JP2023030074A - 三次元組織体及びその製造方法、並びに、三次元組織体の形成剤 - Google Patents

Abstract

【課題】コラーゲンの濃度が生体組織に近い三次元組織体及びその製造方法、並びに、当該三次元組織体の製造に用いることができる形成剤を提供すること。【解決手段】細胞と、内因性コラーゲンを含むコラーゲンとを含み、上記細胞の少なくとも一部が上記コラーゲンに接着している三次元組織体であって、上記コラーゲンの含有率が、上記三次元組織体を基準として１０重量％～９０重量％であり、上記コラーゲンが、断片化コラーゲンを含み、上記断片化コラーゲンが、三重らせん構造を維持している、三次元組織体。【選択図】なし

Description

本発明は、三次元組織体及びその製造方法、並びに、三次元組織体の形成剤に関する。

近年、生体外で細胞の三次元組織体を構築する技術が開発されている。例えば、培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養することによって、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、ポリ乳酸等を材料とした足場に細胞を播種して三次元組織体を製造する方法（非特許文献１）等が提案されている。また、本発明者らはこれまで、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献２）、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び被覆細胞を三次元に配置することを含む三次元組織体の製造方法であって、被覆細胞の形成は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び浸漬させた細胞と被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法（特許文献３）等を提案している。
このような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。

特開２０１２－１１５２５４号公報 国際公開第２０１５／０７２１６４号 国際公開第２０１６／０２７８５３号

Nature Biotechnology, 2005, Vol.23, NO.7, p.879-884

ところで、生体組織における線維性コラーゲン等のコラーゲンの濃度は２０～３０重量％程度であるので、三次元組織体を実験動物の代替品、移植材料等として適用しようとした際には、コラーゲンが生体組織に近い濃度で含まれる三次元組織体を準備することが好ましい。

しかしながら、これまで開発されてきた三次元組織体は、その製造方法による制約等から細胞密度が非常に高いものに限られ、コラーゲンの濃度が生体組織に近い三次元組織体はこれまで知られていなかった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、コラーゲンの濃度が生体組織に近い三次元組織体及びその製造方法、並びに、当該三次元組織体の製造に用いることができる形成剤を提供することを目的とする。

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下に示す発明によって、上記課題が解決できることを見出した。
［１］細胞と、内因性コラーゲンを含むコラーゲンとを含み、上記細胞の少なくとも一部が上記コラーゲンに接着している三次元組織体であって、
上記コラーゲンの含有率が、上記三次元組織体を基準として１０重量％～９０重量％である、三次元組織体。
［２］上記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、請求項１に記載の三次元組織体。
［３］トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の上記三次元組織体の残存率が７０％以上である、上記［１］又は［２］に記載の三次元組織体。
［４］厚さが１０μｍ以上である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の三次元組織体。
［５］上記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む、上記［１］～［４］のいずれかに記載の三次元組織体。
［６］上記コラーゲンとして、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを更に含む、上記［１］～［５］のいずれかに記載の三次元組織体。
［７］（１）水性媒体中において、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンと、細胞とを接触させる工程、及び
（２）上記断片化コラーゲンが接触した上記細胞を培養する工程、
を含む、三次元組織体の製造方法。
［８］上記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、上記［７］に記載の製造方法。
［９］工程（１）及び工程（２）の間に、水性媒体中における上記断片化コラーゲンと上記細胞とを共に沈降させる工程を更に含む、上記［７］又は［８］に記載の製造方法。
［１０］工程（１）の工程が、水性媒体中で細胞の層を形成させた後、上記断片化コラーゲンを接触させることで行われる、上記［７］又は［８］に記載の製造方法。
［１１］上記断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍである、上記［７］～［１０］のいずれかに記載の製造方法。
［１２］上記断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、上記［７］～［１１］のいずれかに記載の製造方法。
［１３］上記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む、上記［７］～［１２］のいずれかに記載の製造方法。
［１４］上記断片化コラーゲンと、上記細胞との質量比が、９００：１～９：１である、上記［７］～［１３］のいずれかに記載の製造方法。
［１５］断片化コラーゲンを含む、三次元組織体の形成剤であって、
上記断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍであり、上記断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、三次元組織体の形成剤。

本発明によれば、コラーゲンの濃度が生体組織に近い三次元組織体及びその製造方法、並びに、当該三次元組織体の製造に用いることができる形成剤を提供することが可能になる。

２分間ホモジナイズすることで得られた断片化コラーゲンを示す写真（Ａ）、及び５分間ホモジナイズすることで得られた断片化コラーゲンの長さの分布を示すヒストグラム（Ｂ）である。 １週間培養した後の、断片化コラーゲン及び正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を含む三次元組織体の位相差顕微鏡写真（Ａ）、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した写真（Ｂ）、及びトルイジンブルー（ＴＢ）で染色した写真（Ｃ）である。 断片化コラーゲン及びＮＨＤＦを含む三次元組織体を抗ヒトコラーゲン抗体で免疫染色した写真である。 トリプシン処理前（Ａ）及びトリプシン処理後（Ｂ）における、断片化コラーゲン及びＮＨＤＦを含む三次元組織体の状態を示す写真である。 断片化コラーゲン、ＮＨＤＦ及びヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む三次元組織体の製造工程を示す模式図（Ａ）と、三次元組織体を抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した写真（Ｂ）である。 ９６ウェル内（Ａ）又は２４ウェル内（Ｂ）で製造した断片化コラーゲン及びＮＨＤＦを含む非収縮性の三次元組織体のＨＥで染色した写真及びＴＢで染色した写真である。 断片化コラーゲンを含むコラーゲンゲル及びＮＨＤＦを含む三次元組織体（Ａ）と、コラーゲンゲル及びＮＨＤＦを含む三次元組織体（Ｂ）との、培養中における収縮の様子を観察した写真である。 断片化コラーゲン、ＮＨＤＦ及びヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９）を含む三次元組織体をＨＥで染色した写真である。 断片化コラーゲン、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を含む三次元組織体をＨＥで染色した写真である。 細胞と断片化コラーゲンを同時に添加する方法により得られた断片化コラーゲン及びヒト大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ－ＳＭＣ）を含む三次元組織体をＨＥで染色した写真である。矢印はＡｒｏｔａ－ＳＭＣが存在している箇所の一例を示す。 Ｂｏｔｔｏｍ Ｌａｙｅｒ Ｍｅｔｈｏｄにより製造した、断片化コラーゲン及びヒト大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ－ＳＭＣ）を含む三次元組織体をＨＥで染色した写真である。矢印はＡｒｏｔａ－ＳＭＣの存在している箇所の一例を示す。 断片化コラーゲン、ヒト大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ－ＳＭＣ）及びヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を含む二層構造の三次元組織体を抗ＣＤ３１抗体で免疫染色した写真である。拡大図における底部の黒い層がＨＵＶＥＣの層である。 断片化コラーゲン及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）を含む三次元組織体をＨＥで染色した写真である。左欄はホモジナイゼーション２分により得られた断片化コラーゲンを用いた結果、右欄はホモジナイゼーション６分により得られた断片化コラーゲンを用いた結果を示す。 断片化コラーゲン、ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）及び不死化ヒト歯肉上皮細胞（Ｅｐｉ４）を含む三次元組織体をＨＥで染色した写真である。上段はホモジナイゼーション２分により得られた断片化コラーゲンを用いた結果、下段はホモジナイゼーション６分により得られた断片化コラーゲンを用いた結果を示す。 断片化コラーゲン、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を含む三次元組織体をマッソントリクロームで染色した写真である。黒い部分は、実際には青く染まった箇所であり、コラーゲンの存在を示す。

（三次元組織体）
本実施形態に係る三次元組織体は、コラーゲン産生細胞を含む細胞と、内因性コラーゲンを含むコラーゲンとを含み、上記細胞の少なくとも一部が上記コラーゲンに接着している三次元組織体である。従来の三次元組織体は、コラーゲンの濃度が低く、且つ細胞密度が高いものであった。そのため、培養中又は培養後に細胞のけん引力によって三次元組織体が収縮したり、培養中又は培養後に細胞が産生する酵素によって三次元組織体が容易に分解される等の問題があった。本実施形態に係る三次元組織体は、コラーゲンの濃度が従来のものより高く、収縮が起きにくく安定である。

「三次元組織体」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。

本実施形態に係る細胞は、培養細胞であってもよい。例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、又は株化細胞が挙げられる。

「コラーゲン産生細胞」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを分泌する細胞を意味する。コラーゲン産生細胞としては、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。

コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン又は非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。

「内因性コラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲン産生細胞が産生するコラーゲンを意味する。内因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであってもよいし、非線維性コラーゲンであってもよい。

三次元組織体におけるコラーゲンの含有率は、上記三次元組織体（乾燥重量）を基準として０．０１～９０重量％であり、１０～９０重量％であることが好ましく、１０～８０重量％であることが好ましく、１０～７０重量％であることが好ましく、１０～６０重量％であることが好ましく、１～５０重量％であることが好ましく、１０～５０重量％であることが好ましく、１０～３０重量％であることがより好ましく、２０～３０重量％であることがより好ましい。ここで、「三次元組織体におけるコラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲンを意味し、内因性コラーゲンであってもよいし、後述する外因性コラーゲンであってもよい。また「三次元組織体におけるコラーゲン」には後述する断片化コラーゲンも含まれる。すなわち、三次元組織体が外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを含む場合、上記三次元組織体を構成するコラーゲンの濃度は、内因性コラーゲン及び上記断片化コラーゲンを合わせた濃度を意味する。上記コラーゲンの濃度は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。

三次元組織体におけるコラーゲンの量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分や、実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量および単位重量あたりに占めるコラーゲン量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。

より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
（サンプルの調製）
凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を６Ｍ ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６Ｍ ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬのミリＱで希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。
（スタンダードの調製）
スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ ｉｎ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２Ｍ ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みをミリＱで希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４Ｍ ＨＣｌ ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。
（アッセイ）
３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ｒｅａｇｅｎｔ Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷で室温まで冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。

また、三次元組織体中に占めるコラーゲンを、その面積比もしくは体積比によって規定してもよい。「面積比もしくは体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲンを既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、もしくはマッソントリクローム染色、など）等で他の組織構成物と区別な状態にした上で、肉眼観察や、各種顕微鏡および画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲンの存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば三次元組織体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定することが、組織全体の様子を適切に反映でき、好ましい。

例えば、三次元組織体中のコラーゲンを面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１～９９％であり、１～９９％であることが好ましく、５～９０％であることが好ましく、７～９０％であることが好ましく、２０～９０％であることが好ましく、５０～９０％であることがより好ましい。「三次元組織体におけるコラーゲン」については、上述したとおりである。三次元組織体が外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを含む場合、上記三次元組織体を構成するコラーゲンの面積の割合は、内因性コラーゲン及び上記断片化コラーゲンを合わせた面積の割合を意味する。上記コラーゲンの面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲンの面積の割合として算出することが可能である。

上記三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。

上記三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。

上記三次元組織体は、厚さが１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。

ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。

上記三次元組織体を構成する細胞は、コラーゲン産生細胞以外の、一種又は複数種の他の細胞を更に含んでもよい。上記他の細胞としては、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ－ＳＭＣ））、等が挙げられる。好ましくは、上記三次元組織体を構成する細胞が、血管内皮細胞、がん細胞及び心筋細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む。

上記三次元組織体は、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンを更に含んでもよい。「外因性コラーゲン」及び「断片化コラーゲン」については、後述する。

上記三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等として適用することが可能である。

（三次元組織体の製造方法）
本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、
（１）水性媒体中において、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンと、細胞とを接触させる工程、及び
（２）上記断片化コラーゲンが接触した上記細胞を培養する工程、
を含む。

本実施形態に係る細胞は、培養細胞であってもよい。例えば、初代培養細胞、継代培養細胞、又は株化細胞が挙げられる。また、本実施形態に係る細胞は、コラーゲン産生細胞を含む細胞であってもよく、コラーゲン産生細胞以外の細胞を含む細胞であってもよく、コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の細胞の両方を含む細胞であってもよい。

「コラーゲン産生細胞」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを分泌する細胞を意味する。コラーゲン産生細胞としては、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。

コラーゲン産生細胞以外の細胞としては、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ－ＳＭＣ））等が挙げられる。好ましくは、上記三次元組織体を構成する細胞が、血管内皮細胞、がん細胞及び心筋細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を更に含む。

本実施形態に係る製造方法により、安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。

本実施形態に係る細胞は、コラーゲン産生細胞を含む細胞であることが好ましい。コラーゲン産生細胞を含む細胞を用いることで、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。その理由は以下のように推測される。

従来の足場を利用した三次元組織体の製造方法では、予め用意された足場に目的の細胞を注入するため、足場の内部にまで均一に細胞を分布させることが困難であった。本実施形態に係る製造方法によれば、得られる三次元組織体は安定であり、細胞が均一に分布している。このような三次元組織体が得られるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推測される。まず細胞が断片化コラーゲン上に接触して接着する。その後、細胞は自分自身で細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成するタンパク質（例えば、線維性コラーゲン等のコラーゲン）を産生する。産生されたタンパク質は断片化コラーゲン上に接触して接着することで、断片化コラーゲン間の架橋剤として働き、細胞が均一に存在する環境下で線維性コラーゲン等の構造化が進む。その結果、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。ただし、上記推測は本発明を限定するものではない。

また、特許文献１～３に記載の製造方法では、三次元組織体を製造するための工程数が多く、１時間程度の作業時間が必要であった。本実施形態に係る製造方法によれば、短い作業時間で三次元組織体を製造できる。さらに、本実施形態に係る製造方法によれば、簡便に三次元組織体を製造できる。
特許文献２に記載の製造方法では、厚さが１ｍｍ程度の三次元組織体を製造するために、細胞が少なくとも１０^６ｃｅｌｌｓ必要であった。本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体を製造できる。

「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、断片化コラーゲン及び細胞が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられる。液体培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。細胞に対する負荷を軽減する観点から、水性媒体は液体培地であることが好ましい。

「外因性コラーゲン」とは、外部から供給されるコラーゲンを意味し、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲンは、由来となる動物種が内因性コラーゲンと同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性コラーゲンは、人工のコラーゲンであってもよい。外因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンが挙げられ、好ましくはＩ型コラーゲンである。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体が挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。

外因性コラーゲンにおいて、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、コラーゲン産生細胞を含む場合、外因性コラーゲンにおいて、由来する動物種は、コラーゲン産生細胞とは異なっていてよい。つまり、外因性コラーゲンは、異種コラーゲンであってよい。

「断片化コラーゲン」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲンの由来となるコラーゲンは、一種類であってもよいし、複数種のコラーゲンを併用してもよい。従来、線維性コラーゲン等のコラーゲンは酸性の水溶液等に溶かしていたが、濃度は０．１～０．３重量％程度であり多く溶かすことはできなかった。そのため従来の方法では三次元組織体における線維性コラーゲン等のコラーゲンの量を多くすることが困難であった。本実施形態に係る断片化コラーゲンは水にほとんど溶解しないが、水性媒体に分散することにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進すると推測される。断片化コラーゲンの平均長は、１００ｎｍ～２００μｍであることが好ましく、２２μｍ～２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ～２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲンの平均径は、５０ｎｍ～３０μｍであることが好ましく、４μｍ～３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ～３０μｍであることがさらにより好ましい。

線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化する方法は、特に制限はなく、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等のホモジナイザーを用いて線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、線維性コラーゲン等のコラーゲンをそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化コラーゲンを得ることも可能である。
断片化コラーゲンの直径及び長さは、電子顕微鏡によって個々の断片化コラーゲンを解析することによって求めることが可能である。

水性媒体中において、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンと、細胞とを接触させる方法としては、特に制限はない。例えば、細胞を含む培養液に、断片化コラーゲンの分散液を加える方法、断片化コラーゲンの培地分散液に細胞を加える方法、又は予め用意した水性媒体に、断片化コラーゲン及び細胞をそれぞれ加える方法が挙げられる。

工程（１）においては、コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を含む細胞を用いてよい。コラーゲン産生細胞、及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞としては、上述した細胞をそれぞれ用いることができる。コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を共に用いて三次元組織体を製造することで、種々のモデル組織を製造することが可能になる。例えば、ＮＨＣＦ及びＨＵＶＥＣを用いた場合、内部に毛細血管を有する三次元組織体を得ることが可能になる。ＮＨＣＦ及び大腸がん細胞を用いた場合、大腸がんのモデル組織を得ることが可能になる。また、ＮＨＣＦ及びｉＰＳ－ＣＭを用いた場合、同期拍動を示す心筋のモデル組織を得ることが可能になる。

工程（１）における水性媒体中の断片化コラーゲンの濃度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程（１）における水性媒体中の断片化コラーゲンの濃度は、０．１～９０重量％であってもよいし、１～３０重量％であってもよい。

工程（１）における断片化コラーゲンの量は、１×１０^５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１～１００ｍｇであってもよいし、１～５０ｍｇであってもよい。

工程（１）における断片化コラーゲンと、細胞との質量比が、１０００：１～１：１であることが好ましく、９００：１～９：１であることがより好ましく、５００：１～１０：１であることが更により好ましい。

コラーゲン産生細胞とその他の細胞とを共に用いる場合、工程（１）におけるコラーゲン産生細胞：その他の細胞の比率（細胞数）は、９９：１～９：１であってもよいし、８０：２０～５０：５０であってもよいし、２０：８０～５０：５０であってもよいし、１０：９０～５０：５０であってもよい。

工程（１）及び工程（２）の間に、水性媒体中における断片化コラーゲンと細胞とを共に沈降させる工程を更に含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体における断片化コラーゲン及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、断片化コラーゲンと細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。

工程（１）の工程が、水性媒体中で細胞の層を形成させた後、上記断片化コラーゲンを接触させることにより行われてもよい。細胞の層を断片化コラーゲンと接触させる前に形成することで、下層部の細胞密度が高い三次元組織体を作製することができる。また、コラーゲン産生細胞を含む細胞の層を断片化コラーゲンと接触させる前に形成することで、コラーゲン産生細胞を含む細胞の下層部の細胞密度が高い三次元組織体を作製することができる。用いる細胞の種類（例えば、大動脈平滑筋細胞）によっては、この方法により、より生体に近い組織を作製することができる。

本実施形態において、三次元組織体の製造方法は、工程（２）の後、工程（３）として、さらに細胞を接触させ、細胞を培養する工程を含んでもよい。上記細胞は、工程（１）で用いた細胞と同じであってよく、異なってもよい。例えば、工程（１）で用いる細胞がコラーゲン産生細胞以外の細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞はコラーゲン産生細胞を含んでもよい。また例えば、工程（１）で用いる細胞がコラーゲン産生細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞はコラーゲン産生細胞以外の細胞を含んでもよい。工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方がコラーゲン産生細胞を含んでもよく、工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方がコラーゲン産生細胞以外の細胞を含んでもよい。上記工程（３）により、二層構造の三次元組織体を作製することができる。例えば、大動脈平滑筋細胞及び血管内皮細胞を用いた場合、並びにヒト皮膚由来線維芽細胞及びヒト表皮角化細胞を用いた場合には、この方法により、より生体に近い組織を作製することができる。また、例えば、ヒト歯肉線維芽細胞と歯肉上皮細胞を用いた場合には、この方法により、組織収縮や組織割れのない二層構造の三次元組織体を作製することができる。

断片化コラーゲンが接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃～４０℃であってもよく、３０℃～３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６～８であってもよく、７．２～７．４であってもよい。培養時間は、１日～２週間であってもよく、１週間～２週間であってもよい。

培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。

工程（２）における培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程（２）における培地中の細胞密度は、１～１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよいし、１０^３～１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよい。また、工程（２）における培地中の細胞密度は、工程（１）における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。

上記三次元組織体は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の三次元組織体のもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の三次元組織体における対応する部分の長さを示す。
収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００

上述の製造方法により例えば、細胞と、外因性コラーゲンに由来するコラーゲンとを含み、上記細胞の少なくとも一部が上記コラーゲンに接着している三次元組織体であって、上記コラーゲンの含有率が、上記三次元組織体を基準として１０重量％～９０重量％である、三次元組織体を製造することができる。また、上記外因性コラーゲンに由来するコラーゲンは、断片化コラーゲンであってもよい。

（三次元組織体の形成剤）
本実施形態に係る三次元組織体の形成剤は、断片化コラーゲンを含む、三次元組織体の形成剤であって、上記断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍであり、上記断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである。また、断片化コラーゲンの長さについて、断片化コラーゲン全体のうち９５％が１００ｎｍ～２００μｍの範囲にあってもよい。さらに、断片化コラーゲンの直径について、断片化コラーゲン全体のうち９５％が５０ｎｍ～３０μｍの範囲にあってもよい。

「三次元組織体の形成剤」とは、三次元組織体を製造するための試薬を意味する。三次元組織体の形成剤は、粉末の状態であってもよいし、水性媒体に断片化コラーゲンが分散した分散液の状態であってもよい。断片化コラーゲンの製造方法及び上記形成剤の使用方法としては、上記（三次元組織体の製造方法）において示されている方法と同様の方法が挙げられる。

（実施例１：Ｉ型コラーゲンを用いた断片化コラーゲンの製造）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０ ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズすることで、直径が約２０～３０μｍであり、長さが約１００～２００μｍである断片化コラーゲンを得た（図１の（Ａ））。断片化コラーゲンの直径及び長さは電子顕微鏡によって個々の断片化コラーゲンを解析することで求めた。得られた断片化コラーゲンを無血清培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。得られた断片化コラーゲンの培地分散液は、室温で１週間保存できた。後述する各三次元組織体の製造においては、同様の方法で得られた断片化コラーゲンを用いた。

また、上記方法において、ホモジナイズする時間を５分間に変更した場合、直径が約９５０ｎｍ～１６．８μｍであり、長さが約９．９μｍ～７８．６μｍである断片化コラーゲンが得られた（表１、図１の（Ｂ））。この結果から、ホモジナイズする時間を調整することで、断片化コラーゲンのサイズを制御できることが分かった。

（実施例２：ヒト皮膚由来線維芽細胞を用いた三次元組織体の製造）
血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が６．０２ｍｇ／ｍｌとなるように断片化コラーゲンを分散した。断片化コラーゲンは、実施例１の２分間ホモジナイズしたものを用いた。得られた分散液１６６μｌ（断片化コラーゲン、約１ｍｇ相当）と、１×１０^５ｃｅｌｌｓの正常ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とを非接着９６ウェル丸底プレートに添加した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物が丸い形状となり、１週間培養後には直径約１．５ｍｍの球体状の三次元組織体（図２の（Ａ））が得られた。得られた三次元組織体をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）、又はトルイジンブルー（ＴＢ）で染色したところ、断片化コラーゲン及びＮＨＤＦがそれぞれ均一に分布していることが確認できた（図２の（Ｂ）及び（Ｃ））。得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約３０重量％であった。

使用したＮＨＤＦはヒト由来であるため、抗ヒトコラーゲン抗体を用いて免疫染色することで、細胞が産生するヒトコラーゲンを、ブタＩ型コラーゲン由来の断片化コラーゲン（外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲン）と区別して染色することが可能となる。予備検討の結果、三次元組織体の内部において、ＮＨＤＦが産生したヒト由来のコラーゲン（内因性コラーゲン）の染色が確認された（図３）。この結果から、内因性コラーゲンと外因性コラーゲンとが、それぞれ別の種に由来する場合、三次元組織体における内因性コラーゲンと、外因性コラーゲンに由来する断片化コラーゲンとを区別できることが分かった。

得られた三次元組織体を、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行ったところ、トリプシンによる分解はほとんど見られなかった（図４、残存率９０％）。この結果から、得られた三次元組織体は、トリプシン等の酵素に安定であることが示唆された。

（実施例３：ヒト皮膚由来線維芽細胞及びヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞を用いた三次元組織体の製造）
ＮＨＤＦとヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とを８０：２０の割合（細胞数）で混合して非接着９６ウェル丸底プレートに播種した。このとき、断片化コラーゲンは、実施例１の２分間ホモジナイズしたものを用い、播種した全細胞数（１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ）を基準として、実施例２と同様の量を加えた。その後、ＤＭＥＭと血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２、ロンザ社製）との１：１（体積比）の混合培地で１週間培養することで、三次元組織体が得られた（図５の（Ａ））。得られた三次元組織体におけるコラーゲンの含有率を算出したところ、約３０重量％であった。得られた三次元組織体を抗ＣＤ３１抗体で染色したところ、三次元組織体の内部まで染色が確認された（図５の（Ｂ））。この結果から、毛細血管を含む三次元組織体を製造できることが分かった。

（実施例４：ヒト皮膚由来線維芽細胞を用いた非収縮性の三次元組織体の製造）
１０ｍｇの断片化コラーゲン（実施例１の２分間ホモジナイズしたもの）と１０×１０^５ｃｅｌｌｓのＮＨＤＦとを混合して接着性の９６ウェルインサート及び２４ウェルインサートにそれぞれ播種して培養すると、三次元組織体の収縮はほとんど見られず、約３ｍｍと１ｍｍの厚さの三次元組織体が得られた（図６）。９６ウェルインサートにおいて得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約３０重量％であった。２４ウェルインサートにおいて得られた三次元組織体における、コラーゲンの重量％を算出したところ、約３０重量％であった。

また、３０ｍｇの断片化コラーゲンを含むコラーゲンゲル１００μｌと、１０×１０^５ｃｅｌｌｓのＮＨＤＦとを混合して、接着性の２４ウェルインサートに播種して培養しても、得られた三次元組織体の収縮はほとんど見られなかった（図７の（Ａ））。一方、断片化コラーゲンを含まないコラーゲンゲル（コラーゲン濃度０．３重量％）を用いて得られた三次元組織体は、培養２日目で収縮が観察され、培養６日目には球体状になることが観察された（図７の（Ｂ））。

（実施例５：ヒト皮膚由来線維芽細胞及びヒト大腸がん細胞を用いた三次元組織体の製造）
ＮＨＤＦとがん細胞とを混合して三次元組織体を製造することも可能であった。具体的にはヒト大腸がん細胞ＨＴ２９をＮＨＤＦと１：１の割合で混合（全細胞数１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ）して非接着９６ウェル丸底プレートに播種したこと以外は、実施例２と同様の条件で三次元組織体を製造した。得られた三次元組織体のＨＥ染色写真を、図８に示す。直径約２ｍｍの三次元組織体の内部にＨＴ２９とＮＨＤＦが均一に分布している様子が観察された。得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約３０重量％であった。

（実施例６：ヒト心臓線維芽細胞及びヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞を用いた三次元組織体の製造）
同様の手法で、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）とヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）とを用いて三次元組織体を製造した（図９）。具体的にはＮＨＣＦとｉＰＳ－ＣＭとを２５：７５の割合で混合して非接着９６ウェル丸底プレートに播種したこと以外は、実施例２と同様の条件（全細胞数１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ）で三次元組織体を製造した。得られた三次元組織体における、コラーゲンの含有率を算出したところ、約３０重量％であった。得られた三次元組織体は、１～２週間培養後も一分間に３０～４０回程度の同期拍動を示した。この実験結果から、三次元組織体におけるｉＰＳ－ＣＭは、生体内の心筋細胞に近い環境にあることが示唆された。また、本発明に係る三次元組織体が、実験動物の代替品、及び移植材料として好適な組織体であることが示唆された。

（実施例７：ヒト大動脈平滑筋細胞を用いた三次元組織体の製造）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０ ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズし、断片化コラーゲンを得た。血清を含む培地（ＳｍＧＭ－２、ロンザ社製）にて濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液２００μｌ（断片化コラーゲン、約２ｍｇ相当）と、１×１０^５ｃｅｌｌｓの正常ヒト大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ－ＳＭＣ）とを２４ウェルセルカルチャーインサート（コーニング社製）に添加した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物がインサートに適合した形状となり、１週間培養後には厚さ約０．３ｍｍの三次元組織体が得られた。得られた三次元組織体を１０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色したところ、断片化コラーゲン及びＡｒｏｔａ－ＳＭＣがそれぞれ均一に分布していることが確認できた（図１０）。断片化コラーゲンを約３ｍｇ、４ｍｇ、８ｍｇ用いた場合にも、厚さは異なるが同様の結果が得られた。

上記と同じ断片化コラーゲン分散液及びＡｒｏｔａ－ＳＭＣを用い、Ａｒｏｔａ－ＳＭＣの層を形成させた後に断片化コラーゲンと接触させる方法（Ｂｏｔｔｏｍ Ｌａｙｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ）により、三次元組織体を製造した。ＳｍＧＭ－２（ロンザ社製）２００μｌと２．５×１０^４ｃｅｌｌｓのＳＭＣとを２４ウェルセルカルチャーインサート（コーニング社製）に添加した。２４時間培養後には、インサート底面にＡｒｏｔａ－ＳＭＣが接着し、細胞層が形成された。次に、断片化コラーゲンの分散液４００μｌ（断片化コラーゲン、約８ｍｇ相当）をＡｒｏｔａ－ＳＭＣの層に添加した。１週間培養後には厚さ約０．８ｍｍの三次元組織体が得られた。得られた三次元組織体を１０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色したところ、下層部にＳＭＣが多く分布しており、より生体に近い組織が形成されていることが確認できた（図１１）。

断片化コラーゲンとＡｒｏｔａ－ＳＭＣを同時に添加する方法により得られた三次元組織体と、上記Ｂｏｔｔｏｍ Ｌａｙｅｒ Ｍｅｔｈｏｄにより得られた三次元組織体を比較すると、三次元組織体の厚みに差は見られず、いずれの方法でも用いるＡｒｏｔａ－ＳＭＣ量に依存して厚みが増加する傾向にあった。前者の方法で得られた三次元組織体は、下層部及び上層部の密度に顕著な差は見られなかった。一方、後者の方法で得られた三次元組織体は、下層部の細胞密度が高く、上層部の細胞密度が低い傾向がみられ、より生体の大動脈平滑筋組織に近い構造であることが確認された。

（実施例８：ヒト大動脈平滑筋細胞とヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞を用いた二層構造の三次元組織体の製造）
実施例７と同様に断片化コラーゲンを培地に懸濁して得た分散液２００μｌ（断片化コラーゲン、約３ｍｇ相当）と、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓのＡｒｏｔａ－ＳＭＣとを懸濁し、９６ウェルインサート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に添加後、一週間培養し、三次元組織体を構築した。更に、構築した三次元組織体の上に、６×１０^４個のヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培地に懸濁し、自然沈降で三次元組織体上に堆積させた。三次元組織体を１０％ＰＦＡで固定後、薄切し、ＣＤ３１による免疫染色を行った。２４時間培養後には一層の内皮細胞の層が三次元組織体上に構築され、より生体の血管壁に近い組織体が得られた（図１２）。

（実施例９：ヒト歯肉線維芽細胞を用いた三次元組織体の製造）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０ ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズし、断片化コラーゲンを得た。血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるように断片化コラーゲンを分散した。（２分の時）得られた分散液８００μｌ（断片化コラーゲン、約８ｍｇ相当）と、正常ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）（５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ、８．０×１０^５ｃｅｌｌｓ、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ）とを２４ウェルセルカルチャーインサート（コーニング社製）に添加した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物がインサート形状に適合した円柱体となり、３日培養後には直径約１．５ｍｍの厚さの三次元組織体が得られた。多量なコラーゲンが存在するにもかかわらず、組織の収縮はほとんど見られなかった。得られた三次元組織体をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色したところ、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ、８．０×１０^５ｃｅｌｌｓ及び１．０×１０^６ｃｅｌｌｓのＨＧＦのいずれを用いた三次元組織体も、断片化コラーゲン及びＨＧＦがそれぞれ均一に分布していることが確認できた（図１３「ホモジナイゼーション：２分」）。

ホモジナイザーを用いて６分間ホモジナイズした断片化コラーゲンを用いたこと以外は同様の方法により、三次元組織体を得た。分散液８１６μｌ（断片化コラーゲン、約８ｍｇ相当）と、５．０×１０^５ｃｅｌｌｓ、８．０×１０^５ｃｅｌｌｓ及び１．０×１０^６ｃｅｌｌｓのいずれのＨＧＦを用いた三次元組織体も、断片化コラーゲン及びＨＧＦがそれぞれ均一に分布していることが確認できた（図１３「ホモジナイゼーション：６分」）。

上記２分間ホモジナイズした断片化コラーゲンを用いて製造した三次元組織体と６分間ホモジナイズした断片化コラーゲンを用いて製造した三次元組織体を比較すると、いずれの場合にも、断片化コラーゲン及びＨＧＦがそれぞれ均一に分布している三次元組織体が得られたが、６分間ホモジナイズした断片化コラーゲンを用いて製造した三次元組織体の方がよりコラーゲンの凝集塊がなくなり、均一になるが、厚さに関しては、同じ量のコラーゲンの場合は、薄くなった。

（実施例１０：ヒト歯肉線維芽細胞と歯肉上皮細胞を用いた三次元組織体の製造）
下層（ＨＧＦ層）の作製：日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン８ｍｇ（２分間のホモジナイゼーションにより断片化したもの）と、正常ヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）１．０×１０^６ｃｅｌｌｓをＤ－ＭＥＭ（和光純薬工業株式会社製）に混合懸濁し、２４ウェルインサート（コーニング社製）に添加し、インサート外側に培地を添加して、一晩培養した。

上層（Ｅｐｉ４層）の作製：翌日インサートの培地を吸い取り、不死化ヒト歯肉上皮細胞（Ｅｐｉ４）を２．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／３００μｌ／インサートになるように調整し、ＨＧＦ層の上にＥｐｉ４を播種した。インサートの外側にＤ－ＭＥＭとＨｕｍｅｄｉａ（倉敷紡績株式会社製）を１：１で混ぜたものを１ｍｌ入れ、３７℃、１時間インキュベート後、インサートの外側に混合培地を１ｍｌ追加し、一晩培養した。

Ｅｐｉ４の分化：インサートの内側と外側両方の培地を除去し、混合培地をインサートの外側に入れ、７日間毎日培地換えを行いつつ、培養した。培養後、薄切し、ＨＥ染色した。

下層の作製の際に、６分間のホモジナイゼーションにより断片化した日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンを用いた以外は上記と同様に三次元組織体を製造し、ＨＥ染色した。

図１４に示すように、２分ホモジナイズした断片化コラーゲン又は６分ホモジナイズした断片化コラーゲンで間質の土台を作製し、その上に歯肉上皮細胞を積層することで、組織収縮や組織割れのない２層構造の歯肉モデルを作製することができた。

（実施例１１：ヒト皮膚由来線維芽細胞と正常ヒト表皮角化細胞を用いた二層構造の三次元組織体の製造）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体５０ｍｇを１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０ ＰＢＳ）５ｍＬに分散し、ホモジナイザーを用いて２分間ホモジナイズし、断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。血清を含む培地（ＳｍＧＭ－２、ロンザ社製）にて濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲンを分散した。

下層（ＮＨＤＦ層）の作製：２４ウェルのインサートを、ＰＢＳ（０．０４μＬ／インサート）中の０．０４ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン溶液（＃Ｆ２００６－５Ｇ、Ｓｉｇｍａ社製）でコートし、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、断片化コラーゲン分散液０．８ｍＬ（断片化コラーゲン、約８ｍｇ相当）と、１×１０^６ｃｅｌｌｓのヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）とを２４ウェルプレートトランスウェル（ＩＷＡＫＩ社製）中で混合した。プレートをインキュベータに入れ、２４時間培養した。

上層（ＮＨＥＫ層）の作製：上記ＮＨＤＦのコラーゲンゲル上で、インサート中の培地を吸引し、ＰＢＳ（０．０４μＬ／インサート）中の０．０４ｍｇ／ｍＬコラーゲンＩＶ溶液でコートし、３７℃で少なくとも２０分間インキュベートした。ＮＨＤＦのコラーゲンゲル上に加えたコラーゲンＩＶ溶液を吸引し、ＮＨＤＦのコラーゲンゲル上に、３００μＬの１×１０^６ｃｅｌｌｓの正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（＃ＫＫ－４００９、１バイアル＝５０００００細胞、ＫＵＲＡＢＯ社製）を加えた。ＤＭＥＭ ５％ＦＢＳ：ＥｐｉＬｉｆｅ（＃Ｃ－２５１７Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（１：１）培地をインサートの外側に１ｍＬ加え、１時間後にインサートの外側に１ｍＬを再度加えた。

内側と外側の培地を静かに吸引し、ＤＭＥＭ ５％ＦＢＳ：ＥｐｉＬｉｆｅ（１：１）培地中でアスコルビン酸を１００倍に希釈し、インサートの外側に５００μＬの分化培地として加えた。インサートの内側には培地を加えなかった。分化７日目まで毎日インサートの外の培地を交換した。

作製した皮膚モデルは、線維芽細胞を含む層（真皮組織）、上部の角化細胞を含む層（表皮組織）における細胞間の距離が適切であり、生体内の皮膚組織に近い構造であった。２分間ホモジナイズした断片化コラーゲン及びヒト皮膚由来線維芽細胞で土台を作製し、その上に正常ヒト表皮角化細胞を積層することで、生体に近い２層構造の皮膚モデルを作製することができた。

（実施例１２：ヒト心臓線維芽細胞及びヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞を用いた三次元組織体の製造、並びにコラーゲンの面積割合の算出）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体５０ｍｇを１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０ ＰＢＳ）５ｍＬに分散し、ホモジナイザーを用いて６分間ホモジナイズし、断片化コラーゲン（ＣＭＦ）を得た。３，５００ｒｐｍ ３分で遠心分離した後、無血清培地（ＤＭＥＭ）を加えて１分洗浄し、再度３，５００ｒｐｍ ３分で遠心分離し、上澄みを除去した。血清を含む培地（ＤＭＥＭ）を全量が５ｍＬになるように加え、断片化コラーゲンを分散した。

非接着９６ウェル丸底プレートに、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）とヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を２５：７５の割合で混合した細胞５×１０^５ｃｅｌｌｓと、０、０．１、０．５、１．０、１．５、２．０ｍｇのＣＭＦを混合し、全液量を３００μＬとしたものを播種した（溶液の濃度は６．５ｍｇ／ｍＬとして計算）。１，１００ｇ ５分で遠心分離した後、インキュベータで２１日間培養し、三次元組織体を得た。

得られた三次元組織体全体をマッソントリクロームにより染色した。染色後の三次元組織体の全体面積（球状体の略中心部の断面切片図）と、青色に染色されたコラーゲンの面積をＩｍａｇｅＪ（米国国立衛生研究所製）で算出した。結果を表２及び図１５に示す。ＩｍａｇｅＪによりコラーゲンの面積を算出する方法は、具体的には以下のように行った。（１）カラーの元画像を「Ｓｐｌｉｔ Ｃｈａｎｎｎｅｌ」コマンドで、ＲＧＢ分割した。（２）画像全体で見たとき、「Ｇ」画像は組織全体の領域、「Ｒ」画像はコラーゲンによって染色された領域を、それぞれ区別できるものと判断し、「Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」コマンドによって、「Ｇ」画像と「Ｒ」画像をそれぞれ二値化した。二値化時の閾値としては、「Ｇ」画像の閾値は０～７５、「Ｒ」画像の閾値は０～１３０を指定して行った。（３）Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｔｏｏｌ（ｆｒｅｅｈａｎｄ）で、三次元組織体の輪郭を範囲指定し、前記範囲内における、「Ｇ」画像および「Ｒ画像」それぞれの（二値化後の）面積を算出し、三次元組織体断面全体に占めるコラーゲン染領域の面積比率を算出した。

三次元組織体の作製に用いたＣＭＦ（「仕込みＣＭＦ」）の量が増加することに伴い、三次元組織体の全体面積に対するコラーゲンの面積の割合も増加するが、仕込みＣＭＦが０．５ｍｇ以上になると、コラーゲンの面積の割合の増加幅は減少することが示された。なお、面積率は、三次元組織体中の染色方法や、コラーゲンの局在状態によってある程度上下することが考えられるが、前記手順に基づき判断した場合、０．５ｍｇ以上のコラーゲンを投入した場合には、コラーゲン領域の面積は少なくとも三次元組織体の全体面積に対して５０％以上となる可能性が非常に高いことが示された。

（実施例１３：ヒト心臓線維芽細胞及びヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞を用いた三次元組織体の製造、並びにコラーゲン定量による含有率の算出）
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体５０ｍｇを１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０ ＰＢＳ）５ｍＬに分散し、ホモジナイザーを用いて６分間ホモジナイズし、断片化コラーゲン（ＣＭＦ）を得た。３，５００ｒｐｍ ３分で遠心分離した後、無血清培地（ＤＭＥＭ）を加えて１分洗浄し、再度３，５００ｒｐｍ ３分で遠心分離し、上澄みを除去した。血清を含む培地（ＤＭＥＭ）を全量が５ｍＬになるように加え、断片化コラーゲンを分散した。

非接着９６ウェル丸底プレートに、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）とヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ－ＣＭ）を２５：７５の割合で混合した細胞５×１０^５ｃｅｌｌｓと、１．０ｍｇのＣＭＦを混合し、全液量を３００μＬとしたものを播種した（溶液の濃度は６．５ｍｇ／ｍＬとして計算）。１，１００ｇ ５分で遠心分離した後、インキュベータで３日間又は５日間培養し、三次元組織体を得た。３日間培養したサンプルはそれぞれＤａｙ３－１、Ｄａｙ３－２、Ｄａｙ３－３、５日間培養したサンプルはそれぞれＤａｙ５－１、Ｄａｙ５－２、Ｄａｙ５－５とした。

ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙ（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、以下の方法で三次元組織体におけるコラーゲンを定量した。

（サンプルの調製）
上記サンプルＤａｙ３－１、Ｄａｙ３－２、Ｄａｙ３－３、Ｄａｙ５－１、Ｄａｙ５－２及びＤａｙ５－５を、それぞれ非接着９６ウェル丸底プレートから回収後、ＦＤＵ－２２００型（東京理化器械製）により凍結乾燥処理を行った。スクリューキャップチューブにおいて、三次元組織体の全量を６Ｍ ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻した。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを６Ｍ ＨＣｌで１０倍希釈し、さらに、２００μＬを１００μＬのミリＱで希釈することでサンプルを調製した。サンプルは３５μＬ用いた。

（スタンダードの調製）
スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ ｉｎ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２Ｍ ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻した。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みをミリＱで希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製した。４Ｍ ＨＣｌ ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備した。ここからそれぞれ３５μｌを実験に用いた。

（アッセイ）
３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ａｓｓａｙキット付属）に加えた。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加えた。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートした。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ｒｅａｇｅｎｔ Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加えた。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートした。氷で室温まで冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定した。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出した。結果を表３に示す。

「コラーゲン無し」のサンプルは、断片化コラーゲンを用いないこと以外はＤａｙ５と同条件で作製した組織体を示す。

断片化コラーゲンを用いて培養時間３日間又は５日間で得られた三次元組織体におけるコラーゲンの含有率は、三次元組織体の乾燥重量に対して約２０～６６％であった。一方、断片化コラーゲンを用いずに作製した組織体においては、コラーゲン量は０．０６μｇであり、三次元組織体に対する含有率はほぼゼロであった。

本発明によれば、三次元組織体を一度に１ｍｍ以上の厚さにすることが可能になる。また、本発明に係る三次元組織体の製造方法は、全層構造の再構成皮膚、並びに、毒性モデルにおける肝臓及び心臓のオルガノイド作製技術として使用できる可能性がある。また、少ない数の心筋細胞を用いて製造した三次元組織体では、心拍同期拍動が観察されており、心毒性評価等への応用が期待される。また、大動脈平滑筋細胞を用いて製造した三次元組織体は、動脈硬化血管壁モデルとしての応用が期待される。さらに、歯肉線維芽細胞を用いて製造した三次元組織体は、歯周炎等のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に使用できる可能性がある。

Claims (14)

1. 細胞と、内因性コラーゲンを含むコラーゲンとを含み、前記細胞の少なくとも一部が前記コラーゲンに接着している三次元組織体であって、
   前記コラーゲンの含有率が、前記三次元組織体を基準として１０重量％～９０重量％であり、
   前記コラーゲンが、断片化コラーゲンを含み、
   前記断片化コラーゲンが、三重らせん構造を維持している、三次元組織体（ただし、ナノスケールコラーゲン及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ポリマーを構成に含むメンブレンの存在下で細胞を培養したものを除く）。
2. 細胞と断片化コラーゲンが均一に分布している、請求項１に記載の三次元組織体。
3. 前記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、請求項１又は２に記載の三次元組織体。
4. トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の前記三次元組織体の残存率が７０％以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の三次元組織体。
5. 厚さが１０μｍ以上である、請求項１～４のいずれか一項に記載の三次元組織体。
6. 前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の三次元組織体。
7. 前記断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍである、請求項１～６のいずれか一項に記載の三次元組織体。
8. 前記断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍである、請求項１～７のいずれか一項に記載の三次元組織体。
9. 断片化コラーゲンを含む、三次元組織体の形成剤であって、
   前記断片化コラーゲンの平均長が１００ｎｍ～２００μｍであり、前記断片化コラーゲンの平均径が５０ｎｍ～３０μｍであり、
   前記三次元組織体が断片化コラーゲンと細胞とを含み、
   前記断片化コラーゲンが、三重らせん構造を維持している、
   三次元組織体（ただし、ナノスケールコラーゲン及び乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ポリマーを構成に含むメンブレンの存在下で細胞を培養したものを除く）の形成剤。
10. 前記三次元組織体において、細胞と断片化コラーゲンが均一に分布している、請求項９に記載の形成剤。
11. 前記細胞が、コラーゲン産生細胞を含む細胞である、請求項９又は１０に記載の形成剤。
12. トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の前記三次元組織体の残存率が７０％以上である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の形成剤。
13. 前記三次元組織体の厚さが１０μｍ以上である、請求項９～１２のいずれか一項に記載の形成剤。
14. 前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び上皮細胞からなる群から選ばれる、一種又は複数種の細胞を含む、請求項９～１３のいずれか一項に記載の形成剤。
    
    

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