三酯(中性脂肪)、胆固醇等脂质的细胞内细胞器，上述脂质类被磷脂单层膜覆盖而具有液滴样的形状。另外，在上述磷脂的表面可见脂肪组织特有的蛋白(围脂滴蛋白等)的出现。成熟的脂肪细胞的脂肪滴的大小之间存在偏差，例如，在脂肪滴的大小的平均值为20μm以上的情况下，可以认为脂肪细胞某种程度地成熟即为成熟脂肪细胞。需要说明的是，本说明书中“脂肪细胞”是指除脂肪来源干细胞以外的所有的脂肪细胞，包括成熟脂肪细胞、及脂肪来源干细胞中不包括的脂肪细胞。
上述组织体的厚度优选为10μm以上，更优选为100μm以上，更进一步优选为1000μm以上。这样的组织体为更接近生物体组织的结构，适合作为实验动物的替代品和移植材料。组织体的厚度的上限没有特别限制，例如可以为10mm以下，可以为3mm以下，可以为2mm以下，可以为1.5mm以下，也可以为1mm以下。
在此，“组织体的厚度”在组织体为片状或长方体状的情况下，是指与主面垂直的方向上的两端的距离。在上述主面存在凹凸的情况下，厚度是指上述主面的最薄部分的距离。另外，在组织体为球体状或大致球体状的情况下，厚度是指其直径。此外，在组织体为椭圆体状或大致椭圆体状的情况下，厚度是指其短径。在组织体为大致球体状或大致椭圆体状且表面存在凹凸的情况下，厚度是指通过组织体的重心的直线与上述表面交叉的2点间的距离中的最短的距离。
在本实施方式的方法中，包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。通过在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育，来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化得到促进。在本实施方式的方法中，通过在脂肪来源干细胞包含于组织体的状态下促进分化，或者在以脂肪来源干细胞包含于组织体的方式形成组织体的状况下促进分化，最终能够制作包含血管内皮细胞的组织体。因此，组织体的制造只要包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序即可，可以是三维培养，也可以是二维培养。组织体例如可以仅通过在培养基中孵育至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞而得到，也可以通过在没有支架的状态下一边使该细胞悬浮于培养基一边进行孵育的悬浮培养而得到，也可以通过使该细胞附着于凝胶和片材等支架进行孵育的附着型培养而得到，如后所述，还可以通过在水性介质中将该细胞与细胞外基质一起进行孵育而得到。
将至少包含脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育可以仅将细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育，也可以以细胞和细胞外基质成分混合的状态在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育，还可以以形成有包含细胞和细胞外基质成分的组织体的状态在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育。
作为TGFβ型I受体抑制剂，例如可举出属于TGFβR1激酶的ALK5、ALK2、ALK4和ALK7的抑制剂。TGFβ型I受体抑制剂只要具有抑制TGFβ型I受体的作用，就没有特别限制。作为ALK5、ALK4和ALK7抑制剂，例如可举出4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺，作为ALK5抑制剂，例如可举出2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶，盐酸盐、N-(2-氟苯基)-4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-2-甲胺等。
在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育例如可以是将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂的培养基中进行孵育(培养)。
培养基没有特别限制，可以根据所要培养的细胞的种类选择适当的培养基。培养基可以为固体培养基，也可以为液体培养基，优选为液体培养基。作为培养基，例如可举出Eagle’s MEM培养基、DMEM、血管内皮细胞专用培养基(EGM-2)、Modified Eagle培养基(MEM)、Minimum Essential培养基、RPMI、KBM培养基、及GlutaMax培养基等。另外，液体培养基也可以使用如纤维蛋白凝胶、水凝胶、基质胶、胶原蛋白凝胶以及明胶凝胶那样的凝胶状的液体培养基。可以在凝胶状的液体培养基中添加细胞，也可以使含有细胞的液体培养基凝胶化后使用。培养基可以是添加有血清的培养基，也可以是无血清培养基。培养基可以是混合有两种培养基的混合培养基。
TGFβ型I受体抑制剂的量只要是足以使各脂肪来源干细胞与该抑制剂接触的量即可，例如可以相对于脂肪来源干细胞1×106cells，为2.0×10-11mol～2.0×10-8mol、或1.0×10-9mol～2.0×10-8mol，例如可以相对于脂肪来源干细胞5×106cells，为1.0×10-10mol～1.0×10-7mol、或5.0×10-9mol～1.0×10-7mol。另外，TGFβ型I受体抑制剂例如可以相对于脂肪来源干细胞1×106cells，为6.0ng～6.0μg或300ng～6.0μg，例如可以相对于脂肪来源干细胞5×106cells，为30ng～30μg或1500ng～30μg。
在将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂的培养基中进行孵育的情况下，培养基中的TGFβ型I受体抑制剂的含量例如可以为0.1μM以上且100μM以下、0.5μM以上且50μM以下、1μM以上且10μM以下、或2μM以上且8μM以下，也可以为0.5μM以上、0.7以上、1μM以上、2μM以上、3μM以上、4μM以上、5μM以上，且可以为20μM以下、15μM以下、12μM以下、10μM以下、8μM以下或7μM以下。
孵育前的培养基中的细胞密度可以根据目标组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当决定。例如，培养基中的细胞密度可以为1～108cells/mL，也可以为103～107cells/mL。
孵育没有特别限制，可以根据所要培养的细胞的种类在适当的条件下进行。例如，孵育的温度可以为20℃～40℃，也可以为30℃～37℃。培养基的pH可以为6～8、也可以为7.2～7.4。孵育的时间可以为24小时以上且336小时以下，可以为72小时以上且336小时以下，可以为96小时以上且288小时以下。添加TGFβ型I受体抑制剂后的孵育的时间可以为24小时以上且336小时以下，可以为72小时以上且336小时以下，也可以为96小时以上且288小时以下。
细胞的培养中使用的培养器(支撑体)没有特别限制，例如可以是孔插件、低吸附平板、具有U字或V字等底面形状的平板。可以将上述细胞在粘附于支撑体的状态下进行培养，也可以将上述细胞在不粘附于支撑体的状态下进行培养，也可以在培养中途从支撑体分离而进行培养。在将上述细胞在不粘附于支撑体的状态下进行培养的情况下、或在培养中途从支撑体分离而进行培养的情况下，优选使用抑制细胞对支撑体的粘附的具有U字或V字等底面形状的平板、低吸附平板。
本实施方式的方法为将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂的培养基中进行孵育(培养)的情况下，培养基中可以含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)。此时，例如可以预先使用含有VEGF和TGFβ型I受体抑制剂的培养基，也可以在含有VEGF的培养基中添加TGFβ型I受体抑制剂，还可以在含有TGFβ型I受体抑制剂的培养基中添加VEGF。
通过将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂和VEGF的培养基中进行孵育，从脂肪干细胞向血管内皮细胞的分化得到进一步促进。另外，通过将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂和VEGF的培养基中进行孵育，还能够促进血管生成，因此能够更简便地制造具有血管网的组织体。
将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有VEGF的培养基中进行孵育的情况下，培养基中的VEGF的含量例如可以为0.5ng/mL以上且100ng/mL以下、1ng/mL以上且85ng/mL以下、6ng/mL以上且80ng/mL以下、10ng/mL以上且70ng/mL以下、或20ng/mL以上且50ng/mL以下，可以为0.5ng/mL以上、1ng/mL以上、5ng/mL以上、6ng/mL以上、10ng/mL以上、15ng/mL以上、20ng/mL以上，且可以为100ng/mL以下、90ng/mL以下、80ng/mL以下、70ng/mL以下、60ng/mL以下或50ng/mL以下。
本实施方式的方法可以包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。通过与片段化细胞外基质成分一起进行孵育，能够得到细胞介由片段化细胞外基质成分三维地配置的三维组织体。优选为片段化细胞外基质成分配置于上述细胞彼此的间隙中的三维组织体。细胞彼此中的细胞可以是同种细胞，也可以是异种细胞。在使用含有TGFβ型I受体抑制剂的培养基的情况下，片段化胞外基质成分可以与TGFβ型I受体抑制剂同时添加到培养基中，也可以先于TGFβ型I受体抑制剂添加到培养基中，也可以后于TGFβ型I受体抑制剂添加到培养基中。
片段化细胞外基质成分可以通过将细胞外基质成分片段化而得到。在本说明书中，“细胞外基质成分”是指由多个细胞外基质分子形成的细胞外基质分子的集合体。细胞外基质是指在生物中存在于细胞外的物质。作为细胞外基质，只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响，就可以使用任意的物质。作为具体例，可举出胶原蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白、透明质酸、层粘连蛋白、波连蛋白、细胞粘合素、巢蛋白和纤维蛋白等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以单独使用它们中的一种，也可以组合使用。细胞外基质成分例如可以含有胶原蛋白成分，也可以是胶原蛋白成分。本实施方式中的细胞外基质成分优选为存在于动物细胞外的物质、即动物的细胞外基质成分。
细胞外基质分子只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响，就可以是上述的细胞外基质分子的修饰体及突变体，也可以是化学合成肽等多肽。细胞外基质分子可以具有胶原蛋白特征性的由Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，Gly表示甘氨酸残基，X和Y分别独立地表示任意的氨基酸残基。多个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同。通过具有由Gly-X-Y表示的序列的重复，对分子链的配置的束缚变少，因此，例如作为细胞培养时的支架材料的功能更为优异。在具有由Gly-X-Y表示的序列的重复的细胞外基质分子中，由Gly-X-Y表示的序列的比例在全部氨基酸序列中可以为80％以上，优选为95％以上。另外，细胞外基质分子也可以是具有RGD序列的多肽。RGD序列是指由Arg-Gly-Asp(精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬氨酸残基)表示的序列。通过具有RGD序列，细胞粘附得到更进一步促进，因此例如作为细胞培养时的支架材料更为合适。作为包含由Gly-X-Y表示的序列和RGD序列的细胞外基质分子，可举出胶原蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、层粘连蛋白、钙黏着蛋白等。
作为胶原蛋白，例如可举出纤维性胶原蛋白及非纤维性胶原蛋白。纤维性胶原蛋白是指成为胶原蛋白纤维的主成分的胶原蛋白，具体而言可举出I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白等。作为非纤维性胶原蛋白，例如可举出IV型胶原蛋白。
作为蛋白多糖，可举出硫酸软骨素蛋白多糖、硫酸肝素蛋白多糖、硫酸角质素蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖，但并不限定于这些。
从本发明的效果变得更显著的角度出发，细胞外基质成分可以包含选自由胶原蛋白、层粘连蛋白及纤连蛋白组成的组中的至少一种，优选包含胶原蛋白。胶原蛋白优选为纤维性胶原蛋白，更优选为I型胶原蛋白。作为纤维性胶原蛋白，可以使用市售的胶原蛋白，作为其具体例，可举出日本Ham株式会社制的猪皮来源的I型胶原蛋白。
细胞外基质成分可以是动物来源的细胞外基质成分。作为成为细胞外基质成分的来源的动物种，例如可举出人、猪、牛等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以使用一个种的动物来源的成分，也可以并用多个种的动物来源的成分。
“片段化”是指使细胞外基质成分的集合体成为更小的尺寸。片段化可以在切断细胞外基质分子内的键的条件下进行，也可以在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行。通过施加物理性的力而片段化的细胞外基质与酶处理不同，通常分子结构在进行片段化之前不发生变化(分子结构得以维持)。片段化细胞外基质成分可以包含通过施加物理性的力而对上述的细胞外基质成分进行解纤而得到的成分、即经解纤的细胞外基质成分(解纤细胞外基质成分)。解纤是片段化的一个方式，例如是在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行的。
作为将细胞外基质成分片段化的方法，没有特别限制。作为对细胞外基质成分进行解纤的方法，例如可以通过超声波式均化器、搅拌式均化器、及高压式均化器等施加物理性的力来对细胞外基质成分进行解纤。在使用搅拌式均化器的情况下，可以将细胞外基质成分直接均化，也可以在生理盐水等水性介质中进行均化。另外，通过调整进行均化的时间、次数等，还可以得到毫米尺寸、纳米尺寸的解纤细胞外基质成分。解纤细胞外基质成分也可以通过反复冷冻融解进行解纤而得到。
片段化细胞外基质成分可以至少部分包含经解纤的细胞外基质成分。另外，片段化细胞外基质成分也可以仅由经解纤的细胞外基质成分构成。即，片段化细胞外基质成分可以是经解纤的细胞外基质成分。经解纤的细胞外基质成分优选包含经解纤的胶原蛋白成分(解纤胶原蛋白成分)。解纤胶原蛋白成分优选维持了胶原蛋白来源的三重螺旋结构。解纤胶原蛋白成分可以是部分地维持了胶原蛋白来源的三重螺旋结构的成分。
作为片段化细胞外基质成分的形状，例如可举出纤维状。纤维状是指由丝状的胶原蛋白成分构成的形状，或者丝状的细胞外基质成分在分子间交联而构成的形状。片段化细胞外基质成分的至少一部分可以是纤维状。纤维状的细胞外基质成分中包括多个丝状的细胞外基质分子集合而形成的细丝状物(细纤维)、细纤维进一步集合而形成的丝状物、将这些丝状物解纤而得到的物质等。在纤维状的细胞外基质成分中，RGD序列不被破坏而得以保存。
片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100nm以上且400μm以下，也可以为100nm以上且200μm以下。在一个实施方式中，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为5μm以上且400μm以下，可以为10μm以上且400μm以下，可以为22μm以上且400μm以下，也可以为100μm以上且400μm以下。在另一实施方式中，从使再分散性更进一步优异的观点出发，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100μm以下，可以为50μm以下，可以为30μm以下，可以为15μm以下，可以为10μm以下，也可以为1μm以下，且可以为100nm以上。片段化细胞外基质成分整体中，大部分的片段化细胞外基质成分的平均长度优选在上述数值范围内。具体而言，优选片段化细胞外基质成分整体中的95％的片段化细胞外基质成分的平均长度在上述数值范围内。片段化细胞外基质成分优选为平均长度在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选为平均长度在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。
片段化细胞外基质成分的平均直径可以为10nm以上且30μm以下，可以为30nm以上且30μm以下，可以为50nm以上且30μm以下，可以为100nm以上且30μm以下，可以为1μm以上且30μm以下，可以为2μm以上且30μm以下，可以为3μm以上且30μm以下，可以为4μm以上且30μm以下，也可以为5μm以上且30μm以下。片段化细胞外基质成分优选为平均直径在上述范围内的片段化胶原蛋白成分，更优选为平均直径在上述范围内的解纤胶原蛋白成分。
片段化细胞外基质成分的平均长度及平均直径可以通过利用光学显微镜测定各个片段化细胞外基质成分并进行图像分析而求出。在本说明书中，“平均长度”是指所测定的试样的长度方向的长度的平均值，“平均直径”是指与所测定的试样的长度方向正交的方向的长度的平均值。
片段化细胞外基质成分例如可以包含片段化胶原蛋白成分，也可以由片段化胶原蛋白成分构成。“片段化胶原蛋白成分”是指将纤维性胶原蛋白成分等胶原蛋白成分片段化而得到的成分，其维持了三重螺旋结构。片段化胶原蛋白成分的平均长度优选为100nm～200μm，更优选为22μm～200μm，更进一步优选为100μm～200μm。片段化胶原蛋白成分的平均直径优选为50nm～30μm，更优选为4μm～30μm，更进一步优选为20μm～30μm。
片段化细胞外基质成分中的至少一部分可以在分子间或分子内交联。细胞外基质成分可以在构成细胞外基质成分的细胞外基质分子的分子内或分子间交联。
作为进行交联的方法，例如可举出通过施加热、紫外线、放射线等进行的物理交联、利用交联剂、酶反应等进行的化学交联等方法，其方法没有特别限定。从不妨碍细胞生长的观点出发，优选物理交联。交联(物理交联及化学交联)可以是介由共价键的交联。
在细胞外基质成分包含胶原蛋白成分的情况下，交联可以在胶原蛋白分子(三重螺旋结构)之间形成，也可以在由胶原蛋白分子形成的胶原蛋白细纤维之间形成。交联可以是利用热进行的交联(热交联)。热交联例如可以通过使用真空泵在减压下进行加热处理来实施。在进行胶原蛋白成分的热交联的情况下，细胞外基质成分可以通过胶原蛋白分子的氨基与同一或其他胶原蛋白分子的羧基形成肽键(-NH-CO)而交联。
通过使用交联剂，也可以使细胞外基质成分交联。交联剂例如可以为能够使羧基与氨基交联的交联剂、或者能够使氨基彼此交联的交联剂。作为交联剂，例如从经济性、安全性及操作性的观点出发，优选醛类、碳二亚胺类、环氧化物类和咪唑系交联剂，具体而言，可举出戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺磺酸盐等水溶性碳二亚胺。
交联度的定量可以根据细胞外基质成分的种类、进行交联的手段等适当选择。交联度可以为1％以上、2％以上、4％以上、8％以上、或12％以上，且可以为30％以下、20％以下、或15％以下。通过使交联度在上述范围内，细胞外基质分子能够适度地分散，并且干燥保存后的再分散性良好。
在细胞外基质成分中的氨基用于交联的情况下，交联度可以通过TNBS(三硝基苯磺酸)法进行定量。通过TNBS法得到的交联度可以在上述的范围内。通过TNBS法得到的交联度是细胞外基质所具有的氨基中用于交联的氨基的比例。在细胞外基质成分包含胶原蛋白成分的情况下，优选通过TNBS法测定的交联度在上述范围内。
交联度也可以通过对羧基进行定量来计算。例如，在水不溶性的细胞外基质成分的情况下，也可以通过TBO(甲苯胺蓝O)法进行定量。通过TBO法得到的交联度也可以在上述的范围内。
以三维组织体(干燥重量)为基准，上述三维组织体中的细胞外基质成分含有率可以为0.01～90质量％、优选为10～90质量％、优选为10～80质量％、优选为10～70质量％、优选为10～60质量％、优选为1～50质量％、优选为10～50质量％、更优选为10～30质量％、更优选为20～30质量％。
在此，“三维组织体中的细胞外基质成分”是指构成三维组织体的细胞外基质成分，可以来源于内源性细胞外基质成分，也可以来源于外源性细胞外基质成分。
“内源性的细胞外基质成分”是指由细胞外基质产生细胞产生的细胞外基质成分。作为细胞外基质产生细胞，例如可举出上述的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞。内源性细胞外基质成分可以为纤维性，也可以为非纤维性。
“外源性的细胞外基质成分”是指从外部供给的细胞外基质成分。外源性的细胞外基质成分与作为来源的动物种的内源性的细胞外基质成分可以相同也可以不同。作为成为来源的动物种，例如可举出人、猪、牛等。另外，外源性的细胞外基质成分也可以是人工的细胞外基质成分。
在细胞外基质成分为胶原蛋白成分的情况下，外源性的细胞外基质成分也被称为“外源性胶原蛋白成分”，是指从外部供给的胶原蛋白成分。“外源性胶原蛋白成分”是由多个胶原蛋白分子形成的胶原蛋白分子的集合体，具体地可举出纤维性胶原蛋白、非纤维性胶原蛋白等。外源性胶原蛋白成分优选为纤维性胶原蛋白。上述纤维性胶原蛋白是指成为胶原蛋白纤维主成分的胶原蛋白成分，例如可举出I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、III型胶原蛋白。上述纤维性胶原蛋白可以使用市售的胶原蛋白，作为其具体例，可举出日本Ham株式会社制的猪皮来源的I型胶原蛋白。作为外源性的非纤维性胶原蛋白，例如可举出IV型胶原蛋白。
在外源性的细胞外基质成分中，所来源的动物种可以与细胞不同。另外，在细胞包含细胞外基质产生细胞的情况下，就外源性的细胞外基质成分而言，所来源的动物种可以与细胞外基质产生细胞不同。即，外源性的细胞外基质成分可以是异种细胞外基质成分。
即，在三维组织体包含内源性细胞外基质成分及片段化细胞外基质成分的情况下，构成上述三维组织体的细胞外基质成分含有率是指内源性细胞外基质成分和片段化细胞外基质成分的合计量。上述细胞外基质含有率可以根据所得到的三维组织体的体积和经脱细胞化的三维组织体的质量来计算。
例如，在三维组织体所含有的细胞外基质成分为胶原蛋白成分的情况下，作为对三维组织体中的胶原蛋白成分量进行定量的方法，例如可举出以下那样的对羟基脯氨酸进行定量的方法。在溶解有三维组织体的溶解液中混合盐酸(HCl)，在高温下孵育规定的时间后恢复至室温，将离心分离后的上清液稀释至规定的浓度，由此制备样品。将羟基脯氨酸标准溶液与样品同样地进行处理后，阶段性地进行稀释而制备标准溶液。对样品和标准溶液分别用羟基脯氨酸分析缓冲液和检测试剂进行规定的处理，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原蛋白成分量。需要说明的是，也可以将三维组织体直接悬浮在高浓度的盐酸中，将溶解后的溶解液离心分离而回收上清液，用于胶原蛋白成分定量。另外，所要溶解的三维组织体可以为直接从培养液中回收的状态，也可以在回收后进行干燥处理、在除去了液体成分的状态下使其溶解。但是，在将直接从培养液中回收的状态的三维组织体溶解而进行胶原蛋白成分定量的情况下，由于因三维组织体所吸收的培养基成分和实验手法的问题所引起的培养基残留的影响，预测三维组织体重量的测量值会发生偏差，因此从稳定地测量三维组织体的重量和每单位重量中所占的胶原蛋白成分量的观点出发，优选以干燥后的重量为基准。
作为对胶原蛋白成分量进行定量的方法，更具体而言，例如可举出以下方法。
(样品的制备)
将进行了冷冻干燥处理的三维组织体的总量与6mol/L HCl混合，用加热块在95℃下孵育20小时以上后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，回收样品溶液的上清液。在后述的测定中，用6mol/L HCl进行适当稀释以使结果收束在标准曲线的范围内后，用100μL的超纯水稀释200μL，由此制备样品。样品使用35μL。
(标准溶液的制备)
在螺口试管中加入125μL的标准溶液(1200μg/mL醋酸溶液)和125μL的12mol/lHCl进行混合，用加热块在95℃下孵育20小时后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，用超纯水稀释上清液，制作300μg/mL的S1，将S1阶段性地稀释，制作S2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)。也准备仅有4mol/HCl90μL的S8(0μg/mL)。
(分析)
将35μL的标准溶液和样品分别加入到平板(QuickZyme Total Collagen Assay试剂盒附带、QuickZyme Biosciences公司)中。将75μL的分析缓冲液(上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，摇动20分钟，同时在室温下进行孵育。剥离密封件，将75μL的检测试剂(detection reagent：reagent A：B＝30μL：45μL，上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，通过摇动混合溶液，在60℃下孵育60分钟。在冰上充分冷却，剥离密封件，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原蛋白成分量。
三维组织体中所占的胶原蛋白成分也可以通过其面积比或体积比来规定。“通过面积比或体积比来规定”是指，例如在使三维组织体中的胶原蛋白成分为能够通过已知的染色方法(例如使用了抗胶原蛋白抗体的免疫染色、或马松三色染色)等与其他组织构成物区别的状态的基础上，使用肉眼观察、各种显微镜和图像分析软件等，计算胶原蛋白成分的存在区域在整个三维组织体中所占的比率。在通过面积比规定的情况下，并不限定是通过三维组织体中的怎样的截面或表面来规定面积比，例如在三维组织体为球状体等的情况下，可以通过从其大致中心部通过的截面图来规定。
例如，在通过面积比规定三维组织体中的胶原蛋白成分的情况下，其面积的比例以上述三维组织体整体的面积为基准为0.01～99％，优选为1～99％，优选为5～90％，优选为7～90％，优选为20～90％，更优选为50～90％。关于“三维组织体中的胶原蛋白成分”，如上文所述。构成三维组织体的胶原蛋白成分的面积的比例是指将内源性胶原蛋白成分和外源性胶原蛋白成分合起来的面积的比例。胶原蛋白成分的面积的比例例如可以将所得到的三维组织体用马松三色染色，作为蓝色染色的胶原蛋白成分的面积相对于从三维组织体的大致中心部通过的截面的整体面积的比例来计算。
三维组织体在胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胰蛋白酶处理后的残留率优选为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的三维组织体在培养中或培养后不易发生由酶引起的分解，是稳定的。上述残留率例如可以根据胰蛋白酶处理前后的三维组织体的质量来计算。
上述三维组织体在胶原蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胶原蛋白酶处理后的残留率可以为70％以上，更优选为80％以上，更进一步优选为90％以上。这样的三维组织体不易在培养中或培养后发生由酶引起的分解，是稳定的。
将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育可以是例如将细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂及片段化细胞外基质成分的培养基中进行孵育(培养)。此时，例如可以使用预先含有片段化细胞外基质成分和TGFβ型I受体抑制剂的培养基，可以在含有片段化细胞外基质成分的培养基中添加TGFβ型I受体抑制剂，也可以在含有TGFβ型I受体抑制剂的培养基中添加片段化细胞外基质成分。
可以进一步包含在孵育前、在水性介质中使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分接触的工序。此时，TGFβ型I受体抑制剂可以包含在水性介质中，可以在孵育前添加，也可以在孵育中添加。水性介质可以与孵育时相同，也可以不同。通过在水性介质中使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分接触并进行孵育，片段化细胞外基质成分配置于上述细胞彼此的间隙中，能够制造细胞与片段化细胞外基质成分遍布整个三维组织体地三维地均匀分布的三维组织体。例如，在水性介质中使上述细胞和上述片段化细胞外基质成分接触并进行孵育后，也可以进一步在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育。在水性介质中使上述细胞和上述片段化细胞外基质成分接触并进行孵育的时间例如可以是12小时～72小时。
“水性介质”是指以水为必须构成成分的液体。作为水性介质，只要是片段化细胞外基质成分能够稳定地存在的介质，就没有特别限制。例如，作为水性介质，可举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)等生理盐水、Dulbecco’sModified Eagle培养基(DMEM)、血管内皮细胞专用培养基(EGM-2)等液体培养基，但不限于此。
水性介质的pH优选在不对细胞的生长及细胞集合体的形成产生不良影响的范围内。从减轻投入至细胞时对细胞的负荷的观点出发，水性介质的pH例如可以为7.0以上，且可以为8.0以下。具体而言，水性介质的pH可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。水性介质优选在上述pH的范围内具有缓冲能力，更优选为液体培养基。液体培养基没有特别限制，可以根据所要培养的细胞的种类选择适当的培养基。作为该培养基，例如可举出Eagle’s MEM培养基、DMEM、EGM-2、Modified Eagle培养基(MEM)、MinimumEssential培养基、RPMI、及GlutaMax培养基等。培养基可以是添加有血清的培养基，也可以是无血清培养基。此外，液体培养基也可以是混合有两种以上的培养基的混合培养基。
通过使片段化细胞外基质成分分散在水性介质中，在水性介质中变得容易与细胞接触，能够促进三维组织体的形成。作为接触工序，可举出将含有片段化细胞外基质成分的水性介质与含有细胞的水性介质混合的方法、在含有片段化细胞外基质成分的水性介质中添加细胞的方法、在含有细胞的培养液中加入含有细胞外基质成分的水性介质的方法、在含有细胞外基质细胞外基质成分的水性介质中加入细胞的方法、在预先准备的水性介质中分别加入细胞外基质成分及细胞的方法等方法，但不限于这些。
接触工序中的片段化细胞外基质成分的浓度可以根据目标三维组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当确定。例如，接触工序中的水性介质中的片段化细胞外基质成分的浓度可以为0.1～90质量％，也可以为1～30质量％。
接触工序中的片段化细胞外基质成分的量例如相对于1.0×106cells的细胞可以为0.1～100mg、0.5～50mg、0.8～25mg、1.0～10mg、1.0～5.0mg、1.0～2.0mg、或1.0～1.8mg，可以为0.7mg以上、1.1mg以上、1.2mg以上、1.3mg以上或1.4mg以上，且可以为7.0mg以下、3.0mg以下、2.3mg以下、1.8mg以下、1.7mg以下、1.6mg以下或1.5mg以下。
在接触工序中，片段化细胞外基质成分与细胞的质量比(片段化细胞外基质成分/细胞)优选为1/1～1000/1，更优选为9/1～900/1，进一步优选为10/1～500/1。
另外，接触工序中的片段化细胞外基质成分的量相对于培养基整体的重量可以为0.1重量％～10重量％、0.5重量％～8重量％、或1～5重量％。
三维组织体的制造方法的一个实施方式可以包含在接触工序、或接触工序后且孵育前将纤维蛋白原和凝血酶同时或分别混合的工序。通过将纤维蛋白原和凝血酶混合，它们将反应而形成纤维蛋白。纤维蛋白原的含量例如相对于培养基可以为1～10mg/mL、可以为2～8mg/mL、也可以为5～6mg/mL。
还可以进一步包含在接触工序后且孵育前使水性介质中的片段化细胞外基质成分与细胞一起沉降的工序。通过进行这样的工序，三维组织体中的片段化细胞外基质成分及细胞的分布变得更为均匀。作为具体的方法，没有特别限制，例如可举出对含有片段化细胞外基质成分和细胞的培养液进行离心操作的方法。
上述的孵育前的培养基中的细胞密度可以与接触工序中的水性介质中的细胞密度相同。
作为一个实施方式，本发明还提供一种脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化促进方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。如上所述，通过在TGFβ型I受体抑制剂的存在下对脂肪来源干细胞进行孵育，可以促进来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化。本实施方式的方法包括在组织体中包含来自人的脂肪来源干细胞的状态下促进分化，或者在以组织体中包含来自人的脂肪来源干细胞的方式形成组织体的状况下促进分化，由此能够制作最终包含血管内皮细胞的组织体。
本实施方式的方法只要通过使至少一部分来自人的脂肪来源干细胞与TGFβ型I受体抑制剂接触来促进分化即可，因此不仅在上述的三维组织体的制造中的三维培养中能够应用，在其他三维培养、二维培养中也能够应用。
另外，本实施方式的方法也可以是上述的三维组织体的制造方法中的来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化促进方法。
如上所述，通过将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂和VEGF的培养基中进行孵育，能够促进从脂肪干细胞向血管内皮细胞的分化和血管生成。即，本实施方式的方法也可以是血管生成促进方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在含有TGFβ型I受体抑制剂和VFGF的培养基中进行孵育(培养)的工序。血管生成促进可以是血管网形成促进。
组织体(包括三维组织体)、细胞、孵育、片段化细胞外基质成分及各工序等、本实施方式的方法中的具体方式等可以没有限制地适用上述的具体方式等。例如，在本实施方式的方法中，也可以包含在孵育前、在水性介质中使上述细胞与上述片段化细胞外基质成分接触的工序。
实施例
以下，基于实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。
组织体的制作中使用的细胞、试剂和制作方法等如下所述。
(细胞和胶原蛋白)
·原代人成熟脂肪细胞和人脂肪干细胞(ADSC)：通过后述的方法从人脂肪组织(来自大腿)(由京都府立医科大学附属医院提供)采集
·人脐带静脉来源血管内皮细胞(HUVEC)(Lonza公司制#C-2517A)
·解纤胶原蛋白成分(sCMF)(通过后述的方法制作的胶原蛋白成分)
(试剂、培养基和各种溶液)
·ALK5抑制剂：2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、CaymanChemical公司No.14794
·来自牛胰腺的胰岛素(Sigma公司#I1882)
·来自牛血浆的凝血酶冻干粉(Sigma公司#T4648)
·来自牛血浆的纤维蛋白原I-S型(Sigma公司#F8630)
·溶组织棱状芽胞杆菌(Clostridium Histolyticum)I型(Sigma公司#C 0130)
·DMEM(培养基)(高葡萄糖、Nacalai Tesque公司)
·EGM-2(培养基)：在500mL的EBM-2中混合EGM-2补充生长因子，(EGM-2supplement growth factors，factors(Lonza公司制#C-2517A))，在4℃下保存的培养基
·KBM(培养基)(Kohjin Bio公司)
·10mg/mL胰岛素储备液：将上述来自牛胰腺的胰岛素100mg溶解于用水稀释的1％冰醋酸溶液(pH≤2)10mL中，等量分注至微量离心管中，在-20℃下保存的培养基
·2mg/mL胶原酶溶液：使用如下得到的溶液：预先将BSA 2.5g与DMEM(0％FBS，1％抗生素)50mL混合。为了消化6孔板全部的脂肪组织，使用将胶原酶I型26mg混合到DMEM(0％FBS、5％BSA、1％抗生素)13mL中，用孔径为0.2μm的过滤器过滤。
·50mg/mL纤维蛋白原储备液：使用如下得到的溶液：称取纤维蛋白原50mg到微量离心管中，立即加入DMEM(0％FBS，1％抗生素)1mL。手动摇动管进行混合后，在37℃的水浴中放置3～5分钟，用孔径为0.2μm的过滤器过滤，等量分注到微量离心管。
·202U/mL凝血酶储备溶液：使用如下得到的溶液：称取凝血酶202U至微量离心管中，立即加入DMEM(0％FBS，1％抗生素)1mL，在37℃的水浴中放置3～5分钟使其溶解。然后，使用孔径为0.2μm的过滤器进行过滤，等量分注至微量离心管中。
(经解纤的胶原蛋白成分)
通过在200℃下对猪皮来源胶原蛋白I型海绵片段(日本Ham株式会社制)100mg进行24小时加热，得到至少一部分交联的胶原蛋白成分(交联胶原蛋白成分)。其中，在200℃的加热前后，胶原蛋白在外观上没有确认到大的变化。将交联胶原蛋白成分50mg放入15mL试管中，加入5mL的超纯水，使用均化器(AS ONE公司VH-10)进行6分钟的均化，由此对交联胶原蛋白成分进行解纤。
在21℃的条件下，以10000rpm离心10分钟。抽吸上清液，将胶原蛋白料粒(pellet)与5mL的新的超纯水混合，制作胶原蛋白溶液。在将装有胶原蛋白溶液的试管维持在冰上的状态下，使用超声发生器(Sonics and Materials公司VC50)以100V进行20秒的超声波处理，从超声发生器取出后将装有胶原蛋白溶液的试管在冰上冷却10秒，反复进行100次。进行100次超声波处理后，用孔径为40μm的过滤器过滤胶原蛋白溶液，得到含有经解纤的胶原蛋白成分(CMF)的分散液。通过利用常规方法使分散液冷冻干燥，得到干燥体形式的解纤胶原蛋白成分(CMF)。CMF的平均长度(长度)为14.8±8.2μm(N＝20)。
(成熟脂肪细胞和ADSC的采集方法)
用含有5％抗生素的PBS清洗人脂肪组织片段。将4～6g的组织分成6孔板的6孔份。在2mg/mL胶原酶溶液2mL中，使用剪刀和镊子细细地剪成大约1mm～3mm的尺寸。37℃和230rpm下孵育1小时后，用10mL移液管混合30分钟。将溶解物用孔径为500μm的铁筛网过滤器过滤，向每1孔中添加2mL的DMEM，将消化后的细胞全部回收后，在室温(15～25℃)下以200g离心3分钟。成熟脂肪细胞包含在上层黄色的油性层中，脂肪干细胞和血细胞包含在料粒中。使用长针和10mL注射器抽吸上层和下层之间的介质并废弃，用25mL的PBS(5％BSA、1％抗生素)清洗上层所含的成熟脂肪细胞以及下层所含的脂肪干细胞和血细胞两次。在进行清洗时，与上述同样地进行离心，由此分离为上层和下层以及上层与下层之间的介质这3层，抽吸上层与下层之间的介质并废弃。进行两次清洗后，用25mL的DMEM清洗。
仅采集包含成熟脂肪细胞的上层，分注到微量离心管中。通过Hoechst染色对核进行染色(经1000倍稀释的Hoechst、15分钟染色)，使用荧光显微镜在Turker Burk血细胞计数器上对细胞数进行计数。
将含有ADSC的料粒悬浮于DMEM 10mL中，接种于10cm培养皿内，进行传代培养。使用胰蛋白酶/EDTA将ADSC从培养皿分离，悬浮于DMEM 1mL中，对细胞数进行计数。
<组织体的制造>
制造例1
将分离得到的ADSC悬浮于含有0μM或5μM的ALK5抑制剂(2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、Cayman Chemical公司No.14794)的EGM-2 2mL或含有10％FBS的DMEM 2mL的培养基中，以10000cells/孔的浓度接种于24孔板(IWAKI制)，在37℃下进行孵育。
每2天更换一次培养基，接种后培养7天，得到组织体。
按照以下顺序进行组织体的荧光成像。使包含所得到的组织体的Transwell移动至24孔板。PBS2mL的清洗后，使用4％PFA 2mL在4℃的条件下固定组织过夜。使用PBS2mL清洗3次。使用0.05％Triton/PBS，在室温条件下对细胞进行7分钟的透过处理(Transwell内为500μL，Transwell外为500μL)，使用PBS2mL清洗3次。
使用1％BSA/PBS溶液，在室温条件下对组织进行1小时的封闭处理(Transwell内为500μL，Transwell外为500μL)。抽吸BSA溶液，添加一次抗体溶液(用1％BSA/PBS溶液稀释至100倍的抗CD31抗体)100μL(Transwell内为50μL，Transwell外为50μL)。在板下铺设湿纸巾，用铝箔覆盖，在4℃的条件下孵育过夜。使用PBS2mL清洗3次后，添加二次抗体溶液(用1％BSA/PBS溶液稀释至200倍的AlexaFluor 647标记抗小鼠IgG抗体和经1000倍稀释的Hoechst)100μL(Transwell内为50μL，Transwell外为50μL)。在板下铺设湿纸巾，用铝箔覆盖，在室温条件下孵育2小时后，使用PBS2mL清洗4次。
切断Transwell的膜，在含有少量PBS的玻璃底培养皿的底部直接配置凝胶，使用激光共聚焦扫描型显微镜(FV3000，奥林巴斯株式会社制)，将激光激发光设定为640nm(AlexaFluor647)观察染色后的组织体。
图1表示具有血管网的组织体的荧光观察结果(放大20倍)。(a)是在不含有ALK5抑制剂(ALK5i)的EGM-2培养基中培养的组织体，(b)是在含有5μM ALK5抑制剂的EGM-2培养基中培养的组织体，(c)是在含有10％FBS的DMEM中培养的组织体。(c)中，未确认到血管网的形成。与(a)进行比较，确认到(b)的组织体中与生物体组织同样地具有直径粗的血管(例如10μm以上且小于25μm)和细的血管(例如超过0μm且小于10μm)，形成有血管的分支数更多的血管网。
显示了通过在含有ALK5抑制剂的培养基中的培养，脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化得到促进。
制造例2
将分离得到的ADSC悬浮于含有0μM或5μM的ALK5抑制剂(2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、Cayman Chemical公司No.14794)的EGM-2培养基中，接种于10cm培养皿，在37℃下进行孵育。
每2天更换一次培养基，培养7天。然后，使用胰蛋白酶/EDTA将ADSC从培养皿分离，悬浮于DMEM 1mL中，对细胞数进行计数。进而，将回收的ADSC以1.0×105cells/培养皿、1.5×105cells/培养皿、2.0×105cells/培养皿的浓度接种于预先用基质胶涂布的24孔板中，在37℃下孵育24小时。然后，用相位差显微镜评价组织体的形态。图2表示所制造的组织体的相位差观察图像。无论ADSC的细胞数如何，在含有ALK5抑制剂(ALK5i)的EGM-2中培养的组织体与在不含有ALK5抑制剂的EGM-2中培养的组织体相比，观察到管腔形成更为进展。特别是，在ADSC的细胞数为1.5×105cells/mL以上的情况下，确认到形成有血管的分支数更多的血管网，由此启示了通过在含有ALK5抑制剂的培养基中的培养，脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化得到促进。
制造例3
将分离得到的ADSC悬浮于含有5μM的ALK5抑制剂(2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、Cayman Chemical公司No.14794)的EGM-2培养基中，接种于10cm培养皿，在37℃下进行孵育。每2天更换一次培养基，培养7天，得到组织体。然后，通过使用了0.25％胰蛋白酶的5分钟的孵育，将ADSC在保留细胞表面的蛋白的状态下温和剥离，从培养皿回收，悬浮于DMEM 1mL中，对细胞数进行计数。
通过使用了BD Facsmelody(注册商标)cellsorter(Beckton Dickinson公司制)的流式细胞仪分析，分析组织体中的血管内皮细胞的比率。对如上所述回收的组织体进行离心分离(100g、5分钟、4℃)。然后，加入用alexafluor647标记的抗CD31抗体(100×稀释)，将细胞悬浮液在4℃进一步孵育30分钟。然后，进行离心分离(100g、5分钟、4℃)，清洗细胞，将料粒化的细胞悬浮于缓冲液中，记录10,000个事件。此外，同时测定结合抗体(conjugateantibody)的同种型对照。然后，使用Flowjo(注册商标)Software(Beckton Dickinson公司)进行分析，求出CD31+细胞的比率。
将结果示于图3。(a)表示使用所制造的组织体的结果，(b)表示直接使用组织消化后分离的细胞的结果。(a)中可知，以从组织体回收的总细胞数为基准，29.29％为血管内皮细胞。另一方面，(b)中，仅1.20％为血管内皮细胞。
制造例4
将以2.5：1.5：1.5的比率(细胞数)使用成熟脂肪细胞、ADSC及ADSC来源血管内皮细胞制造的组织体(细胞球)、以及以2.5：3的比率(细胞数)使用成熟脂肪细胞及ADSC来源血管内皮细胞制造的组织体(细胞球)与以2.5：2：1的比率(细胞数)使用成熟脂肪细胞、ADSC及HUVEC同样地制造的组织体(细胞球)进行比较。任一组织体所使用的细胞的总细胞数为4.0×104cells/细胞球。成熟脂肪细胞和ADSC使用如上述(成熟脂肪细胞和ADSC的采集)中记载的那样分离得到的来自人的细胞。ADSC来源血管内皮细胞使用从制造例3中制备的组织体得到的细胞。
称取2.4mg sCMF，加入DMEM 1mL，温和混合，直至仅观察到sCMF的小粒子。在室温下以10000rpm离心1分钟，抽吸上清液，得到sCMF料粒。将ADSC和/或ADSC来源血管内皮细胞(比较例中进一步有HUVEC)温和地添加到sCMF料粒上，在室温下以3500rpm离心1分钟，抽吸上清液。添加纤维蛋白原(50mg/mL纤维蛋白原储备溶液32μL)，与细胞和sCMF温和混合。进而添加成熟脂肪细胞，温和混合。添加少量的DMEM，将总量调整为200μL。立即添加凝血酶(202U/mL凝血酶储备溶液3.9μL)，稍微混合后，在低粘附96孔板(IWAKI#4860-800LP)上按各孔5μL(1个细胞球的量)分别接种混合物(40个细胞球的量)。
在37℃的培养箱内孵育15分钟使其凝胶化，添加含有终浓度为10μg/mL的胰岛素的EGM-2 300μL。
培养24小时后，移至低粘附24孔板(IWAKI#4820-800LP)，添加2mL的上述EGM-2。每隔2～3天更换一次培养基，直至培养第7天。
按照以下顺序进行组织体的荧光成像。使包含所得到的组织体的Transwell移动到24孔板(IWAKI#4820-800LP)。PBS200μL的清洗后，使用4％PFA 200μL在4℃的条件下固定组织过夜。使用PBS200μL清洗3次。为了免疫染色，使用0.05％Triton/PBS200μL，在室温条件下对细胞进行7分钟的透过处理，使用PBS200μL清洗3次。
使用1％BSA/PBS溶液200μL，在室温条件下对组织进行1小时的封闭处理。抽吸BSA溶液，添加一次抗体溶液(用1％BSA/PBS溶液稀释至100倍的抗CD31抗体)100μL。在板下铺设湿纸巾，用铝箔覆盖，在4℃的条件下孵育过夜。使用PBS200μL清洗3次后，添加二次抗体溶液(用1％BSA/PBS溶液稀释至200倍的AlexaFluor 647标记抗小鼠IgG抗体)。在板下铺设湿纸巾，用铝箔覆盖，在室温条件下孵育2小时后，使用PBS 200μL清洗4次。
在共聚焦定量细胞成像仪CQ1(横河电机制造)的成品板(complete plate)上直接配置细胞球，使用上述共聚焦定量细胞成像仪CQ1，将激光激发光设定为640nm(AlexaFluor647)观察染色后的组织体。
图4表示基于CD31染色的具有血管网的细胞球的荧光观察结果。在使用了从在ALK5抑制剂作用下脂肪干细胞向血管内皮细胞的分化得到促进的组织体得到的血管内皮细胞的细胞球中，无论有无使用ADSC以及各种细胞的比率如何，都与使用HUVEC制作的组织体同样地形成了血管网。这些血管网形成至细胞球的内部。
制造例5
将分离得到的ADSC悬浮于含有0μM或5μM的ALK5抑制剂(2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、Cayman Chemical公司No.14794)的EGM-2培养基中，接种于10cm培养皿，在37℃下进行孵育。每2天更换一次培养基，培养7天，得到组织体。然后，通过使用了0.25％胰蛋白酶的5分钟的孵育，将ADSC在保留细胞表面的蛋白的状态下温和剥离，从培养皿回收，悬浮于DMEM 1mL中，对细胞数进行计数。
通过使用了BD Facsmelody(注册商标)cellsorter(Beckton Dickinson公司制)的流式细胞仪分析，分析样品中的血管内皮细胞的比率。将如上所述回收的样品离心分离(100g、5分钟、4℃)。然后，加入用alexa fluor647标记的抗CD31抗体(100×稀释)，将细胞悬浮液在4℃进一步孵育30分钟。然后，进行离心分离(100g、5分钟、4℃)，清洗细胞，将料粒化的细胞悬浮于缓冲液中，记录10,000个事件。此外，同时测定结合抗体的同种型对照。然后，使用Flowjo(注册商标)Software(Beckton Dickinson公司)进行分析，求出CD31+细胞的比率。
将结果示于图5。可知在含有5μM的ALK5抑制剂的EGM2培养基下培养的样品中，以所回收的总细胞数为基准，32.4％为血管内皮细胞。另一方面，在不含有ALK5抑制剂的EGM2培养基下培养的样品中，14.1％为血管内皮细胞，表明ALK5抑制剂显著地诱导了从ADSC向血管内皮细胞的分化。
将分离得到的ADSC悬浮于EGM-2培养基中，接种于10cm培养皿，在37℃下进行孵育。每2天更换一次培养基，培养7天，得到组织体。从该组织体回收包括ADSC、ADSC来源血管内皮细胞和血管内皮前体细胞在内的细胞。
将上述所回收的细胞、sCMF、纤维蛋白、成熟脂肪细胞和凝血酶用与制造例4同样的方法混合，在低粘附96孔板(IWAKI#4860-800LP)上按各孔5μL(1个细胞球的量)分别接种混合物(40个细胞球的量)。所使用的组织体(细胞球)的总细胞数为4.0×104cells/细胞球，以3：2.5的比率使用成熟脂肪细胞及上述所回收的细胞来制造。
将接种于低粘附96孔板的细胞球在37℃的培养箱内孵育15分钟，使其凝胶化，添加EGM-2或KBM 300μL。其中，上述EGM-2或KBM使用调整为含有终浓度为10μg/mL的胰岛素、5μM的ALK-5抑制剂(2-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-1,5-萘啶、Cayman Chemical公司No.14794)和0.5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的VEGF或1μg/mL的瘦蛋白的培养基。另外，作为对照，使用仅包含终浓度为10μg/mL的胰岛素和5μM的ALK-5抑制剂的EGM-2或KBM。
培养24小时后，移至低粘附24孔板(IWAKI#4820-800LP)，添加2mL的上述EGM-2或KBM。每隔2～3天更换一次培养基，直至培养第7天。
除了作为一次抗体溶液使用用1％BSA/PBS溶液稀释至100倍的抗血管性血友病因子(vWF)抗体、以及作为二次抗体溶液使用用1％BSA/PBS溶液稀释至200倍的AlexaFluor647标记抗兔IgG抗体溶液以外，与制造例4同样地进行组织体的荧光成像。vWF用作血管内皮细胞的标记物。另外，观察时，在共聚焦定量细胞成像仪CQ1(横河电机制)的成品板上直接配置细胞球，使用共聚焦定量细胞成像仪CQ1，将激光激发光设定为640nm，观察染色后的组织体。
将基于vWF染色的具有血管网的细胞球的荧光观察结果示于图6。在含有VEGF的培养基中培养的细胞球与在不含有VEGF的培养基中培养的对照的细胞球相比，形成了血管的分支数更多的血管网。另外，与在含有瘦蛋白的培养基中培养的细胞球相比，在含有VEGF的培养基中培养的细胞球也形成了血管的分支数更多的血管网。在添加有VEGF的培养基中培养的细胞球中，通过在使培养基中含有20ng/mL以上的VEGF的培养基中进行培养，形成了血管更多的血管网。
该结果表明，通过在培养基加入ALK-5抑制剂并添加VEGF，来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化和血管生成得到进一步促进。
制造例7
通过与制造例6同样的方法制造组织体(细胞球)。将所制造的组织体在低粘附96孔板(IWAKI#4860-800LP)上按各孔5μL(1个细胞球的量)分别接种混合物(40个细胞球的量)。
将接种于低粘附96孔板的细胞球在37℃的培养箱内孵育15分钟，使其凝胶化，添加含有终浓度为10μg/mL的胰岛素、5μM的AKL-5抑制剂和50ng/mL的VEGF的EGM-2 300μL。
培养24小时后，移至低粘附24孔板(IWAKI#4820-800LP)，添加2mL的上述EGM-2或KBM。每隔2～3天更换一次培养基，直至培养第7天。
除了使用各种一次抗体溶液及与它们对应的二次抗体溶液以外，与制造例4同样地进行组织体的荧光成像。一次抗体溶液使用用1％BSA/PBS溶液稀释至100倍的兔抗CD34抗体、用1％BSA/PBS溶液稀释至100倍的小鼠抗CD31、或用1％BSA/PBS溶液稀释至100倍的兔抗血管性血友病因子(vWF)抗体。二次抗体溶液使用用1％BSA/PBS溶液稀释至200倍的AlexaFluor546标记抗小鼠IgG抗体、用1％BSA/PBS溶液稀释至200倍的AlexaFluor647标记抗兔IgG抗体。CD34用作血管内皮前体细胞的标记物。CD31用作血管内皮前体细胞和血管内皮细胞的标记物。vWF用作血管内皮细胞的标记物。另外，也进行了基于Hoechst染色的核的染色。
观察时，在共聚焦定量细胞成像仪CQ1(横河电机制)的成品板上直接配置细胞球，使用共聚焦定量细胞成像仪CQ1观察染色后的组织体。将对AlexaFluor546的激光激发光设定为556nm，将对AlexaFluor647的激光激发光设定为640nm。
将其结果示于图7。通过VEGF在培养基中的添加，vWF阳性细胞相对于全部CD31阳性细胞的比例高于CD34阳性细胞的比例。即，在如上所述制造的细胞球中，血管内皮细胞数比血管内皮前体细胞数多。另外，还形成了血管网。
该结果表明，通过在培养基中加入ALK-5抑制剂并添加VEGF，来自人的脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化和血管生成得到进一步促进。

Claims (14)

1.一种包含血管内皮细胞的组织体的制造方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞不包含血管内皮细胞。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，在所述TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育是在含有所述TGFβ型I受体抑制剂的培养基中进行孵育，培养基中的所述TGFβ型I受体抑制剂的含量为1μM以上且10μM以下。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其中，孵育进行96小时以上且288小时以下。
5.根据权利要求1所述的制造方法，其包含将所述细胞与片段化细胞外基质成分一起在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
6.根据权利要求5所述的制造方法，其中，在所述组织体中，所述片段化细胞外基质成分配置于所述细胞彼此的间隙中。
7.根据权利要求5所述的制造方法，其中，所述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的制造方法，其进一步包含在孵育前、在水性介质中使所述细胞与所述片段化细胞外基质成分接触的工序。
9.一种脂肪来源干细胞向血管内皮细胞的分化促进方法，其包含将至少包含来自人的脂肪来源干细胞的细胞在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，在所述TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育是在含有所述TGFβ型I受体抑制剂的培养基中进行孵育，培养基中的所述TGFβ型I受体抑制剂的含量为1μM以上且10μM以下。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，孵育进行96小时以上且288小时以下。
12.根据权利要求9所述的方法，其包含将至少包含脂肪来源干细胞的细胞与片段化细胞外基质成分一起在TGFβ型I受体抑制剂的存在下进行孵育的工序。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述片段化细胞外基质成分为片段化胶原蛋白成分。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其进一步包含在孵育前、在水性介质中使所述细胞与所述片段化细胞外基质成分接触的工序。
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