JP2014204711A

JP2014204711A - 三次元培養皮膚モデルの製造方法およびその利用

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Publication number: JP2014204711A
Application number: JP2013105359A
Authority: JP
Inventors: 憲明鎌田; Noriaki Kamata; 弘之松江; Hiroyuki Matsue
Original assignee: Chiba University NUC
Current assignee: Chiba University NUC
Priority date: 2013-03-19
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2014-10-30

Abstract

【課題】角化細胞が採取される個体間における個体差を評価でき、テーラーメイドの評価を可能とする、安価な手段を提供する。
【解決手段】本発明の一形態によれば、動物の毛包から採取された組織に由来するか、または動物の毛包から採取された角化細胞を三次元的に培養する培養工程を含む、三次元培養皮膚モデルの製造方法が提供される。
【選択図】図２

Description

本発明は、三次元培養皮膚モデルの製造方法およびその利用に関する。

ヒト等の動物の上皮細胞を増殖させた培養細胞や、当該培養細胞から再構築させた構築体は、動物実験代替法の一つの実験モデルとして用いられている。

皮膚外用剤や化粧料等の研究においては、上述したような上皮再構築体が、ヒト皮膚モデルとして安全性試験や皮膚生理試験に用いられており、このような皮膚モデルは各種市販もされている。これらヒト皮膚モデルは、メンブレンやコラーゲンゲル、デエピダーミストダーミス（de-epidermised dermis）等の支持体上に角化細胞を播種して、浸漬培養、気相・液相培養することで、実際の皮膚と同様の上皮各層（基底層、有棘層、顆粒層、角層）からなる上皮が形成されている。

ここで、ＯＥＣＤ加盟国の標準的ガイドライン（OECD(2004). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris）においては、化学物質の皮膚吸収の評価法として、recombinant human epidermis（ＲＨＥ）を用いた三次元培養皮膚モデルを利用した方法が認められており、その有用性は非特許文献１でも確認されている。

Toxicology in Vitro, 24 (2010) 257-266

しかしながら、上述のＲＨＥを用いた評価法において、ＲＨＥを作製する際に用いられる表皮角化細胞（ケラチノサイト）は手術の際に得られた余剰皮膚を由来とするものである。したがって、角化細胞が採取された個体の背景が明らかでないために、得られた三次元培養皮膚モデルでは個体差を評価できない（すなわち、テーラーメイド（個別化）の評価はできない）という問題がある。また、ＲＨＥを用いた評価法は、一般に高価であるという問題もある。

そこで本発明は、角化細胞が採取される個体間における個体差を評価でき、テーラーメイドの評価を可能とする、安価な手段を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行った。その過程で、驚くべきことに、動物の毛包由来の角化細胞を培養することで、上記の課題を解決しうる三次元培養皮膚モデルが提供されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明の一形態によれば、動物の毛包から採取された組織に由来するか、または動物の毛包から採取された角化細胞を三次元的に培養する培養工程を含む、三次元培養皮膚モデルの製造方法が提供される。

本発明によれば、角化細胞が採取される個体間における個体差を評価でき、テーラーメイドの評価を可能とする、安価な手段が提供される。

実施例において、ヒトの毛包由来の角化細胞を用いて三次元培養皮膚モデルを作製したフローを説明する写真である。実施例で得られた三次元培養皮膚モデルの断面写真である。実施例で得られた三次元培養皮膚モデルおよび皮膚由来の三次元皮膚モデルのそれぞれについて、Ｈ＆Ｅ染色によりケラチンの発現パターンを確認した断面写真である。実施例で得られた三次元培養皮膚モデルおよび皮膚由来の三次元皮膚モデルのそれぞれについて、Ｈ＆Ｅ染色によりフィラグリンの発現パターンを確認した断面写真である。実施例において、９７歳女性の毛包由来の角化細胞を用いて作製した三次元培養皮膚モデル（６継代したもの）についての、培養開始後１４日目、２１日目、および２８日目の断面写真である。実施例において、１００歳以上の女性３名の毛包由来の角化細胞を用いて作製した三次元培養皮膚モデルについての、培養開始後１４日目の断面写真である。実施例において、同一の健常人の毛包および皮膚からそれぞれ採取した角化細胞を用いて作製した二次元培養および三次元培養皮膚モデルを用いて、ＴｏｔａｌＲＮＡをテンプレートとしたＧｅｎｅＡｒｒａｙ解析により、遺伝子発現のプロファイルを解析した結果を示すグラフである。実施例において、３人の異なる被験者の毛包由来の三次元培養皮膚モデルを用いて、各人の皮膚の薬剤に対する反応性を評価した結果を示すグラフである。実施例において、５人の異なるアトピー性皮膚炎患者と４人の異なる健常人の毛包由来の三次元培養皮膚モデルを用いて、TotalRNAをテンプレートとしたRNAseq解析により遺伝子発現を比較した際のクラスタリング解析の結果を示す図である。

以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。

本発明の一形態は、動物の毛包から採取された組織に由来するか、または動物の毛包から採取された角化細胞を三次元的に培養する培養工程を含む、三次元培養皮膚モデルの製造方法が提供される。また、本発明の他の形態によれば、ヒトの毛包から採取された組織に由来するか、または動物の毛包から採取された角化細胞を三次元的に培養する培養工程を含む、三次元培養皮膚モデルの製造方法が提供される。

まず、本発明に係る製造方法において用いられる「毛包」は、いずれの動物のものであってもよいが、脊椎動物のものであることが好ましく、哺乳動物のものであることがより好ましく、ヒトのものであることが最も好ましい。また、他の好ましい実施形態において、動物またはヒトは、生きている動物またはヒトである。

また、毛包は、動物の個体の頭髪、眉毛、睫毛、髭等を抜毛することで得ることができる。本方法で使用する毛包は、成長期の毛包であることが好ましい。成長期の毛包は、例えば抜毛を顕微鏡下で観察し、外毛根鞘とバルジ領域が存在することを指標に選択することができる。

このようにして選択された毛包に対して、例えばプロテアーゼ処理などの前処理を施した後、培養液中で毛包をインキュベートする。これにより、毛包の周囲に角化細胞（ケラチノサイト）の増殖がみられるようになることから、コンフルエントになるまで培養液の交換を繰り返す。なお、本発明に係る製造方法において用いられる培養液は特に制限されず、市販されている細胞増殖用培養液（培地）であればいずれも用いることができる。なお、この培養液は、１〜３日に一回交換することが好ましい。

角化細胞が毛包の周囲でコンフルエントに達したら、角化細胞を回収し、シャーレや培養プレートのウェルなどに移し、同様にして培養を継続する。どの程度培養を継続するか（培養時間、期間）は、所望の角化細胞の量などを考慮して、適宜決定すればよい。

このようにして培養した角化細胞は、後述する三次元培養工程に供されて三次元培養皮膚モデルの作製に用いられるが、ここまでの培養後すぐに三次元培養工程に用いられない場合には、チューブ等に入れて冷凍保存しておいてもよい。このように冷凍保存された角化細胞を融解したものを用いても、三次元培養皮膚モデルの作製は可能である（後述する実施例を参照）。

続いて、上記で得られた角化細胞を三次元培養する。これにより、三次元培養皮膚モデルが作製される。角化細胞を三次元培養するには、上記で得られた角化細胞を、例えば細胞培養インサートなどの培養容器（支持体）に入れ、増殖培養させればよい。具体的には、上記で得られた角化細胞を三次元培養用培養液中に分散し、支持体としての細胞培養インサートの液透過性膜底面に添加し、細胞培養インサート外側も同じ細胞増殖用培養液で満たして、培養する。これにより、角化細胞および培養液を内部に含む細胞培養インサートが、さらに培養液中に浸漬された状態で培養工程が行われることになり、この際、細胞培養インサートの内部と外部とは培養液が透過可能なように連通している状態が維持される。

ここで、細胞培養インサートに添加する角化細胞の数は、特に限定されないが、通常１．５×１０^５〜４．５×１０^５細胞／ｃｍ^２の範囲であることが好ましく、２．０×１０^５〜３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２の範囲がより好ましい。

細胞培養インサートの液透過性膜は、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等を用いてもよく、さらに膜にコラーゲンやラミニン、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスやポリL-リジン等の細胞の接着を補助するものをコーティングしてもよい。

さらに、支持体として培養インサートを用いる他に、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジもしくは上皮や線維芽細胞が除去された無細胞化真皮を用いてもよい。これらを支持体として用いる場合には、適宜線維芽細胞を組み込んでもよい。また、これらの支持体には支持体表面にガラスリングを設置し、その中に角化細胞の細胞懸濁液を添加するのが好ましい。

細胞培養インサートでの培養は、角化細胞が細胞培養インサート底面に対してコンフルエントになるまで培養させるものであり、数日間程度（１〜６日間程度、好ましくは２〜４日間程度）培養させることが好ましい。また、この間、培養液を適宜交換してもよい。ここで、上述したような液透過性底面を有する細胞培養インサートを用いて培養を行うと、細胞培養インサートの内部と外部とは培養液が透過可能なように連通している状態が維持されるが、これにより、細胞培養インサートにおいて増殖した角化細胞のコンフルエントの状態を簡便に確認することができる。すなわち、インサート内の培養液の液面が、インサート外（例えば、プレートのウェル）内の培養液の液面よりも高くなったときに、角化細胞がコンフルエントになったと判断することができる。これは、コンフルエントになっていなければインサートの液透過性底面の膜の孔を通して培養液が移動して液面が同じ高さに釣り合うのに対し、コンフルエントになれば膜の孔が塞がれる結果、培養液は膜の孔を通して移動できなくなり、液面が異なることとなるためである。このようにして、培養工程を終了して三次元培養皮膚モデルを得ることができる。なお、かようなコンフルエントの判定をより確実に行うためには、インサート外（プレートのウェル等の内部）に添加する培養液の量を、インサート内に添加する培養液の量に対して１．５〜２．５倍程度となるように多めに設定するとよい。

なお、本発明における各培養工程の培養温度は由来動物の体温付近であればよく、具体的にはヒト角化細胞の場合は、３６〜３８℃程度とするのが好適である。

上記のようにして本発明に係る製造方法により製造された三次元培養皮膚モデルは、動物実験代替法の一つとして、一般的な実験モデル（皮膚モデル等）として用いることができる。例えば、皮膚の化学物質（例えば、工業製品、家庭用品、薬剤、皮膚外用剤、化粧料など）に対する反応性を評価する方法に、また新規化合物の皮膚に対する安全性の個人差を評価する補法に本発明に係る三次元培養皮膚モデルを用いることができる。具体的には、本発明に係る三次元培養皮膚モデルに、薬剤や皮膚外用剤、化粧料等を投与（「塗布」も含む）して、その細胞の角化する状態を互いに比較することによりこれらの化学物質に対する皮膚の反応性を観察して、工業製品、家庭用品、薬剤、皮膚外用剤、化粧料等を評価、スクリーニングすることが可能である。

また、本発明に係る製造方法により製造された三次元培養皮膚モデルは、由来動物（固体）の皮膚（免疫機構や代謝機構等）に近い状態のものであることから、より個別的なアプローチに利用することも可能である。すなわち、特定の動物（個体）由来の本発明に係る三次元培養皮膚モデルを用いて、例えば、特定の化学物質が当該特定の動物（個体）の皮膚に対して刺激性を有するものであるか否かを判定することができる。すなわち、本発明に係る三次元培養皮膚モデルは、被験物質の評価またはスクリーニングにも用いられうる。具体的には、本発明に係る三次元培養皮膚モデルに、薬剤（例えば、炎症性皮膚疾患の治療剤）や皮膚外用剤、化粧料（例えば、保湿剤）等またはこれらに使用するための被験物質を投与して、培養を行う。この際、対照として、未投与の本発明の三次元培養皮膚モデルを用いるのが、その細胞の角化する状態を互いに比較することにより判定が正確かつ容易に行うことができるので、好適である。なお、必要に応じて従来の三次元培養皮膚モデルを用いてもよい。また、場合によっては、皮膚移植、薬量や副作用の見積り等に利用することも可能である。

このように本発明に係る三次元培養皮膚モデルを用いれば、薬剤や皮膚外用剤、化粧料等またはこれらに使用するための被験物質を評価またはスクリーニングすることが可能となる。

また、本発明によれば、少量採取した抜毛の毛包由来の角化細胞を培養することで、生体皮膚に近い状態の三次元培養皮膚モデルが得られることから、被験者数を多くでき、得られた結果データの信頼性が高まり、かつ比較的短期間で結果を得ることができるので、従来の評価方法やスクリーニング方法よりも有利である。

ここで、安全性評価や薬理性評価やスクリーニングの（判定）基準としては、一般的に行われている安全性薬理試験や安全性薬理性評価を用いればよい。特に、本発明は再構築皮膚モデルであることから、皮膚に関連する安全性薬理試験や安全性薬理性評価（例えば皮膚生理試験）を用いるのが好適である。前記安全性試験・評価としては、例えば、細胞増殖阻害や細胞死等を指標とした細胞毒性試験が挙げられる。前記薬理性試験や評価としては、例えば、しわ予防改善、皮膚老化予防改善、皮膚炎症予防改善、日焼け防止、皮膚収斂、化粧膜形成能、肌荒れ状態、肌水分量増減等の試験・評価が挙げられる。

また、安全性や薬理性に関連する作用メカニズム（作用機序）についても試験・評価することも可能である。この作用機序としては、例えば、抗酸化作用等が挙げられる。

このとき、安全性や薬理性を判定する際の指標としては、評価や試験項目に応じて公知の方法を適宜選択すればよく、例えば染色法による顕微鏡観察、画像解析法、水分量分析、遺伝子発現量分析（インボルクリン、ＧＡＰＤＨ等）等が挙げられる。この遺伝子発現量分析としては、例えば、ＰＣＲ法や等温増幅法、抗原抗体反応等を利用したものが挙げられる。なお、これらを適宜組み合わせても良い。

さらに、本発明に係る三次元培養皮膚モデルを用いることで、由来動物の皮膚の表皮バリアを評価することが可能である。すなわち、本発明の一形態によれば、上記三次元培養皮膚モデルを用いる由来動物の皮膚の表皮バリア機能の評価方法もまた、提供される。アトピー性皮膚炎、アレルギー、喘息などのアトピー性疾患の発症には表皮バリア機能（セラミドやフィラグリンの発現など）の低下が関与していることから、本発明に係る三次元培養皮膚モデルを利用して表皮バリア機能を評価することで、上述したようなアトピー性疾患に対する罹患リスクを評価したりすることが可能となる。例えば、蛍光色素（Ｌｕｃｉｆｅｒｙｅｌｌｏｗなど）を三次元培養皮膚モデルの角層上に添加し、経時的に凍結標本を調製してそれらにおける蛍光色素の移動を観察したり、電気抵抗などを測定することによって、表皮バリア機能の指標としての皮膚モデルにおける経皮吸収を評価することができる。

また、本発明に係る三次元培養皮膚モデルを用いることで、皮膚の疾患または障害（例えば、上述したようなアトピー性疾患や、角化異常症等の病因未特定の皮膚疾患）の原因遺伝子の解析を行うことも可能である。すなわち、本発明の一形態によれば、上記三次元培養皮膚モデルを用いる皮膚の疾患または障害の原因遺伝子の解析方法もまた、提供される。原因遺伝子の解析の具体的な手法について特に制限はなく、例えば、その候補遺伝子解析、連鎖解析法に基づく全ゲノム解析（ｐｈｙｓｉｃａｌｍａｐｐｉｎｇ）、全ゲノムＳＮＰ（一塩基多型：ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析、次世代シークエンサーを用いた遺伝子解析（RNAseq、全遺伝子解析）などが挙げられる。また、例えば、アトピー性皮膚炎患者の毛包由来の角化細胞を用いて本発明に係る製造方法により製造した三次元培養皮膚モデルと、健常人または他の皮膚疾患患者の毛包由来の角化細胞を用いて本発明に係る製造方法により製造した三次元培養皮膚モデルとを同時に用いて、これらに種々の刺激を付与し、その刺激の前後でＧｅｎｅＡｒｒａｙ解析等の遺伝子解析を行うことも考えられる。そして、かような遺伝子解析の結果、発現に有意差が認められた遺伝子に関して、遺伝子調節部位の同定を含め、広範囲な遺伝子の塩基配列の異常の有無を検討することで、アトピー性皮膚炎の原因遺伝子を探索することが可能となる。また、付与した刺激により誘導される転写因子の量的または質的な差異を比較検討することも、病因の同定に有用である。

以下、実施例および参考例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されない。

≪ヒトの毛包由来の角化細胞の二次元培養≫
以下の方法により、ヒトの毛包由来の角化細胞（ケラチノサイト）を二次元的に培養した。

１．毛髪を抜去し、毛根に白色の付着物（外毛根鞘）が付着しているもののみを選択して、外毛根鞘の遠位端から約５ｍｍのところで切断した（以下、これを「毛包」とも呼ぶ；図１の（ａ）および（ｂ））。得られた毛包を培養液（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社：ＣｎＴ−０７）に浸した（１０本程度採取する）。

２．６ウェルプレートの１ウェルに、新たに培養液を３ｍＬ入れておく。一方、別のウェルに上記で得られた毛包を培養液ごと入れ、ピンセットでつまんで新しい培養液に移した。

３．培養液を除去し、非特異的プロテアーゼ（三光純薬：ＤｉｓｐａｓｅＩＩ、５００Ｕ／ｍＬ）を２ｍＬ加え、室温で５分間反応させた。

４．ＤｉｓｐａｓｅＩＩを除去し、培養液を３ｍＬ加えた。

５．２４ウェルプレートを用意し、各ウェルに毛包を１本ずつ移した。

６．培養液を１５０μＬずつ加え、３７℃にてインキュベートを開始した。

７．翌日より毎日、培養液を交換した。

８．毛包周囲に角化細胞が散在し、それらが敷石状に増殖したら培養液を１ｍＬに増やし、２〜３日に１回、培養液を交換した。

９．角化細胞がコンフルエントに近くなったら、３〜４ウェル分の角化細胞を、細胞解離剤であるＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔ（Gibco Cat# 12563-011）を用いて集めて、６ウェルプレートの１ウェルに移して継代した（図１の（ｃ））。

１０．角化細胞がコンフルエントに近くなったら、角化細胞をＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔを用いて集めて、１０ｃｍ培養皿に移して継代した。

１１．さらに角化細胞がコンフルエントに近くなったら、角化細胞をＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔを用いて集めた後、セルバンカーに浮遊させ、１ディッシュあたり２チューブに分けて凍結保存した。

≪ヒトの毛包由来の角化細胞の三次元培養≫
以下の方法により、ヒトの毛包由来の角化細胞（ケラチノサイト）を三次元的に培養した。

１２．上記１１．で凍結保存した角化細胞を３７℃の恒温槽で急速に融解した後、上記と同様の培養液で培養し、８０％程度飽和状態に達したらＴｒｙｐＬＥｓｅｌｅｃｔを用いて角化細胞を回収し、細胞数を数えて１．２５〜２．５×１０^５／ｍＬになるように調整した。

１３．２４ウェルプレート（BD Falcon社 Cat# 351147）を用意し、各ウェル内に培養液を４５０μＬずつ入れ、そこに細胞培養インサート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−Ｏｎｅ社ＴｈｉｎＣｅｒｔ０．４μｍ高密度 Cat# 662640）の底が培養液に浸るように置いた後、各インサート内に上記で細胞数を調整した角化細胞含有培養液を４００μＬ加えた（最終濃度は０．５〜１×１０^５細胞／インサート）。そして、さらにウェル内（インサートの外）に培養液を４５０μＬ注ぎ、３７℃にて培養した。

１４．翌日、インサートを別のウェルに移してから、インサートの底面に生着した角化細胞を吸引してしまわないように細胞培養インサート内の培養液を除去し、ウェル内の培養液も同様に除去した。その後、新たに培養液を前日同様にウェル内に４５０μＬ入れ、細胞培養インサートを戻し、細胞培養インサート内に培養液を４５０μＬ加えたら、さらに細胞培養インサート外に培養液を４５０μＬ追加して、３７℃にて培養を継続した。

１５．３〜４日間、この培養液の交換を繰り返した後、インサート内の培養液の液面がウェル内の培養液の液面よりも高ければ、ほぼコンフルエントになったと判断した（コンフルエントになっていなければ膜の孔を通して培養液が移動して液面が同じ高さに釣り合うのに対し、コンフルエントになれば膜の孔が塞がれる結果、培養液は膜の孔を通して移動できなくなり、液面が異なることとなる）。上述したように、インサート内の培養液を４５０μＬとし、ウェル内の培養液を９００μＬにすることで、このような液面の高さの違いによるコンフルエントの確認が可能となる。

１６．上記１５．の方法により１００％飽和状態になったと判断したら、培養液を三次元培養用の培養液（ＣＥＬＬｎＴＥＣ社のＣｎＴ−０２−３ＤＰ）に変更した。具体的には、細胞培養インサート内およびウェル内の培養液を除去した後、三次元培養液をウェル内に４５０μＬ入れてから、細胞培養インサートをその内部を空気に曝したまま戻し、次いでインサート内に培養液を２００μＬ加えて、３７℃にて培養した。ここで、インサート内の培養液の量を２００μＬに減らしたのは、角化細胞にかかる培養液の圧力の負担を軽減する目的である。そして、１２〜１６時間培養後、インサート内の培養液を除去した。

１７．その後、ウェル内の培養液を除去して新たな三次元培養液を４５０μＬ加え、インサート内部を空気に曝したまま戻すという作業を毎日繰り返し、約１４日で三次元培養皮膚モデルを得た（図１の（ｄ））。

なお、このようにして得られた三次元培養皮膚モデルでは、図２に示すように、皮膚由来の三次元皮膚モデルと同様に、Ｈ＆Ｅ染色により基底層、有棘層、顆粒層、および角層が確認された。また、ケラチンの発現パターン（図３；「ＣＫ」はサイトケラチンの略である）や、フィラグリンの発現パターン（図４）に差異は認められなかった。

≪超高齢者の毛包由来の三次元培養皮膚モデルの作製≫
上記と同様の手法により、超高齢者の毛包由来の三次元培養皮膚モデルを作製した。結果を図５および図６に示す。ここで、図５は、９７歳女性の毛包由来の角化細胞を用いて作製された三次元培養皮膚モデル（６継代したもの）の培養開始後１４日目、２１日目、および２８日目の断面写真であり、図６は、１００歳以上の女性３名の毛包由来の角化細胞を用いて作製された三次元培養皮膚モデルの培養開始後１４日目の断面写真である。このように、本発明の方法によれば、超高齢者の毛包由来の角化細胞を用いて三次元培養皮膚モデルを作製することも可能となることから、老化やアンチエイジング、高齢者に多い皮膚疾患の研究などへの応用が期待される。

≪毛包および皮膚由来の三次元培養皮膚モデルにおける遺伝子発現解析≫
同一の健常人の毛包および皮膚から、それぞれ角化細胞を採取し、上記と同様の手法により、二次元培養および三次元培養皮膚モデルの作製を行った。

そして、得られた毛包または皮膚のそれぞれ由来の二次元培養物および三次元培養物を用いて、ＴｏｔａｌＲＮＡをテンプレートとしたＧｅｎｅＡｒｒａｙ解析により、遺伝子発現のプロファイルを解析した。結果を図７に示す。なお、図７に示す赤色のプロットは、発現量が５倍以上異なる遺伝子を表す。図７を参照して、例えば３Ｄ毛包と２Ｄ毛包とを比較すると、発現量の異なる遺伝子が数多く存在することがわかる。このことから、毛包由来の角化細胞を用いて作製した三次元培養皮膚モデルを利用することで、２Ｄでは発現していない遺伝子の変化を解析することが可能になると考えられる。ここで、３Ｄ毛包において、３Ｄ皮膚に対して発現の亢進が認められた遺伝子の例を以下に示す。

≪三次元培養皮膚モデルを用いた薬剤に対する反応性の評価≫
上述した手法により作製した、３人の異なる被験者の毛包由来の三次元培養皮膚モデルを用いて、各人の皮膚の薬剤に対する反応性を評価した（図８）。

具体的には、炎症応答の指標としてＩＬ−１αの放出をＥＬＩＳＡ法によって測定した。炎症を引き起こすための刺激物質としてはイソプロパノールを用いた。イソプロパノールで刺激すると、刺激前（図８に示す左カラム）と比較して３つのサンプルすべてにおいてＩＬ−１αの放出量が増大した（図８に示す中央カラム）。また、イソプロパノール刺激による炎症を抑えるための抗炎症薬として、デキサメタゾンをさらに投与したところ、ケース１（ｃａｓｅ１）ではＩＬ−１αの放出量の抑制が確認されたが、ケース２（ｃａｓｅ２）およびケース３（ｃａｓｅ３）では放出量の抑制は確認されず、むしろＩＬ−１αの放出量はさらに増大した。このように、本発明の方法により作製される三次元培養皮膚モデルを利用することで、個体間における薬剤等に対する反応性（応答性）の差異を評価することも可能である。

≪三次元培養皮膚モデルを用いたアトピー性皮膚炎患者と健常人の遺伝子発現の比較≫
上述した手法により作製した、５人の異なるアトピー性皮膚炎患者と４人の異なる健常人の毛包由来の三次元培養皮膚モデルを用いて、TotalRNAをテンプレートとしたRNAseq解析により遺伝子発現を比較した。結果を図９に示す（図９中、「ＡＤ」はアトピー性皮膚炎患者を示し、「ＮＣ」は健常者を示す）。クラスタリング解析の結果、アトピー性皮膚炎患者と健常人とではそれぞれ発現量の異なる遺伝子が存在することがわかる。このことから、さらにこれらの遺伝子を解析することで、アトピー性皮膚炎の発症に関与するタンパク質を明らかにするということが可能になると考えられる。

Claims

動物の毛包から採取された組織に由来するか、または動物の毛包から採取された角化細胞を三次元的に培養する培養工程を含む、三次元培養皮膚モデルの製造方法。
ヒトの毛包から採取された組織に由来するか、または動物の毛包から採取された角化細胞を三次元的に培養する培養工程を含む、三次元培養皮膚モデルの製造方法。
前記培養工程が、前記角化細胞を初期増殖する第１培養工程、および、前記第１培養工程において増殖された角化細胞を培養容器に播種し、前記培養容器内で培養する第２培養工程を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
前記培養容器が細胞培養インサートであり、前記角化細胞および培養液を内部に含む前記細胞培養インサートを、さらに培養液中に浸漬させた状態で前記第２培養工程を行い、この際、前記細胞培養インサートの内部と外部とは培養液が透過可能なように連通している、請求項３に記載の製造方法。
前記細胞培養インサートの内部における前記培養液の液面が、前記細胞培養インサートの外部における前記培養液の液面よりも高くなったときに、前記角化細胞がコンフルエントになったと判断して、培養工程を終了する、請求項４に記載の製造方法。
前記動物またはヒトが、生きている動物またはヒトである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法により製造された三次元培養モデルを用いることを特徴とする、前記動物の皮膚の化学物質に対する反応性の評価方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法により製造された三次元培養モデルを用いることを特徴とする、工業製品、家庭用品、薬剤、皮膚外用剤または化粧料に使用するための被験物質の評価またはスクリーニング方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法により製造された三次元培養モデルを用いることを特徴とする、前記動物の皮膚の表皮バリア機能の評価方法。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法により製造された三次元培養モデルを用いることを特徴とする、皮膚の疾患または障害に関連した遺伝子異常の同定方法。