JP2017537654A - 人工三次元皮膚組織、そのアレイ、およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年11月5日に出願された米国出願第62/075,703号および2015年3月30日に出願された米国出願第62/140,381号の恩典を主張し、それらの全開示が参照により本明細書に組み入れられる。
医薬品および化粧品産業では、毒物学スクリーニング、バリア機能分析、色素沈着研究のための皮膚モデル、ならびに腐食、刺激、炎症、および感染のためのモデルが利用される。
本明細書に記載されるのは、ある態様において、真皮線維芽細胞を含む真皮層とケラチノサイトを含む表皮層とを含む三次元人工生体皮膚組織であって、表皮層が真皮層と接触して三次元人工生体皮膚組織を形成しており、但し、真皮層が真皮バイオインクからバイオプリントされたか、表皮層が表皮バイオインクからバイオプリントされたか、または真皮層および表皮層が両方ともそれぞれのバイオインクからバイオプリントされた、三次元人工生体皮膚組織である。
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明確に特に指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」へのあらゆる言及は、特に明記のない限り、「および/または」を包含するように意図される。
本明細書に開示される三次元皮膚組織は、技術水準に対する改善を示す。ヒト皮膚についての組織モデルは、毒性ポテンシャル、毒性効力を決定するための、および化学物質の危険同定のための、インビボモデルの代替物として、化粧品産業および医薬品産業の両方において価値がある。皮膚モデルは、インビボモデルの代替物として毒物学評価のために開発された。これらの皮膚モデルは、一般に、再構築されたヒト表皮の皮膚刺激および腐食について、それぞれ、経済協力開発機構(OECD)試験ガイドライン(TG)439および431に詳述される方法に従う。皮膚刺激は、最大4時間の試験化学物質の適用後に皮膚に可逆的な損傷を引き起こすことを指す[国連(UN)の化学品の分類および表示に関する世界調和システム(GHS)による定義]。皮膚腐食は、試験材料の適用後、表皮を通って真皮中への目に見える壊死として現れる、皮膚に不可逆的な損傷を引き起こすことを指す(UN GHS)。本明細書において提供されるのは、毒物学をモデル化するためのインビトロシステムとしての人工3D皮膚組織についての使用法の非限定的な例である。刺激剤または腐食剤としての試験物質の予測および分類に加えて、本明細書において提供されるのは、ネイティブな皮膚の形態、細胞反応性およびバリア機能を模倣するために十分に複雑であり、光毒性、遺伝毒性、感作、浸透、吸収、吸着を予測するために、および経皮的な薬物送達をモデル化するために使用することができる、インビトロヒト皮膚モデルである。
いくつかの態様において、本明細書に記載される三次元人工皮膚組織は、それらが、神経支配されない(例えば、神経組織を実質的に含まない)、成熟した血管を実質的に含まない、かつ/または血液成分を実質的に含まないという事実によって、ネイティブな(例えば、人工でないまたは製作されていない)組織と区別される。ある態様において、組織は灌流可能な血管を欠いている。例えば、様々な態様において、三次元人工皮膚組織は、血漿、赤血球、血小板などおよび/または内生的に生じた血漿、赤血球、血小板などを含まない。ある態様において、組織はヘモグロビンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、神経支配またはニューロンを欠いている。いくつかの態様において、組織は、以下のいずれかのような神経細胞マーカーを発現する細胞を欠いている:βIIIチューブリン、MAP2、NeuNおよびニューロン特異性エノラーゼ。ある態様において、組織はリンパ管を含まない。ある態様において、組織は免疫細胞を含まない。ある態様において、組織はランゲルハンス細胞を含まない。ある態様において、組織はT細胞を含まない。ある態様において、細胞は、以下のタンパク質によってマークされる免疫細胞のいずれかを実質的に含まない:CD11c、DC-SIGN、CD11b、CD4、CD8、CD28、CD3、CD19、CD80、および/またはCD86。
本明細書に記載される組織、アレイおよび方法は、3D皮膚組織構造体を作るためにバイオインク製剤およびバイオプリント法を伴う。ある態様において、バイオインクは、真皮、表皮、皮下、基底非細胞性バイオインク、またはそれらの任意の組み合わせである。
いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は、真皮バイオインクを含む。ある態様において、真皮バイオインクは線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクはヒト真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは初代ヒト真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは非真皮線維芽細胞を含む。ある態様において、真皮バイオインクは線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクは真皮線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクはヒト真皮線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクは初代ヒト真皮線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、真皮バイオインクは非真皮線維芽細胞から本質的になる。
いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は、表皮バイオインクを含む。ある態様において、表皮バイオインクはケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはケラチノサイトおよびメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代メラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトおよび初代メラノサイトを含む。いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は表皮バイオインクから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは初代ケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは初代メラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ケラチノサイトおよび初代メラノサイトを含む、から本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒトケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒトメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒトケラチノサイトおよびヒトメラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代ケラチノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代メラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒト初代ケラチノサイトおよびヒト初代メラノサイトを含む。ある態様において、表皮バイオインクはヒトケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒトメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒトケラチノサイトおよびヒトメラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代ケラチノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクはヒト初代メラノサイトから本質的になる。ある態様において、表皮バイオインクは、ヒトケラチノサイトおよびヒト初代メラノサイトを含む、から本質的になる。
ある態様において、皮下バイオインクは、内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは内皮細胞および線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞およびヒト線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞およびヒト初代線維芽細胞を含む。ある態様において、皮下バイオインクは内皮細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクは線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクは内皮細胞および線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト内皮細胞およびヒト線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代線維芽細胞から本質的になる。ある態様において、皮下バイオインクはヒト初代内皮細胞およびヒト初代線維芽細胞から本質的になる。
いくつかの態様において、三次元人工皮膚組織は、非細胞性バイオインクを含む。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、細胞外マトリックスタンパク質またはペプチド、例えば、コラーゲンまたはフィブリノーゲン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、多糖類、フィブリノーゲン/トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン/ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)およびプロテオグリカン(これは、例えば、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、ケラチン硫酸、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、デコリン、アグレカン、パールカンを含有し得る)またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の態様において、好適なヒドロゲルは合成ポリマーである。さらなる態様において、好適なヒドロゲルとしては、ポリ(アクリル酸)およびその誘導体、ポリ(エチレンオキシド)およびその共重合体、ポリ(ビニルアルコール)、ポリホスファゼン、ならびにそれらの組み合わせから誘導されるものが挙げられる。様々な具体的な態様において、閉じ込め材料は:ヒドロゲル、NovoGel(商標)、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Matrigel(商標)、ヒアルロナン、ポロキサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ(イソプロピルn-ポリアクリルアミド)、ポリエチレングリコールジアクリラート(PEG-DA)、ヒドロキシエチルメタクリラート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ(乳酸)、シリコン、シルク、またはそれらの組み合わせより選択される。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、ヒドロゲルまたは他の支持材料、クッション材料もしくは閉じ込め材料を含む。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは、無機または合成ポリマーを含まない。いくつかの態様において、非細胞性バイオインクは死細胞残屑を含まない。
本明細書に記載される三次元人工皮膚組織、アレイ、および方法は、多層の、コンパートメント化された人工構築物の作製を可能にする。これらの層は、表面上に配置されるバイオインクによって形成される。バイオインクは、次いで、密着し、複数の層および/または不連続コンパートメントを有する単一の組織を形成する。ある態様において、組織層またはコンパートメントは構造的に別個である。ある態様において、皮膚組織は表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は真皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は皮下層を含む。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された、真皮層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された、非細胞性層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された(deposed)、真皮層の上部に配置された非細胞性層の上部に配置された表皮層を含む。ある態様において、組織層は構造的に別個である。ある態様において、皮膚組織は表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は真皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は皮下層からなる。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された、真皮層の上部に配置された表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は、真皮層の上部に配置された、非細胞性層の上部に配置された表皮層からなる。ある態様において、皮膚組織は、皮下層の上部に配置された、真皮層の上部に配置された非細胞性層の上部に配置された表皮層からなる。
図3を参照して、例えば、特定の態様において、連続的付着バイオプリント技術は、コラーゲンコーティングプリント表面上へ層状組織をプリントするために使用される。この態様において、真皮細胞がトランスウェル表面上へバイオプリントされ、真皮層が形成される。その後、表皮細胞が真皮細胞の上部にバイオプリントされ、表皮層が形成される。最後に、層状組織を細胞培養環境において成熟させる。
いくつかの態様において、人工皮膚組織/構築物およびそのアレイの少なくとも1つのコンポーネントをバイオプリントする。さらなる態様において、バイオプリントされた構築物は、三次元送達デバイス(例えば、バイオプリンター)による、生体適合性支持表面(例えば、ヒドロゲルおよび/または多孔性膜から構成される)上への、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞体(例えば、シリンダー、スフェロイド、リボンなど)を含む細胞、および、任意で、閉じ込め材料の、三次元の、自動化された、コンピューター支援される付着に基づく迅速なプロトタイピング技術を利用する方法を用いて作られる。本明細書において使用される場合、いくつかの態様において、用語「人工」は、組織および/または器官を指すために使用される場合、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞含有ゲルまたはペースト、細胞濃縮物、多細胞集合体、ならびにそれらの層が、コンピュータースクリプトに従ってコンピューター支援されるデバイス(例えば、バイオプリンター)によって三次元構造体を形成するように位置決めされることを意味する。さらなる態様において、コンピュータースクリプトは、例えば、1つまたは複数のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。なおさらなる態様において、三次元組織構造体は、細胞または多細胞体のプリント後の接着によって形成し、これは、いくつかの場合において、初期形態形成における自己集合現象に類似している。
いくつかの態様において、本明細書に開示されるのは、いかなる予め形成されたスキャフォールドをも含まないかまたは実質的に含まない人工の移植可能な皮膚組織である。さらなる態様において、「スキャフォールド」は、合成スキャフォールド、例えば、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲル、非合成スキャフォールド、例えば、予め形成された細胞外マトリックス層、死細胞層、および無細胞化組織、ならびに人工組織および/または器官の物理的構造体にとって不可欠でありかつ組織および/または器官から除去されない任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。なおさらなる態様において、無細胞化組織スキャフォールドは、無細胞化ネイティブ組織、または任意の方法で培養細胞によって生成された無細胞化細胞材料;例えば、生きている間に産生したECMを残して、死滅させられるかまたは無細胞化される細胞層を含む。
いくつかの態様において、人工皮膚組織/構築物は、1つまたは複数の面上において生体適合性表面へ固定される。いくつかの態様において、人工皮膚組織/構築物は、生体適合性表面の1、2、3、4個、またはそれ以上の面へ固定される。多くの方法が、組織を生体適合性表面へ固定するのに適している。様々な態様において、組織は、生体適合性表面へ、例えば、1つまたは複数の面全体にわたって、1つまたは複数の面の端でのみ、または1つまたは複数の面の中央でのみ、適切に固定される。様々なさらなる態様において、組織は、表面へ一体化されたまたは表面と結合されたホルダーまたはキャリアーを用いて、生体適合性表面へ適切に固定される。様々なさらなる態様において、組織は、表面へ一体化されたまたは表面と結合された1つまたは複数のピンチ-クランプまたはプラスチックノブを用いて、生体適合性表面へ適切に固定される。いくつかの態様において、組織は、多孔性表面への細胞付着によって、生体適合性表面へ適切に固定される。いくつかの態様において、表面の細孔サイズは0.2μmを超え得る。いくつかの態様において、表面の細孔サイズは1μmを超え得る。いくつかの態様において、組織は、多孔性膜への細胞付着によって、生体適合性表面へ適切に固定される。いくつかの態様において、人工皮膚組織/構築物は、1つまたは複数の面上における生体適合性表面への貼り付けによってアレイ構成で保持される。さらなる態様において、組織は、1、2、3、4個、またはそれ以上の面上において生体適合性表面へ貼り付けられる。いくつかの態様において、生体適合性表面は、組織または組織に接触する生物に対して傷害または毒性の大きな危険をもたらさない任意の表面である。さらなる態様において、生体適合性表面は、伝統的な組織培養法に適した任意の表面である。好適な生体適合性表面は、非限定的な例として、処理されたプラスチック、膜、多孔性膜、コーティングされた膜、コーティングされたプラスチック、金属、コーティングされた金属、ガラス、処理されたガラス、およびコーティングされたガラスを含み、好適なコーティングは、ヒドロゲル、ECM成分、化学物質、タンパク質などを含み、コーティングまたは処理は、生体適合性表面への細胞および組織接着を促すまたは妨げる手段を提供する。ある態様において、生体適合性表面は柔軟である。ある態様において、生体適合性表面は、バイオプリント時に非静的である(動いている)。ある態様において、生体適合性表面は平らでない。生体適合性表面は、ヒトまたは他の哺乳動物の身体部分のように形作られた型もしくは形態であり得るか、または曲線状である。
いくつかの態様において、人工皮膚組織/構築物のアレイを本明細書に開示する。いくつかの態様において、「アレイ」は、複数の試験が1つのサンプルに対して行われることを可能にする、1つまたは複数の試験が複数のサンプルに対して行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された複数の要素の連合体を含む科学的ツールである。いくつかの態様において、アレイは、ミディアム-またはハイ-スループットスクリーニングに関連するものを含むスクリーニング方法およびデバイスに、適応しているかまたは適合性がある。さらなる態様において、アレイは、複数の試験が同時に行われることを可能にする。さらなる態様において、アレイは、複数のサンプルが同時に試験されることを可能にする。いくつかの態様において、アレイは、細胞マイクロアレイである。さらなる態様において、細胞マイクロアレイは、固体支持体の表面上の生きている細胞の多重の問い合わせを可能にする実験用ツールである。他の態様において、アレイは、組織マイクロアレイである。さらなる態様において、組織マイクロアレイは、アレイにおいて集められた複数の分離した組織または組織サンプルを含み、これによって、複数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的解析の実施が可能となる。
いくつかの態様において、本明細書に開示される人工皮膚組織およびアレイは、インビトロアッセイにおいて使用するためのものである。いくつかの態様において、「アッセイ」は、有機的または生物学的サンプル(例えば、細胞集合体、組織、器官、生物など)中における物質(例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など)の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる態様において、アッセイは定性的アッセイおよび定量的アッセイを含む。なおさらなる態様において、定量的アッセイは、サンプル中の物質の量を測定する。
ある態様において、本出願の皮膚組織は、皮膚状態を有する対象の治療において使用するためのものである。ある態様において、三次元皮膚組織は、対象への移植のためのものである。皮膚状態は、皮膚移植片が利用される任意の状態であり得る。状態は、熱または化学物質によって引き起こされる熱傷などの外傷に起因し得る。状態は、開放創または以前に閉じた傷の再開放を生じる外傷によって引き起こされ得る。状態は、皮膚の除去を生じる外傷によって引き起こされ得る。状態は皮膚癌であり得る。状態は、壊死性筋膜炎または電撃性紫斑病などの感染症に起因し得る。状態は、皮膚壊死によって引き起こされ得る。状態は、美容的であり得る。状態は、美容的欠陥であり得る。状態は、加齢に起因し得る。ある態様において、三次元皮膚組織は、創傷治癒を助ける処置において使用するためのものである。
手順
1ミリリットル当たり1億5000万個の細胞の濃度で、6%ゼラチンおよび1%アルギナート(Novogel(登録商標)3.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。上部を縁取る1mm壁を有する4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter(登録商標)プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、カップに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。プリント後、構築物を、2〜5分間5 mlの50 mM塩化カルシウム中に沈めることによって、直ちに架橋した。次いで、塩化カルシウムを吸引し、構築物を5 mlの線維芽細胞増殖培地(10% FBSおよびP/S/Aを含有するDMEM)中に沈めた。構築物を、加湿されていない37℃インキュベーター中において24時間成熟させた。24時間後、真皮組織構築物をインキュベーターから取り出し、BSCフード中に置いた。培地をエアロゾルスプレー適用の直前に吸引した。1ミリリットル培地当たり100万個の細胞の濃度で、90%初代成人ヒト表皮ケラチノサイト(HEKa)および10%初代成人ヒト表皮メラノサイト(HEMa)の細胞懸濁液混合物によって、表皮バイオインクを作製した。使用した培地は、90%ケラチノサイト増殖培地および10%メラノサイト培地を含有した。細胞を無菌様式でBSCフード中の滅菌ガラス瓶中へ分配し、手動で撹拌し、懸濁液を維持した。細胞懸濁液を含有する瓶を、堅く密封された蓋を通って出ている2つのチューブへ付けた。チューブの一方のセットは、細胞懸濁液の体積をフード内部のスプレーノズルへ連結した。瓶の蓋の内部から出ているチューブの別のセットは、23〜25 psiへ調節されたフード外部の圧縮空気タンクへ連結した。スプレーの直径をスプレーノズルの高さによって制御した。チューブを調節可能なスタンドへ付けることによって、スプレーノズルの高さを手動で調節した。高さをおよそ3 cmに設定し、6ウェルプレートの高さを可能にした。スプレー直径は、およそ2.5 cm、またはプレート中の1つのウェルの幅であった。スプレーノズルの流速を、1スプレー当たり100 msまたは200 msのパルス化分配によってデジタル制御した。バイオプリントされた真皮線維芽細胞組織構築物を含有するウェルプレートを、24時間後、37℃インキュベーターから取り出した。構築物培地を吸引した。真皮構築物を含有する各ウェルを、スプレーノズルの真下に個々に置いた。100 msまたは200 msでのシングル、ダブル、またはマルチプルパルスの適用を、構築物の表面上へスプレーした。対照として、スプレーをトランスウェル膜単独のものへも投与した。エアロゾルスプレー後、2 mlの培地を、トランスウェルバスケットの外部領域へ添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:40:10比率のHDFa:HEKa:HEMa培地であった。添加した体積は、プリントされた構造体の底部で集まるには十分であったが、構造体を沈めるには十分でなかった。スプレー体積を、分配された体積を1.5 mlチューブ中へ集めることによってプリント後に測定した。スプレー体積は、平均すると、200 msで1スプレーパルス当たり23μl、および100 msで1スプレー当たり8.7μlであった。生存性は、トリパンブルー色素排除アッセイによって90%と測定された。細胞数は、平均すると1 ml当たり140万個の細胞であり、このため、200 msで1スプレー当たり32,200個の細胞、および100 msで1スプレー当たり12,180個の細胞と再計算された。組織を第3日(エアロゾルスプレー適用後48時間)に4時間、1ウェル当たり3 mlの体積で0.34 mg/mlアルギナートリアーゼで処理した。培地をトランスウェルの外部領域へ添加した。リアーゼ培地の体積のメニスカスは、構築物を沈めることなく構築物の面の上部に達するのに十分であった。リアーゼ処理に続いて、培地を吸引し、1mlの新鮮な培地を各ウェルの外部領域へ添加し、組織構築物を気液界面へもっていった。培地を、その後最長12日間、1ウェル当たり1 mlで毎日変えた。インキュベーション後、構築物を組織学のために2%パラホルムアルデヒド(PFA)中に固定した。
バイオプリントされた真皮構築物を、線維芽細胞培地中で増殖させ、培地中でのインキュベーション後、これは密着性構造体を維持した。構築物を、第0日での架橋工程の直後に、および第1日でのエアロゾルスプレー適用の前に、画像化した(図8)。線維芽細胞から構成されるバイオインクを、連続的付着によってプリントし、真皮層を作り、続いてこれに、24時間の成熟期間後、ケラチノサイトおよびメラノサイトの細胞混合物をスプレーし、上部に表皮層を作る。全ての構築物が、連続的付着およびエアロゾルスプレー適用でのプリント後、密着性構造体を維持した。構築物は経時的に収縮した(図9)。皮膚組織をトランスウェルの面に対して垂直に切断し、真皮カップ構造体の底部および壁を示した。断面をH&Eによって染色した(図10)。エアロゾルスプレーによって付着された表皮層中のケラチノサイトを、ケラチノサイト特異的マーカーであるサイトケラチン14(CK14)を使用する免疫組織化学によって可視化した(図10)。CK14は、通常のヒト表皮皮膚中の基底層ケラチノサイトについてのマーカーであり、線維芽細胞やメラノサイトは染色されない。画像は、赤色で陽性CK14染色(ケラチノサイト)を示し、青色でdapi対比染色核(線維芽細胞)を示す。陽性染色は、エアロゾルスプレーが適用された構築物の頂端面上においてのみ見られ得る。染色は、エアロゾルスプレーが細胞の薄層を表面へ首尾よく適用することができることを示す。本適用は1層厚の細胞を示す。陽性CK14染色は、第2、4、および6日に構築物中に見られる(図11)。ケラチノサイトがより丸くなってそして潜在的に塊で現れるにつれて(矢印)、線維芽細胞組織は経時的により平らになる。ケラチノサイト形態の差異は、経時的な潜在的分化を示唆している。ケラチノサイトをトランスウェル膜の表面上にもスプレーした(図12)。細胞は、第8日に、真皮組織構築物上へスプレーされたケラチノサイトの形態と比較した場合、トランスウェル表面上において同様のグルーピングを形成する。
手順
1ミリリットル当たり1億5000万個の細胞の濃度で、6%ゼラチン(Novogel(登録商標))中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。上部を縁取る1mm壁を有する4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter(登録商標)プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、カップに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。95%初代成人ヒト表皮ケラチノサイト(HEKa)および5%初代成人ヒト表皮メラノサイト(HEMa)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって90.5%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって160,000細胞と推定された。次いで、培地をトランスウェルの外部ウェルへ2 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:40:10比率のHDFa:HEKa:HEMa培地であった。添加した体積は、プリントされた構造体の底部で集まるには十分であったが、構造体を沈めるには十分でなかった。48時間後に培地を変え、続いてその後毎日変えた。第2、9、および12日に、構築物を、RNA解析のために溶解させたか、または組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
第12日での皮膚組織のH&E染色は別個の層状構造を示す(図13、矢印、および14)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。このアプローチでの予想外の知見は、観察された層状構造の程度である。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する(矢印)。この層はCK14に対して特異的に染色され、これは、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置されたことを示している。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5およびインボルクリン(IVL)[顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー]に対して同時に染色されることによって可視化される。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。層状構造はまた、中期分化におけるCK10-陽性有棘および顆粒ケラチノサイトを含む(図15)。以前のプリント法は表皮層のCK14陽性染色を生じさせたが、観察されたパターンは、第10日で、層の全体にわたって広がっており、基底領域に非特異的である。本アプローチにおいて、予想外であることは、第12日において、ネイティブなヒト皮膚と同様に、染色が表皮層の底部での規定の領域に限定されることである(図16)。遺伝子発現解析は組織学的知見を支持している。データは、経時的に表皮分化マーカーCK1、CK10、および特に後期マーカーFLGの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲン4レベルが経時的に増加することを示しており、これは基底膜の形成を示唆している。コラーゲンIレベルは実験の時間経過にわたって維持され、これは真皮層が生存可能のままであることを示唆している(図17)。
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel(登録商標))中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞:ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度を減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter(登録商標)プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、シートに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。100%初代新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。別のしかし同一の表皮ペースト構造体を、真皮シートの隣りに、直接的にトランスウェルプリント表面上へ同時に付着させた。この構造体は、表皮ケラチノサイトペーストのみから構成され、真皮組織を含有しなかった。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって87.1%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって60,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。これは、Novogel(登録商標)を強固にするための重要な工程であり、これは、プリントされた形状を維持し、構築物間の均一性を改善するのを助ける。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ3 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKn培地であった。添加した最初の体積は、構造体を沈めるために十分であった。全てのその後の培地変更は、加温された培地(37℃)を使用し、内部バスケットではなくトランスウェルの外部ウェルへ添加した。48時間後に培地を変え、1ウェル当たり1.5 mlの体積へ減らし、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。その後続いて、培地を、48時間(第4日)で1.5 mlの体積で変えた。第5日に、培地を変え、1ウェル当たり1mlへさらに減らし、その後毎日変えた。第0および12日に、構築物を、RNA解析のために溶解させたか、または組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
トランスウェル表面上に直接プリントされる場合に対して、真皮シートの上部にプリントされたペーストの表皮層パターニングを比較するためのその後の組織学的解析は、予想外の知見をもたらした(図18AおよびB)。第12日での皮膚組織のH&E染色は、表皮ペーストが真皮層の上部にプリントされた構造体においてのみ、別個の層状構造を示す(図18CおよびD対FおよびG、図19A)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)[顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー]に対して同時に染色されることによって可視化される(図18E対H、図19B)。別個の緑色層は、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置され、より分化したIVL陽性細胞の層は上部に配置されたことを示している。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。増殖マーカーPCNAに対する染色(図19E、緑色)は、真皮線維芽細胞および基底層ケラチノサイトの両方において増殖が高いが、分化中のケラチノサイトにおいては高くないことを示している。このパターンは、ネイティブな皮膚において見られるものと類似している。TUNELによるアポトーシスに対する染色(図19F)もまた、真皮層または表皮層のいずれにおいてもごくわずかな陽性染色細胞を低く示している。まとめて、PCNAおよびTUNEL染色は、全層組織の真皮コンパートメントおよび表皮コンパートメントの両方が第12日に生存可能であることを実証している。遺伝子発現解析は組織学的知見を支持している。データは、第0日と比較しての第12日での、中期表皮分化マーカーCK1、CK10、および後期マーカーIVL、ロリクリンの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲンIおよび4レベルは実験の時間経過にわたって維持され、一方、コラーゲン3レベルは増加することを示しており、これは、真皮層が生存可能かつ機能的のままであることを示唆している(図20)。多くの驚くべき結果がこれから決定された;例えば、表皮ペーストは別個の層状構造中へ重層化することができること。現在の3D皮膚モデルは、これを達成するために、長期間にわたる単一のケラチノサイト単層の分化に頼る。ここで、本発明者らは、重層化がペーストで達成することが可能であることを示す。ペーストの厚みは単層よりも大きく、細胞がペースト内で自己組織化し、層として分化し得ることを示す。また、本発明者らは、真皮組織の存在無しでトランスウェル表面上へ直接プリントされたケラチノサイトペーストが、重層化層へ組織化しなかったことを示す。同じ分化マーカーに対する染色は、規定された層を含まないかまたは別個の細胞形態を含まない混合発現を示す。この予想外の知見は、真皮層が表皮ケラチノサイトの分化および/または重層化を指示すること、ならびに表皮細胞単独には存在しない、真皮細胞および表皮細胞の組み合わせの独自性があることを示している。3)表皮細胞および真皮細胞の両方から構成された組織中において観察された層状構造の程度は、CK5-陽性基底層の染色を含み、これは、ネイティブなヒト皮膚と同様に、表皮層の底部での規定の領域に限定される。層状構造はまた、中期分化におけるCK10陽性(図19C)有棘および顆粒ケラチノサイトを含み、その上にH&Eおよびトリクローム染色(それぞれ図19AおよびD)によって可視であるケラチノサイトの形態学的に別個の角化層を含む。このアプローチの注目すべき利点は、真皮層の外観である。H&E染色は、真皮線維芽細胞が、前の実施例1および2におけるような薄いシートを形成しないが、より厚い構造体を形成することを示している。コラーゲン付着(これは、真皮中における通常の線維芽細胞機能の重要な指標である)が、トリクローム染色(青色)および真皮細胞間のコラーゲン3についての免疫蛍光染色(赤色)の両方によって理解され得る(図19)。
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel(登録商標)2.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞:ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度を減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。4 mm x 4 mm x 0.5 mmベースにおいてNovogen Bioprinter(登録商標)プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、シートに似ている真皮構造体を作った。6ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。100%初代新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって87.1%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって60,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ3 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKn培地であった。添加した最初の体積は、構造体を沈めるために十分であった。全てのその後の培地変更は、加温された培地(37℃)を使用し、内部バスケットではなくトランスウェルの外部ウェルへ添加した。48時間後に培地を変え、1ウェル当たり1.5 mlの体積へ減らし、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。培地を、続いてその後48時間(第4日)で1.5 mlの体積で変えた。第5日に、培地を変え、1ウェル当たり1mlへさらに減らし、その後毎日変えた。第10日に、皮膚組織を、1% Triton X 100を使用する皮膚刺激試験法へ供した。1% Triton X-100(商標)は、他の3D皮膚モデルにおいて現在使用される公知の刺激原および参照化学物質である。方法は、インビトロ皮膚刺激または腐食へヒト皮膚モデルを適用するためのOECDガイドライン439および431にそれぞれ基づいた。第10日に、馴化培地を保存し(指定時間=0)、1 mlの新鮮な培地をトランスウェルの外部ウェルへ添加した。プリントされた皮膚組織を、次いで、陰性対照としての20μlのPBSで、または陽性対照および公知の刺激原としての20μlの1% Triton X-100(商標)で処理した。試験物質をピペットによって手動で組織の頂端面へ移した。Triton X-100(商標)を脱イオン水中の1%水溶液へ希釈し、使用前に20ミクロンフィルターで無菌濾過した。サンプルを、37℃で30分間、続いて室温で30分間、合計60分間、インキュベートした。培地を保存した(指定時間=1時間)。次いで、サンプルをPBSすすぎによって徹底的に洗浄した。次いで、トランスウェルを新しい6-ウェルプレート中に置き、新鮮な培地(1 ml)を外部ウェルへ添加し、次いで、一晩37℃へ戻した。次いで、処理後24時間および48時間で培地を変えた。収集した全培地は、時点 = -48、0、1、24、および48時間を含んだ。IL-1α産生(R&D Systems)を、製造業者のプロトコールに従って比色アッセイにおいて分析した。培地を、細胞傷害性についてのマーカーとしての乳酸デヒドロゲナーゼについて分析した。IL-1α産生を古典的な細胞傷害性試験の補足的なエンドポイントとして評価し、刺激原の予測可能性を改善した。ケラチノサイトは、通常、化学的または物理的なストレスに応答して炎症性サイトカインIL-1αを産生し、放出する。処理後48時間(第12日)で、組織を、RNA抽出およびその後のqPCR解析のために溶解させたか、またはアラマーブルーアッセイによって生存性について試験し、次いで、PBS中でリンスし、組織学的解析のために2% PFAで固定した。アラマーブルー(Life Technologies)を、製造業者の説明書に従って培地へ添加し、組織構築物(1 ml)と共に37℃で3時間インキュベートした。生存性をレサズリンからレゾルフィンへの変換による培地中の蛍光として測定した。
生存性/細胞傷害性に対するTriton X-100処理の効果を、アラマーブルーアッセイ、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)活性、およびIL-1α産生によって定量化した。1% Triton X 100で1時間処理された皮膚組織は、処理後に試験された1時間、24時間、および48時間の時点でPBS対照と比較してLDH活性のおよそ2倍の誘導を示した。対照的に、PBS対照は0時間での初期ベースラインと同様である(図21A)。IL-1α活性もまた、PBS対照と比較してTriton X処理に応答して増加し、最大差は処理後1時間で観察された。IL-1αレベルは、処理後24時間で高いままであったが、48時間でベースラインへ戻った(図21B)。処理後48時間での組織の比較は、PBS対照と比較して生存性の80%減少を示す(図18C)。第12日でのPBS対照群における皮膚組織のH&E染色は、別個の層状構造を示す(図22A)。真皮層中の線維芽細胞は底部(紫色)で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部(桃色)に観察される。特に、界面で観察され得る別個の形態を有する細胞の層が存在する。分化ケラチノサイトの別個の層は、基底細胞マーカーCK5(緑色)およびインボルクリン(IVL、赤色)[顆粒および角化ケラチノサイトの後期分化マーカー]に対して同時に染色されることによって可視化される(図22B)。別個の緑色層は、付着されたペースト中のケラチノサイト細胞が基底層へ配置され、より分化したIVL陽性細胞の層は上部に配置されたことを示している。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである。層状構造はまた、中期分化におけるCK10-陽性有棘および顆粒ケラチノサイトを含む(図22C)。コラーゲン付着(これは、真皮中における通常の線維芽細胞機能の重要な指標である)が、トリクローム染色(図22D)(青色)および真皮細胞間のコラーゲン3についての免疫蛍光染色(赤色)(図22E)の両方によって理解され得る。増殖マーカーPCNAに対する染色(緑色)は、真皮線維芽細胞および基底層ケラチノサイトの両方において増殖が高いが、分化中のケラチノサイトにおいては高くないことを示している。このパターンは、ネイティブな皮膚において見られるものと類似している。TUNELによるアポトーシスについての染色もまた、真皮層または表皮層のいずれにおいてもごくわずかな陽性染色細胞を低く示している(図22F)。まとめて、PCNAおよびTUNEL染色は、全層組織の真皮コンパートメントおよび表皮コンパートメントの両方が第12日に生存可能であることを実証している。Triton Xで処理された組織は、肉眼ではPBS対照組織と同様に見えた。しかしながら、組織学的解析は、H&Eによる表皮層および真皮層の分離を明らかにし(図22G)、これは、基底膜および/または基底ケラチノサイト層の可能性のある壊死を示唆している。ケラチノサイト分化マーカーCK5、IVL、およびCK10が見られ得るが(図22HおよびI)、CK5陽性基底ケラチノサイト層が断片化されている。コラーゲン3染色もまたPBS対照と比較し、これは、真皮線維芽細胞機能の減少を示している(図22K)。生存性もまた減少し、生化学的データと一致している。これは、真皮線維芽細胞中のより少ないPCNA陽性染色および基底層中の染色の欠如によって明白な、増殖の減少によって実証される。真皮層中のTUNEL陽性染色によって実証されたようなアポトーシスの増加(図22L)と組み合わせて、組織学は、1% Triton Xはバイオプリントされた皮膚に対する刺激原であることを示唆している。遺伝子発現解析は組織学的および生化学的知見を支持している。データは、第0日での組織と比較してのPBS対照群における経時的な表皮分化マーカーCK1、CK10、ならびに後期マーカーIVL、ロリクリン、およびFLGの増加を示している。遺伝子発現はまた、コラーゲンIおよび4レベルは実験の時間経過にわたって維持され、一方、コラーゲン3レベルは増加することを示しており、これは、真皮層が生存可能のままであることを示唆している(図23)。1% Triton Xでの処理は、曝露後48時間での表皮マーカーおよび真皮マーカーの両方の発現を劇的に減少させた(図23)。CK1およびCK10が減少し、これは、表皮の有棘層/顆粒層に対する可能性のある効果を示唆している。1型、3型、および4型コラーゲンのコラーゲン産生が減少し、これは、同様に、真皮線維芽細胞の機能に対する負の影響を示唆している。炎症性サイトカインIL1a遺伝子発現もまた分析し、これはPBS対照と比較して約3倍増加することが分かり、これは、処理後48時間において、ケラチノサイトはTriton Xへの曝露によって依然としてストレスをかけられていることを示唆している(図24)。
手順
1ミリリットル当たり5000万個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel(登録商標)2.0)中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。細胞:ゼラチン比率を変更し、真皮シートの細胞密度をさらに減らし、ネイティブな皮膚中の真皮組織をよりよく模倣した。2 mm x 2 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter(登録商標)プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントし、シートに似ている真皮構造体を作った。より小さな注射針を使用し、より小さなサイズでより大きな分解能を達成した。500um直径注射針で1つの0.5 mmシートをプリントする代わりに、250um直径針で0.25 mmシートの2つの層をプリントした。24ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。100%初代新生児ヒト表皮ケラチノサイト(HEKn)の混合物を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって96.0%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって11,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。これは、Novogel(登録商標)を強固にするための重要な工程であり、これは、プリントされた形状を維持し、構築物間の均一性を改善するのを助ける。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ1 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKn培地であった。添加した最初の体積は、構造体を沈めるために十分であった。全てのその後の培地変更は、加温された培地(37℃)を使用し、内部バスケットではなくトランスウェルの外部ウェルへ添加した。48時間後に培地を変え、1ウェル当たり0.25 mlの体積へ減らし、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。培地をその後毎日変えた。皮膚組織を、1% Triton X 100および5% SDSを使用する皮膚刺激試験法へ供した。1% Triton X 100および5% SDSは、他の3D皮膚モデルにおいて現在使用される公知の刺激原および参照化学物質である。方法は、インビトロ皮膚刺激または腐食へヒト皮膚モデルを適用するためのOECDガイドライン439および431にそれぞれ基づいた。第13日に、培地を変えた。馴化培地を保存し(指定時間=0)、1 mlの新鮮な培地をトランスウェルの外部ウェルへ添加した。プリントされた皮膚組織を、次いで、陰性対照としての5μlのPBSで、または陽性対照および公知の刺激原としての5μlの1% Triton X 100でもしくは5μlの%% SDSで処理した。試験物質をピペットによって手動で組織の頂端面へ移した。Triton X 100およびSDSの両方を脱イオン水中の水溶液に希釈し、使用前に20ミクロンフィルターで無菌濾過した。サンプルを室温で15分間インキュベートした。培地を保存した(指定時間=15分)。次いで、サンプルをPBSすすぎによって徹底的に洗浄した。次いで、トランスウェルを新しい6-ウェルプレート中に置き、新鮮な培地(0.25 ml)を外部ウェルへ添加し、次いで、一晩37℃へ戻した。次いで、処理後24時間および42時間で培地を変えた。収集した全培地は、時点 = 0、15分、24時間、および42時間を含んだ。IL-1α産生(R&D Systems)を、製造業者のプロトコールに従って比色アッセイにおいて分析した。培地を、細胞傷害性についてのマーカーとしての乳酸デヒドロゲナーゼについて分析した。IL-1α産生を古典的な細胞傷害性試験の補足的なエンドポイントとして評価し、刺激原の予測可能性を改善した。ケラチノサイトは、化学的または物理的なストレスに応答して炎症性サイトカインIL-1αを産生し、放出する。処理後42時間(第15日)で、組織を、RNA抽出およびその後のqPCR解析のために溶解させたか、またはアラマーブルーアッセイによって生存性について試験し、次いで、PBS中でリンスし、組織学的解析のために2% PFAで固定した。アラマーブルー(Life Technologies)を、製造業者の説明書に従って培地へ添加し、組織構築物(0.25 ml)と共に37℃で3時間インキュベートした。生存性をレサズリンからレゾルフィンへの変換による培地中の蛍光として測定した。
皮膚組織は、曝露後42時間でのPBS対照組織と比較してのSDSおよびTriton Xの両方に対する上昇したLDH反応を示した(図25A)。SDS処理群におけるLDH活性は、PBSよりも約1.7倍高く、一方、Triton Xは約1.4倍高く、これは、5% SDSでの15分間の曝露は、1% Triton Xよりも顕著な効果を構築物生存性に対して有したことを示唆している。IL-1a産生も両方の刺激原によって誘導され、しかしながら、SDS処理は、LDH活性と一致して、遥かにより強い反応をもたらした(図25B)。SDSおよびTriton Xで処理された組織は両方とも、アラマーブルーアッセイによって生存性の減少を示した(図25C)。SDSで処理された組織はPBS対照と比較して2.45%だけ生存可能であり、一方、Triton Xで処理された組織は68.75%生存可能であった。このデータは、LDH活性およびIL1a産生と一致しており、これは、5% SDSはこれらの試験条件下で1% Triton Xよりも遥かに強い刺激原であることを示唆している。実施例5と比較しての実施例4におけるTriton Xに応答しての差は、刺激原と共のより短いインキュベーション時間に起因し得る。
手順
1ミリリットル当たり1億個の細胞の濃度で、8%ゼラチン(Novogel(登録商標))中の100%初代成人ヒト真皮線維芽細胞(HDFa)の細胞混合物によって、バイオインクを作製した。3 mm x 3 mm x 0.5 mmベースシートにおいてNovogen Bioprinter(登録商標)プラットフォームを使用する連続的付着によって三次元のバイオインク構築物をプリントした。12ウェルプレート中の1トランスウェル当たり1つの組織構築物をプリントした。トランスウェルプリント表面は、3μmサイズの細孔を有する、I型およびIII型コラーゲン(ウシ)の等モル混合物でコーティングされたポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜を含有した。IV型コラーゲン、ラミニン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンの混合物を含有する細胞外マトリックス(ECM)を、1ミリリットル当たり120マイクログラムの濃度で、次いで、真皮バイオインクの上部にプリントした。100%初代成人ヒト表皮ケラチノサイト(HEKa)を含有する表皮細胞ペーストを、次いで、ECMの上部にプリントした。細胞ペーストは、トリパン排除アッセイによって94.4%生存可能とプリント後に測定された。付着された表皮層中の細胞数は、Cell-O-Meterにおける細胞カウンティングによって14,000細胞と推定された。プリントの直後に、構築物を4℃で10分間置いた。次いで、冷培地をトランスウェルの外部ウェルへ0.5 mlの体積で添加した。皮膚組織のその後の増殖および維持のために使用した培地は、50:50比率のHDFa:HEKa培地であった。添加した体積は、プリントされた構造体の底部で集まるには十分であったが、構造体を沈めるには十分でなかった。培地を、ウェル中合計1 mlのために0.5 mlの体積で、90分後に再び添加した。培地を48時間後に1 mlの体積で変えた。培地をさらに24時間後(第3日)に0.5 mlの体積で再び変え、構造体を気液界面(ALI)へもっていった。培地を、続いてその後一日おきに、0.5 mlの体積で変えた。第10日に、構築物を組織学的解析のために2% PFA中に固定した。
第10日での皮膚組織のH&E染色は別個の層状構造を示す(図28AおよびB)。真皮層中の線維芽細胞は底部で観察され、表皮層中の分化ケラチノサイトは上部に観察される。分化ケラチノサイトの別個の層状構造は、基底細胞マーカーCK5および分化マーカーインボルクリン(IVL)に対して同時に染色されることによって可視化される。通常のヒト皮膚と同様に、形態の差異が見られ、何故ならば、基底細胞は別個の立方体様形態を有するようであり、一方、上部における分化ケラチノサイトはより平らに見えるためである(図28AおよびB)。以前のプリント法は基底ケラチノサイト層のCK5陽性染色を生じさせたが、表皮層と真皮層との間の界面または真皮-表皮接合部の境界は明らかには定められなかった。表皮ケラチノサイトの基底層と真皮層との間の界面に基底膜がある。IV型およびVII型コラーゲンは両方とも基底膜形成の特異的マーカーである。本アプローチにおいて、予想外であることは、基底膜マーカーであるIV型およびVII型コラーゲンの発現および組織化の程度である。予想外であることは、両方のマーカーの染色パターンが、ネイティブなヒト皮膚と同様に、真皮-表皮接合部での表皮ケラチノサイトの基底層の正確に底部での、規定の領域または線に限定されることである(図28E〜H)。
Claims (130)
- a.真皮バイオインクを含む真皮層であって、真皮バイオインクが線維芽細胞を含む、真皮層;および
b.表皮バイオインクを含む表皮層であって、表皮バイオインクがケラチノサイトを含む、表皮層
を含む、三次元人工生体皮膚組織であって、
但し、該表皮層が該真皮層と接触して三次元人工生体皮膚組織を形成している、
三次元人工生体皮膚組織。 - 真皮層が真皮線維芽細胞から本質的になる、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層がケラチノサイトから本質的になる、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が初代ケラチノサイトから本質的になる、請求項3記載の皮膚組織。
- 表皮層が初代ケラチノサイトを含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が実質的に単層である、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が多層であり、ケラチノサイトの複数の層を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が、バイオプリンターからのエアロゾルスプレー付着によって真皮層上へバイオプリントされた、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が、真皮層のバイオプリントの直後に真皮層上へバイオプリントされた、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が、真皮層のバイオプリントおよびその後の融合の後に真皮層上へバイオプリントされた、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が真皮層と途切れることなく接触している、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層の90%超が真皮層と接触している、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層の70%超が真皮層と接触している、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層の50%超が真皮層と接触している、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が20〜500μm厚である、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層が約150μm厚である、請求項15記載の皮膚組織。
- 真皮層が10〜1000μm厚である、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮層が約500μm厚である、請求項17記載の皮膚組織。
- 表皮層が押し出し化合物を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮層が押し出し化合物を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層がメラノサイトを含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮層がケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる、請求項21記載の皮膚組織。
- ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約99:1〜約75:25 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮層中に存在する、請求項21記載の皮膚組織。
- ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約90:10〜約99:1 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮層中に存在する、請求項21記載の皮膚組織。
- 分泌細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 分泌細胞が脂腺細胞を含む、請求項25記載の皮膚組織。
- 免疫細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 免疫細胞がランゲルハンス細胞を含む、請求項27記載の皮膚組織。
- 毛包幹細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 癌細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮層および表皮層と接触している基底層を含み、基底層が基底ケラチノサイトを含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 基底層の細胞がKRT14(CK14)に対して陽性に染色される、請求項1記載の皮膚組織。
- 予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項1記載の皮膚組織。
- 線維芽細胞およびケラチノサイトがヒト細胞である、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮層が少なくとも30体積%の生細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮層が少なくとも70体積%の生細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮層の腹側にある皮下層を含み、皮下層が皮下バイオインクを含み、皮下バイオインクが内皮細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 少なくとも1つのバイオインクが複数のオルガノイドを含み、オルガノイドが腺細胞または毛包細胞(follicle cell)を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 表皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項40記載の皮膚組織。
- 真皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 真皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項44記載の皮膚組織。
- 試験物質を含み、試験物質が、該物質で処理されない皮膚組織と比較して皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項1記載の皮膚組織。
- 試験物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に存在する、請求項46記載の皮膚組織。
- 試験物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に存在する、請求項46記載の皮膚組織。
- 試験物質が表皮層の頂端面と接触している、請求項46記載の皮膚組織。
- 試験物質が表皮層と真皮層との間にある、請求項46記載の皮膚組織。
- 試験物質が真皮層とプリント表面との間にある、請求項46記載の皮膚組織。
- 試験物質が外側表面と接触している、請求項46記載の皮膚組織。
- 試験物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント(discreet compartment)内にある、請求項46記載の皮膚組織。
- 治療物質を含む、請求項1記載の皮膚組織。
- 治療物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に存在する、請求項54記載の皮膚組織。
- 治療物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に存在する、請求項54記載の皮膚組織。
- 治療物質が表皮層の頂端面と接触している、請求項54記載の皮膚組織。
- 治療物質が表皮層と真皮層との間にある、請求項54記載の皮膚組織。
- 治療物質が真皮層とプリント表面との間にある、請求項54記載の皮膚組織。
- 治療物質が外側表面と接触している、請求項54記載の皮膚組織。
- 治療物質が、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内にある、請求項54記載の皮膚組織。
- 少なくとも1つの層の付着が、前の層の付着後に時間的に遅らされた、請求項1記載の皮膚組織。
- 時間的遅延が10ミリ秒を超える、請求項62記載の皮膚組織。
- 皮膚組織が遺伝キメラである、請求項1記載の皮膚組織。
- 皮膚組織が種キメラである、請求項1記載の皮膚組織。
- インビトロアッセイ、薬物スクリーニングアッセイ、または化粧品アッセイを容易にするようにアレイに構成された、複数の請求項1記載の皮膚組織。
- 各組織間に少なくとも20μmのスペースを空けるように構成された、請求項66記載の複数の皮膚組織。
- a.真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程;
b.ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程;
c.表面上に真皮バイオインクを付着させる工程;
d.表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程;および
e.細胞を密着させて三次元人工生体皮膚組織を形成するように、前記付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程
を含む、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法。 - 真皮バイオインクを押し出しバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクをエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
- 真皮バイオインクをエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
- 支持材料をエアロゾルスプレーバイオプリントによって付着させる、請求項68記載の方法。
- 真皮バイオインクが少なくとも30体積%、生細胞である、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクが少なくとも30体積%、生細胞である、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクが初代ケラチノサイトを含む、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクが初代ケラチノサイトから本質的になる、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクがメラノサイトを含む、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクがケラチノサイトおよびメラノサイトから本質的になる、請求項77記載の方法。
- ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約99:1〜約75:25 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮バイオインク中に存在する、請求項78記載の方法。
- ケラチノサイトおよびメラノサイトが、約90:10〜約99:1 ケラチノサイト対メラノサイトの比率で表皮バイオインク中に存在する、請求項78記載の方法。
- 真皮バイオインクまたは表皮バイオインクが癌細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 真皮バイオインクまたは表皮バイオインクが、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 付着されたバイオインク中へ複数のオルガノイドを付着させる工程を含み、オルガノイドが腺細胞または毛包細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 皮下バイオインクを調製する工程を含み、皮下バイオインクが内皮細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 皮下バイオインクを少なくとも1つの表面上の表面上に付着させ、続いて真皮バイオインクを付着させる、請求項84記載の方法。
- 表皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項87記載の方法。
- 真皮バイオインクが1 ml当たり5万〜5000万個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 真皮バイオインクが1 ml当たり500万〜5億個の細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 真皮バイオインクが1 ml当たり約1億5000万個の細胞を含む、請求項90記載の方法。
- 真皮バイオインクが押し出し化合物を含む、請求項68記載の方法。
- 表皮バイオインクが押し出し化合物を含む、請求項68記載の方法。
- いずれかのバイオインクが分泌細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 分泌細胞が脂腺細胞を含む、請求項94記載の方法。
- いずれかのバイオインクが免疫細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 免疫細胞がランゲルハンス細胞を含む、請求項96記載の方法。
- いずれかのバイオインクが毛包幹細胞を含む、請求項68記載の方法。
- いずれかのバイオインクが癌細胞を含む、請求項68記載の方法。
- いずれかのバイオインクが、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞由来の細胞を含む、請求項68記載の方法。
- 真皮層および表皮層と接触している基底層を付着させる工程を含み、基底層が、基底ケラチノサイトを含むバイオインクを含む、請求項68記載の方法。
- 組織をスキャフォールド上に付着させない、請求項68記載の方法。
- 線維芽細胞およびケラチノサイトがヒト細胞である、請求項68記載の方法。
- 試験物質を付着させる工程を含み、試験物質が、該物質で処理されない皮膚組織と比較して皮膚組織において変化を誘発するその能力についての評価を受けている物質である、請求項68記載の方法。
- 試験物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に付着させる、請求項104記載の方法。
- 試験物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に付着させる、請求項104記載の方法。
- 試験物質を、表皮層の頂端面と接触した状態で付着させる、請求項104記載の方法。
- 試験物質を表皮層と真皮層との間に付着させる、請求項104記載の方法。
- 試験物質を真皮層とプリント表面との間に付着させる、請求項104記載の方法。
- 試験物質を、外側表面と接触した状態で付着させる、請求項104記載の方法。
- 試験物質を、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に付着させる、請求項104記載の方法。
- 治療物質を付着させる工程を含む、請求項68記載の方法。
- 治療物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって均一に付着させる、請求項112記載の方法。
- 治療物質を真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方の全体にわたって不均一に付着させる、請求項112記載の方法。
- 治療物質を、表皮層の頂端面と接触した状態で付着させる、請求項112記載の方法。
- 治療物質を表皮層と真皮層との間に付着させる、請求項112記載の方法。
- 治療物質を真皮層とプリント表面との間に付着させる、請求項112記載の方法。
- 治療物質を、外側表面と接触した状態で付着させる、請求項112記載の方法。
- 治療物質を、真皮層、表皮層、または真皮層および表皮層の両方内に埋め込まれた不連続コンパートメント内に付着させる、請求項112記載の方法。
- 真皮バイオインク上への表皮バイオインクの付着において時間的遅延を含む、請求項68記載の方法。
- 遅延が10ミリ秒を超える、請求項120記載の方法。
- a.人工皮膚組織である第1の人工組織であって、人工皮膚組織が:真皮バイオインクを含む真皮層であって、真皮バイオインクが真皮線維芽細胞を含む、真皮層と;表皮バイオインクを含む表皮層であって、表皮バイオインクがケラチノサイトを含む、表皮層とを含み、該表皮層が該真皮層と接触して人工皮膚組織を形成している、第1の人工組織;ならびに
b.皮膚組織ではない第2の人工組織であって、前記人工皮膚組織と物理的にまたは流体的に接触して多組織システムを形成しており、第2の組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、第2の人工組織
を含む、三次元人工生体多組織システム。 - 第1の人工組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、請求項122記載の多組織システム。
- 第2の人工組織の少なくとも1つのコンポーネントがバイオプリントされた、請求項122記載の多組織システム。
- 第2の人工組織が、肝臓組織、腎臓組織、骨組織、肺組織、脈管組織、脳組織、腸組織、胃組織、または食道組織である、請求項122記載の多組織システム。
- 人工皮膚組織が、使用時に、予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項122記載の多組織システム。
- 第2の人工組織が、使用時に、予め形成されたスキャフォールドを実質的に含まない、請求項122記載の多組織システム。
- 真皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、真皮が真皮線維芽細胞を含み;但し、真皮は、真皮バイオインクからバイオプリントされ、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組織。
- 表皮を含む三次元人工生体皮膚組織であって、表皮がケラチノサイトを含み;但し、表皮は、表皮バイオインクからバイオプリントされ、そして融合して三次元人工生体皮膚組織を形成している、三次元人工生体皮膚組。
- a.真皮線維芽細胞を含む真皮バイオインクを調製する工程;
b.ケラチノサイトを含む表皮バイオインクを調製する工程;
c.表面上に真皮バイオインクを付着させる工程;
d.表皮バイオインクが真皮バイオインクの少なくとも1つの表面上に層を形成するように、表皮バイオインクを付着させる工程であって、表皮バイオインクの付着が、真皮バイオインクの付着後10ミリ秒を超えてかつ21日未満で生じる、工程
を含む、三次元人工生体皮膚組織を製造する方法。
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