JP2022036357A - 細胞構造体及び細胞構造体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
〔1〕 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有する細胞構造体であって、
上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。
〔2〕 上記血管網が、上記脂肪細胞間に形成されている〔1〕に記載の細胞構造体。
〔3〕 上記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、〔1〕又は〔2〕に記載の細胞構造体。
〔4〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が、100nm以上400μm以下である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔5〕 細胞構造体における細胞外マトリックス成分含有率が、上記細胞構造体の乾燥重量を基準として0.01~90質量%である、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔6〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔7〕 フィブリンをさらに含む、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔8〕 移植用である、〔1〕~〔6〕のいずれかに記載の細胞構造体。
〔9〕 断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程であって、細胞が、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む工程と、
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程と
を含む、細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法。
〔10〕 上記細胞が、脂肪細胞、脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む、〔9〕に記載の方法。
〔11〕 上記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、〔9〕又は〔10〕に記載の方法。
〔12〕 上記接触工程における上記断片化された細胞外マトリックス成分の量が、1.0×106cellsの細胞に対して、0.1~100mgである、〔9〕~〔11〕のいずれかに記載の方法。
〔13〕 上記接触工程おける幹細胞と血管内皮細胞の細胞数の比が、100/1~1/100である、〔9〕~〔12〕のいずれかに記載の方法。
〔14〕 上記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、〔9〕~〔13〕のいずれかに記載の方法。
〔15〕 上記接触工程、又は上記接触工程後かつ培養工程前に、フィブリノゲンを添加することをさらに含む、〔9〕~〔14〕のいずれかに記載の方法。
〔16〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を移植物として有する、非ヒトモデル動物。
〔17〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトモデル動物の製造方法。
〔18〕 〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の細胞構造体を動物に移植することを含む、血管構造を有する細胞構造体の移植方法。
〔19〕 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有し、
支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体であって、
上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。
〔20〕 略球体状である、〔19〕に記載の細胞構造体。
〔21〕 断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程であって、細胞が、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む工程と、
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程と
を含み、
上記培養工程が、上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を支持体に接着しない状態で培養することを含む、細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法。
〔22〕 上記培養工程が、支持体から上記断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を引き離すことを含む、〔21〕に記載の方法。
〔23〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を含み、上記血管網が、複数の細胞構造体間で接続している、細胞組織。
〔24〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を浮遊培養することを含む、細胞組織の製造方法。
〔25〕 複数の〔19〕又は〔20〕に記載の細胞構造体を非ヒト動物に移植することを含む、非ヒトモデル動物の製造方法。
〔26〕 細胞構造体を非ヒト動物に移植した後、30日以上生育することを含む、〔25〕に記載の方法。
〔27〕 細胞構造体を非ヒト動物に移植した後、90日以上生育することを含む、〔26〕に記載の方法。
本実施形態に係る細胞構造体は、断片化された細胞外マトリックス成分と、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む細胞とを含み、細胞間に血管網を有する。
本明細書において「細胞」は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の哺乳類動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、幹細胞であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。
本実施形態に係る細胞構造体は、細胞間に血管網を有する。「細胞間に血管網を有する」とは、生体組織と同様に、分岐した血管が細胞を取り囲むように細胞と細胞の間に延びた構造を有することを意味する。生体組織と同様の血管網が形成されているか否かについては、例えば、生体組織における血管の分岐数及び/又は血管の分岐間の長さ及び/又は血管の直径の多様性に基づき判断することができる。例えば、生体組織における血管の分岐数の平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、80%以上150%以下、85%以上130%以下、又は90%以上120%以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。また、例えば、細胞構造体における血管の分岐数の平均値が、2.5以上4.5以下、又は3.0以上4.2以下である場合に、生体組織における血管の分岐数と類似していると判断してもよい。例えば、生体組織における血管の分岐間の長さの平均値に対する、細胞構造体における血管の分岐間の長さの平均値が、80%以上150%以下、85%以上130%以下、及び90%以上120%以下である場合に、生体組織における血管の分岐間の長さと類似していると判断してもよい。生体組織においては、太い血管及び細い血管の両方が観察される。そこで、例えば、生体組織と同様に直径の太いもの(例えば、10μm以上25μm未満)と細いもの(例えば、0μm超10μm未満)の両方が観察された場合には、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。また、例えば、0μm超25μm未満に血管直径全体の60%以上、70%以上又は80%以上が分布している場合に、生体組織における血管の直径と同様の多様性を有すると判断してもよい。本実施形態に係る細胞構造体は、脂肪細胞間に血管網を有することが好ましい。その場合、血管網を有するだけでなく、血管に取り囲まれる脂肪細胞も生体組織と近いことが好ましい。例えば、本実施形態に係る細胞構造体における脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、20μm~180μm、又は100μm~180μmである場合に、細胞構造体が生体組織における脂肪細胞と同様の脂肪細胞を有すると判断してもよい。上記生体組織及び細胞構造体の比較に際しては、同じ条件(例えば、一定体積当たり、画像解析であれば一定面積当たり、一定サンプル当たり等)にて生体組織と細胞構造体を比較する。
本明細書において「細胞外マトリックス成分」とは、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックスとは、生物において細胞の外に存在する物質を意味する。細胞外マトリックスとしては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。具体例としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン及びフィブリリン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらの1種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲン成分を含んでいてよく、コラーゲン成分であってもよい。本実施形態における細胞外マトリックス成分は、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックス成分であることが好ましい。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。
(サンプルの調製)
凍結乾燥処理を行った細胞構造体の全量を6mol/L HClと混合し、ヒートブロックで95℃、20時間以上インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように6mol/L HClで適宜希釈した後、200μLを100μLの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは35μL用いる。
スクリューキャップチューブに125μLのスタンダード溶液(1200μg/mL in acetic acid)と、125μLの12mol/l HClを加え混合し、ヒートブロックで95℃、20時間インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して300μg/mLのS1を作製し、S1を段階的に希釈してS2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)を作製する。4mol/l HCl90μLのみのS8(0μg/mL)も準備する。
35μLのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート(QuickZyme Total Collagen Assayキット付属、QuickZyme Biosciences社)に加える。75μLのアッセイバッファ(上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、20分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、75μLのdetection reagent (reagent A:B=30μL:45μL、上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、60℃で60分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして570nmの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。
本実施形態に係る細胞構造体は、フィブリンを含んでいてもよい。フィブリンは、フィブリノゲンにトロンビンが作用してAα鎖、Bβ鎖のN末端からA鎖、B鎖を放出して生ずる成分である。フィブリンはポリマーであり、一般的に水に不溶である。フィブリンは、フィブリノゲンと、トロンビンとを接触させることにより形成される。
本実施形態に係る細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法は、断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程と、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程とを含む。上記接触工程において、細胞は、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む。
本実施形態に係る製造方法において、接触工程は、断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる工程である。
本実施形態に係る製造方法において、培養工程は、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する工程である。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
上述した支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体、すなわち、「断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、細胞間に血管網を有し、支持体と接着していない状態で塊状に集合した細胞構造体であって、上記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体」を複数用いて、上記血管網が、複数の細胞構造体間で接続している細胞組織を製造することができる。
上述したように、本実施形態に係る細胞構造体は、生体組織のように細胞間に血管網が形成されており、哺乳類等の動物に移植した際に生着しやすくなることも期待されることから、移植用とすることができる。移植に用いる細胞構造体は、1つであってもよく、複数であってもよい。複数である場合には、例えば、1個~1000個、10個~500個、又は50個~200個用いることができる。
ブタ皮膚由来コラーゲンI型スポンジ断片(日本ハム株式会社製)100mgを200℃で24時間加熱を行うことにより、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分(架橋コラーゲン成分)を得た。なお、200℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。架橋コラーゲン成分50mgを15mLチューブに入れ、5mLの超純粋を加え、ホモジナイザー(アズワン社 VH-10)を用いて6分間ホモジナイズすることで架橋コラーゲン成分を解繊した。
細胞構造体の作製において用いた細胞、試薬及び作成方法等は以下のとおりである。
(細胞及びコラーゲン)
・初代ヒト成熟脂肪細胞及びヒト脂肪幹細胞(ADSC)を得るためのヒト脂肪組織(太もも由来)(京都府立医科大学附属病院から提供)
・ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)(ロンザ社製 #C-2517A)
・解繊コラーゲン成分(sCMF)(試験1にて作製したもの)
・ウシ膵臓由来インスリン(シグマ社 #I1882)
・ウシ血漿由来トロンビン凍結乾燥粉末(シグマ社 #T4648)
・クロストリジウム ヒストリチクム由来コラゲナーゼI型(シグマ社 #C0130)
・ウシ血漿由来フィブリノゲンI-S型(シグマ社 #F8630)
・DMEM(高グルコース、ナカライテスク社)
・EGM-2MV BulletKit with growth factors(ロンザ社製 #C-2517A)
・EGM-2培地:500mLのEBM-2にEGM-2 supplement growth factorsと混合し、4℃で保存したもの
・10mg/mL インスリンストック溶液:上記ウシ膵臓由来インスリン100mgを水で希釈した1%氷酢酸溶液(pH≦2)10mLに溶かし、エッペンドルフチューブに等量分注し-20℃で保存したもの
・2mg/mL コラゲナーゼ溶液:BSA 2.5gをDMEM(0%FBS、1%抗生物質)50mLと混合しておく。6ウェルプレートすべての脂肪組織を消化するために、コラゲナーゼI型26mgをDMEM(0%FBS、5%BSA、1%抗生物質)13mLに混合し、孔径0.2μmのフィルターでろ過したものを使用。
・50mg/mL フィブリノゲンストック溶液:フィブリノゲン 50mgをエッペンドルフチューブに秤とり、DMEM(0%FBS、1%抗生物質)1mLをすぐに加える。手動でチューブを振って混合した後、37℃のウォーターバスに3~5分間置き、孔径0.2μmのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
・202U/mL トロンビンストック溶液:トロンビン 202Uをエッペンドルフチューブに秤とり、DMEM(0%FBS、1%抗生物質)1mLをすぐに加え、37℃のウォーターバスに3~5分間置いて溶解させる。その後、孔径0.2μmのフィルターでろ過し、エッペンドルフチューブに等量分注したものを使用。
ヒト脂肪組織断片を5%の抗生物質を含むPBSで洗浄した。4~6gの組織を6ウェルプレートの6ウェル分に分けた。2mg/mL コラゲナーゼ溶液2mL中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻んだ。37℃及び230rpmで1時間インキュベートした後、10mLピペットで30分間混合した。溶解物を孔径500μmの鉄メッシュフィルターでろ過し、1ウェル当たり2mLのDMEMを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温(15~25℃)下にて200gで3分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び10mLシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層及び上層と下層の間の媒体の3層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。二回の洗浄をした後、25mLのDMEMで洗浄した。
成熟脂肪細胞を500000cells、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、成熟脂肪細胞を囲むように血管網が形成された細胞構造体が作製できた。図3は、試験例2と同様に染色した細胞構造体の蛍光観察結果(10倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞の細胞数及びsCMFの量を変更しても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
成熟脂肪細胞を使用せず、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg、トロンビンを0.3U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、血管網を有する細胞構造体が作製できた。図4は、抗CD31抗体を用いて血管のみを染色した細胞構造体の蛍光観察結果(4倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞を使用しなくても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
成熟脂肪細胞を使用せず、HUVECを50000cells(ADSC:HUVEC=5:1)、sCMFを2mg、フィブリノゲンを0.6mg、トロンビンを0.3U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製したところ、血管網を有する細胞構造体が作製できた。図5は、抗CD31抗体を用いて血管のみを染色した細胞構造体の蛍光観察結果(4倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞を使用せず、ADSCとHUVECの割合を変更しても、血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。
成熟脂肪細胞、ADSC及びHUVECに代えて、ヒトの太もも(生体組織)から脂肪吸引により得られた脂肪組織を使用し、播種前の総量を60μLに調整した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。脂肪組織は、採取した3gの生体組織をはさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻み、10mLシリンジを用いてゆっくり数回ピペッティングすることで液体状にした。液体状になった脂肪組織から60μLを取って、sCMFと混合した。なお、脂肪吸引により得られた脂肪組織には、成熟脂肪細胞、脂肪幹細胞及び血管内皮細胞が含まれている。図6は、試験例2と同様の方法により染色した細胞構造体の蛍光観察結果(10倍拡大)を示す。成熟脂肪細胞、ADSC及びHUVECに代えて、生体組織から得られた脂肪組織を使用しても血管網を有する細胞構造体が作製できることが示された。sCMFを2mg使用した場合にも同様に血管網を有する細胞構造体が作製できることを確認した。
sCMFを使用せず、フィブリノゲンを1mg、トロンビンを0.5U使用した以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。作製した細胞構造体において血管の形成は観察されなかった。また、ADSCを含まない以外は試験例2と同様の方法により細胞構造体を作製した。作製した細胞構造体においては、ごくわずかな血管の形成しか観察されず、成熟脂肪細胞を囲む血管網の形成は確認できなかった。
試験例2と同様に、細胞構造体の作製において用いる細胞、試薬、培地及び各種溶液を準備した。解繊コラーゲン成分(sCMF)も試験例1と同様の方法により作製したものを用いた。本試験例の概要を図7に示す。図7において、左の液滴中の円は成熟脂肪細胞を、白い菱形はADSCを、グレーの短棒はHUVECをそれぞれ示す。
ヒト脂肪組織断片を5%の抗生物質を含むPBSで洗浄した。4~6gの組織を6ウェルプレートの6ウェル分に分けた。2mg/mL コラゲナーゼ溶液2mL中ではさみ及びピンセットを使用しておよそ1~3mmのサイズに細かく切り刻んだ。37℃及び230rpmで1時間インキュベートした後、10mLピペットで30分間混合した。溶解物を孔径500μmの鉄メッシュフィルターでろ過し、1ウェル当たり2mLのDMEMを添加して消化された細胞すべてを回収した後、室温(15~25℃)下にて200gで3分間遠心した。成熟脂肪細胞は上層の黄色の油性層に、脂肪幹細胞及び血球はペレットに含まれる。長い針及び10mLシリンジを用いて、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄し、上層に含まれる成熟脂肪細胞並びに下層に含まれる脂肪幹細胞及び血球を25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回洗浄した。洗浄を行う際には、上述したのと同様に遠心することで、上層及び下層及び上層と下層の間の媒体の3層に分離し、上層と下層の間の媒体を吸引及び廃棄した。25mLのPBS(5%BSA、1%抗生物質)で二回の洗浄をした後、25mLのDMEMで洗浄した。
試験例7で作製した培養7日後の5μLの細胞ボール複数を隣接して接触させた状態で培養液10mL中で7日間浮遊培養した。試験例7と同様に染色して観察した。その結果、図11に示されるように、複数の細胞ボール(図11では5個)が凝集し、合体した細胞組織が得られた。5個の細胞ボールが合体した細胞組織は、各細胞ボール内で血管網が接続されているだけでなく、複数の細胞ボール間でも血管網が接続されていることが確認された(図11左及び右上)。
免疫不全マウスを6個体準備し、背中の皮膚を切開し、切開箇所に以下の(1)~(3)をそれぞれ流し込み、縫合した後、3個体は30日間、3個体は90日間生育した。
(1)試験例7で作成した培養後の細胞ボール111個を2.5mgフィブリノゲン及び1.25Uのトロンビンを含む溶液100μLに懸濁した混合物
(2)HUVECを使用しない以外は(1)と同様に作製した細胞ボール111個を2.5mgフィブリノゲンおよび1.25Uのトロンビンを含む溶液100μLに懸濁した混合物
(3)試験例6にて、ヒトの太もも(生体組織)から脂肪吸引により得られた脂肪組織を使用し作製した細胞構造体(100μL)
Claims (15)
- 断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞を含み、
細胞間に血管網を有する細胞構造体であって、
前記細胞が、少なくとも脂肪細胞及び血管内皮細胞を含む、細胞構造体。 - 前記血管網が、前記脂肪細胞間に形成されている、請求項1に記載の細胞構造体。
- 前記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、請求項1又は2に記載の細胞構造体。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が、100nm以上400μm以下である、請求項1~3のいずれか一項に記載の細胞構造体。
- 細胞構造体における細胞外マトリックス成分含有率が、前記細胞構造体の乾燥重量を基準として0.01~90質量%である、請求項1~4のいずれか一項に記載の細胞構造体。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の細胞構造体。
- フィブリンをさらに含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞構造体。
- 移植用である、請求項1~6のいずれか一項に記載の細胞構造体。
- 断片化された細胞外マトリックス成分と細胞とを接触させる接触工程であって、細胞が、(i)少なくとも脂肪細胞、幹細胞及び血管内皮細胞を含むか、又は(ii)少なくとも脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む工程と、
断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する培養工程と
を含む、細胞間に血管網を有する細胞構造体の製造方法。 - 前記細胞が、脂肪細胞、脂肪幹細胞及び血管内皮細胞を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記脂肪細胞が、成熟脂肪細胞を含む、請求項9又は10に記載の方法。
- 前記接触工程における前記断片化された細胞外マトリックス成分の量が、1.0×106cellsの細胞に対して、0.1~100mgである、請求項9~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程おける幹細胞と血管内皮細胞の細胞数の比が、100/1~1/100である、請求項9~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記断片化された細胞外マトリックス成分が、コラーゲンを含む、請求項9~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触工程、又は前記接触工程後かつ培養工程前に、フィブリノゲンを添加することをさらに含む、請求項9~14のいずれか一項に記載の方法。
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