WO2023074814A1 - 組織体の製造方法及びヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法 - Google Patents

組織体の製造方法及びヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法 Download PDF

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WO2023074814A1
WO2023074814A1 PCT/JP2022/040212 JP2022040212W WO2023074814A1 WO 2023074814 A1 WO2023074814 A1 WO 2023074814A1 JP 2022040212 W JP2022040212 W JP 2022040212W WO 2023074814 A1 WO2023074814 A1 WO 2023074814A1
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cells
extracellular matrix
tissue
medium
derived
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PCT/JP2022/040212
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史朗 北野
典弥 松▲崎▼
フィオナ ルイス
善弘 素輪
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凸版印刷株式会社
国立大学法人大阪大学
京都府公立大学法人
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing tissue bodies and a method for promoting the differentiation of human-derived adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells.
  • a three-dimensional tissue is formed by arranging cells coated with a film containing collagen three-dimensionally to form a three-dimensional tissue.
  • Patent Document 1 comprising mixing cells with a cationic substance and an extracellular matrix component to obtain a mixture, collecting cells from the obtained mixture, and forming cell aggregates on a substrate.
  • Patent Document 2 A method for producing a three-dimensional cell tissue (Patent Document 2) is known.
  • Patent Document 3 the present inventors have found a method for producing a large-sized three-dimensional tissue with a thickness of 1 mm or more with a relatively small number of cells by contacting cells with fragmented exogenous collagen
  • tissue bodies containing vascular endothelial cells are expected to be used as substitutes for experimental animals, transplant materials, and the like.
  • tissue bodies containing vascular endothelial cells are expected to be used as substitutes for experimental animals, transplant materials, and the like.
  • adipose-derived stem cells derived from other species such as bovine, allogeneic cells collected from different individuals even if they are the same human, etc. are used.
  • the human's autologous cells are used to produce the transplant material. Therefore, particularly when a tissue body is produced using human-derived adipose-derived stem cells, a method for promoting the differentiation of the adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells is desired.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to provide a method for promoting the differentiation of human-derived adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells in the production of tissues containing vascular endothelial cells. .
  • the present inventors found that incubation of human adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor promotes the differentiation of adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells. and completed the present invention.
  • the present invention includes, for example, the following inventions.
  • a method for producing tissue bodies containing vascular endothelial cells which comprises incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • Incubating in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor means incubating in a medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, the production method according to [1] or [2].
  • the production method according to any one of [1] to [4] which comprises incubating the cell with the fragmented extracellular matrix component in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • [6] The production method according to [5], wherein the fragmented extracellular matrix component is arranged in the interstices between the cells in the tissue.
  • a method for promoting differentiation of adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells comprising incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • Incubating in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor means incubating in a medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less.
  • the method of [12], wherein the fragmented extracellular matrix component is a fragmented collagen component.
  • the differentiation of human adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells is promoted.
  • By promoting differentiation into vascular endothelial cells it becomes possible to produce tissue bodies containing vascular endothelial cells in a short period of time.
  • FIG. 1 is a photograph showing the observation results of the tissue body produced in Production Example 1 by CD31 staining and Hoechst staining.
  • tissue body cultured in EGM-2 containing no ALK5 inhibitor (ALK5i) tissue body cultured in EGM-2 containing 5 ⁇ M ALK5 inhibitor,
  • 10% FBS It is a tissue body cultured in the containing DMEM medium.
  • White dots indicate nuclei (Hoechst staining).
  • FIG. 2 is a photograph showing observation results of the tissue body produced in Production Example 2 by CD31 staining.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of flow cytometric analysis of the ratio of vascular endothelial cells in the tissue produced in Production Example 3, and a table showing the ratio.
  • FIG. 4 is a photograph showing the result of comparing tissue bodies (cell balls) produced in Production Example 4.
  • FIG. The upper photograph shows the produced cell balls (plurality), the middle photograph shows the cell balls used for the CD31 staining analysis, and the lower photograph shows the fluorescence observation results of the cell balls having a vascular network stained with CD31.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of flow cytometric analysis of the ratio of vascular endothelial cells in the tissue produced in Production Example 5, and a table showing the ratio.
  • FIG. 6 is a set of photographs showing the results of comparing the formation of vascular networks by vWF staining in the tissues (cell balls) prepared in Production Example 6.
  • FIG. 7 is a photograph showing the observation results of the tissue body (cell ball) produced in Production Example 7.
  • the present invention provides a method for producing tissue bodies containing vascular endothelial cells, which comprises incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor. .
  • tissue means an aggregate of cells artificially produced by cell culture.
  • three-dimensional tissue means a cell aggregate (aggregate cell mass) in which cells are artificially produced by cell culture and arranged three-dimensionally.
  • cells are three-dimensionally arranged via the extracellular matrix component.
  • the shape of the tissue is not particularly limited, and examples thereof include sheet-like, spherical, substantially spherical, ellipsoidal, substantially ellipsoidal, hemispherical, substantially hemispherical, semicircular, substantially semicircular, and cuboidal shapes. , a substantially rectangular parallelepiped shape, and the like.
  • the biological tissue includes sweat glands, lymphatic vessels, sebaceous glands, etc., and has a more complicated structure than the tissue body. Therefore, tissue bodies and living tissues can be easily distinguished.
  • Cells as used herein are not particularly limited, but may be, for example, cells derived from mammals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, and rats.
  • the site of cell origin is not particularly limited, and may be somatic cells derived from bones, muscles, internal organs, nerves, brains, bones, skin, blood, or the like, or germ cells.
  • the cells may be stem cells, or cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells and cell line cells.
  • stem cell means a cell with self-renewal ability and pluripotency.
  • Stem cells include pluripotent stem cells that have the ability to differentiate into any cell type, and tissue stem cells (also called somatic stem cells) that have the ability to differentiate into specific cell types.
  • Pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem cells (ES cells), somatic cell-derived ES cells (ntES cells) and induced pluripotent stem cells (iPS cells).
  • Tissue stem cells include, for example, mesenchymal stem cells (eg, adipose-derived stem cells, bone marrow-derived stem cells), hematopoietic stem cells and neural stem cells.
  • Adipose-derived stem cells include, for example, human adipose-derived stem cells (ADSC).
  • the cells include at least human-derived adipose-derived stem cells.
  • Human-derived adipose-derived stem cells may be stem cells collected from human living tissue, such as human subcutaneous adipose tissue and epicardial-derived adipose tissue.
  • tissue body containing vascular endothelial cells produced by the method of the present embodiment is ultimately used as a tissue at a specific site in a human body, tissue derived from a tissue corresponding to the tissue at the site is used. is preferred.
  • cells include at least human-derived adipose-derived stem cells, but may further include cells other than adipose-derived stem cells.
  • cells other than adipose-derived stem cells include mature adipocytes, vascular endothelial cells, fibroblasts, chondrocytes, mesenchymal cells such as osteoblasts, colon cancer cells (e.g., human colon cancer cells (HT29 )), cancer cells such as liver cancer cells, cardiomyocytes, epithelial cells (e.g., human gingival epithelial cells), lymphatic endothelial cells, nerve cells, dendritic cells, hepatocytes, adhesive cells (e.g., immune cells ), smooth muscle cells (eg, aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)), pancreatic islet cells, keratinocytes (eg, human epidermal keratinocytes), and the like.
  • keratinocytes eg, human epidermal
  • Adipose-derived stem cells and/or mature adipocytes can be collected from living tissue by a conventional method, and can be collected, for example, as follows. Adipose tissue pieces are washed and cut and digested with collagenase (eg, incubated at 37° C. for 1 hour). After that, the digested cells are collected by filtration or the like, and centrifuged to separate into an upper yellow oily layer containing mature adipocytes and a lower pellet containing adipose stem cells and blood cells. Mature adipocytes can be collected by collecting only the upper layer, and ADSCs can be collected by collecting only the pellet.
  • vascular endothelial cells means flat cells that form the surface of the lumen of blood vessels.
  • Vascular endothelial cells include, for example, human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC). Whether adipose stem cells are differentiated into vascular endothelial cells can be confirmed by, for example, immunostaining using vascular endothelial cell markers such as CD31, von Willebrand factor (vWF) and VE-cadherin, flow cytometric analysis, and the like. can do.
  • vascular endothelial cell markers such as CD31, von Willebrand factor (vWF) and VE-cadherin, flow cytometric analysis, and the like.
  • the content of vascular endothelial cells in the tissue is, for example, 5% or more, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, or 30% or more of the total number of cells in the tissue. Well, it may be 95% or less, 90% or less, 80% or less, or 75% or less. From the viewpoint that the effect of the present invention becomes more pronounced, the content of vascular endothelial cells in cells containing at least adipose-derived stem cells, i.e., cells before incubation, is 10% or less, 5% or less relative to the total number of cells before incubation. , or 1 or less.
  • the tissue may have a vascular network between cells.
  • a vascular network When a vascular network is formed between cells, it is expected that the tissue can be maintained for a long period of time, and that the tissue will be easier to engraft when transplanted into a mammal or the like.
  • Having a vascular network between cells means having a structure in which branched blood vessels extend between cells so as to surround cells, similar to living tissue. Whether or not a vascular network similar to that of the living tissue is formed is determined based on, for example, the number of branched blood vessels and/or the diversity of the length between branched blood vessels and/or the diameter of the blood vessels in the living tissue. can be done. For example, when the average value of the branching number of blood vessels in the tissue is 80% or more and 150% or less, 85% or more and 130% or less, or 90% or more and 120% or less with respect to the average value of the blood vessel branching number in the living tissue.
  • the number of branches is similar to the number of branches of blood vessels in living tissue. Further, for example, when the average value of the branching number of blood vessels in the tissue is 2.5 or more and 4.5 or less, or 3.0 or more and 4.2 or less, it is similar to the number of blood vessels branching in the biological tissue. You can judge that there is For example, the average value of the length between branches of blood vessels in tissue is 80% or more and 150% or less, 85% or more and 130% or less, and 90% or more with respect to the average value of the length between branches of blood vessels in living tissue. If it is 120% or less, it may be determined that the length is similar to the length between branches of blood vessels in living tissue. Both large and small blood vessels are observed in living tissue.
  • tissue body containing vascular endothelial cells preferably has a vascular network between the vascular endothelial cells.
  • vascular endothelial cells surrounded by blood vessels close to living tissue.
  • the living tissue and tissue body are compared under the same conditions (for example, per fixed volume, per fixed area in the case of image analysis, per fixed sample, etc.).
  • the tissue body may further contain cells other than vascular endothelial cells.
  • cells other than vascular endothelial cells include mesenchymal cells such as mature adipocytes, fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts, colon cancer cells (e.g., human colon cancer cells (HT29)), and liver cells.
  • Cancer cells such as cancer cells, cardiomyocytes, epithelial cells (e.g., human gingival epithelial cells), lymphatic endothelial cells, nerve cells, dendritic cells, hepatocytes, adhesive cells (e.g., immune cells), smooth muscle cells (eg, aortic smooth muscle cells (Aorta-SMC)), pancreatic islet cells, keratinocytes (eg, human epidermal keratinocytes), and the like.
  • the present invention has the effect of promoting the differentiation of adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells, the effect of the present invention becomes more pronounced. It is preferably 10% or less, more preferably 5% or less of the number of cells, and still more preferably does not contain adipose-derived stem cells.
  • lipid droplets can be used as an indicator of the maturity of fat cells.
  • Lipid droplets are intracellular organelles that store lipids such as triglycerides (neutral fats) and cholesterol.
  • lipids such as triglycerides (neutral fats) and cholesterol.
  • adipose tissue-specific proteins such as perilipin
  • adipocyte means all adipocytes other than adipose-derived stem cells, and includes mature adipocytes and adipocytes that are not included in adipose-derived stem cells.
  • the thickness of the tissue body is preferably 10 ⁇ m or more, more preferably 100 ⁇ m or more, and even more preferably 1000 ⁇ m or more.
  • a tissue body has a structure closer to that of a living tissue, and is suitable as a substitute for laboratory animals and as a transplant material.
  • the upper limit of the thickness of the tissue is not particularly limited, but may be, for example, 10 mm or less, 3 mm or less, 2 mm or less, or 1.5 mm or less. It may be 1 mm or less.
  • the thickness of the tissue means the distance between both ends in the direction perpendicular to the main surface when the tissue is sheet-like or cuboid-like.
  • the thickness means the distance at the thinnest part of the main surface.
  • the tissue when the tissue is spherical or approximately spherical, it means its diameter.
  • the tissue when the tissue is ellipsoidal or substantially ellipsoidal, it means the minor axis thereof.
  • the thickness is the shortest distance between two points where the surface intersects the straight line passing through the center of gravity of the tissue. means
  • the method of this embodiment includes incubating cells containing at least human adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor. Incubation in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor promotes the differentiation of human-derived adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells. In the method of the present embodiment, differentiation is promoted in a state where adipose-derived stem cells are contained in tissue bodies, or differentiation is promoted in a situation where tissue bodies are formed such that adipose-derived stem cells are contained in tissue bodies. Thus, a tissue body containing vascular endothelial cells can be finally produced.
  • tissue bodies may include incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor. It may be cultured.
  • the tissue body may be obtained, for example, by incubating cells containing at least human adipose-derived stem cells in a medium, and incubating the cells while suspending them in the medium in the absence of a scaffold. It may be obtained by suspension culture, or may be obtained by adherent culture in which the cells are attached to a scaffold such as a gel or sheet and incubated. obtained by incubating the cells with an extracellular matrix in the medium.
  • Incubating cells containing at least adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be performed by incubating only cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and cells and extracellular matrix components are It may be incubated in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in a mixed state, and incubated in the presence of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in a state where an tissue body containing cells and extracellular matrix components is formed. good too.
  • TGF ⁇ type I receptor inhibitors include inhibitors of ALK5, ALK2, ALK4 and ALK7, which are TGF ⁇ R1 kinases.
  • the TGF ⁇ type I receptor inhibitor is not particularly limited as long as it has an inhibitory effect on the TGF ⁇ type I receptor.
  • ALK5, ALK4 and ALK7 inhibitors include, for example, 4-[4-(1,3-benzodioxyol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide
  • ALK5 inhibitors include, for example, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, 2-(3-(6-methyl Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine, hydrochloride, N-(2-fluorophenyl)-4-([1,2,4]triazolo[1,5- a]pyridin-6-yl)-5-(6-methyl-2-pyridyl)-1H-imidazole-2-methanamine and the like.
  • Incubating in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor means, for example, incubating (cultivating) cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in a medium containing a TGF ⁇ type I receptor inhibitor. good.
  • the medium may be a solid medium or a liquid medium, preferably a liquid medium.
  • the medium include Eagle's MEM medium, DMEM, vascular endothelial cell-only medium (EGM-2), Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, KBM medium, and GlutaMax medium.
  • the liquid medium may be in the form of a gel such as fibrin gel, hydrogel, matrigel, collagen gel and gelatin gel. Cells may be added to a gelled liquid medium, or a liquid medium containing cells may be gelled before use.
  • the medium may be a serum-supplemented medium or a serum-free medium.
  • the medium may be a mixed medium in which two types of medium are mixed.
  • the amount of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be an amount sufficient for each adipose-derived stem cell to come into contact with the inhibitor. ⁇ 11 mol to 2.0 ⁇ 10 ⁇ 8 mol, or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol to 2.0 ⁇ 10 ⁇ 8 mol, for example, for 5 ⁇ 10 6 cells of adipose-derived stem cells, It may be from 1.0 ⁇ 10 ⁇ 10 mol to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 mol, or from 5.0 ⁇ 10 ⁇ 9 mol to 1.0 ⁇ 10 ⁇ 7 mol.
  • the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be, for example, 6.0 ng to 6.0 ⁇ g, or 300 ng to 6.0 ⁇ g, for 1 ⁇ 10 6 cells of adipose-derived stem cells. It may be 30 ng to 30 ⁇ g, or 1500 ng to 30 ⁇ g for ⁇ 10 6 cells.
  • the content of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor in the medium is, for example, 0.1 ⁇ M or more and 100 ⁇ M or less. , 0.5 ⁇ M or more and 50 ⁇ M or less, 1 ⁇ M or more and 10 ⁇ M or less, or 2 ⁇ M or more and 8 ⁇ M or less; 20 ⁇ M or less, 15 ⁇ M or less, 12 ⁇ M or less, 10 ⁇ M or less, 8 ⁇ M or less, or 7 ⁇ M or less.
  • the cell density in the medium before incubation can be appropriately determined according to the shape and thickness of the tissue of interest, the size of the incubator, and the like.
  • the cell density in the medium can be 1-10 8 cells/mL, 10 3 -10 7 cells/mL.
  • Incubation is not particularly limited, and can be carried out under suitable conditions according to the type of cells to be cultured.
  • the incubation temperature may be 20°C to 40°C, or 30°C to 37°C.
  • the pH of the medium may be 6-8, or 7.2-7.4.
  • the incubation time may be 24 hours or more and 336 hours or less, 72 hours or more and 336 hours or less, or 96 hours or more and 288 hours or less.
  • the incubation time after the addition of the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be 24 hours or more and 336 hours or less, 72 hours or more and 336 hours or less, or 96 hours or more and 288 hours or less.
  • the incubator (support) used for cell culture is not particularly limited, and may be, for example, a well insert, a low-adhesion plate, or a plate having a U-shaped or V-shaped bottom surface.
  • the cells may be cultured while adhered to the support, the cells may be cultured without being adhered to the support, or the cells may be separated from the support during culture and cultured.
  • a U-shaped or V-shaped bottom surface that inhibits adhesion of the cells to the support is used. It is preferable to use a plate with a low adsorption or a low adsorption plate.
  • the medium contains vascular endothelial cell growth factor (VEGF) may be included.
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • a medium containing VEGF and a TGF ⁇ type I receptor inhibitor in advance may be used, a TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be added to a medium containing VEGF, and a TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be added to the medium containing VEGF.
  • VEGF may be added to the medium containing the agent.
  • adipose-derived stem cells By incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in a medium containing a TGF ⁇ type I receptor inhibitor and VEGF, the differentiation of adipose stem cells into vascular endothelial cells is further promoted. In addition, by incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in a medium containing a TGF ⁇ type I receptor inhibitor and VEGF, angiogenesis can be promoted. It can be manufactured more easily.
  • the content of VEGF in the medium is, for example, 0.5 ng/mL or more and 100 ng/mL or less, 1 ng/mL or more and 85 ng/mL.
  • 6 ng/mL or more and 80 ng/mL or less, 10 ng/mL or more and 70 ng/mL or less, or 20 ng/mL or more and 50 ng/mL or less; 6 ng/mL or more, 10 ng/mL or more, 15 ng/mL or more, may be 20 ng/mL or more, 100 ng/mL or less, 90 ng/mL or less, 80 ng/mL or less, 70 ng/mL or less, 60 ng/mL or less or 50 ng/mL or less.
  • the method of the present embodiment may comprise incubating cells containing at least human adipose-derived stem cells with fragmented extracellular matrix components in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • a TGF ⁇ type I receptor inhibitor By incubating with the fragmented extracellular matrix component, it is possible to obtain a three-dimensional tissue in which cells are three-dimensionally arranged via the fragmented extracellular matrix component. It is preferable that the fragmented extracellular matrix component is a three-dimensional tissue that is arranged in the interstices between the cells. Cells among cells may be allogeneic cells or heterologous cells.
  • the fragmented extracellular matrix component may be added to the medium at the same time as the TGF ⁇ type I receptor inhibitor, and may be added to the medium prior to the TGF ⁇ type I receptor inhibitor. It may be added to the medium or may be added to the medium after the TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • Extracellular matrix component refers to an aggregate of extracellular matrix molecules formed by a plurality of extracellular matrix molecules.
  • Extracellular matrix means a substance that exists outside cells in an organism. Any substance can be used as the extracellular matrix as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates. Specific examples include, but are not limited to, collagen, elastin, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, laminin, vitronectin, tenascin, entactin and fibrillin. These extracellular matrix components may be used singly or in combination.
  • the extracellular matrix component may, for example, contain or be a collagen component.
  • the extracellular matrix component in the present embodiment is preferably a substance existing outside animal cells, that is, an animal extracellular matrix component.
  • the extracellular matrix molecule may be a modification or variant of the above extracellular matrix molecule, or a polypeptide such as a chemically synthesized peptide, as long as it does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates. good.
  • the extracellular matrix molecule may have repeats of the Gly-XY sequence characteristic of collagen.
  • Gly represents a glycine residue
  • X and Y each independently represent any amino acid residue.
  • a plurality of Gly-XY may be the same or different.
  • the proportion of the sequence represented by Gly-XY in the total amino acid sequence may be 80% or more, preferably 95%. That's it.
  • the extracellular matrix molecule may be a polypeptide having an RGD sequence.
  • the RGD sequence refers to a sequence represented by Arg-Gly-Asp (arginine residue-glycine residue-aspartic acid residue). Having an RGD sequence further promotes cell adhesion, making it more suitable as a scaffold material for cell culture, for example.
  • Extracellular matrix molecules containing a sequence represented by Gly-XY and an RGD sequence include collagen, fibronectin, vitronectin, laminin, cadherin and the like.
  • Collagen includes, for example, fibrous collagen and non-fibrous collagen.
  • Fibrous collagen means collagen that is the main component of collagen fibers, and specifically includes type I collagen, type II collagen, type III collagen, and the like.
  • Non-fibrillar collagens include, for example, type IV collagen.
  • Proteoglycans include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycans, heparan sulfate proteoglycans, keratan sulfate proteoglycans, and dermatan sulfate proteoglycans.
  • the extracellular matrix component may contain at least one selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin, and preferably contains collagen, since the effects of the present invention are more pronounced.
  • the collagen is preferably fibrillar collagen, more preferably type I collagen.
  • Commercially available collagen may be used as the fibrillar collagen, and a specific example thereof is porcine skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • the extracellular matrix component may be an animal-derived extracellular matrix component.
  • animal species from which extracellular matrix components are derived include, but are not limited to, humans, pigs, and bovines.
  • As the extracellular matrix component a component derived from one kind of animal may be used, or a combination of components derived from a plurality of kinds of animals may be used.
  • Fragmentation means reducing the size of aggregates of extracellular matrix molecules to a smaller size. Fragmentation may be performed under conditions that cleave bonds within extracellular matrix molecules, or under conditions that do not cleave bonds within extracellular matrix molecules. Extracellular matrices that have been fragmented by the application of physical force usually do not change their molecular structure (the molecular structure is maintained) unlike enzymatic treatment. Fragmented extracellular matrix components may contain defibrated extracellular matrix components (fibrillated extracellular matrix components), which are components obtained by defibrating the above-described extracellular matrix components by applying physical force. . Defibrillation is one mode of fragmentation, and is performed under conditions that do not break bonds within extracellular matrix molecules, for example.
  • the method for fragmenting extracellular matrix components is not particularly limited.
  • the extracellular matrix components may be defibrated by applying physical force using an ultrasonic homogenizer, a stirring homogenizer, a high-pressure homogenizer, or the like.
  • the extracellular matrix components may be homogenized as they are, or may be homogenized in an aqueous medium such as physiological saline. It is also possible to obtain millimetre-size and nanometer-size fibrillated extracellular matrix components by adjusting the homogenization time, number of times, and the like.
  • the defibrated extracellular matrix component can also be obtained by defibrating by repeating freezing and thawing.
  • the fragmented extracellular matrix component may at least partially contain a defibrated extracellular matrix component. Moreover, the fragmented extracellular matrix component may consist of only the defibrated extracellular matrix component. That is, the fragmented extracellular matrix component may be a defibrated extracellular matrix component.
  • the defibrated extracellular matrix component preferably contains a fibrillated collagen component (fibrillated collagen component).
  • the defibrated collagen component preferably maintains the triple helical structure derived from collagen.
  • the defibrillated collagen component may be a component that partially maintains the triple helical structure derived from collagen.
  • the shape of the fragmented extracellular matrix component includes, for example, a fibrous shape.
  • the fibrous shape means a shape composed of filamentous collagen components or a shape composed of filamentous extracellular matrix components crosslinked between molecules. At least some of the fragmented extracellular matrix components may be fibrous.
  • Fibrous extracellular matrix components include thin filaments (fibrils) formed by aggregation of multiple filamentous extracellular matrix molecules, filaments formed by further aggregation of filaments, and these filaments. Including defibrated ones. The RGD sequence is preserved without disruption in the fibrous extracellular matrix component.
  • the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 100 nm or more and 400 ⁇ m or less, and may be 100 nm or more and 200 ⁇ m or less. In one embodiment, the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 5 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 10 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, 22 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or more and 400 ⁇ m or less. good. In another embodiment, the average length of the fragmented extracellular matrix component may be 100 ⁇ m or less, 50 ⁇ m or less, or 30 ⁇ m or less from the viewpoint of further excellent redispersibility.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average length within the above range, and more preferably a fibrillated collagen component having an average length within the above range.
  • the average diameter of the fragmented extracellular matrix component may be 10 nm or more and 30 ⁇ m or less, 30 nm or more and 30 ⁇ m or less, 50 nm or more and 30 ⁇ m or less, 100 nm or more and 30 ⁇ m or less, or 1 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less. 2 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 3 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, 4 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less, or 5 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the fragmented extracellular matrix component is preferably a fragmented collagen component having an average diameter within the above range, and more preferably a fibrillated collagen component having an average diameter within the above range.
  • the average length and average diameter of the fragmented extracellular matrix components can be determined by measuring individual fragmented extracellular matrix components with an optical microscope and analyzing the images.
  • average length means the average length of the measured sample in the longitudinal direction
  • average diameter means the average length of the measured sample in the direction orthogonal to the longitudinal direction. means.
  • the fragmented extracellular matrix component may contain, for example, a fragmented collagen component or consist of a fragmented collagen component.
  • the “fragmented collagen component” means a fragmented collagen component such as a fibrillar collagen component that maintains a triple helical structure.
  • the average length of the fragmented collagen component is preferably 100 nm to 200 ⁇ m, more preferably 22 ⁇ m to 200 ⁇ m, even more preferably 100 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the average diameter of the fragmented collagen component is preferably 50 nm to 30 ⁇ m, more preferably 4 ⁇ m to 30 ⁇ m, even more preferably 20 ⁇ m to 30 ⁇ m.
  • At least part of the fragmented extracellular matrix components may be crosslinked intermolecularly or intramolecularly.
  • the extracellular matrix component may be intramolecularly or intermolecularly crosslinked with the extracellular matrix molecules that make up the extracellular matrix component.
  • cross-linking methods include physical cross-linking by applying heat, ultraviolet rays, radiation, etc., and chemical cross-linking by cross-linking agents, enzymatic reactions, etc., but the method is not particularly limited. Physical cross-linking is preferred from the standpoint of not interfering with cell growth. Cross-linking (physical cross-linking and chemical cross-linking) may be cross-linking via covalent bonds.
  • the crosslinks may be formed between collagen molecules (triple helix structure) or between collagen fibrils formed by the collagen molecules.
  • the cross-linking may be thermal cross-linking (thermal cross-linking). Thermal crosslinking can be performed, for example, by heat treatment under reduced pressure using a vacuum pump.
  • the extracellular matrix component is crosslinked by forming a peptide bond (-NH-CO-) between the amino group of the collagen molecule and the carboxyl group of the same or another collagen molecule. you can
  • the extracellular matrix component can also be crosslinked by using a crosslinker.
  • the cross-linking agent may be, for example, one capable of cross-linking carboxyl groups and amino groups, or one capable of cross-linking amino groups.
  • As the crosslinking agent for example, aldehyde-based, carbodiimide-based, epoxide-based and imidazole-based crosslinking agents are preferable from the viewpoint of economy, safety and operability.
  • glutaraldehyde 1-ethyl-3-(3 -dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide sulfonate, and other water-soluble carbodiimides.
  • the quantification of the degree of cross-linking can be appropriately selected according to the type of extracellular matrix component, cross-linking means, and the like.
  • the degree of cross-linking may be 1% or more, 2% or more, 4% or more, 8% or more, or 12% or more, and may be 30% or less, 20% or less, or 15% or less.
  • the degree of cross-linking is within the above range, the extracellular matrix molecules can be appropriately dispersed, and the redispersibility after dry storage is good.
  • the degree of cross-linking can be quantified based on the TNBS (trinitrobenzenesulfonic acid) method.
  • the degree of cross-linking by the TNBS method may be within the range described above.
  • the degree of cross-linking by the TNBS method is the proportion of amino groups used for cross-linking among the amino groups in the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix component contains a collagen component
  • the degree of cross-linking measured by the TNBS method is preferably within the above range.
  • the degree of cross-linking may be calculated by quantifying the carboxyl groups.
  • water-insoluble extracellular matrix components may be quantified by the TBO (toluidine blue O) method.
  • the degree of cross-linking by the TBO method may be within the range described above.
  • the content of extracellular matrix components in the three-dimensional tissue may be 0.01 to 90% by mass, preferably 10 to 90% by mass, preferably 10 to 90% by mass, based on the three-dimensional tissue (dry weight). It is preferably 80% by mass, preferably 10 to 70% by mass, preferably 10 to 60% by mass, preferably 1 to 50% by mass, preferably 10 to 50% by mass. is preferred, 10 to 30 mass % is more preferred, and 20 to 30 mass % is more preferred.
  • extracellular matrix component in the three-dimensional tissue means an extracellular matrix component that constitutes the three-dimensional tissue, and may be derived from endogenous extracellular matrix components or exogenous extracellular matrix components. It may be derived from matrix components.
  • Endogenous extracellular matrix components means extracellular matrix components produced by extracellular matrix-producing cells.
  • extracellular matrix-producing cells include mesenchymal cells such as fibroblasts, chondrocytes, and osteoblasts described above. Endogenous extracellular matrix components may be fibrous or non-fibrous.
  • Exogenous extracellular matrix component means an extracellular matrix component supplied from the outside. Exogenous extracellular matrix components may be derived from the same or different animal species as endogenous extracellular matrix components. Examples of animal species from which it is derived include humans, pigs, and bovines. Exogenous extracellular matrix components may also be artificial extracellular matrix components.
  • the extrinsic extracellular matrix component is also referred to as an "exogenous collagen component", and the term “exogenous collagen component”, which means a collagen component supplied from the outside, includes a plurality of collagen components. It is an aggregate of collagen molecules formed by the collagen molecules of , and specifically includes fibrillar collagen, non-fibrillar collagen, and the like.
  • the exogenous collagen component is fibrillar collagen.
  • the fibrillar collagen means a collagen component that is the main component of collagen fibers, and examples thereof include type I collagen, type II collagen, and type III collagen.
  • Commercially available collagen may be used as the fibrillar collagen, and specific examples thereof include porcine skin-derived type I collagen manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.
  • Exogenous non-fibrillar collagens include, for example, type IV collagen.
  • the animal species from which the exogenous extracellular matrix component is derived may be different from the cell. Moreover, when the cells contain extracellular matrix-producing cells, the animal species from which the exogenous extracellular matrix component is derived may be different from the extracellular matrix-producing cells. Thus, an exogenous extracellular matrix component may be a heterologous extracellular matrix component.
  • the content of extracellular matrix components constituting the three-dimensional tissue is the endogenous extracellular matrix component and the fragmented cell means the total amount of outer matrix components.
  • the extracellular matrix content can be calculated from the volume of the obtained three-dimensional tissue and the mass of the decellularized three-dimensional tissue.
  • the method for quantifying the amount of collagen component in the three-dimensional tissue includes, for example, the following method for quantifying hydroxyproline.
  • a sample is prepared by mixing hydrochloric acid (HCl) with a solution in which a three-dimensional tissue is dissolved, incubating at a high temperature for a predetermined time, returning to room temperature, and diluting the centrifuged supernatant to a predetermined concentration. After treating the hydroxyproline standard solution in the same manner as the sample, prepare the standard by serially diluting it. Each sample and standard is treated with a hydroxyproline assay buffer and a detection reagent, and the absorbance at 570 nm is measured.
  • the amount of collagen component is calculated by comparing the absorbance of the sample with the standard.
  • the three-dimensional tissue may be directly suspended in high-concentration hydrochloric acid, and the dissolved solution may be centrifuged to recover the supernatant, which may be used to quantify the collagen component.
  • the three-dimensional tissue to be dissolved may be in a state as it is recovered from the culture medium, or may be dissolved in a state in which a liquid component is removed by performing a drying treatment after recovery.
  • the weight after drying is used as the standard. preferably.
  • examples of the method for quantifying the amount of collagen components include the following methods.
  • sample preparation The whole amount of the freeze-dried three-dimensional tissue is mixed with 6 mol/L HCl, incubated in a heat block at 95° C. for 20 hours or more, and then returned to room temperature. After centrifugation at 13000 g for 10 minutes, the supernatant of the sample solution is recovered. After appropriately diluting with 6 mol/L HCl so that the results in the measurement described below fall within the range of the calibration curve, a sample is prepared by diluting 200 ⁇ L with 100 ⁇ L of ultrapure water. 35 ⁇ L of sample is used.
  • the collagen component occupying the three-dimensional tissue may be defined by its area ratio or volume ratio.
  • "Define by area ratio or volume ratio” means, for example, collagen components in the three-dimensional tissue by known staining techniques (e.g., immunostaining using anti-collagen antibody, or Masson's trichrome staining) Other tissues It means calculating the ratio of the existing area of the collagen component to the entire three-dimensional tissue body by using macroscopic observation, various microscopes, image analysis software, etc. after making it distinguishable from the structure.
  • the area ratio it is not limited by any cross section or surface in the three-dimensional tissue, but for example, when the three-dimensional tissue is a spherical body etc., it passes through the approximate center It may be defined by a cross-sectional view.
  • the ratio of the area is 0.01 to 99% based on the total area of the three-dimensional tissue, and 1 to 99%. preferably 5 to 90%, preferably 7 to 90%, preferably 20 to 90%, more preferably 50 to 90%.
  • the “collagen component in the three-dimensional tissue” is as described above.
  • the ratio of the area of the collagen component that constitutes the three-dimensional tissue refers to the ratio of the total area of the endogenous collagen component and the exogenous collagen component.
  • the ratio of the area of the collagen component is obtained, for example, by staining the obtained three-dimensional tissue with Masson's trichrome, and comparing the area of the blue-stained collagen component to the total area of the cross section passing through the approximate center of the three-dimensional tissue. It can be calculated as a percentage.
  • the three-dimensional tissue has a trypsin concentration of 0.25%, a temperature of 37° C., a pH of 7.4, and a reaction time of 15 minutes. It is more preferably 90% or more, and even more preferably 90% or more. Such a three-dimensional tissue is stable and resistant to enzymatic degradation during or after culturing.
  • the survival rate can be calculated, for example, from the mass of the three-dimensional tissue before and after trypsinization.
  • the three-dimensional tissue may have a residual rate of 70% or more after collagenase treatment at a collagenase concentration of 0.25%, a temperature of 37 ° C., pH 7.4, and a reaction time of 15 minutes, or 80% or more. is more preferable, and 90% or more is even more preferable.
  • Such a three-dimensional tissue is stable and resistant to enzymatic degradation during or after culturing.
  • Incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells with a fragmented extracellular matrix component in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor means, for example, that the cells are treated with a TGF ⁇ type I receptor inhibitor and fragmented extracellular matrix. It may be incubation (culturing) in a medium containing the component. At that time, for example, a medium containing a fragmented extracellular matrix component and a TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be used in advance, and the TGF ⁇ type I receptor inhibitor is added to the medium containing the fragmented extracellular matrix component. Alternatively, fragmented extracellular matrix components may be added to the medium containing the TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • the TGF ⁇ type I receptor inhibitor may be contained in the aqueous medium, added before incubation, or added during incubation.
  • the aqueous medium may be the same as during incubation or may be different.
  • the cells may be contacted with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium and incubated, followed by further incubation in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • the time for contacting and incubating the cells and the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium may be, for example, 12 hours to 72 hours.
  • Aqueous medium means a liquid containing water as an essential component.
  • the aqueous medium is not particularly limited as long as it allows the fragmented extracellular matrix components to exist stably.
  • aqueous media include physiological saline such as phosphate buffered saline (PBS), Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), and liquid media such as vascular endothelial cell-specific medium (EGM-2). is not limited to
  • the pH of the aqueous medium is preferably within a range that does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • the pH of the aqueous medium may be, for example, 7.0 or more and 8.0 or less from the viewpoint of reducing the load on the cells when injected into the cells.
  • the pH of the aqueous medium is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9. , or 8.0.
  • the aqueous medium preferably has a buffering capacity in the above pH range, and is more preferably a liquid medium.
  • the liquid medium is not particularly limited, and a suitable medium can be selected according to the type of cells to be cultured.
  • the medium examples include Eagle's MEM medium, DMEM, EGM-2, Modified Eagle medium (MEM), Minimum Essential medium, RPMI, and GlutaMax medium.
  • the medium may be a serum-supplemented medium or a serum-free medium.
  • the liquid medium may be a mixed medium in which two or more types of medium are mixed.
  • the contacting step includes a method of mixing an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components and an aqueous medium containing cells, a method of adding cells to an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components, and a method of adding cells to an aqueous medium containing fragmented extracellular matrix components.
  • a method of adding an aqueous medium containing an extracellular matrix component to a culture medium a method of adding cells to an aqueous medium containing an extracellular matrix component, and adding an extracellular matrix component and cells to a previously prepared aqueous medium.
  • the methods include, but are not limited to.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the contact step can be appropriately determined according to the shape and thickness of the target three-dimensional tissue, the size of the incubator, and the like.
  • the concentration of the fragmented extracellular matrix component in the aqueous medium in the contacting step may be 0.1-90% by mass, or 1-30% by mass.
  • the amount of the fragmented extracellular matrix component in the contact step is, for example, 0.1 to 100 mg, 0.5 to 50 mg, 0.8 to 25 mg, 1.0 to 1.0 mg for 1.0 ⁇ 10 6 cells. 10 mg, 1.0-5.0 mg, 1.0-2.0 mg, or 1.0-1.8 mg, 0.7 mg or more, 1.1 mg or more, 1.2 mg or more, 1.3 mg or more Or it may be 1.4 mg or more, and may be 7.0 mg or less, 3.0 mg or less, 2.3 mg or less, 1.8 mg or less, 1.7 mg or less, 1.6 mg or less, or 1.5 mg or less.
  • the mass ratio between the fragmented extracellular matrix components and the cells is preferably 1/1 to 1000/1, more preferably 9/1 to 900/1. is more preferable, and 10/1 to 500/1 is even more preferable.
  • the amount of the fragmented extracellular matrix component in the contacting step is 0.1% to 10% by weight, 0.5% to 8% by weight, or 1% to 5% by weight relative to the weight of the entire medium. There may be.
  • An embodiment of the method for producing a three-dimensional tissue may include mixing fibrinogen and thrombin simultaneously or separately in the contacting step, or after the contacting step and before incubation. By mixing fibrinogen and thrombin, they react to form fibrin.
  • the content of fibrinogen may be, for example, 1-10 mg/mL, 2-8 mg/mL, or 5-6 mg/mL relative to the medium.
  • the contacting step and before the incubation it may further comprise a step of co-sedimenting the fragmented extracellular matrix component and the cells in the aqueous medium.
  • a step of co-sedimenting the fragmented extracellular matrix component and the cells in the aqueous medium By carrying out such steps, the distribution of fragmented extracellular matrix components and cells in the three-dimensional tissue becomes more uniform.
  • Specific methods are not particularly limited, but include, for example, a method of centrifuging a culture solution containing fragmented extracellular matrix components and cells.
  • the cell density in the medium before incubation described above may be the same as the cell density in the aqueous medium in the contacting step.
  • the present invention also provides a method for promoting the differentiation of adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells, which comprises incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • a method for promoting the differentiation of adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells comprises incubating cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor.
  • incubating adipose-derived stem cells in the presence of a TGF ⁇ type I receptor inhibitor can promote the differentiation of human-derived adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells.
  • differentiation is promoted in a state in which human-derived adipose-derived stem cells are contained in a tissue body, or a tissue body is formed such that human-derived adipose-derived stem cells are contained in the tissue body. , thereby ultimately producing tissue bodies containing vascular endothelial cells.
  • the differentiation of at least a portion of human-derived adipose-derived stem cells may be promoted by contacting a TGF ⁇ type I receptor inhibitor. It can be applied not only to culture but also to other three-dimensional cultures and two-dimensional cultures.
  • the method of the present embodiment may be a method for promoting the differentiation of human-derived adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells in the above-described method for producing a three-dimensional tissue.
  • the method of the present embodiment is an angiogenesis-promoting method comprising incubating (cultivating) cells containing at least human-derived adipose-derived stem cells in a medium containing a TGF ⁇ type I receptor inhibitor and VFGF.
  • Promotion of angiogenesis may be promotion of vascular network formation.
  • the method of this embodiment may also include a step of contacting the cells with the fragmented extracellular matrix component in an aqueous medium before incubation.
  • the cells, reagents, preparation method, etc. used in preparation of the tissue are as follows.
  • (cells and collagen) ⁇ Primary human mature adipocytes and human adipose stem cells (ADSC): collected from human adipose tissue (derived from thigh) (provided by Kyoto Prefectural University of Medicine Hospital) by the method described later ⁇ Human umbilical vein-derived vascular endothelial cells (HUVEC) ( #C-2517A manufactured by Lonza) - Defibrillated collagen component (sCMF) (prepared by the method described later)
  • ADSC Primary human mature adipocytes and human adipose stem cells
  • ALK5 inhibitor 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical No. 14794 ⁇ Insulin derived from bovine pancreas (Sigma #I1882) ⁇ Bovine plasma-derived thrombin lyophilized powder (Sigma #T4648) ⁇ Bovine plasma-derived fibrinogen type IS (Sigma #F8630) ⁇ Clostridium histolyticum-derived collagenase type I (Sigma #C0130) ⁇ DMEM (medium) (high glucose, Nacalai Tesque) ⁇ EGM-2 (medium): 500 mL of EBM-2 was mixed with EGM-2 supplement growth factors (factors (Lonza #C-2517A)) and stored at 4 ° C.
  • KBM medium
  • Kohjin Bio company ⁇ 10 mg/mL insulin stock solution: 100 mg of bovine pancreas-derived insulin dissolved in 10 mL of a 1% glacial acetic acid solution (pH ⁇ 2) diluted with water, divided into equal aliquots into Eppendorf tubes, and stored at -20°C ⁇ 2 mg /mL
  • Collagenase solution 2.5 g of BSA are mixed with 50 mL of DMEM (0% FBS, 1% antibiotics).
  • 202 U/mL thrombin stock solution Weigh 202 U of thrombin into an Eppendorf tube, immediately add 1 mL of DMEM (0% FBS, 1% antibiotics) and place in a 37°C water bath for 3-5 minutes to dissolve. After that, it was filtered through a filter with a pore size of 0.2 ⁇ m, and an equal amount was dispensed into an Eppendorf tube for use.
  • DMEM 0% FBS, 1% antibiotics
  • Defibrillated collagen component By heating 100 mg of porcine skin-derived collagen type I sponge fragment (manufactured by Nippon Ham Co., Ltd.) at 200° C. for 24 hours, a collagen component at least partially crosslinked (crosslinked collagen component) was obtained. Before and after heating at 200° C., no significant change in the appearance of the collagen was observed. 50 mg of the crosslinked collagen component was placed in a 15 mL tube, 5 mL of ultrapure was added, and the mixture was homogenized for 6 minutes using a homogenizer (VH-10, AS ONE) to defibrillate the crosslinked collagen component.
  • a homogenizer VH-10, AS ONE
  • the lysate was filtered through an iron mesh filter with a pore size of 500 ⁇ m, 2 mL of DMEM was added per well to collect all the digested cells, and then centrifuged at 200 g for 3 minutes at room temperature (15-25° C.). Mature adipocytes are contained in the upper yellow oily layer, and adipose stem cells and blood cells are contained in the pellet. Using a long needle and a 10 mL syringe, the medium between the upper and lower layers was aspirated and discarded, and the mature adipocytes contained in the upper layer and the adipose stem cells and blood cells contained in the lower layer were collected in 25 mL of PBS substance) twice.
  • centrifugation was performed in the same manner as described above to separate the medium into three layers: the upper layer, the lower layer, and the medium between the upper layer and the lower layer, and the medium between the upper layer and the lower layer was aspirated and discarded. After washing twice, wash with 25 mL of DMEM.
  • a pellet containing ADSCs was suspended in 10 mL of DMEM, seeded in a 10 cm dish, and subcultured. ADSCs were separated from the dish using trypsin/EDTA, suspended in 1 mL of DMEM, and the number of cells was counted.
  • the medium was exchanged every 2 days, cultured for 7 days after seeding, and tissue bodies were obtained.
  • Fluorescent imaging of the tissue was performed according to the following procedure. Transwells containing the resulting tissue bodies were transferred to 24-well plates. After washing with 2 mL of PBS, the tissue was fixed overnight at 4°C using 2 mL of 4% PFA. Washed three times with 2 mL of PBS. Cells were permeabilized with 0.05% Triton/PBS for 7 minutes at room temperature (500 ⁇ L inside the transwell, 500 ⁇ L outside the transwell) and washed three times with 2 mL of PBS.
  • a 1% BSA/PBS solution was used to block the tissue for 1 hour at room temperature (500 ⁇ L inside the transwell, 500 ⁇ L outside the transwell).
  • the BSA solution was aspirated, and 100 ⁇ L of primary antibody solution (100-fold diluted anti-CD31 antibody with 1% BSA/PBS solution) was added (50 ⁇ L inside the transwell, 50 ⁇ L outside the transwell).
  • a wet tissue was placed under the plate, covered with aluminum foil, and incubated overnight at 4°C.
  • the transwell membrane was cut, the gel was placed directly on the bottom of a glass bottom dish containing a small amount of PBS, and the stained tissue was observed with a laser excitation light using a confocal laser scanning microscope (FV3000, manufactured by Olympus Corporation). was observed as 640 nm (AlexaFluor647).
  • Fig. 1 shows the results of fluorescence observation (20x magnification) of tissue with a vascular network.
  • tissue body cultured in EGM-2 medium containing no ALK5 inhibitor (ALK5i) tissue body cultured in EGM-2 medium containing 5 ⁇ M ALK5 inhibitor,
  • tissue body cultured in EGM-2 medium containing 5 ⁇ M ALK5 inhibitor tissue body cultured in EGM-2 medium containing 5 ⁇ M ALK5 inhibitor
  • c 10% Tissue cultured in DMEM containing FBS.
  • formation of a vascular network could not be confirmed.
  • the tissue body of (b) has blood vessels with a large diameter (e.g., 10 ⁇ m or more and less than 25 ⁇ m) and thin blood vessels (e.g., more than 0 ⁇ m and less than 10 ⁇ m) similar to living tissue, and has more blood vessels. It was confirmed that a vascular network with a large number of branches was formed.
  • Production example 2 Isolated ADSCs were treated with an ALK5 inhibitor (2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical No. 14794) at 0 ⁇ M or It was suspended in EGM-2 medium containing 5 ⁇ M, seeded in a 10 cm dish and incubated at 37°C.
  • ALK5 inhibitor 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical No. 14794
  • FIG. 2 shows a phase-contrast observation image of the manufactured tissue body.
  • ADSC cell number tissues cultured in EGM-2 containing an ALK5 inhibitor (ALK5i) were more ductal than those cultured in EGM-2 without ALK5 inhibitor. It was observed that cavity formation was progressing. In particular, when the number of ADSC cells is 1.5 ⁇ 10 5 cells / mL or more, it was confirmed that a vascular network with a greater number of branched blood vessels was formed. It was suggested that the differentiation of adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells was promoted by culturing.
  • Isolated ADSCs were spiked with 5 ⁇ M of an ALK5 inhibitor (2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical No. 14794).
  • the cells were suspended in EGM-2 medium, seeded in a 10 cm dish, and incubated at 37°C. The medium was exchanged every two days and cultured for 7 days to obtain tissue bodies. Subsequently, the ADSCs were gently detached from the dish by incubation with 0.25% Trypsin for 5 minutes while leaving the protein on the cell surface, collected from the dish, suspended in 1 mL of DMEM, and the number of cells was counted.
  • an ALK5 inhibitor 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical No. 14794.
  • Tissue bodies (cell balls) produced using endothelial cells at a ratio (number of cells) of 2.5:3 were prepared using mature adipocytes, ADSCs and HUVECs at a ratio (number of cells) of 2.5:2:1. It was compared with tissue bodies (cell balls) similarly produced by The total number of cells used for any tissue is 4.0 ⁇ 10 4 cells/ball.
  • Mature adipocytes and ADSCs were human-derived cells isolated as described above (collection of matured adipocytes and ADSCs).
  • ADSC-derived vascular endothelial cells obtained from the tissue prepared in Production Example 3 were used.
  • sCMF 2.4 mg was weighed out, 1 mL of DMEM was added, and mixed gently until only small particles of sCMF were observed. After centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute at room temperature, the supernatant was aspirated to obtain an sCMF pellet.
  • ADSCs and/or ADSC-derived vascular endothelial cells also HUVECs in the comparative example
  • were gently added onto the sCMF pellet centrifuged at 3500 rpm for 1 minute at room temperature, and the supernatant was aspirated.
  • Fibrinogen 32 ⁇ L of 50 mg/mL fibrinogen stock solution
  • Additional mature adipocytes were added and gently mixed.
  • DMEM fetal calf serum
  • the cells were transferred to a low-adhesion 24-well plate (IWAKI #4820-800LP), and 2 mL of EGM-2 was added. Medium was changed every 2-3 days until day 7 of culture.
  • Fluorescent imaging of the tissue was performed according to the following procedure.
  • the resulting transwell containing the tissue was transferred to a 24-well plate (IWAKI #4820-800LP). After washing with 200 ⁇ L of PBS, the tissue was fixed overnight at 4° C. using 200 ⁇ L of 4% PFA. Washed 3 times with 200 ⁇ L of PBS.
  • cells were permeabilized with 200 ⁇ L of 0.05% Triton/PBS for 7 minutes at room temperature and washed three times with 200 ⁇ L of PBS.
  • the cell balls were placed directly on the complete plate of a confocal quantitative image cytometer CQ1 (manufactured by Yokogawa Electric Corporation), and the stained tissue body was measured using the above confocal quantitative image cytometer CQ1 with a laser excitation light of 640 nm (AlexaFluor647). Observed.
  • FIG. 4 shows the results of fluorescence observation of cell balls with vascular networks by CD31 staining.
  • HUVECs were produced regardless of the use of ADSCs and the ratio of various cells.
  • a vascular network was formed in the same manner as the tissue body created by using it. These vascular networks were formed to the inner part of the cell balls.
  • Isolated ADSCs were treated with an ALK5 inhibitor (2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical No. 14794) at 0 ⁇ M or It was suspended in EGM-2 medium containing 5 ⁇ M, seeded in a 10 cm dish and incubated at 37°C. The medium was exchanged every two days and cultured for 7 days to obtain tissue bodies. Subsequently, the ADSCs were gently detached from the dish by incubation with 0.25% Trypsin for 5 minutes while leaving the protein on the cell surface, collected from the dish, suspended in 1 mL of DMEM, and the number of cells was counted.
  • an ALK5 inhibitor (2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine, Cayman Chemical No. 14794
  • EGM-2 medium containing
  • BD Facsmelody (registered trademark) cellsorter manufactured by Beckton Dickinson analyzed the ratio of vascular endothelial cells in the samples.
  • Samples collected as above were centrifuged (100 g, 5 min, 4° C.).
  • an alexa fluor647 labeled anti-CD31 antibody 100x dilution was added and the cell suspension was incubated for an additional 30 minutes at 4°C.
  • Cells were then washed by centrifugation (100 g, 5 min, 4° C.), pelleted cells were suspended in buffer and 10,000 events were recorded.
  • an isotype control for the conjugated antibody was also measured at the same time.
  • analysis was performed using Flowjo (registered trademark) Software (Beckton Dickinson) to determine the ratio of CD31 + cells.
  • the isolated ADSCs were suspended in EGM-2 medium, seeded in 10 cm dishes, and incubated at 37°C. The medium was exchanged every two days and cultured for 7 days to obtain tissue bodies. Cells including ADSCs, ADSC-derived vascular endothelial cells, and vascular endothelial progenitor cells were recovered from this tissue.
  • the collected cells, sCMF, fibrin, mature adipocytes, and thrombin were mixed in the same manner as in Production Example 4, and the mixture (40 cell balls) was placed on a low-adhesion 96-well plate (IWAKI #4860-800LP). 5 ⁇ L (one cell ball) was seeded in each well. The total number of cells in the tissue body (cell ball) used was 4.0 ⁇ 10 4 cells/ball, and the matured adipocytes and the collected cells were prepared using a ratio of 3:2.5.
  • EGM-2 or KBM was composed of insulin at a final concentration of 10 ⁇ g/mL, ALK-5 inhibitor at 5 ⁇ M (2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]- 1,5-naphthyridine, Cayman Chemical Company No. 14794) and 0.5 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL VEGF, or 1 ⁇ g/mL leptin. board.
  • EGM-2 or KBM containing only 10 ⁇ g/mL final concentration of insulin and 5 ⁇ M ALK-5 inhibitor was used.
  • the cells were transferred to a low-adhesion 24-well plate (IWAKI #4820-800LP), and 2 mL of EGM-2 or KBM was added. Medium was changed every 2-3 days until day 7 of culture.
  • vWF anti-von Willebrand factor
  • the cell balls were placed directly on the complete plate of a confocal quantitative image cytometer CQ1 (manufactured by Yokogawa Electric Corporation), and the stained tissue bodies were subjected to laser excitation light using the confocal quantitative image cytometer CQ1. 640 nm.
  • Fig. 6 shows the results of fluorescence observation of cell balls with a vascular network by vWF staining.
  • Cell balls cultured in medium containing VEGF formed a vascular network with a higher number of branched vessels than control cell balls cultured in medium without VEGF.
  • the cell balls cultured in the VEGF-containing medium formed a vascular network with a greater number of vascular branches.
  • culturing in the medium containing 20 ng/mL or more of VEGF resulted in the formation of a vascular network with more blood vessels.
  • VEGF in addition to the ALK-5 inhibitor to the medium further promoted the differentiation of human-derived adipose-derived stem cells into vascular endothelial cells and angiogenesis.
  • Production example 7 A tissue body (cell ball) was produced in the same manner as in Production Example 6. 5 ⁇ L of the mixture (for 40 cell balls) was seeded in each well (for 1 cell ball) on a low-adhesion 96-well plate (IWAKI #4860-800LP).
  • Cell balls seeded in low-attachment 96-well plates were incubated for 15 min in a 37° C. incubator to allow gelation, and were treated with insulin at a final concentration of 10 ⁇ g/mL, AKL-5 inhibitor at 5 ⁇ M, and VEGF at 50 ng/mL. 300 ⁇ L containing EGM-2 was added.
  • the cells were transferred to a low-adhesion 24-well plate (IWAKI #4820-800LP), and 2 mL of EGM-2 or KBM was added. Medium was changed every 2-3 days until day 7 of culture.
  • Fluorescent imaging of the tissue was performed in the same manner as in Production Example 4, except that various primary antibody solutions and their corresponding secondary antibody solutions were used.
  • Primary antibody solutions were rabbit anti-CD34 antibody diluted 100-fold in 1% BSA/PBS solution, mouse anti-CD31 diluted 100-fold in 1% BSA/PBS solution, or 100-fold diluted in 1% BSA/PBS solution.
  • a rabbit anti-von Willebrand factor (vWF) antibody was used.
  • As secondary antibody solutions AlexaFluor 546-labeled anti-mouse IgG antibody diluted 200-fold with 1% BSA/PBS solution and AlexaFluor 647-labeled anti-rabbit IgG antibody diluted 200-fold with 1% BSA/PBS solution were used.
  • CD34 was used as a marker for vascular endothelial progenitor cells.
  • CD31 was used as a marker for vascular endothelial progenitor cells and vascular endothelial cells.
  • vWF was used as a marker for vascular endothelial cells. Nuclei were also stained by Hoechst staining.
  • the cell balls were placed directly on the complete plate of the confocal quantitative image cytometer CQ1 (manufactured by Yokogawa Electric Corporation), and the stained tissue bodies were observed using the confocal quantitative image cytometer CQ1.
  • the laser excitation light for AlexaFluor546 was set at 556 nm
  • the laser excitation light for AlexaFluor647 was set at 640 nm.

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Abstract

ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、血管内皮細胞を含む組織体の製造方法。

Description

組織体の製造方法及びヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法
　本発明は、組織体の製造方法及びヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法に関する。
　人工的に生体組織を模した構造体を作製する手法として、例えば、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、細胞をカチオン性物質及び細胞外マトリックス成分と混合して混合物を得て、得られた混合物から細胞を集めて、基材上に細胞集合体を形成することを含む、立体的細胞組織の製造方法（特許文献２）等が知られている。また、本発明者らは、細胞と断片化された外因性コラーゲンを接触させることで、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造する方法（特許文献３）を提案している。
国際公開第２０１５／０７２１６４号 国際公開第２０１７／１４６１２４号 国際公開第２０１８／１４３２８６号
　上述の製造方法によれば、細胞培養によって人工的に作られる細胞の集合体である組織体を得ることができる。特に、血管内皮細胞を含む組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。ここで、人工的に組織体を製造する際には、ウシ等の他生物種を由来とする脂肪由来幹細胞、同じヒトであっても異なる個体から採取されたアロジェニックな細胞等が使用されることが多いものの、例えば、ヒトへの移植材料を製造する際には、当該ヒトの自家細胞を使用して移植材料を製造することが想定される。そのため、特にヒト由来の脂肪由来幹細胞を用いて組織体を製造する際に、当該脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化を促進する方法が望まれている。
　本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、血管内皮細胞を含む組織体の製造において、ヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化を促進させる方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、ヒト由来の脂肪由来幹細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることにより、脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化が促進されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、例えば、以下の発明を含む。
　［１］
　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、血管内皮細胞を含む組織体の製造方法。
　［２］
　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞が、血管内皮細胞を含まない、［１］に記載の方法。
　［３］
　上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、上記ＴＧＦΒタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
　［４］
　インキュベートが、９６時間以上２８８時間以下で行われる、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
　［５］
　上記細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
　［６］
　上記組織体において、上記断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されている、［５］に記載の製造方法。
　［７］
　上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、［５］又は［６］に記載の製造方法。
　［８］
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、［５］～［７］のいずれかに記載の製造方法。
　［９］
　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法。
　［１０］
　上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における上記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、［９］に記載の方法。
　［１１］
　インキュベートが、９６時間以上２８８時間以下で行われる、［９］又は［１０］に記載の方法。
　［１２］
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、［９］～［１１］のいずれかに記載の方法。
　［１３］
　上記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、［１２］に記載の方法。
　［１４］
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、［１２］又は［１３］に記載の方法。
　本発明によれば、ヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化が促進される。血管内皮細胞への分化を促進することで、短時間で血管内皮細胞を含む組織体を製造可能となる。
図１は、ＣＤ３１染色及びヘキスト染色による、製造例１において作製した組織体の観察結果を示す写真である。（ａ）はＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ）を含有しないＥＧＭ－２において培養した組織体、（ｂ）はＡＬＫ５阻害剤を５μＭ含有するＥＧＭ－２において培養した組織体、（ｃ）は１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地において培養した組織体である。白色の点は核（ヘキスト染色）を示す。 図２は、ＣＤ３１染色による、製造例２において作製した組織体の観察結果を示す写真である。 図３は、フローサイトメトリー解析により、製造例３において作製した組織体における血管内皮細胞の比率を解析した結果を示すグラフ及びその比率を示す表である。（ａ）は製造した組織体を用いた結果、（ｂ）は組織消化後に単離した細胞をそのまま用いた結果を示す。 図４は、製造例４において作製した組織体（細胞ボール）を比較した結果を示す写真である。上段の写真は製造した細胞ボール（複数）、中段の写真はＣＤ３１染色解析に用いた細胞ボール、下段の写真は、ＣＤ３１染色による、血管網を有する細胞ボールの蛍光観察結果を示す。 図５は、フローサイトメトリー解析により、製造例５において作製した組織体における血管内皮細胞の比率を解析した結果を示すグラフ及びその比率を示す表である。 図６は、製造例６において作製した組織体（細胞ボール）において、ｖＷＦ染色により血管網の形成を比較した結果を示す写真である。 図７は、製造例７において作製した組織体（細胞ボール）の観察結果を示す写真である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、一実施形態として、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、血管内皮細胞を含む組織体の製造方法を提供する。
　本明細書において、「組織体」とは、細胞培養によって人工的に作られる細胞の集合体を意味する。そのうち、「三次元組織体」とは、細胞培養によって人工的に作られ、細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体（塊状の細胞集団）を意味する。三次元組織体が後述する細胞外マトリックス成分を含む場合には、細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置される。組織体の形状は、特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、略球体状、楕円体状、略楕円体状、半球状、略半球状、半円状、略半円状、直方体状、略直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が組織体より複雑である。そのため、組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
　本明細書において「細胞」は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
　本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能及び多分化能を有する細胞を意味する。幹細胞には、任意の細胞種に分化する能力を持つ多能性幹細胞と、特定の細胞種に分化する能力を持つ組織幹細胞（体性幹細胞とも呼ばれる）が含まれる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。組織幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞、骨髄由来幹細胞）、造血幹細胞及び神経幹細胞が挙げられる。脂肪由来幹細胞としては、例えば、ヒト脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。
　細胞は、少なくともヒト由来の脂肪由来幹細胞を含む。ヒト由来の脂肪由来幹細胞は、ヒトの生体組織、例えば、ヒトの皮下脂肪組織及び心外膜由来脂肪組織等から採取した幹細胞を用いてもよい。本実施形態の方法により製造する血管内皮細胞を含む組織体を、最終的にヒトの生体の特定箇所の組織に見立てて利用する場合には、当該箇所の組織に対応する組織由来のものを用いることが好ましい。
　本実施形態において細胞は、少なくともヒト由来の脂肪由来幹細胞を含むが、脂肪由来幹細胞以外の細胞を更に含んでいてもよい。脂肪由来幹細胞以外の細胞としては、例えば、成熟脂肪細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、肝細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ））、膵島細胞、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。
　生体組織からの脂肪由来幹細胞及び／又は成熟脂肪細胞の採取は、常法により行うことができるが、例えば、以下のように採取することができる。脂肪組織断片を洗浄及び切断し、コラゲナーゼで消化（例えば、３７℃で１時間インキュベート）する。その後、消化された細胞をろ過等により回収し、遠心すると、成熟脂肪細胞を含む上層の黄色の油性層、脂肪幹細胞及び血球を含む下層のペレットに分離される。上層のみを回収することで成熟脂肪細胞を、ペレットのみを回収することでＡＤＳＣをそれぞれ採取することができる。
本明細書において「血管内皮細胞」は、血管内腔の表面を構成する扁平状の細胞を意味する。血管内皮細胞としては、例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が挙げられる。脂肪幹細胞が血管内皮細胞に分化しているかは、例えば、血管内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）及びＶＥ－カドヘリン等を用いた免疫染色やフローサイトメトリー解析等により確認することができる。
　組織体における血管内皮細胞の含有率は、組織体における全細胞数に対して、例えば、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、又は３０％以上であってよく、９５％以下、９０％以下、８０％以下又は７５％以下であってよい。本発明による効果がより顕著になる観点から、脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞、すなわちインキュベート前の細胞における血管内皮細胞の含有率は、インキュベート前の全細胞数に対して１０％以下、５％以下、又は１以下であってよい。
　組織体は、細胞間に血管網を有するものであってよい。細胞間に血管網が形成されていると、組織体を長期間維持できること、及び、組織体を哺乳類等に移植した際に生着しやすくなることが期待される。
　「細胞間に血管網を有する」とは、生体組織と同様に、分岐した血管が細胞を取り囲むように細胞と細胞の間に延びた構造を有することを意味する。生体組織と同様の血管網が形成されているか否かについては、例えば、生体組織における血管の分岐数及び／又は血管の分岐間の長さ及び／又は血管の直径の多様性に基づき判断することができる。例えば、生体組織における血管の分岐数の平均値に対する、組織体における血管の分岐数の平均値が、８０％以上１５０％以下、８５％以上１３０％以下、又は９０％以上１２０％以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。また、例えば、組織体における血管の分岐数の平均値が、２．５以上４．５以下、又は３．０以上４．２以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。例えば、生体組織における血管の分岐間の長さの平均値に対する、組織体における血管の分岐間の長さの平均値が、８０％以上１５０％以下、８５％以上１３０％以下、及び９０％以上１２０％以下である場合に、生体組織における血管の分岐間の長さと類似していると判断してもよい。生体組織においては、太い血管及び細い血管の両方が観察される。そこで、例えば、生体組織と同様に直径の太いもの（例えば、１０μｍ以上２５μｍ未満）と細いもの（例えば、０μｍ超１０μｍ未満）の両方が観察された場合には、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。また、例えば、０μｍ超２５μｍ未満に血管直径全体の６０％以上、７０％以上又は８０％以上が分布している場合に、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。血管内皮細胞を含む組織体は、血管内皮細胞間に血管網を有することが好ましい。その場合、血管網を有するだけでなく、血管に取り囲まれる血管内皮細胞も生体組織と近いことが好ましい。上記生体組織及び組織体の比較に際しては、同じ条件（例えば、一定体積当たり、画像解析であれば一定面積当たり、一定サンプル当たり等）にて生体組織と組織体を比較する。
　組織体は血管内皮細胞以外の細胞を更に含んでいてもよい。血管内皮細胞以外の細胞としては、例えば、成熟脂肪細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、樹状細胞、肝細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ－ＳＭＣ））、膵島細胞、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。ただし、本発明は、脂肪由来幹細胞を血管内皮細胞の分化を促進する効果を奏するため、本発明による効果がより顕著になることから、インキュベート後の組織体において、脂肪由来幹細胞が組織体における全細胞数に対して１０％以下であることが好ましく、５％以下であることがより好ましく、脂肪由来幹細胞を含まないことがさらに好ましい。
　脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド（中性脂肪）、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の１重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質（ペリリピン等）の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が２０μｍ以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。なお、本明細書において「脂肪細胞」とは、脂肪由来幹細胞を除くすべての脂肪細胞を意味し、成熟脂肪細胞、及び脂肪由来幹細胞に含まれない脂肪細胞が含まれる。
　上記組織体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。組織体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。
　ここで、「組織体の厚さ」とは、組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。また、組織体が球体状又は略球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、組織体が楕円体状又は略楕円体状である場合、その短径を意味する。組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
　本実施形態の方法は、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることで、ヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化が促進される。本実施形態の方法においては、脂肪由来幹細胞が組織体に含まれた状態で分化を促進させること、又は脂肪由来幹細胞が組織体に含まれるように組織体が形成される状況において分化を促進することにより、最終的に血管内皮細胞を含む組織体を作製することができる。したがって、組織体の製造は、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含んでいればよく、三次元培養であっても、二次元培養であってもよい。組織体は、例えば、培地中でヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をインキュベートすることのみで得られたものであってもよく、足場がない状態で当該細胞を培地中に浮遊させながらインキュベートする浮遊培養により得られたものであってもよく、ゲル及びシート等の足場に当該細胞を付着させてインキュベートする付着型培養で得られたものであってもよく、後述するように、水性媒体中で当該細胞を細胞外マトリックスとともにインキュベートすることで得られたものであってもよい。
　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることは、細胞のみがＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤存在下でインキュベートされてもよく、細胞及び細胞外マトリックス成分が混合された状態でＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤存在下でインキュベートされてもよく、細胞及び細胞外マトリックス成分を含む組織体が形成された状態でＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤存在下でインキュベートされてもよい。
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤としては、例えば、ＴＧＦβＲ１キナーゼである、ＡＬＫ５、ＡＬＫ２、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７の阻害剤が挙げられる。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤は、ＴＧＦβタイプＩ受容体を阻害する作用を有するものであれば、特に制限されない。ＡＬＫ５、ＡＬＫ４及びＡＬＫ７阻害剤としては、例えば、４－［４－（１，３－ベンゾジオキシオール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミドが挙げられ、ＡＬＫ５阻害剤としては、例えば、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン，塩酸塩、Ｎ－（２－フルオロフェニル）－４－（［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）－５－（６－メチル－２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－メタンアミン等が挙げられる。
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートするとは、例えば、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベート（培養）することであってよい。
　培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地は、固体培地であっても、液体培地であってもよいが、液体培地であることが好ましい。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ－２）、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、ＫＢＭ培地、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。また、液体培地は、フィブリンゲル、ハイドロゲル、マトリゲル、コラーゲンゲル及びゼラチンゲルのようにゲル状のものを用いてもよい。ゲル状の液体培地に細胞を添加してもよく、細胞を含む液体培地をゲル化させて用いてもよい。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。
　ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の量は、各脂肪由来幹細胞が当該阻害剤に接するのに十分な量であればよく、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、２．０×１０－１１ｍｏｌ～２．０×１０－８ｍｏｌ、又は１．０×１０－９ｍｏｌ～２．０×１０－８ｍｏｌであってよく、例えば、脂肪由来幹細胞５×１０６ｃｅｌｌｓに対して、１．０×１０－１０ｍｏｌ～１．０×１０－７ｍｏｌ、又は５．０×１０－９ｍｏｌ～１．０×１０－７ｍｏｌであってよい。また、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤は、例えば、脂肪由来幹細胞１×１０６ｃｅｌｌｓに対して、６．０ｎｇ～６．０μｇ、又は３００ｎｇ～６．０μｇであってよく、例えば、脂肪由来幹細胞５×１０６ｃｅｌｌｓに対して、３０ｎｇ～３０μｇ、又は１５００ｎｇ～３０μｇであってよい。
　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートする場合、培地におけるＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量は、例えば、０．１μＭ以上１００μＭ以下、０．５μＭ以上５０μＭ以下、１μＭ以上１０μＭ以下、又は２μＭ以上８μＭ以下であってもよく、０．５μＭ以上、０．７以上、１μＭ以上、２μＭ以上、３μＭ以上、４μＭ以上、５μＭ以上であってもよく、２０μＭ以下、１５μＭ以下、１２μＭ以下、１０μＭ以下、８μＭ以下又は７μＭ以下であってもよい。
　インキュベート前の培地中の細胞密度は、目的とする組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、培地中の細胞密度は、１～１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０３～１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。
　インキュベートは、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な条件で行うことができる。例えば、インキュベートの温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。インキュベートの時間は、２４時間以上３３６時間以下であってもよく、７２時間以上３３６時間以下であってもよく、９６時間以上２８８時間以下であってもよい。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を添加してからのインキュベートの時間は、２４時間以上３３６時間以下であってもよく、７２時間以上３３６時間以下であってもよく、９６時間以上２８８時間以下であってもよい。
　細胞の培養に用いられる培養器（支持体）は、特に制限されず、例えば、ウェルインサート、低接着プレート、Ｕ字やＶ字等の底面形状を有するプレートであってよい。上記細胞を支持体と接着させたまま培養してもよく、上記細胞を支持体と接着させずに培養してもよく、培養の途中で支持体から引き離して培養してもよい。上記細胞を支持体と接着させずに培養する場合や、培養の途中で支持体から引き離して培養する場合には、細胞の支持体への接着を阻害するＵ字やＶ字等の底面形状を有するプレートや、低吸着プレートを用いることが好ましい。
　本実施形態の方法は、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベート（培養）することである場合、培地には血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれていてもよい。その際、例えば、予めＶＥＧＦとＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地を使用してもよく、ＶＥＧＦを含む培地にＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地にＶＥＧＦを添加してもよい。
　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及びＶＥＧＦを含む培地中でインキュベートすることで、より脂肪幹細胞から血管内皮細胞への分化が促進される。また、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及びＶＥＧＦを含む培地中でインキュベートすることで、血管新生を促進することもできるため、血管網を有する組織体をより簡便に製造できる。
　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＶＥＧＦが含まれる培地中でインキュベートする場合、培地におけるＶＥＧＦの含有量は、例えば、０．５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下、１ｎｇ／ｍＬ以上８５ｎｇ／ｍＬ以下、６ｎｇ／ｍＬ以上８０ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以上７０ｎｇ／ｍＬ以下、又は２０ｎｇ／ｍＬ以上５０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｎｇ／ｍＬ以上、１ｎｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、６ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、１５ｎｇ／ｍＬ以上、２０ｎｇ／ｍＬ以上であってもよく、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下又は５０ｎｇ／ｍＬ以下であってもよい。
　本実施形態の方法は、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含んでもよい。断片化細胞外マトリックス成分とともにインキュベートすることで、断片化細胞外マトリックス成分を介して細胞が三次元的に配置された三次元組織体を得ることができる。断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されている三次元組織体であることが好ましい。細胞同士における細胞は、同種細胞であってもよく、異種細胞であってもよい。ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地を用いる場合において、断片化細胞外マトリックス成分は、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤と同時に培地に添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤より先に培地に添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤より後に培地に添加してもよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を断片化して得ることができる。本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらの１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲン成分を含んでいてよく、コラーゲン成分であってもよい。本実施形態における細胞外マトリックス成分は、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。
　細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。細胞外マトリックス分子は、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列の繰り返しを有するものであってよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ－Ｘ－Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することによって、分子鎖の配置への束縛が少なくなるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としての機能がより一層優れたものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックス分子において、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックス分子は、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってもよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（アルギニン残基－グリシン残基－アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。ＲＧＤ配列を有することによって、細胞接着がより一層促進されるため、例えば、細胞培養の際の足場材料としてより一層好適なものとなる。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン等が挙げられる。
　コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞外マトリックス成分は、本発明による効果がより顕著になることから、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。
　細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。
　「断片化」とは、細胞外マトリックス分子の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断する条件で行われてもよいし、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われてもよい。物理的な力の印加によって断片化された細胞外マトリックスは、酵素処理とは異なり、通常、分子構造は断片化する前とは変化しない（分子構造は維持されている）。断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である、解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含んでいてよい。解繊は、断片化の一態様であり、例えば、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
　細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。細胞外マトリックス成分を解繊する方法としては、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を解繊してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの解繊細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。解繊細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで解繊することにより得ることもできる。
　断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分であってよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン成分（解繊コラーゲン成分）を含むことが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。
　断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状のコラーゲン成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が分子間で架橋して構成される形状を意味する。断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であってよい。線維状の細胞外マトリックス成分には、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細線維）、細線維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。線維状の細胞外マトリックス成分ではＲＧＤ配列が破壊されることなく保存されている。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均長が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均径は、１０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、３０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、５０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、１μｍ以上３０μｍ以下であってよく、２μｍ以上３０μｍ以下であってよく、３μｍ以上３０μｍ以下であってよく、４μｍ以上３０μｍ以下であってよく、５μｍ以上３０μｍ以下であってよい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均径が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
　断片化細胞外マトリックス成分は、例えば、断片化コラーゲン成分を含んでいてよく、断片化コラーゲン成分からなっていてよい。「断片化コラーゲン成分」とは、線維性コラーゲン成分等のコラーゲン成分を断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲン成分の平均長は、１００ｎｍ～２００μｍであることが好ましく、２２μｍ～２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ～２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲン成分の平均径は、５０ｎｍ～３０μｍであることが好ましく、４μｍ～３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ～３０μｍであることがさらにより好ましい。
　断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。細胞外マトリックス成分は、細胞外マトリックス成分を構成する細胞外マトリックス分子の分子内又は分子間で架橋されていてよい。
　架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。細胞の生育を妨げない観点からは、物理架橋が好ましい。架橋（物理架橋及び化学架橋）は、共有結合を介した架橋であってよい。
　細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、架橋は、コラーゲン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細繊維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）であってよい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。コラーゲン成分の熱架橋を行う場合、細胞外マトリックス成分は、コラーゲン分子のアミノ基が、同一又は他のコラーゲン分子のカルボキシ基とペプチド結合（－ＮＨ－ＣＯ－）を形成することにより、架橋されていてよい。
　細胞外マトリックス成分は架橋剤を使用することによっても、架橋させることができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
　架橋度の定量は、細胞外マトリックス成分の種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。架橋度が上記範囲にあることにより、細胞外マトリックス分子が適度に分散することができ、また、乾燥保存後の再分散性が良好である。
　細胞外マトリックス成分中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、ＴＮＢＳ（トリニトロベンゼンスルホン酸）法に基づき定量することが可能である。ＴＮＢＳ法による架橋度が、上述の範囲内であってもよい。ＴＮＢＳ法による架橋度は、細胞外マトリックスが有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合である。細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分を含む場合、ＴＮＢＳ法により測定される架橋度が上記範囲内であることが好ましい。
　架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックス成分の場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。ＴＢＯ法による架橋度が、上述した範囲内であってもよい。
　三次元組織体における細胞外マトリックス成分含有率は、上記三次元組織体（乾燥重量）を基準として０．０１～９０質量％であってよく、１０～９０質量％であることが好ましく、１０～８０質量％であることが好ましく、１０～７０質量％であることが好ましく、１０～６０質量％であることが好ましく、１～５０質量％であることが好ましく、１０～５０質量％であることが好ましく、１０～３０質量％であることがより好ましく、２０～３０質量％であることがより好ましい。
　ここで、「三次元組織体における細胞外マトリックス成分」とは、三次元組織体を構成する細胞外マトリックス成分を意味し、内因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよく、外因性細胞外マトリックス成分に由来していてもよい。
　「内因性の細胞外マトリックス成分」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックス成分を意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、例えば、上述した線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられる。内因性細胞外マトリックス成分は、線維性であってもよいし、非線維性であってもよい。
　「外因性の細胞外マトリックス成分」とは、外部から供給される細胞外マトリックス成分を意味する。外因性の細胞外マトリックス成分は、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックス成分と同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックス成分は、人工の細胞外マトリックス成分であってもよい。
　細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合には、外因性の細胞外マトリックス成分は「外因性コラーゲン成分」とも称され、外部から供給されるコラーゲン成分を意味する「外因性コラーゲン成分」は、複数のコラーゲン分子によって形成されている、コラーゲン分子の集合体であり、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲン成分は、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲン成分を意味し、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンが挙げられる。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
　外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックス成分において、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてもよい。つまり、外因性の細胞外マトリックス成分は、異種細胞外マトリックス成分であってよい。
　すなわち、三次元組織体が内因性細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分を含む場合、上記三次元組織体を構成する細胞外マトリックス成分含有率は、内因性細胞外マトリックス成分及び断片化細胞外マトリックス成分の合計量を意味する。上記細胞外マトリックス含有率は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。
　例えば、三次元組織体に含まれる細胞外マトリックス成分がコラーゲン成分である場合、三次元組織体におけるコラーゲン成分量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン成分定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン成分定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、三次元組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン成分量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。
　コラーゲン成分量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
（サンプルの調製）
　凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。
（スタンダードの調製）
　スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ　ｉｎ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ　ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。
（アッセイ）
　３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｔｏｔａｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　（ｒｅａｇｅｎｔ　Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。
　三次元組織体中に占めるコラーゲン成分を、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲン成分を既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲン成分の存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば三次元組織体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。
　例えば、三次元組織体中のコラーゲン成分を面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１～９９％であり、１～９９％であることが好ましく、５～９０％であることが好ましく、７～９０％であることが好ましく、２０～９０％であることが好ましく、５０～９０％であることがより好ましい。「三次元組織体におけるコラーゲン成分」については、上述したとおりである。三次元組織体を構成するコラーゲン成分の面積の割合は、内因性コラーゲン成分及び外因性コラーゲン成分を合わせた面積の割合を意味する。コラーゲン成分の面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲン成分の面積の割合として算出することが可能である。
　三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
　上記三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートするとは、例えば、細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及び断片化細胞外マトリックス成分が含まれる培地中でインキュベート（培養）することであってよい。その際、例えば、予め断片化細胞外マトリックス成分とＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地を使用してもよく、断片化細胞外マトリックス成分を含む培地にＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を添加してもよく、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤を含む培地に断片化細胞外マトリックス成分を添加してもよい。
　インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含んでいてもよい。この場合、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤は、水性媒体中に含まれていてもよく、インキュベート前に添加してもよく、インキュベート中に添加してもよい。水性媒体は、インキュベート時と同じであってもよく、異なっていてもよい。水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させてインキュベートすることで、断片化細胞外マトリックス成分が上記細胞同士の隙間に配置されており、細胞と断片化細胞外マトリックス成分が三次元組織体全体に渡って三次元的に均一に分布した三次元組織体を製造することができる。例えば、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させてインキュベートした後に、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でさらにインキュベートしてもよい。水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させてインキュベートする時間は、例えば、１２時間～７２時間であってもよい。
　「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、断片化細胞外マトリックス成分が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、水性媒体として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ－２）等の液体培地が挙げられるがこれに制限されない。
　水性媒体のｐＨは細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない範囲が好ましい。水性媒体のｐＨは、細胞に投入した際の細胞への負荷を軽減する観点から、例えば、７．０以上であってよく、８．０以下であってよい。具体的には、水性媒体のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０であってよい。水性媒体は、上記ｐＨの範囲において緩衝能を有することが好ましく、より好ましくは液体培地である。液体培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。当該培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、ＥＧＭ－２、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。
　断片化細胞外マトリックス成分は、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進し得る。接触工程としては、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体と細胞を含有する水性媒体とを混合する方法、断片化細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を添加する方法、細胞を含む培養液に細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体を加える方法、細胞外マトリックス細胞外マトリックス成分を含有する水性媒体に細胞を加える方法、予め用意した水性媒体に、細胞外マトリックス成分及び細胞をそれぞれ加える方法等の方法が挙げられるが、これらに限られるものではない。
　接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、接触工程における水性媒体中の断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、０．１～９０質量％であってもよいし、１～３０質量％であってもよい。
　接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の量は、例えば、１．０×１０６ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１～１００ｍｇ、０．５～５０ｍｇ、０．８～２５ｍｇ、１．０～１０ｍｇ、１．０～５．０ｍｇ、１．０～２．０ｍｇ、又は１．０～１．８ｍｇであってよく、０．７ｍｇ以上、１．１ｍｇ以上、１．２ｍｇ以上、１．３ｍｇ以上又は１．４ｍｇ以上であってよく、７．０ｍｇ以下、３．０ｍｇ以下、２．３ｍｇ以下、１．８ｍｇ以下、１．７ｍｇ以下、１．６ｍｇ以下又は１．５ｍｇ以下であってもよい。
　接触工程において、断片化細胞外マトリックス成分と細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス成分／細胞）は、１／１～１０００／１であることが好ましく、９／１～９００／１であることがより好ましく、１０／１～５００／１であることがさらに好ましい。
　また、接触工程における断片化細胞外マトリックス成分の量は、培地全体の重量に対して、０．１重量％～１０重量％、０．５重量％～８重量％、又は１～５重量％であってもよい。
　三次元組織体の製造方法の一実施形態は、接触工程、又は接触工程後かつインキュベート前に、フィブリノゲン及びトロンビンを同時に又は別々に混合することを含んでいてよい。フィブリノゲン及びトロンビンを混合することによって、これらが反応してフィブリンが形成される。フィブリノゲンの含有量は、例えば、培地に対して、１～１０ｍｇ／ｍＬであってよく、２～８ｍｇ／ｍＬであってよく、５～６ｍｇ／ｍＬであってもよい。
　接触工程後かつインキュベート前に、水性媒体中における断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを共に沈降させる工程を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における断片化細胞外マトリックス成分及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、断片化細胞外マトリックス成分と細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
　上述したインキュベート前の培地中の細胞密度は、接触工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
　本発明は、一実施形態として、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法も提供する。上述したように、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下で脂肪由来幹細胞をインキュベートすることにより、ヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化を促進することができる。本実施形態の方法は、ヒト由来の脂肪由来幹細胞が組織体に含まれた状態で分化を促進させること、又はヒト由来の脂肪由来幹細胞が組織体に含まれるように組織体が形成される状況において分化を促進することを含み、それにより最終的に血管内皮細胞を含む組織体を作製することができる。
　本実施形態の方法は、少なくとも一部のヒト由来の脂肪由来幹細胞がＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤と接触することで分化が促進されればよいため、上述した三次元組織体の製造における三次元培養だけでなく、他の三次元培養、二次元培養においても適用することができる。
　また、本実施形態の方法は、上述した三次元組織体の製造方法におけるヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法であってもよい。
　上述のとおり、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を、ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及びＶＥＧＦを含む培地中でインキュベートすることで、脂肪幹細胞から血管内皮細胞への分化、及び血管新生を促進することができる。すなわち、本実施形態の方法は、ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤及びＶＦＧＦが含まれる培地中でインキュベート（培養）することを含む、血管新生促進方法とすることもできる。血管新生促進とは、血管網形成促進であってもよい。
　組織体（三次元組織体を含む）、細胞、インキュベート、断片化細胞外マトリックス成分及び各工程等、本実施形態の方法における具体的な態様等は、上述した具体的な態様等を制限なく適用できる。例えば、本実施形態の方法においても、インキュベート前に、水性媒体中において上記細胞と上記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程を含んでもよい。
　以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
　組織体の作製において用いた細胞、試薬及び作成方法等は以下のとおりである。
（細胞及びコラーゲン）
・初代ヒト成熟脂肪細胞及びヒト脂肪幹細胞（ＡＤＳＣ）：ヒト脂肪組織（太もも由来）（京都府立医科大学附属病院から提供）より後述する方法にて採取
・ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ロンザ社製　＃Ｃ－２５１７Ａ）
・解繊コラーゲン成分（ｓＣＭＦ）（後述する方法にて作製したもの）
（試薬、培地及び各種溶液）
・ＡＬＫ５阻害剤：２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４
・ウシ膵臓由来インスリン（シグマ社　＃Ｉ１８８２）
・ウシ血漿由来トロンビン凍結乾燥粉末（シグマ社　＃Ｔ４６４８）
・ウシ血漿由来フィブリノゲンＩ－Ｓ型（シグマ社　＃Ｆ８６３０）
・クロストリジウム　ヒストリチクム由来コラゲナーゼI型（シグマ社　＃Ｃ０１３０）
・ＤＭＥＭ（培地）（高グルコース、ナカライテスク社）
・ＥＧＭ－２（培地）：５００ｍＬのＥＢＭ－２にＥＧＭ－２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒs（ｆａｃｔｏｒｓ（ロンザ社製　＃Ｃ－２５１７Ａ））と混合し、４℃で保存したもの
・ＫＢＭ（培地）（コージンバイオ社）
・１０ｍｇ／ｍＬ　インスリンストック溶液：上記ウシ膵臓由来インスリン１００ｍｇを水で希釈した１％氷酢酸溶液（ｐＨ≦２）１０ｍＬに溶かし、エッペンドルフチューブに等量分注し－２０℃で保存したもの
・２ｍｇ／ｍＬ　コラゲナーゼ溶液：ＢＳＡ　２．５ｇをＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、１％抗生物質）５０ｍＬと混合しておく。６ウェルプレートすべての脂肪組織を消化するために、コラゲナーゼＩ型２６ｍｇをＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、５％ＢＳＡ、１％抗生物質）１３ｍＬに混合し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過したものを使用。
・５０ｍｇ／ｍＬ　フィブリノゲンストック溶液：フィブリノゲン　５０ｍｇをエッペンドルフチューブに秤とり、ＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、１％抗生物質）１ｍＬをすぐに加える。手動でチューブを振って混合した後、３７℃のウォーターバスに３～５分間置き、孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
・２０２Ｕ／ｍＬ　トロンビンストック溶液：トロンビン　２０２Ｕをエッペンドルフチューブに秤とり、ＤＭＥＭ（０％ＦＢＳ、１％抗生物質）１ｍＬをすぐに加え、３７℃のウォーターバスに３～５分間置いて溶解させる。その後、孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
（解繊されたコラーゲン成分）
　ブタ皮膚由来コラーゲンＩ型スポンジ断片（日本ハム株式会社製）１００ｍｇを２００℃で２４時間加熱を行うことにより、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分（架橋コラーゲン成分）を得た。なお、２００℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。架橋コラーゲン成分５０ｍｇを１５ｍＬチューブに入れ、５ｍＬの超純粋を加え、ホモジナイザー（アズワン社　ＶＨ－１０）を用いて６分間ホモジナイズすることで架橋コラーゲン成分を解繊した。
　２１℃の条件下、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を吸引し、コラーゲンペレットを５ｍＬの新しい超純水と混合し、コラーゲン溶液を作製した。コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上に維持したまま、ソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社　ＶＣ５０）を用いて１００Ｖで２０秒間超音波処理し、ソニケーターを取り出した後コラーゲン溶液の入ったチューブを氷上で１０秒間冷却することを１００回繰り返した。超音波処理を１００回行った後、コラーゲン溶液を孔径４０μｍのフィルターでろ過し、解繊されたコラーゲン成分（ＣＭＦ）を含む分散液を得た。分散液を常法によって凍結乾燥させることにより、乾燥体として、解繊コラーゲン成分（ＣＭＦ）を得た。ＣＭＦの平均長（長さ）は、１４．８±８．２μｍ（Ｎ＝２０）であった。
（成熟脂肪細胞及びＡＤＳＣの採取方法）
　ヒト脂肪組織断片を５％の抗生物質を含むＰＢＳで洗浄した。４～６ｇの組織を６ウェルプレートの６ウェル分に分けた。２ｍｇ／ｍＬ　コラゲナーゼ溶液２ｍＬ中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ１～３ｍｍのサイズに細かく切り刻んだ。３７℃及び２３０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、１０ｍＬピペットで３０分間混合した。溶解物を孔径５００μｍの鉄メッシュフィルターでろ過し、１ウェル当たり２ｍＬのＤＭＥＭを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温（１５～２５℃）下にて２００ｇで３分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び１０ｍＬシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を２５ｍＬのＰＢＳ（５％ＢＳＡ、１％抗生物質）で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層及び上層と下層の間の媒体の３層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。二回の洗浄をした後、２５ｍＬのＤＭＥＭで洗浄した。
　成熟脂肪細胞を含む上層のみを採取し、エッペンドルフチューブに分注した。ヘキスト染色により核を染色し（１０００倍希釈したヘキスト、１５分間染色）、蛍光顕微鏡を用いて、Ｔｕｒｋｅｒ　Ｂｕｒｋ血球計数器上で細胞数をカウントした。
　ＡＤＳＣを含むペレットをＤＭＥＭ　１０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍディッシュ内に播種し、継代培養した。トリプシン／ＥＤＴＡを使用してＡＤＳＣをディッシュから分離し、ＤＭＥＭ　１ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。
＜組織体の製造＞
製造例１
　単離したＡＤＳＣを、ＡＬＫ５阻害剤（２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４）を０μＭ又は５μＭ含有するＥＧＭ－２　２ｍＬ、又は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ２ｍＬを培地に懸濁し、２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製）に１００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種して、３７℃でインキュベートした。
　２日ごとに培地を交換し、播種後７日間培養し、組織体を得た。
　組織体の蛍光イメージングを次の手順で行った。得られた組織体を含むトランスウェルを２４ウェルプレートに移動させた。ＰＢＳ　２ｍＬの洗浄の後、４％ＰＦＡ　２ｍＬを使用して４℃の条件下で一晩組織を固定した。ＰＢＳ　２ｍＬを用いて３回洗浄した。０．０５％　Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳを用いて、室温条件下で７分間、細胞を透過処理し（トランスウェル内に５００μＬ、トランスウェル外に５００μＬ）、ＰＢＳ　２ｍＬを用いて３回洗浄した。
　１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を用いて、室温条件下で１時間組織をブロック処理した（トランスウェル内に５００μＬ、トランスウェル外に５００μＬ）。ＢＳＡ溶液を吸引し、一次抗体溶液（１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈した抗ＣＤ３１抗体）１００μＬを添加した（トランスウェル内に５０μＬ、トランスウェル外に５０μＬ）。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、４℃の条件下で一晩インキュベートした。ＰＢＳ　２ｍＬを用いて３回洗浄した後、二次抗体溶液（１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で２００倍に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗マウスＩｇＧ抗体及び１０００倍希釈したヘキスト）１００μＬを添加した（トランスウェル内に５０μＬ、トランスウェル外に５０μＬ）。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、室温条件下で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ　２ｍＬを用いて４回洗浄した。
　トランスウェルのメンブレンを切断し、少量のＰＢＳを含むガラスボトムディッシュの底に直接ゲルを配置し、染色した組織体を共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ３０００、オリンパス株式会社製）を用い、レーザー励起光を６４０ｎｍ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）として観察した。
　図１は、血管網を有する組織体の蛍光観察結果（２０倍拡大）を示す。（ａ）はＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ）を含有しないＥＧＭ－２培地において培養した組織体、（ｂ）はＡＬＫ５阻害剤を５μＭ含有するＥＧＭ－２培地において培養した組織体、（ｃ）は１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭにおいて培養した組織体である。（ｃ）において、血管網の形成は確認できなかった。（ａ）と比較し、（ｂ）の組織体では、生体組織と同様に直径の太い血管（例えば、１０μｍ以上２５μｍ未満）と細い血管（例えば、０μｍ超１０μｍ未満）を有し、より血管の分岐数が多い血管網が形成されていることが確認された。
　ＡＬＫ５阻害剤を含む培地での培養により、脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化が促進されていることが示された。
製造例２
　単離したＡＤＳＣを、ＡＬＫ５阻害剤（２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４）を０μＭ又は５μＭ含有するＥＧＭ－２培地に懸濁し、１０ｃｍディッシュに播種して、３７℃でインキュベートした。
　２日ごとに培地を交換し、７日間培養した。その後、トリプシン／ＥＤＴＡを使用してＡＤＳＣをディッシュから分離し、ＤＭＥＭ　１ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。更に、回収されたＡＤＳＣを予めマトリゲルでコーティングした２４ウェルプレート上に、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ、２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈの濃度で播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、組織体の形態を位相差顕微鏡で評価した。図２は、製造した組織体の位相差観察画像を示す。ＡＤＳＣの細胞数にかかわらず、ＡＬＫ５阻害剤（ＡＬＫ５ｉ）を含有するＥＧＭ－２において培養した組織体の方が、ＡＬＫ５阻害剤を含有しないＥＧＭ－２において培養した組織体と比較して、より管腔形成が進んでいることが観察された。特に、ＡＤＳＣの細胞数が１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上の場合は、より血管の分岐数が多い血管網が形成されていることが確認されたことから、ＡＬＫ５阻害剤を含む培地での培養により、脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化が促進されていることが示唆された。
製造例３
　単離したＡＤＳＣを、ＡＬＫ５阻害剤（２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４）を５μＭ含有するＥＧＭ－２培地に懸濁し、１０ｃｍディッシュに播種して、３７℃でインキュベートした。２日ごとに培地を交換し、７日間培養して、組織体を得た。その後、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎを用いた５分間のインキュベーションにより、ＡＤＳＣを細胞表面のタンパク質を残したまま穏やかに剥離してディッシュから回収し、ＤＭＥＭ　１ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。
　ＢＤ　Ｆａｃｓｍｅｌｏｄｙ（登録商標）ｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いたフローサイトメトリー解析により、組織体中の血管内皮細胞の比率を解析した。上記の通り回収された組織体を、遠心分離（１００ｇ、５分間、４℃）した。その後、ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ６４７で標識した抗ＣＤ３１抗体（１００×希釈）を加え、細胞懸濁液を４℃でさらに３０分間インキュベートした。その後、遠心分離（１００ｇ、５分間、４℃）して細胞を洗浄し、ペレット化した細胞をバッファーに懸濁して１０，０００イベントを記録した。さらに、コンジュゲート抗体のアイソタイプコントロールも同時に測定した。その後、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析し、ＣＤ３１＋細胞の比率を求めた。
　結果を図３に示す。（ａ）は製造した組織体を用いた結果、（ｂ）は組織消化後に単離した細胞をそのまま用いた結果を示す。（ａ）においては、組織体から回収された全細胞数を基準として２９．２９％が血管内皮細胞であることが分かった。一方、（ｂ）では、わずか１．２０％が血管内皮細胞であった。
製造例４
　成熟脂肪細胞、ＡＤＳＣ及びＡＤＳＣ由来血管内皮細胞を、２．５：１．５：１．５の比率（細胞数）で用いて製造した組織体（細胞ボール）、並びに成熟脂肪細胞及びＡＤＳＣ由来血管内皮細胞を２．５：３の比率（細胞数）で用いて製造した組織体（細胞ボール）を、成熟脂肪細胞、ＡＤＳＣ及びＨＵＶＥＣを２．５：２：１の比率（細胞数）で用いて同様に製造した組織体（細胞ボール）と比較した。いずれの組織体も用いた細胞の総細胞数は４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｂａｌｌである。成熟脂肪細胞及びＡＤＳＣは、上記（成熟脂肪細胞及びＡＤＳＣの採取）に記載のように単離したヒト由来の細胞を用いた。ＡＤＳＣ由来血管内皮細胞は、製造例３で調整した組織体から得られたものを用いた。
　ｓＣＭＦを２．４ｍｇ秤取り、ＤＭＥＭ　１ｍＬを添加し、ｓＣＭＦの小さな粒子のみが観察されるようになるまで穏やかに混合した。室温下にて１００００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を吸引し、ｓＣＭＦペレットを得た。ＡＤＳＣ及び／又はＡＤＳＣ由来血管内皮細胞（比較例ではさらにＨＵＶＥＣ）をｓＣＭＦペレット上に穏やかに添加し、室温下にて３５００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を吸引した。フィブリノゲン（５０ｍｇ／ｍＬ　フィブリノゲンストック溶液３２μＬ）を添加し、細胞及びｓＣＭＦと穏やかに混合した。さらに成熟脂肪細胞を添加して穏やかに混合した。少量のＤＭＥＭを添加し、総量を２００μＬに調整した。すぐにトロンビン（２０２Ｕ／ｍＬ　トロンビンストック溶液３．９μＬ）を添加し、少し混合した後、低接着９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　＃４８６０－８００ＬＰ）上に混合物（細胞ボール４０個分）を各ウェル５μＬ（細胞ボール１個分）ずつ播種した。
　３７℃のインキュベータ内で１５分間インキュベートしてゲル化させ、最終濃度１０μｇ／ｍＬのインスリンを含むＥＧＭ－２　３００μＬを添加した。
　２４時間培養した後、低接着２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　＃４８２０－８００ＬＰ）に移し、２ｍＬの上記ＥＧＭ－２を添加した。培地を２～３日毎に培養７日目まで交換した。
　組織体の蛍光イメージングを次の手順で行った。得られた組織体を含むトランスウェルを２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　＃４８２０－８００ＬＰ）に移動させた。ＰＢＳ　２００μＬの洗浄の後、４％ＰＦＡ　２００μＬを使用して４℃の条件下で一晩組織を固定した。ＰＢＳ　２００μＬを用いて３回洗浄した。免疫染色のため、０．０５％　Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ　２００μＬを用いて、室温条件下で７分間、細胞を透過処理し、ＰＢＳ　２００μＬを用いて３回洗浄した。
　１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液　２００μＬを用いて、室温条件下で１時間組織をブロック処理した。ＢＳＡ溶液を吸引し、一次抗体溶液（１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈した抗ＣＤ３１抗体）１００μＬを添加した。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、４℃の条件下で一晩インキュベートした。ＰＢＳ　２００μＬを用いて３回洗浄した後、二次抗体溶液（１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で２００倍に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗マウスＩｇＧ抗体）を添加した。プレート下にウェットティッシュを敷き、アルミホイルで覆って、室温条件下で２時間インキュベートした後、ＰＢＳ　２００μＬを用いて４回洗浄した。
　共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１（横河電機製）のコンプリートプレート上に直接細胞ボールを配置し、染色した組織体を上記共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１を用い、レーザー励起光を６４０ｎｍ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７）として観察した。
　図４は、ＣＤ３１染色による、血管網を有する細胞ボールの蛍光観察結果を示す。ＡＬＫ５阻害剤により脂肪幹細胞の血管内皮細胞への分化が促進された組織体から得られた血管内皮細胞を使用した細胞ボールでは、ＡＤＳＣの使用の有無及び各種の細胞の比率にかかわらず、ＨＵＶＥＣを使用して作成した組織体と同様に血管網が形成されていた。これらの血管網は細胞ボールの内部の方まで形成されていた。
製造例５
　単離したＡＤＳＣを、ＡＬＫ５阻害剤（２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４）を０μＭ又は５μＭ含有するＥＧＭ－２培地に懸濁し、１０ｃｍディッシュに播種して、３７℃でインキュベートした。２日ごとに培地を交換し、７日間培養して、組織体を得た。その後、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎを用いた５分間のインキュベーションにより、ＡＤＳＣを細胞表面のタンパク質を残したまま穏やかに剥離してディッシュから回収し、ＤＭＥＭ　１ｍＬに懸濁し、細胞数をカウントした。
　ＢＤ　Ｆａｃｓｍｅｌｏｄｙ（登録商標）ｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いたフローサイトメトリー解析により、サンプル中の血管内皮細胞の比率を解析した。上記の通り回収されたサンプルを、遠心分離（１００ｇ、５分間、４℃）した。その後、ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ６４７で標識した抗ＣＤ３１抗体（１００×希釈）を加え、細胞懸濁液を４℃でさらに３０分間インキュベートした。その後、遠心分離（１００ｇ、５分間、４℃）して細胞を洗浄し、ペレット化した細胞をバッファーに懸濁して１０，０００イベントを記録した。さらに、コンジュゲート抗体のアイソタイプコントロールも同時に測定した。その後、Ｆｌｏｗｊｏ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて解析し、ＣＤ３１＋細胞の比率を求めた。
　結果を図５に示す。５μＭのＡＬＫ５阻害剤含有ＥＧＭ２培地下で培養したサンプルでは、回収された全細胞数を基準として３２．４％が血管内皮細胞であることが分かった。一方、ＡＬＫ５阻害剤を含まないＥＧＭ２培地下で培養したサンプルでは、１４．１％が血管内皮細胞であり、ＡＬＫ５阻害剤がＡＤＳＣからの血管内皮細胞への分化を顕著に誘導したことが示された。
　単離したＡＤＳＣを、ＥＧＭ－２培地に懸濁し、１０ｃｍディッシュに播種して、３７℃でインキュベートした。２日ごとに培地を交換し、７日間培養して、組織体を得た。この組織体から、ＡＤＳＣ、ＡＤＳＣ由来血管内皮細胞、及び血管内皮前駆細胞を含む細胞を回収した。
　上記回収した細胞、ｓＣＭＦ、フィブリン、成熟脂肪細胞、及びトロンビンを製造例４と同様の方法で混合し、低接着９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　＃４８６０－８００ＬＰ）上に混合物（細胞ボール４０個分）を各ウェル５μＬ（細胞ボール１個分）ずつ播種した。用いた組織体（細胞ボール）の総細胞数は、４．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｂａｌｌであり、成熟脂肪細胞、及び上記回収した細胞は、３：２．５の比率で用いて製造した。
　低接着９６ウェルプレートに播種した細胞ボールを、３７℃のインキュベータ内で１５分間インキュベートしてゲル化させ、ＥＧＭ－２又はＫＢＭ　３００μＬを添加した。なお、上記ＥＧＭ－２又はＫＢＭは、最終濃度１０μｇ／ｍＬのインスリン、５μＭのＡＬＫ－５阻害剤（２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社　Ｎｏ．　１４７９４）及び、０．５ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、又は１μｇ／ｍＬのレプチンを含むように調整したものを用いた。また、コントロールとして最終濃度１０μｇ／ｍＬのインスリン、及び５μＭのＡＬＫ－５阻害剤のみを含むＥＧＭ－２又はＫＢＭを用いた。
　２４時間培養した後、低接着２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　＃４８２０－８００ＬＰ）に移し、２ｍＬの上記ＥＧＭ－２又はＫＢＭを添加した。培地を２～３日毎に培養７日目まで交換した。
　組織体の蛍光イメージングを、一次抗体溶液として１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈した抗フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗体を用いたこと、及び二次抗体溶液として１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で２００倍に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ウサギＩｇＧ抗体溶液を用いたこと以外は製造例４と同様にして行った。ｖＷＦは、血管内皮細胞のマーカーとして用いた。また、観察は共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１（横河電機製）のコンプリートプレート上に直接細胞ボールを配置し、染色した組織体を、上記共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１を用い、レーザー励起光を６４０ｎｍとした。
　ｖＷＦ染色による血管網を有する細胞ボールの蛍光観察結果を図６に示す。ＶＥＧＦを含む培地中で培養した細胞ボールでは、ＶＥＧＦを含まない培地中で培養したコントロールの細胞ボールと比較して、より血管の分岐数が多い血管網が形成されていた。また、レプチンを含む培地で培養した細胞ボールと比較しても、ＶＥＧＦを含む培地中で培養した細胞ボールは、より血管の分岐数が多い血管網が形成されていた。ＶＥＧＦを添加した培地中で培養した細胞ボールの中でも、培地に２０ｎｇ／ｍＬ以上のＶＥＧＦを含む培地で培養することで、さらに血管の多い血管網が形成されていた。
　この結果から、培地にＡＬＫ－５阻害剤に加えてＶＥＧＦを添加することにより、ヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化及び血管新生がより促進されていることが示された。
製造例７
　製造例６と同様の方法で、組織体（細胞ボール）を製造した。製造した組織体を低接着９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　＃４８６０－８００ＬＰ）上に混合物（細胞ボール４０個分）を各ウェル５μＬ（細胞ボール１個分）ずつ播種した。
　低接着９６ウェルプレートに播種した細胞ボールを、３７℃のインキュベータ内で１５分間インキュベートしてゲル化させ、最終濃度１０μｇ／ｍＬのインスリン、５μＭのＡＫＬ－５阻害剤、及び５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含むＥＧＭ－２　３００μＬを添加した。
　２４時間培養した後、低接着２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ　＃４８２０－８００ＬＰ）に移し、２ｍＬの上記ＥＧＭ－２又はＫＢＭを添加した。培地を２～３日毎に培養７日目まで交換した。
　組織体の蛍光イメージングを、様々な一次抗体溶液及びそれらに対応する二次抗体溶液を用いたこと以外は製造例４と同様にして行った。一次抗体溶液は、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈したウサギ抗ＣＤ３４抗体、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈したマウス抗ＣＤ３１、又は１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈したウサギ抗フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗体を用いた。二次抗体溶液は、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で２００倍に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６標識抗マウスＩｇＧ抗体、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で２００倍に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた。ＣＤ３４は、血管内皮前駆細胞のマーカーとして用いた。ＣＤ３１は、血管内皮前駆細胞及び血管内皮細胞のマーカーとして用いた。ｖＷＦは、血管内皮細胞のマーカーとして用いた。また、ヘキスト染色による核の染色も行った。
　観察は、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１（横河電機製）のコンプリートプレート上に直接細胞ボールを配置し、染色した組織体を、上記共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ１を用いた。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６に対するレーザー励起光を５５６ｎｍとし、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７に対するレーザー励起光を６４０ｎｍとした。
　その結果を図７に示す。ＶＥＧＦの培地への添加により、全ＣＤ３１陽性細胞に対するｖＷＦ陽性細胞の割合が、ＣＤ３４陽性細胞の割合よりも高くなっていた。つまり、上記のとおり製造した細胞ボールにおいて、血管内皮前駆細胞数よりも血管内皮細胞数の方が多かった。また、血管網も形成されていた。
　この結果から、培地にＡＬＫ－５阻害剤に加えてＶＥＧＦを添加することにより、ヒト由来の脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化及び血管新生がより促進されていることが示された。

 

Claims (14)

  1. 　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、血管内皮細胞を含む組織体の製造方法。
  2. 　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞が、血管内皮細胞を含まない、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、前記ＴＧＦΒタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、請求項１に記載の製造方法。
  4. 　インキュベートが、９６時間以上２８８時間以下で行われる、請求項１に記載の製造方法。
  5. 　前記細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、請求項１に記載の製造方法。
  6. 　前記組織体において、前記断片化細胞外マトリックス成分が前記細胞同士の隙間に配置されている、請求項５に記載の製造方法。
  7. 　前記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、請求項５に記載の製造方法。
  8. 　インキュベート前に、水性媒体中において前記細胞と前記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、請求項５～７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 　ヒト由来の脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞をＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、脂肪由来幹細胞の血管内皮細胞への分化促進方法。
  10. 　前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることが、前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤が含まれる培地中でインキュベートすることであり、培地における前記ＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の含有量が１μＭ以上１０μＭ以下である、請求項９に記載の方法。
  11. 　インキュベートが、９６時間以上２８８時間以下で行われる、請求項９に記載の方法。
  12. 　脂肪由来幹細胞を少なくとも含む細胞を断片化細胞外マトリックス成分とともにＴＧＦβタイプＩ受容体阻害剤の存在下でインキュベートすることを含む、請求項９に記載の方法。
  13. 　前記断片化細胞外マトリックス成分が断片化コラーゲン成分である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　インキュベート前に、水性媒体中において前記細胞と前記断片化細胞外マトリックス成分とを接触させる工程をさらに含む、請求項１２又は１３に記載の方法。

     
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