KR101778153B1

KR101778153B1 - 인체 색소화피부모델을 이용한 피부 미백 효능 물질의 평가방법

Info

Publication number: KR101778153B1
Application number: KR1020150107488A
Authority: KR
Inventors: 이수현; 김혜수; 정행선; 장지혜
Original assignee: 주식회사 바이오솔루션
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2015-07-29
Publication date: 2017-09-13
Also published as: KR20170014337A

Abstract

본 발명은 인체 색소화피부모델을 이용하여 피부 미백 효능 물질을 신속하게 판별하기 위한 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 멜라닌세포와 피부각질세포를 동시에 3차원 배양하여 만든 인체 색소화피부모델을 이용하여 피부 미백 효능 물질을 보다 정확하고 신속하게 평가하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 멜라닌세포와 피부각질세포를 동시에 3차 배양하여 만든 인공피부모델을 이용하여 멜라닌세포의 멜라닌 전달을 위한 축색돌기의 길이 변화 및/또는 피부각질세포의 핵 상단의 멜라닌 캐핑(melanin capping)의 정도 변화를 평가함으로써 실제 피부에서의 미백 효능을 보다 정확히 모사하고 신속히 평가할 수 있다.

Description

인체 색소화피부모델을 이용한 피부 미백 효능 물질의 평가방법{Method for estimating skin whitening effect of material using human skin melanization model}

본 발명은 인체 색소화피부모델을 이용하여 피부 미백 효능 물질을 신속하게 판별하기 위한 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 멜라닌세포와 피부각질세포를 동시에 3차원 배양하여 만든 인체 색소화피부모델을 이용하여 피부 미백 효능 물질을 보다 정확하고 신속하게 평가하는 방법에 관한 것이다.

인체의 피부는 사람이 지니고 있는 장기 중 가장 큰 장기로써, 체외로 수분과 열을 빼앗기지 않도록 보호막을 형성하여 인체를 보호하는 역할을 한다. 또한 피부는 외부와의 정보전달의 수단으로 사용될 뿐 아니라, 땀을 배출하여 체온을 조절하고, 때로는 미적 기준이 되기도 하는 외관상으로도 중요한 역할을 담당하는 기관이다. 표피를 구성하는 각질세포의 주된 기능이 케라틴 단백질과 지질을 합성하여 피부장벽을 형성함으로써 외부의 오염원이나 자극으로부터 인체를 보호하는 것이라면, 표피의 또 다른 구성세포인 멜라닌세포는 멜라닌을 합성하고 이를 각질세포의 핵 위에 전달함으로써 유해한 자외선을 차단하여 인체의 유전정보를 보호하는 역할을 담당한다.

멜라닌은 모발과 피부에 존재하는 갈색 또는 흑색의 인돌핵을 가진 퀴논이 중합한 형태의 고분자 색소이다. 이는 타이로신이라는 아미노산으로부터 산화효소 타이로시나제와 다른 산화 효소에 의하여 산화 중합되어 생성되며 피부 및 모발에 분포되어 일광 광선으로부터 신체를 보호하고 빛을 흡수하여 열에너지로 바꿔 체내에 축적함으로써 보온의 기능을 한다. 멜라닌은 멜라닌세포의 멜라노좀이라는 세포소기관에서 만들어지며 멜라닌세포는 수상돌기를 뻗어 멜라노좀의 형태로 멜라닌과립을 계속적으로 표피의 피부각질세포에게 전달하며 이는 피부각질세포의 핵 위에 모자 형태로 위치해 피부각질세포의 핵을 유해한 자외선으로부터 보호하여 유전적인 변이를 막는다. 이와 같이 피부각질세포의 핵 위에 멜라닌과립이 전달되어 위치한 형태를 멜라닌 캐핑(melanin capping)이라고 부른다.

피부에서의 멜라닌세포는 단독으로 존재하지 않고 멜라닌 유닛트라고 불리는 멜라닌세포와 피부각질세포간의 멜라닌 전달 단위를 형성하여 멜라닌의 합성과 전달을 제어한다. 멜라닌의 합성에는 피부각질세포에서 분비하는 여러 성장인자와 싸이토카인이 관여하여 멜라닌세포의 멜라닌합성을 조절하며 또한 피부각질세포는 멜라닌의 피부각질 세포 내로 받아들이는 양을 조절함으로써 피부 색 조절에 핵심적인 역할을 담당한다.

2014년 국내 기능성화장품 생산실적은 9조원으로 기능성화장품은 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부의 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태워주거나 자외선으로부터 피부를 보호하는 데에 도움을 주는 제품으로 피부의 고운 빛과 결에 효능을 갖는 제품이 주를 이루고 있으며 매년 생산 및 매출의 상승세를 이어가고 있으며, 한국 일본 및 중국 등 동양권에서는 예로부터 희고 고운 피부를 선호하고 있으므로 미백제 및 미백 화장품 개발에 관한 연구가 지속적으로 진행 중이다.

인체 내의 색소, 즉 멜라닌의 침착은 크게 세 단계로 나뉠 수 있다. 첫 번째 단계는 멜라닌 생합성 전 단계로 멜라닌 생합성에 필요한 여러 가지 요소들, 즉 타이로시나제, TRP1(Tyrosinase related protein), TRP2(dopachrome tatomerase) 같은 효소의 활성화와 멜라닌이 생합성되는 장소인 멜라노좀 구조와 기능 활성화 단계, 두 번째 단계는 멜라닌 생합성 단계, 마지막으로 멜라닌이 생성된 멜라노좀의 피부 각질세포로의 전달의 세 단계이다. 따라서 미백화장품은 각 단계의 활성을 조절함으로서 미백에 효능을 갖는 제품이 개발되어 왔다. 알부틴과 코지산 등과 같이 티로시나아제의 생성 및 활동을 억제함으로서 멜라닌의 생성을 억제하는 제품과 Niacinamide와 같이 멜라노좀의 전달을 억제하는 제품 그리고 레틴산, 살리실산과 같이 각질을 제거함으로서 멜라닌의 빠른 탈피를 유도하는 제품 등이 있다.

통상적인 미백 평가법은 멜라닌 합성에 관여하는 타이로시나제 억제 정도를 통해 시험하거나, 멜라닌세포의 용출을 통해 총 멜라닌 양을 측정하고 있다. (식약처 , 기능성화장품 유효성평가를 위한 가이드라인) 그러나 타이로시나제 멜라닌세포에서의 멜라닌의 합성을 저해 할 수 있는 여러 효소나 세포 신호전달의 기작 중 일부분 일 뿐 이며 실제 피부에서의 멜라닌 세포의 비율은 1:10 정도로 피부색의 결정에는 피부의 대부분을 차지하고 있는 피부각질세포가 보유한 멜라닌의 양, 즉 피부각질세포로의 멜라닌 전달이 더 주요한 인자로 평가되어야 한다. 뿐만 아니라 단일 세포군의 세포 수준 평가에서의 실제 피부에서 미백 효능을 나타내는 타이로시나제 뿐 아니라 멜라닌 합성에 관여하는 다양한 효소의 활성, 멜라닌 합성에 영향을 미치는 세포 간, 세포 내 신호전달, 피부 각질세포의 멜라닌 수용체 발현 등 다양한 인자들을 동시에 평가 할 수 없기 때문에 세포 수준에서는 실제 피부에서의 멜라닌 형성과 전달, 탈락의 미백 메카니즘을 구현하기 어려움이 있다.

선행기술의 3차 배양 인공피부를 이용한 미백 평가는 인공피부의 색의 변화, 멜라닌 과립의 전자현미경 관찰, 세포수준의 총 멜라닌 양 측정과 타이로시나제 활성도 측정 등에 의해 평가되고 있다.(reference 표기; Z. Wang et al. 2008, Y. Won et al. 2014) 그러나 실제 피부와는 달리 각질 탈락이 이루어지지 않는 실험실 내 상황에서 인공 피부의 멜라닌 세포는 지속적으로 합성이 이루어지고 있을 뿐 이미 색소가 침착되어 형성된 각질층이 탈락 되지 않는다. 따라서 피부 색의 변화를 유도하기 위하여 오랜 기간 배양이 소요될 뿐 아니라 이를 미백 효능의 평가 지표로써 활용하는 것은 미백 효능의 입증도 어려울것으로 판단된다.

또한 인공피부를 이용한 미백 평가에서 세포수준의 총 멜라닌 양과 타이로시나제의 활성화도를 측정하는것은 3차배양 인체조직모델의 장점을 활용하지 못하고 있는 평가법이다. 선행기술의 멜라닌 과립의 전자현미경 관찰은 전체 인공피부에서 극히 작은 부위만을 정성적으로 보여 줄 뿐 미백 평가 시험법으로써의 정량적인 분석은 불가능하다.

이에 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 멜라닌세포와 피부각질세포를 동시에 3차원 배양하여 만든 인공피부모델을 이용하여 멜라닌세포의 멜라닌 전달을 위한 축색돌기의 길이 변화 및/또는 피부각질세포의 핵 상단의 멜라닌 캐핑(melanin capping)의 정도 변화를 평가함으로써 실제 피부에서의 미백 효능을 보다 정확히 모사하고 신속히 평가할 수 있는 평가방법을 개발하였다.

KR 1020150072567 (2015.06.30) 화장료 조성물의 피부 미백 효과 평가 방법

따라서, 본 발명의 주된 목적은 실제 피부에서의 미백 효능을 보다 정확히 모사하고 신속히 평가할 수 있는 평가방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 평가방법에 이용될 수 있는 인체 색소화피부모델의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법을 제공한다:

a) 멜라닌형성세포와 피부각질세포를 혼합하여 3차원 배양하여 인체 색소화피부모델을 준비하는 단계;

b) 상기 인체 색소화피부모델에 피부 미백 후보 물질을 처리하는 단계;

c) 상기 인체 색소화피부모델에서 멜라닌형성세포의 수상돌기가 축소되는 효과 및/또는 피부각질세포의 멜라닌 캐핑(melanin capping)의 정도가 줄어드는 효과를 측정하는 단계.

본 발명에 있어서, 인체 색소화피부모델이란 멜라닌세포와 피부각질세포를 동시에 3차원 배양하여 만든 인공피부모델로서 인체 피부의 색소화 과정, 즉 멜라닌세포의 멜라닌 전달을 위한 축색돌기의 길이 변화, 피부각질 내 유입된 멜라닌 양의 측정, 피부 각질 세포로의 멜라닌 전달을 더욱 쉽게 관찰할 수 있는 인체 피부 모델을 의미한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 a) 단계에서 사람의 피부조직으로부터 멜라닌형성세포 및 피부각질세포를 각각 분리하고 계대배양한 후, 이들 세포를 혼합하여 1x10⁴/cm² 내지 5x10⁵/cm² 의 세포 밀도가 되도록 배양삽입체(culture insert)에 넣어 3차원 배양하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 c) 단계에서 비처리 대조군에 비해 멜라닌형성세포의 수상돌기가 축소되거나 및/또는 피부각질세포의 멜라닌 캐핑의 정도가 줄어들면 상기 후보 물질을 피부 미백 효능 물질로 평가하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 c) 단계에서 3차원 색소화모델의 절편을 Fontana masson(FM) 염색하고, 현미경 사진 촬영을 한 후, 이미지 분석 프로그램을 이용하여 멜라닌형성세포의 수상돌기의 길이를 측정하거나 및/또는 피부각질세포의 멜라닌 캐핑의 갯수 또는 정도(예컨대, 피부각질세포의 핵에 대한 capping %)를 측정하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법을 제공한다. 여기서 축색돌기란 피부멜라닌세포의 멜라닌전달을 위한 뉴런과 같은 형태의 뻗어나온 돌기를 의미하며, 멜라닌캡핑이란 피부각질세포의 핵(사진에서 연한분홍색) 상단의 멜라닌색소의 자외선차단용 검은모자씌움(진한남색 과립)을 의미한다 (도 5 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 피부 미백 효능 물질의 평가용 인체 색소화피부모델의 제조방법을 제공한다:

a) 사람의 피부조직으로부터 멜라닌형성세포 및 피부각질세포를 각각 분리하고 계대배양하는 단계;

b) 상기 멜라닌형성세포 및 피부각질세포를 혼합하여 바람직하게는 1x10⁴/cm² 내지 5x10⁵/cm² 의 세포 밀도가 되도록 배양삽입체(culture insert)에 넣는 단계;

c) 상기 배양삽입체를 배양액으로 덮여 있는 서브머지(submerge) 상태로 바람직하게는 4~10일간 배양하여 상피세포가 고르게 자라도록 하는 단계; 및

d) 상기 상피세포층을 공기에 노출시키는 기-액 배양(air-liquid culture)법으로 바람직하게는 10-15일 추가 배양하여 중층화되도록 분화를 유도하는 단계.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 표피세포는 공기층과 물층의 중간에서 배양됨으로써 중층편평상피로 분화하며 각질화되고 멜라닌세포는 기저층에서 멜라닌을 합성하여 각질세포로 전달함으로써 멜라닌 유니트를 형성 인체 피부에서와 유사한 멜라닌형성세포를 포함한 피부 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 물질의 평가용 인체 색소화피부모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 멜라닌세포와 피부각질세포를 동시에 3차 배양하여 만든 인공피부모델을 이용하여 멜라닌세포의 멜라닌 전달을 위한 축색돌기의 길이 변화, 피부각질 내 유입된 멜라닌 양의 측정, 피부 각질 세포로의 멜라닌 전달 24시간 내 신속하게 평가함으로써 실제 피부에서의 미백 효능을 보다 정확히 모사하고 신속히 평가할 수 있다.

도 1은 사람의 정상 피부조직에서 분리한 멜라닌형성세포이다.
도 2는 사람의 정상 피부조직에서 분리한 피부각질세포이다.
도 3은 사람의 정상 피부조직에서 분리한 피부각질세포만 이루어진 피부모델과 피부각질세포와 멜라닌형성세포를 혼합하여 제작한 인체 색소화피부모델의 형태와 조직병리를 나타내는 도이다.
도 4는 실제 사람피부와 인체색소화피부모델에서의 멜라닌세포의 위치를 면역조직염색으로 나타내는 도이다.
도 5는 Fontana-Masson 염색을 통해 인체 색소화피부모델에 미백 효능 물질을 처리시 멜라닌형성세포의 수상 돌기가 축소와 멜라닌 캡핑의 정도가 감소되는 효과를 보여주는 도이다. (A)는 비처치 대조군이고 (B)는 미백물질 처리군이다.
도 6은 이미지 분석을 통해 인체 색소화피부모델에서 미백 효능 물질을 처리시 멜라닌형성세포의 수상 돌기가 축소되는 효과를 보여주는 도이다. (A)는 비처치 대조군이고 (B)는 미백물질 처리군이다.
도 7은 이미지 분석을 통해 인체 색소화피부모델에서 미백 효능 물질을 처리 시 멜라닌 캡핑의 정도가 줄어드는 효과를 보여주는 도이다. (A)는 비처치 대조군이고 (B)는 미백물질 처리군이다.
도 8a는 이미지 분석을 통해 인체 색소화피부모델에 미백 효능 물질을 처리시 멜라닌형성세포의 수상 돌기가 축소되는 정도를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 이미지 분석을 통해 인체 색소화피부모델에 미백 효능 물질을 처리시 멜라닌 캐핑의 정도가 줄어드는 정도를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 멜라닌형성세포와 각질세포의 분리 및 배양

사람의 정상조직으로부터 피부 멜라닌형성세포, 각질세포를 분리하고 배양하였다.

실시예 1-1: 멜라닌형성세포의 분리 및 배양

절제된 피부조직을 50 ㎍/㎖의 항생제 (gentamicin, Gibco)가 포함된 인산완충용액(WelGENE)으로 8번 이상 세척하여 응고된 혈액과 오염물을 제거하였다. 이어, 진피부분의 지방층을 제거하고 조직을 5 mm 정도로 가능한 한 잘게 절단하고, 절단한 피부 조직을 1 mg/㎖ 디스파아제 (Roche)에 넣고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 핀셋을 이용하여 피부조직으로부터 표피를 분리하고, 분리된 표피를 인산완충용액으로 세척한 후 트립신-EDTA 용액 (0.05% trypsin - 0.53 mM EDTAㆍ4Na, Gibco)을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 표피가 담긴 트립신-EDTA 용액을 수차례 파이펫팅하여 표피로부터 세포가 떨어져 나오도록 하였고, 이때 멜라닌형성세포와 각질세포가 함께 분리된다.

멜라닌형성세포와 각질세포가 떨어져 나온 트립신-EDTA 용액에 멜라닌세포 배양배지인 MGM-3 (Cambrex)를 첨가하여 50 ㎖ 튜브로 옮긴 다음 300 x g에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 멜라닌형성세포 배양배지를 첨가하여 분리된 세포를 단일화 하고, 세포수를 계산하여 직경 100 mm 배양접시에 1x10⁷개의 세포가 되도록 분주하였다. 37℃ CO2배양기에서 배양하고 배지는 2일에 한 번 교체하였으며, 배양접시의 세포가 과밀해지면 배양접시의 멜라닌형성세포 배양배지를 제거하고, 인산완충용액으로 한번 세척하였다. 트립신-EDTA 용액 2 ㎖을 첨가하여 배양기에서 4분간 효소 반응시키고, 각질세포에 비하여 멜라닌형성세포가 트립신 처리에 의해 배양용기로부터 빨리 떨어지는 것을 이용하여 배양된 표피세포로부터 멜라닌형성세포만을 회수하였다. 멜라닌형성세포의 수를 계산하고 300 x g에서 원심분리하여 멜라닌형성세포만을 남겼다. 원심분리한 상등액을 제거하고, 멜라닌형성세포 배양배지를 첨가하여 멜라닌형성세포를 고르게 현탁한 후, 100 mm 배양접시에 3 x 10⁵개의 세포수가 되도록 세포현탁액을 첨가해 계대 배양하였다.

도 1은 인체 피부로부터 분리한 멜라닌형성세포를 현미경 관찰하여 확인하였다.

실시예 1-2: 피부각질세포의 분리 및 배양

절제된 피부조직을 50 ㎍/㎖의 항생제 (gentamicin, Gibco)가 포함된 인산완충용액(WelGENE)으로 8번 이상 세척하여 응고된 혈액과 오염물을 제거하였다. 이어, 진피부분의 지방층을 제거하고, 조직을 5 mm 정도로 가능한 한 잘게 절단하고, 절단된 피부 조직을 50 ㎖ 튜브에 옮긴 후 트립신용액 (0.125% 트립신: versene = 1:1, Gibco) 10 ㎖을 첨가한 후, 마그네틱 바를 이용하여 37℃에서 1시간동안 물리적인 자극을 주어 각질세포가 떨어져 나오도록 하였다. 세포가 떨어져 나온 트립신 용액에 0.1 mg/㎖의 트립신 억제자 (Gibco)를 첨가하여 50 ㎖ 튜브로 옮긴 다음 300 x g에서 원심분리 하고, 상층액을 제거한 다음, 각질세포배양 배지인 KGM (Cambrex)을 첨가하여 세포를 단일화하였다. 세포수를 계산하여 직경 100 mm 배양접시에 1 x 10⁶개의 세포가 되도록 분주하였다. 37℃ CO2 배양기에서 배양하고 배지는 2일에 한 번 교체하여 주었으며, 배양접시의 세포가 과밀해지면 배양접시의 각질세포 배양배지를 제거하고, 인산완충용액으로 한번 세척하였다. 이어, 트립신-EDTA 용액 2㎖을 첨가하여 배양기에서 5분간 효소 반응시키고, 배양용기로부터 각질세포를 회수하여 세포수를 계산하고 300 x g에서 원심분리 하였다. 원심분리한 상등액을 제거하고, 각질세포 배양배지를 첨가하여 각질세포를 고르게 현탁한 후, 100 mm 배양접시에 3 x 10⁵개의 세포수가 되도록 세포현탁액을 첨가해 계대 배양하였다. 도 2는 인체 피부로부터 분리한 피부각질세포를 현미경 관찰하여 확인하였다.

실시예 2: 색소화 피부모델 제조

피부 상피세포의 분화를 유도하는 주된 요인은 칼슘과 공기-건조 (air-dry) 상태이다. 3차원 배양은 표피세포를 접종하면 이것이 배양되어 다층의 고도로 분화된 인간 표피모델을 형성하는 3차원적 배양법이다. 표피세포는 공기층과 물층의 중간에서 배양됨으로써 중층편평상피로 분화하며 각질화되고 멜라닌세포는 기저층에서 멜라닌을 합성하여 각질세포로 전달함으로써 멜라닌 유니트를 형성 인체 피부에서와 유사한 멜라닌형성세포를 포함한 피부 구조를 형성한다. 인체색소화피부를 제작하기 위해 실시예 1의 각질세포와 멜라닌형성세포를 적절히 혼합하여 약 1x10⁴/cm² 내지 5x10⁵/cm² 의 세포 밀도가 되도록 배양삽입체(culture insert, 12mm Millicell, Millipore, USA)에 넣어 3차 배양하였다. 배지로는 동물세포 배양을 위하여 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)과 Ham's F12의 3:1 혼합배지를 사용하였다. 이 배지는 동물세포 증식을 위해, 10% 우태아혈청(FBS), 5㎍/mL 인슐린, 5㎍/mL 트랜스페린, 400ng/mL 하이드로코티손, 10-9M 콜레라독소, 10㎍/mL 상피성장인자(EGF), 10unit/mL 페니실린 및 10㎍/mL스트렙토마이신을 포함한다. 상기 배양액으로 덮여 있는 서브머지(submerge) 상태로 7일 배양하여 상피세포가 고르게 자라도록 한 후, 상피세포층을 공기에 노출시키는 기-액 배양(air-liquid culture), 이른바 에어 리프팅법으로 10-15일 추가 배양하여 중층화되도록 분화를 유도하였다. 배지교환은 2-3일에 한번씩 하였다.

도 3은 인체 피부모델과 인체 색소화피부모델의 사진이며 (a)는 멜라닌형성세포를 넣지 않은 피부각질세포로만 제작된 인체 피부모델이며 (b)는 멜라닌형성세포와 피부각질세포를 혼합하여 제작된 인체 색소화피부모델이다. 각질세포만으로 재구성된 피부모델에 반하여 각질세포와 멜라닌형성세포를 함께 접종한 경우 갈색의 멜라닌색소가 침착된 피부 형성을 도 3a를 통해서 확인할 수 있었다. 또한 이를 절편하여 H&E (헤마톡실린&에오신) 염색을 수행한 결과, 각질세포가 실제 사람피부와 같은 형태로 분화하여 각질화된 피부를 형성하고 있으며 멜라닌 세포는 각질화된 피부의 기저층에 부착하여 멜라닌을 합성하고 이를 분화한 각질세포로 전달하고 있음을 도 3b를 통해 확인할 수 있었다. HE염색은 인체피부모델 대조군과 실험군을 10% 포르말린으로 24시간 고정한 후 파라핀에 포배시킨뒤 두께 4μm로 절편하여 슬라이드에 붙인 다음, 슬라이드를 자이렌(xylene)에 10분 동안 담궈 조직 주변의 파라핀을 제거하였다. 이어 100%, 90% 80% 및 70% 에탄올을 2분씩 순차적으로 처리하여 조직을 탈수시키고, 자일렌에 10분 처리하였다. 슬라이드의 조직 부분에 마운팅 용액(Shandon Synthetic Mountant, Thermo)를 떨어뜨린 후 슬라이드 커버를 밀착하여 붙여 마운팅 하여 관찰하였다.

실시예 3: 물질처치

모든 실험군은 duplicate를 원칙으로 하고 비처리된 대조군 외에 미백효과를 확인하고자 하는 물질을 처치농도에 맞게 색소화 피부모델의 배양배지인 E-media로 희석하여 6웰 배양접시의 각 웰에 0.9ml씩 준비하고 색소화 피부모델을 그 위에 기포가 생기지 않게 올려둔다. 이를 37℃ CO2 배양기에서 24시간 배양하고, 24시간이 지나면 육안상의 변화를 관찰한 후 10% 포르말린 에 고정한다.

실시예 4: Fontana masson(FM) 염색

파라핀에 포배된 3차원 색소화모델을 두께 4 μm로 절편하여 슬라이드에 붙인 다음, 슬라이드를 자이렌(xylene)에 약 20분 동안 담궈 조직 주변의 파라핀을 제거하였다. 이어 100%, 90%, 80% 및 70% 에탄올을 3분씩 순차적으로 처리하여 조직을 수화시킨 다음, 증류수에 dipping하여 슬라이드를 수세하였다. 이 후 Fontana silver nitrate working solution을 조직부분이 덮힐 만큼 처리하고 60도에서 두시간 동안 방치한 다음, 3분간 3번 증류수에 수세한다. 이어 0.2% gold chloride working solution을 처치하고 실온에서 10분간 방치한 후 다시 3분간 3번 증류수에 수세한다. 이 후 5% sodium thiosulfate solution을 처리하고 마찬가지로 실온에서 10분간 방치한 후 3분간 3번 증류수에 수세한다. 끝으로 fast red용액으로 1분간 카운터 염색을 하고 증류수를 dipping하여 슬라이드를 수세하였다. 앞의 과정이 완료되면 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올을 2분씩 순차적으로 처리하여 조직을 탈수시키고, 자일렌에 10분 처리한다. 관찰 전 최종적으로 슬라이드의 조직 부분에 마운팅 용액(Shandon Synthetic Mountant, Thermo)를 떨어뜨린 후 슬라이드 커버를 밀착하여 붙여 마운팅하였다. 도 5를 통해서 비처치 대조군에 비해 미백효능물질 처치시 멜라닌 양이 감소한다는 것과 멜라닌 세포의 dendrite 길이가 줄어든다는 것, capping수나 진하기가 감소함을 예측해볼 수 있었다.

실시예 5: Image J 프로그램을 이용한 이미지분석

육안으로 관찰된 결과를 수치화하기위해 ImageJ 프로그램을 이용한다. 먼저 Scale bar를 포함시켜 현미경 사진 촬영을 마치면 Image J 프로그램을 실행시켜 이미지를 분석한다. Image J 프로그램에서 상단의 file의 open을 클릭하여 비처치군 대조군 사진을 열고 straight line 아이콘을 클릭하여 scale bar크기에 맞춘 다음, Analyze의 Set scale 클릭하여 각각의 정보에 값을 입력하여 원하는 단위 값을 맞춘다. 이 후, Analyze의 Set Measurements를 클릭한 다음 분석하고자 하는 area (멜라닌 총 양, 면적계산), perimeter (멜라닌세포의 둘레계산) 등 분석에 필요한 parameter를 클릭하여 설정한다. Rectangle tool 아이콘을 클릭한 다음 분석이 필요한 이미지 영역을 포함하도록 범위를 지정한 후 Image의 Crop하여 이미지를 단순화 시킨다. Image의 Adjust의 Threshold 를 실행시키고 비처치군 대조군 사진을 기준으로 하여 멜라닌 혹은 멜라닌세포를 적절히 포함시키는 기준을 잡고 Hue, Saturation, Brightness 값을 조절한 다음 원하는 site의 면적이 설정되면 select를 클릭한다. 반면, 원하는 영역을 선택하여 설정하기 위해서는 threshold기능 대신 Process의 binary의 make binary를 통해 wand (tracing) tool 기능을 이용한다. wand tool 아이콘을 클릭하여 활성화시킨 다음 원하는 영역을 클릭하는데, 다중의 영역을 지정 시 shift키를 누른 다음 원하는 영역을 다중 지정할 수 있다. 실제로 melanocyte dendrite길이 측정과 capping영역 지정을 위해서는 주관적인 판단이 필요하므로 이 기능을 이용하여 원하는 영역을 선택하여 측정하는 방법을 선택하였다. 위의 기능을 통해서 영역 지정이 완료되면 원하는 parameter의 수치값을 알기 위해서 Analyze의 Measure를 클릭하여 수치값을 확인한다. 미백효능을 확인하고자 하는 물질군에도 비처치 대조군에서 설정한 기준 동일하게 적용하여 area, perimeter 등의 parameter에 해당하는 수치값을 확인하여 비교한다.

앞선 도 5의 FM결과를 통해 비처치대조군과 미백물질 처치군의 두드러진 차이로 멜라닌형성세포의 수지 돌기의 길이 감소 현상과 멜라노솜 capping수의 감소 현상을 육안으로 확인할 수 있었으므로 이 두 인자의 분석을 실시하였다. 먼저 멜라닌형성세포의 수지 돌기의 길이의 차이를 확인하고자 하였고 실제로 도 6에서는 멜라닌형성세포가 존재하는 기저층 영역부분만이 포함되도록 이미지를 단순화 시킨 다음 멜라닌형성세포를 선택하여(노란색으로 표시) (A)비처치 대조군과 (B)미백물질 처리군의 수지 돌기길이를 측정, 비교하였다. 그 결과 도 8-a의 그래프를 통해 알 수 있듯이 미백물질에 의해서 수지 돌기의 길이가 25%이상 감소하였음을 확인 할 수 있었다.

또 다른 분석 인자인 멜라노솜 capping은 도 7에서 볼 수 있듯이 UV에 대응하는 피부의 방어기작을 통해 생성되는 것으로, 미백물질에 의한 미백효과를 나타내는 기작 중 capping이 감소되어짐이 미백효과를 나타내는 지표로 인정받고 있다. 따라서 이러한 현상학적인 차이를 수치화하여 비교하고자 하였고 도 7과 같은 이미지분석을 통해 비처치 대조군과 미백물질 처치군 각각의 capping수와 핵수를 확인하여 capping형성정도 (capping %)를 수치화 하였다. 그 결과 미백물질 처리시, 비처치 대조군에 비해 capping이 약 55%, 절반이상이 감소되어짐을 도 8-b의 그래프를 통해 알 수 있었다. 이러한 분석을 통해서 이 물질은 수지 돌기의 길이를 감소시키며 capping의 형성정도도 저해하는데 특히 미백효과를 나타내는 다양한 기작 중에서도 capping형성을 저해함으로써 미백효과를 가진다고 판단할 수 있었다.

하기 표 1은 이미지 분석을 통해 인체 색소화피부모델에 미백 효능의 정도를 대조군 대비 감소한 정도를 수치화하여 나타낸 표이다.

이는 본 방법을 통해 기존의 장시간 배양을 통한 미백효과 판단방법에 비해 단시간(24시간) 배양을 통해서 판단할 수 있으므로 소요기간이 매우 단축되며 한 번의 실험(FM염색)을 통해 다각화된 관점(수지 돌기의 길이, capping %)에서 미백효과를 수치화 하여 판단할 수 있으므로 신속, 정확한 판단이 가능해질 것이라고 기대되어진다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 멜라닌세포와 피부각질세포를 동시에 3차 배양하여 만든 인공피부모델을 이용하여 멜라닌세포의 멜라닌 전달을 위한 축색돌기의 길이 변화, 피부각질 내 유입된 멜라닌 양의 측정, 피부 각질 세포로의 멜라닌 전달 24시간 내 신속하게 평가함으로써 실제 피부에서의 미백 효능을 보다 정확히 모사하고 신속히 평가할 수 있다.

Claims

다음 단계들을 포함하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법:
a) 멜라닌형성세포와 피부각질세포를 혼합하여 3차원 배양하여 인체 색소화피부모델을 준비하는 단계;
b) 상기 인체 색소화피부모델에 피부 미백 후보 물질을 처리하는 단계;
c) 상기 인체 색소화피부모델에서 멜라닌형성세포의 수상돌기가 축소되는 효과 및 피부각질세포의 멜라닌 캐핑(melanin capping)의 정도가 줄어드는 효과를 측정하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계에서 사람의 피부조직으로부터 멜라닌형성세포 및 피부각질세포를 각각 분리하고 계대배양한 후, 이들 세포를 혼합하여 1x10⁴/cm² 내지 5x10⁵/cm² 의 세포 밀도가 되도록 배양삽입체(culture insert)에 넣어 3차원 배양하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법.
제 1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 비처리 대조군에 비해 멜라닌형성세포의 수상돌기가 축소되거나 피부각질세포의 멜라닌 캐핑의 정도가 줄어들면 상기 후보 물질을 피부 미백 효능 물질로 평가하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법.
제 1항에 있어서, 상기 c) 단계에서 3차원 색소화모델의 절편을 Fontana masson(FM) 염색하고, 현미경 사진 촬영을 한 후, 이미지 분석 프로그램을 이용하여 멜라닌형성세포의 수상돌기의 길이를 측정하고 피부각질세포의 멜라닌 캐핑의 갯수 또는 정도(capping %)를 측정하는 것을 특징으로 하는 피부 미백 효능 물질의 평가 방법.
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