JP2023030074A - 三次元組織体及びその製造方法、並びに、三次元組織体の形成剤 - Google Patents
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Abstract
Description
このような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。
[1]細胞と、内因性コラーゲンを含むコラーゲンとを含み、上記細胞の少なくとも一部が上記コラーゲンに接着している三次元組織体であって、
上記コラーゲンの含有率が、上記三次元組織体を基準として10重量%~90重量%である、三次元組織体。
[2]上記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、請求項1に記載の三次元組織体。
[3]トリプシンの濃度0.25%、温度37℃、pH7.4、反応時間15分でトリプシン処理を行った後の上記三次元組織体の残存率が70%以上である、上記[1]又は[2]に記載の三次元組織体。
[4]厚さが10μm以上である、上記[1]~[3]のいずれかに記載の三次元組織体。
[5]上記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む、上記[1]~[4]のいずれかに記載の三次元組織体。
[6]上記コラーゲンとして、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを更に含む、上記[1]~[5]のいずれかに記載の三次元組織体。
[7](1)水性媒体中において、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンと、細胞とを接触させる工程、及び
(2)上記断片化コラーゲンが接触した上記細胞を培養する工程、
を含む、三次元組織体の製造方法。
[8]上記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、上記[7]に記載の製造方法。
[9]工程(1)及び工程(2)の間に、水性媒体中における上記断片化コラーゲンと上記細胞とを共に沈降させる工程を更に含む、上記[7]又は[8]に記載の製造方法。
[10]工程(1)の工程が、水性媒体中で細胞の層を形成させた後、上記断片化コラーゲンを接触させることで行われる、上記[7]又は[8]に記載の製造方法。
[11]上記断片化コラーゲンの平均長が100nm~200μmである、上記[7]~[10]のいずれかに記載の製造方法。
[12]上記断片化コラーゲンの平均径が50nm~30μmである、上記[7]~[11]のいずれかに記載の製造方法。
[13]上記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む、上記[7]~[12]のいずれかに記載の製造方法。
[14]上記断片化コラーゲンと、上記細胞との質量比が、900:1~9:1である、上記[7]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15]断片化コラーゲンを含む、三次元組織体の形成剤であって、
上記断片化コラーゲンの平均長が100nm~200μmであり、上記断片化コラーゲンの平均径が50nm~30μmである、三次元組織体の形成剤。
本実施形態に係る三次元組織体は、コラーゲン産生細胞を含む細胞と、内因性コラーゲンを含むコラーゲンとを含み、上記細胞の少なくとも一部が上記コラーゲンに接着している三次元組織体である。従来の三次元組織体は、コラーゲンの濃度が低く、且つ細胞密度が高いものであった。そのため、培養中又は培養後に細胞のけん引力によって三次元組織体が収縮したり、培養中又は培養後に細胞が産生する酵素によって三次元組織体が容易に分解される等の問題があった。本実施形態に係る三次元組織体は、コラーゲンの濃度が従来のものより高く、収縮が起きにくく安定である。
(サンプルの調製)
凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を6M HClと混合し、ヒートブロックで95℃、20時間以上インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように6M HClで適宜希釈した後、200μLを100μLのミリQで希釈することでサンプルを調製する。サンプルは35μL用いる。
(スタンダードの調製)
スクリューキャップチューブに125μLのスタンダード溶液(1200μg/mL in acetic acid)と、125μLの12M HClを加え混合し、ヒートブロックで95℃、20時間インキュベートした後、室温に戻す。13000gで10分遠心分離した後、上澄みをミリQで希釈して300μg/mLのS1を作製し、S1を段階的に希釈してS2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)を作製する。4M HCl 90μLのみのS8(0μg/mL)も準備する。
(アッセイ)
35μLのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート(QuickZyme Total Collagen Assayキット付属、QuickZyme Biosciences社)に加える。75μLのアッセイバッファ(上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、20分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、75μLのdetection reagent (reagent A:B=30μL:45μL、上記キット付属)をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、60℃で60分インキュベートする。氷で室温まで冷まし、シールをはがして570nmの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。
また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する2点間の距離であって最短の距離を意味する。
本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、
(1)水性媒体中において、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンと、細胞とを接触させる工程、及び
(2)上記断片化コラーゲンが接触した上記細胞を培養する工程、
を含む。
特許文献2に記載の製造方法では、厚さが1mm程度の三次元組織体を製造するために、細胞が少なくとも106cells必要であった。本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが1mm以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造できる。
断片化コラーゲンの直径及び長さは、電子顕微鏡によって個々の断片化コラーゲンを解析することによって求めることが可能である。
収縮率(%)={(L1―L3)/L1}×100
本実施形態に係る三次元組織体の形成剤は、断片化コラーゲンを含む、三次元組織体の形成剤であって、上記断片化コラーゲンの平均長が100nm~200μmであり、上記断片化コラーゲンの平均径が50nm~30μmである。また、断片化コラーゲンの長さについて、断片化コラーゲン全体のうち95%が100nm~200μmの範囲にあってもよい。さらに、断片化コラーゲンの直径について、断片化コラーゲン全体のうち95%が50nm~30μmの範囲にあってもよい。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体を10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)に分散し、ホモジナイザーを用いて2分間ホモジナイズすることで、直径が約20~30μmであり、長さが約100~200μmである断片化コラーゲンを得た(図1の(A))。断片化コラーゲンの直径及び長さは電子顕微鏡によって個々の断片化コラーゲンを解析することで求めた。得られた断片化コラーゲンを無血清培地(DMEM)で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。得られた断片化コラーゲンの培地分散液は、室温で1週間保存できた。後述する各三次元組織体の製造においては、同様の方法で得られた断片化コラーゲンを用いた。
血清を含む培地(DMEM)にて濃度が6.02mg/mlとなるように断片化コラーゲンを分散した。断片化コラーゲンは、実施例1の2分間ホモジナイズしたものを用いた。得られた分散液166μl(断片化コラーゲン、約1mg相当)と、1×105cellsの正常ヒト皮膚由来線維芽細胞(NHDF)とを非接着96ウェル丸底プレートに添加した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物が丸い形状となり、1週間培養後には直径約1.5mmの球体状の三次元組織体(図2の(A))が得られた。得られた三次元組織体をヘマトキシリン・エオジン(HE)、又はトルイジンブルー(TB)で染色したところ、断片化コラーゲン及びNHDFがそれぞれ均一に分布していることが確認できた(図2の(B)及び(C))。得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約30重量%であった。
NHDFとヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)とを80:20の割合(細胞数)で混合して非接着96ウェル丸底プレートに播種した。このとき、断片化コラーゲンは、実施例1の2分間ホモジナイズしたものを用い、播種した全細胞数(1.0×105cells)を基準として、実施例2と同様の量を加えた。その後、DMEMと血管内皮細胞専用培地(EGM2、ロンザ社製)との1:1(体積比)の混合培地で1週間培養することで、三次元組織体が得られた(図5の(A))。得られた三次元組織体におけるコラーゲンの含有率を算出したところ、約30重量%であった。得られた三次元組織体を抗CD31抗体で染色したところ、三次元組織体の内部まで染色が確認された(図5の(B))。この結果から、毛細血管を含む三次元組織体を製造できることが分かった。
10mgの断片化コラーゲン(実施例1の2分間ホモジナイズしたもの)と10×105cellsのNHDFとを混合して接着性の96ウェルインサート及び24ウェルインサートにそれぞれ播種して培養すると、三次元組織体の収縮はほとんど見られず、約3mmと1mmの厚さの三次元組織体が得られた(図6)。96ウェルインサートにおいて得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約30重量%であった。24ウェルインサートにおいて得られた三次元組織体における、コラーゲンの重量%を算出したところ、約30重量%であった。
NHDFとがん細胞とを混合して三次元組織体を製造することも可能であった。具体的にはヒト大腸がん細胞HT29をNHDFと1:1の割合で混合(全細胞数1.0×105cells)して非接着96ウェル丸底プレートに播種したこと以外は、実施例2と同様の条件で三次元組織体を製造した。得られた三次元組織体のHE染色写真を、図8に示す。直径約2mmの三次元組織体の内部にHT29とNHDFが均一に分布している様子が観察された。得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約30重量%であった。
同様の手法で、ヒト心臓線維芽細胞(NHCF)とヒトiPS細胞由来心筋細胞(iPS-CM)とを用いて三次元組織体を製造した(図9)。具体的にはNHCFとiPS-CMとを25:75の割合で混合して非接着96ウェル丸底プレートに播種したこと以外は、実施例2と同様の条件(全細胞数1.0×105cells)で三次元組織体を製造した。得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約30重量%であった。得られた三次元組織体は、1~2週間培養後も一分間に30~40回程度の同期拍動を示した。この実験結果から、三次元組織体におけるiPS-CMは、生体内の心筋細胞に近い環境にあることが示唆された。また、本発明に係る三次元組織体が、実験動物の代替品、及び移植材料として好適な組織体であることが示唆された。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体を10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)に分散し、ホモジナイザーを用いて2分間ホモジナイズし、断片化コラーゲンを得た。血清を含む培地(SmGM-2、ロンザ社製)にて濃度が10mg/mlとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液200μl(断片化コラーゲン、約2mg相当)と、1×105cellsの正常ヒト大動脈平滑筋細胞(Arota-SMC)とを24ウェルセルカルチャーインサート(コーニング社製)に添加した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物がインサートに適合した形状となり、1週間培養後には厚さ約0.3mmの三次元組織体が得られた。得られた三次元組織体を10%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)で染色したところ、断片化コラーゲン及びArota-SMCがそれぞれ均一に分布していることが確認できた(図10)。断片化コラーゲンを約3mg、4mg、8mg用いた場合にも、厚さは異なるが同様の結果が得られた。
実施例7と同様に断片化コラーゲンを培地に懸濁して得た分散液200μl(断片化コラーゲン、約3mg相当)と、5.0×105cellsのArota-SMCとを懸濁し、96ウェルインサート(ACEA Bioscience社製)に添加後、一週間培養し、三次元組織体を構築した。更に、構築した三次元組織体の上に、6×104個のヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞(HUVEC)を培地に懸濁し、自然沈降で三次元組織体上に堆積させた。三次元組織体を10%PFAで固定後、薄切し、CD31による免疫染色を行った。24時間培養後には一層の内皮細胞の層が三次元組織体上に構築され、より生体の血管壁に近い組織体が得られた(図12)。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体を10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)に分散し、ホモジナイザーを用いて2分間ホモジナイズし、断片化コラーゲンを得た。血清を含む培地(DMEM)にて濃度が10mg/mlとなるように断片化コラーゲンを分散した。(2分の時)得られた分散液800μl(断片化コラーゲン、約8mg相当)と、正常ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)(5.0×105cells、8.0×105cells、1.0×106cells)とを24ウェルセルカルチャーインサート(コーニング社製)に添加した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物がインサート形状に適合した円柱体となり、3日培養後には直径約1.5mmの厚さの三次元組織体が得られた。多量なコラーゲンが存在するにもかかわらず、組織の収縮はほとんど見られなかった。得られた三次元組織体をヘマトキシリン・エオジン(HE)で染色したところ、5.0×105cells、8.0×105cells及び1.0×106cellsのHGFのいずれを用いた三次元組織体も、断片化コラーゲン及びHGFがそれぞれ均一に分布していることが確認できた(図13「ホモジナイゼーション:2分」)。
下層(HGF層)の作製:日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン8mg(2分間のホモジナイゼーションにより断片化したもの)と、正常ヒト歯肉線維芽細胞(HGF)1.0×106cellsをD-MEM(和光純薬工業株式会社製)に混合懸濁し、24ウェルインサート(コーニング社製)に添加し、インサート外側に培地を添加して、一晩培養した。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体50mgを10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)5mLに分散し、ホモジナイザーを用いて2分間ホモジナイズし、断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地(DMEM)で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。血清を含む培地(SmGM-2、ロンザ社製)にて濃度が10mg/mLとなるように断片化コラーゲンを分散した。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体50mgを10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)5mLに分散し、ホモジナイザーを用いて6分間ホモジナイズし、断片化コラーゲン(CMF)を得た。3,500rpm 3分で遠心分離した後、無血清培地(DMEM)を加えて1分洗浄し、再度3,500rpm 3分で遠心分離し、上澄みを除去した。血清を含む培地(DMEM)を全量が5mLになるように加え、断片化コラーゲンを分散した。
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来I型コラーゲン凍結乾燥体50mgを10倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水(×10 PBS)5mLに分散し、ホモジナイザーを用いて6分間ホモジナイズし、断片化コラーゲン(CMF)を得た。3,500rpm 3分で遠心分離した後、無血清培地(DMEM)を加えて1分洗浄し、再度3,500rpm 3分で遠心分離し、上澄みを除去した。血清を含む培地(DMEM)を全量が5mLになるように加え、断片化コラーゲンを分散した。
上記サンプルDay3-1、Day3-2、Day3-3、Day5-1、Day5-2及びDay5-5を、それぞれ非接着96ウェル丸底プレートから回収後、FDU-2200型(東京理化器械製)により凍結乾燥処理を行った。スクリューキャップチューブにおいて、三次元組織体の全量を6M HClと混合し、ヒートブロックで95℃、20時間以上インキュベートした後、室温に戻した。13000gで10分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを6M HClで10倍希釈し、さらに、200μLを100μLのミリQで希釈することでサンプルを調製した。サンプルは35μL用いた。
スクリューキャップチューブに125μLのスタンダード溶液(1200μg/mL in acetic acid)と、125μLの12M HClを加え混合し、ヒートブロックで95℃、20時間インキュベートした後、室温に戻した。13000gで10分遠心分離した後、上澄みをミリQで希釈して300μg/mLのS1を作製し、S1を段階的に希釈してS2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)を作製した。4M HCl 90μLのみのS8(0μg/mL)も準備した。ここからそれぞれ35μlを実験に用いた。
35μLのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート(QuickZyme Total Collagen Assayキット付属)に加えた。75μLのアッセイバッファ(上記キット付属)をそれぞれのウェルに加えた。シールでプレートを閉じ、20分シェイキングしながら室温でインキュベートした。シールをはがし、75μLのdetection reagent (reagent A:B=30μL:45μL、上記キット付属)をそれぞれのウェルに加えた。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、60℃で60分インキュベートした。氷で室温まで冷まし、シールをはがして570nmの吸光度を測定した。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出した。結果を表3に示す。
Claims (14)
- 細胞と、内因性コラーゲンを含むコラーゲンとを含み、前記細胞の少なくとも一部が前記コラーゲンに接着している三次元組織体であって、
前記コラーゲンの含有率が、前記三次元組織体を基準として10重量%~90重量%であり、
前記コラーゲンが、断片化コラーゲンを含み、
前記断片化コラーゲンが、三重らせん構造を維持している、三次元組織体(ただし、ナノスケールコラーゲン及び乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)ポリマーを構成に含むメンブレンの存在下で細胞を培養したものを除く)。 - 細胞と断片化コラーゲンが均一に分布している、請求項1に記載の三次元組織体。
- 前記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、請求項1又は2に記載の三次元組織体。
- トリプシンの濃度0.25%、温度37℃、pH7.4、反応時間15分でトリプシン処理を行った後の前記三次元組織体の残存率が70%以上である、請求項1~3のいずれか一項に記載の三次元組織体。
- 厚さが10μm以上である、請求項1~4のいずれか一項に記載の三次元組織体。
- 前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の三次元組織体。
- 前記断片化コラーゲンの平均長が100nm~200μmである、請求項1~6のいずれか一項に記載の三次元組織体。
- 前記断片化コラーゲンの平均径が50nm~30μmである、請求項1~7のいずれか一項に記載の三次元組織体。
- 断片化コラーゲンを含む、三次元組織体の形成剤であって、
前記断片化コラーゲンの平均長が100nm~200μmであり、前記断片化コラーゲンの平均径が50nm~30μmであり、
前記三次元組織体が断片化コラーゲンと細胞とを含み、
前記断片化コラーゲンが、三重らせん構造を維持している、
三次元組織体(ただし、ナノスケールコラーゲン及び乳酸・グリコール酸共重合体(PLGA)ポリマーを構成に含むメンブレンの存在下で細胞を培養したものを除く)の形成剤。 - 前記三次元組織体において、細胞と断片化コラーゲンが均一に分布している、請求項9に記載の形成剤。
- 前記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、請求項9又は10に記載の形成剤。
- トリプシンの濃度0.25%、温度37℃、pH7.4、反応時間15分でトリプシン処理を行った後の前記三次元組織体の残存率が70%以上である、請求項9~11のいずれか一項に記載の形成剤。
- 前記三次元組織体の厚さが10μm以上である、請求項9~12のいずれか一項に記載の形成剤。
- 前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を含む、請求項9~13のいずれか一項に記載の形成剤。
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