KR20190020736A

KR20190020736A - 모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부의 제조방법

Info

Publication number: KR20190020736A
Application number: KR1020197000741A
Authority: KR
Inventors: 타카시 츠지; 코헤이 토요시마; 미호 오가와
Original assignee: 가부시키가이샤 오간 테크놀로지즈; 고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2019-03-04
Also published as: WO2017221870A1; CA3028357A1; SG11201811102XA; CN109415691A; EP3473705A1; AU2017282306A1; EP3473705A4; JPWO2017221870A1; US20190201579A1

Abstract

(과제) 본 발명은 모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부를 제공하는 것을 과제로 하였다. (해결수단) 모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부의 제조방법으로서, 상기 제조방법은 하기 각 단계; (A): 진피층 및 표피층을 갖는 인공피부 또는 진피층만을 갖는 인공피부를 준비하는 단계; 및 (B): 단계 (A)에서 준비한 인공피부에 단리된 모낭을 이식하는 단계;를 포함하고, 여기서 상기 단리된 모낭은 피지선을 갖는 것이고, 상기 단리된 모낭은 상기 인공피부의 상기 진피층의 표면과 상기 단리된 모낭의 모공부의 위치가 일치하도록 상기 인공피부에 이식되는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

Description

모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부의 제조방법

본 발명은 인공피부의 제조방법 및 해당 방법에 의해 제조되는 인공피부에 관한 것이다.

최근, 유럽을 중심으로 동물애호의 관점으로부터 동물실험을 폐지하고, 의약품이나 화장품의 약효평가나 안전성 평가를 동물실험 대체법으로 수행하기 위한 기술개발이 진행되고 있다. 또한, 최근 생체로부터 취출한 세포를 인위적으로 증식시키기 위한 세포배양기술 개발의 진전에 따라, 여러 장기나 조직의 생리적 기능을 유지하면서 생체 외 배양하는 것이 가능해지고 있다. 그 결과, 인간 유래 배양세포를 이용한 각종 시험평가법이 개발되어, 이들 대체평가법을 이용하여 의약품 후보물질이 인체에 대하여 어떠한 영향을 미치는지 또한 어떠한 투여량에 의해 원하는 효과나 유해작용을 미치게 하는지를 조사하는 것도 가능해지고 있다. 또한, 배양세포, 세포발판재료 및 배양액을 조합하는 것에 의한 인공피부 제조방법의 개발이 진행되어 H. Green 박사에 의해 천연의 피부와 동등한 기능과 구조를 갖는 삼차원 배양피부가 발명된 것을 계기로 하여, 피부 과학 분야는 동물실험 대체법의 개발에 있어서의 개척자가 되고 있다. 지금까지도 피부에 대한 의약품이나 화장품의 약효평가나 안전성 평가를 실험동물을 이용하지 않고 수행하기 위한 인공피부의 개발과 제품화 및 인공피부를 이용한 동물실험 대체법이 제안되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1).

표피와 진피조직 및 피하조직으로 구성되는 피부는 몸의 표면을 빠짐없이 덮어 체내와 외계를 구별하고 있는 거대한 기관이다. 피부에는 모낭, 피지선 및 땀샘이라는 다양한 외배엽성 기관이 분포하고, 이들이 구조적이며 기능적으로 연계함으로써 외피계(피부 기관계)를 구성하고 있다. 외피계는 털이 나 있어서 여러 외적 침해로부터 체표를 방어하고, 피지나 땀의 분비에 의해 체표의 환경조절이나 노폐물의 배설을 수행하고, 또한 순환기계나 신경계라는 다른 기관계와도 연계함으로써 체온조절이나 감각수용이라는 다채로운 생리적 기능을 담당하고 있다. 피부 부속기에 의해 피부표면에 분비되는 여러 가지 수용성 및 지용성 성분은 강고한 각화중층상피인 표피층의 물질투과성이나 수분함유량을 변화시킨다는 점에서 알레르기성 질환이나 나이를 먹음에 따라 수반하는 심미적 변화와의 관련이 시사되고 있다.

그러나 지금까지 제안되어 있는 인공피부는 단순하게 표피층과 진피층을 포함할 뿐, 피부 부속기관을 갖지 않는 것이나 피부 부속기관과 유사한 구조(예를 들어, 모낭과 유사한 구조)를 포함하는 것이라 할지라도 정상적인 피부의 구조 및 기능을 재현하는 것은 아니었다. 기능적인 피부 부속기관을 갖지 않는 인공피부는 피지 등에 의한 피부의 장벽기능이 존재하지 않기 때문에 실험동물의 대체물로서의 사용에는 한계가 있다.

예를 들어, 특허문헌 1에서는 수축제 세포(예를 들어, 섬유아세포)를 포함하는 콜라겐 매트릭스 층과 조직부속기관을 구성하는 세포(예를 들어, 모유두세포)를 포함하는 콜라겐 매트릭스 층을 중층시켜 배양함으로써 배양물 내에 모낭과 유사한 구조물이 발생할 수 있음을 나타내고 있다. 그러나 특허문헌 1에는 단지 외형상 모낭을 닮은 구조물이 발생한 것이 나타나 있음에 불과하고, 피부 부속기관의 정상적인 구조 및 기능을 재현한 인공피부는 나타나 있지 않다.

특허공개 평10-136977

본 발명은 모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부를 제공하는 것을 과제로 하였다.

본 발명자들은 동물 피부의 장벽기능을 재현할 수 있는 인공피부를 제조하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 기능적인 피부 부속기관을 갖는 인공피부의 제조에 성공하였다.

즉, 본 발명은 일 실시형태에 있어서,

모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부의 제조방법으로서,

상기 제조방법은 하기 각 단계

(A): 진피층 및 표피층을 갖는 인공피부 또는 진피층만을 갖는 인공피부를 준비하는 단계; 및

(B): 단계 (A)에서 준비한 인공피부에 단리된 모낭을 이식하는 단계;

를 포함하고, 여기서

상기 단리된 모낭은 피지선을 갖는 것이고,

상기 단리된 모낭은 상기 인공피부의 상기 진피층의 표면과 상기 단리된 모낭의 모공부의 위치가 일치하도록 상기 인공피부에 이식되는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서,

상기 단계 (A)에 있어서 진피층만을 갖는 인공피부가 사용되고,

상기 단계 (B)의 후에 아래의 단계

(C): 상기 인공피부의 상기 진피층 상에 표피층을 형성시키는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서,

상기 단계 (A)에 있어서의 인공피부의 진피층은 섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 겔화시킴으로써 형성된 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서,

상기 단계 (A)에 있어서의 인공피부의 진피층은 섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 겔화시킨 후, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 더 첨가하고, 겔화시키는 것을 적어도 1회 이상 반복함으로써 형성된 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서,

상기 단계 (A)에 있어서의 「진피층 및 표피층을 갖는 인공피부」의 표피층은 상기 진피층의 표면에 각화세포 및 배양액을 포함하는 혼합액을 적용하고, 이들을 배양함으로써 형성된 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서,

상기 단계 (C)는 상기 인공피부의 상기 진피층의 표면에 각화세포 및 배양액을 포함하는 혼합액을 적용하고, 이들을 배양함으로써 상기 표피층을 형성시키는 단계인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 단계 (A)가

(A): 진피층, 표피층 및 지방조직층을 갖는 인공피부를 준비하는 단계인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 단계 (A)의 후 또한 상기 단계 (B)의 전에 이하의 단계

(A'): 단계 (B)에 있어서 단리된 모낭이 이식되는 인공피부의 부위에 지방전구세포를 매립하는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 단리된 모낭이 동물의 피부로부터 단리된 모낭인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 단리된 모낭이 인간의 피부로부터 단리된 모낭인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 단리된 모낭이 인공적으로 유도된 재생 모낭인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 재생 모낭이 간엽계 세포로 실질적으로 구성되는 제1 세포집합체와 상피계 세포로 실질적으로 구성되는 제2 세포집합체를 밀착시켜 지지체 내부에서 배양함으로써 제조되는 재생 모낭인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 간엽계 세포 또는 상기 상피계 세포의 적어도 하나가 미분화세포를 유도함으로써 얻어진 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 일 실시형태에 있어서, 상기 간엽계 세포 또는 상기 상피계 세포의 적어도 하나가 동물의 모낭 유래의 단일화된 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 다른 실시형태에 있어서, 모낭, 피지선을 갖는 인공피부로서, 모공을 더 갖는 것을 특징으로 하는 인공피부에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 일 실시형태에 있어서,

섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 겔로 이루어지는 진피층,

상기 진피층의 표면에 형성되고, 실질적으로 각화세포로 이루어지는 표피층, 및

피지선을 갖는 모낭을 포함하고,

상기 모낭은 상기 표피층을 관통하여 상기 진피층에 매몰되어 있고,

상기 모낭의 모공부가 상기 표피층과 접속하고 있는 인공피부에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 인공피부는 일 실시형태에 있어서, 상기 진피층의 하부에 지방 조직층을 더 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 인공피부는 일 실시형태에 있어서, 상기 모낭이 상기 진피층 내에서 지방전구세포로 덮여있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 일 실시형태에 있어서, 상기에 기술한 본 발명의 인공피부의 제조방법에 의해 제조되는 인공피부인 것을 특징으로 한다.

상기에 기술한 본 발명의 하나 또는 복수의 특징을 임의로 조합한 발명도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 방법에 따르면, 기능적인 모낭, 피지선 및 모공을 구비하고, 정상피부의 장벽기능을 재현한 인공피부를 제조할 수 있다. 이에 의해 의약품이나 화장품의 약효평가나 안전성 평가(특히, 털에 관한 의약품이나 화장품의 약효평가나 안전성 평가)에 유용한 인공피부를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 방법에 의해 제조되는 모낭, 피지선을 갖고, 이들과 표피층이 모공부를 통하여 연결된 인공피부의 모식도이다. 도 1A는 모낭 등의 피부 부속기관을 삽입한 인공피부의 삼차원적인 모식도이다. 도 1B는 도 1A의 사각으로 나타낸 부분의 모낭을 포함하는 단면의 모식도를 나타낸다. 인공피부의 모낭 및 피지선의 개구부는 인공피부의 각화 표피층과 연속하고 있고, 그 표면으로부터 털을 맹출(萌出)하여 체표면으로 피지분비가 이루어진다.
도 2는 본 발명의 인공피부의 제조방법의 2개의 실시형태를 나타낸 도면이다. 본 발명의 방법은 인공피부의 각화표피층 형성 및 피지선을 포함하는 모낭의 삽입 시기에 따라 모낭 삽입 후에 표피형성을 하는 방법과 표피층 형성 후에 모낭을 삽입하는 방법의 두 가지로 대별된다.
도 3은 본 발명의 방법의 일 실시형태에 의해 진피층만을 갖는 인공피부에 단리된 모낭을 이식하고, 그 후 표피층을 형성시켜 배양한 결과를 나타낸다. 도 3A는 진피층만을 갖는 인공피부(세포 함유 콜라겐 겔)의 형성을 Day 0으로 하여 Day 1에 인공 진피층 내에 성체 마우스의 수염 모낭을 삽입하고, 그날 중에 배양 케라티노사이트를 인공진피 상에 중층 파종하여 표피층의 형성을 실시하고, Day 8까지 관찰을 실시했을 때의 사진이다. 도 3B는 도 3A의 순서에 있어서 이식하는 모낭으로서 마우스 수염의 모낭을 이용한 경우의 인공피부의 조직 상(像)을 나타낸다. 인공피부에 삽입한 모낭을 포함하는 조직의 연속 절편의 저배율 상을 사진 오른쪽의 상하에 나타내고, 오른쪽 윗부분 및 오른쪽 아랫부분의 사각으로 나타낸 부분의 확대사진을 a-c에 나타낸다. 확대사진의 부위는 저배율 중 a-c의 기호로 나타낸다. 모낭의 모공부의 상피와 인공피부의 각화 표피층이 연속하고 있는 부분을 a의 화살표로 나타내고, 모구부는 b의 화살촉으로 나타낸다. 도 3C는 도 3A의 순서에 있어서, 마우스 체모의 모낭을 삽입하고, 7일간 배양한 후의 인공피부로부터 연속 절편을 제작하여 관찰한 조직 상을 상하사진으로서 나타낸다. 사진 왼쪽은 저배율 상이고, 사각으로 나타낸 영역의 저배율 상을 사진 오른쪽의 상하에 각각 나타낸다. 확대 상의 화살표 부분에서 인공피부에 삽입된 모낭과 인공피부의 각화표피층이 모공부를 통해 접속하고 있다. 또한, 사진 우하단의 모구부의 HE 상에 화살촉으로 나타내는 모구부는 조직학적으로 건전(健全)하다.
도 4는 본 발명의 방법의 일 실시형태에 의해 진피층 및 표피층을 갖는 인공피부에 단리된 모낭을 이식하고, 배양한 결과를 나타낸다. 도 4A는 진피층 및 표피층을 갖는 인공피부(세포 함유 콜라겐 겔)의 형성을 Day 0으로 하여 Day 4에 모낭(마우스 수염의 모낭)의 이식을 실시하고, Day 10까지 관찰을 실행했을 때의 사진이다. 도 4B는 모낭 이식 후의 인공피부의 조직상(H&E 염색)을 나타낸다. 화살표부에 있어서, 이식한 모낭의 모공부와 인공피부의 표피층이 접속하고 있고, 화살촉 분에 있어서 모모세포와 모유두세포가 생존하고 있으며, 모구부는 조직학적으로 건전함이 나타나 있다.
도 5는 인공피부에 삽입된 모낭으로부터 성장한 모간을 경시적으로 관찰하여 화상해석에 의해 모간 길이를 계측한 결과를 나타낸다. 도 5A는 성체 마우스 수염의 모낭을 인공피부에 이식한 후에 표피층을 형성시킨 경우에 있어서의 모간 성장의 관찰결과이다. 인공피부에 삽입한 복수의 모낭을 각각 식별하여 각각의 모간 성장을 경시적으로 추적하였다. 성장한 모간을 적색 화살표로 나타내고, 성장하지 않은 모간을 백색 화살표로 나타낸다. 도 5B는 성체 마우스 체모의 모낭을 인공피부에 이식한 후에 표피층을 형성시킨 경우에 있어서의 모간 성장의 관찰결과이다. 마우스 수염에 있어서의 경시적 관찰과 마찬가지로, 인공피부에 삽입한 모낭을 식별하여 모 성장한 모낭(적색 화살표)의 모간 길이를 계측하였다. 도 5C는 인간 두발의 모낭을 인공피부에 이식한 후에 표피층을 형성시킨 경우에 있어서의 모간 성장의 관찰결과이다. 마우스 모낭과 마찬가지로 모간 길이를 계측하여 플롯팅을 실시하였다.
도 6은 진피층 및 표피층을 갖는 인공피부에 모낭을 이식한 후의 모간 성장을 관찰한 결과를 나타낸다. 모낭의 이식 전에 모간의 실체현미경 사진을 촬영하고, 모구부 최상단으로부터 클럽헤어와 성장기 모간의 길이를 계측하고, 인공피부에의 이식 후 3, 6, 12일째에 인공피부로부터 모간과 모낭을 적출하여 마찬가지로 실체현미경에 의한 촬영을 실시하여 모간 성장량을 계측하였다. 클럽헤어의 길이를 내부표준으로 하여 성장기 모의 신장량을 계측 플롯팅하였다.
도 7은 마우스 수염 모낭의 기관 배양에 있어서의 경시변화를 나타낸다. 성장기의 마우스 수염을 채취하여 콜라겐시스를 포함하는 인택트 모낭(상단) 및 가변영역의 콜라겐시스를 제거한 모낭(하단)을 제작하였다. 각각의 조건의 모낭을 6 cm 플라스틱 배양접시의 저면에 박층 콜라겐겔로 접착하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12(1:1) 중에서 5% CO₂ 환경하에서 침지배양을 3일째까지 수행하였다. 배양개시 시(Day 0)부터 매일 실체현미경에 의해 경과 관찰을 수행하였다. 화살표는 모간 선단을 나타내고, 화살촉은 모구부의 위치를 나타낸다. 오른쪽 열에는 배양 3일째의 모구부 확대 상을 나타낸다. 점선은 모구부의 간엽조직 경계를 나타낸다. 모구부 위치와 모구부의 간엽조직 경계의 엇갈림은 퇴행기 또는 휴지기인 것을 나타낸다.
도 8은 표피 및 진피만의 인공피부 모델과 표피, 진피 및 지방조직층을 갖는 인공피부 모델의 비교를 나타낸다. 도 8의 a는 본 실험의 흐름을 나타낸다. 성장기의 마우스 수염을 채취하여 가변영역의 콜라겐시스를 제거한 모낭을 제작하였다. 이것을 6웰 포맷으로서 제작한 표피 + 진피 모델 또는 표피 + 진피 + 지방조직 모델의 인공피부에 삽입하고, 3일간의 기관배양을 수행하였다. 기관배양 조건은 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12(1:1), 5% CO₂ 환경하로서, 반기상 배양에 의해 실시하였다. 도 8b는 기관배양 3일째의 조직 상을 나타낸다. 표피 + 진피 모델에 삽입된 모낭(왼쪽 도면)은 퇴행기를 나타내는 선상의 모낭 간엽상(화살표)인 것에 대하여, 표피 + 진피 + 지방조직 모델에 삽입된 모낭(오른쪽 도면)은 성장기 모구부인 것이 나타났다. 사진 오른쪽의 점선은 진피(Der)와 지방조직(Adp)의 경계를 나타낸다.
도 9는 인공적으로 제작한 재생 모낭을 이용하여 본 발명의 인공피부를 제작한 결과를 나타낸다. 도 9a는 본 실험의 흐름을 나타낸다. 도 9b의 상단은 「표피 + 진피 모델」, 중단은 「표피 + 진피 + 지방조직 모델」, 하단은 「표피 + 진피 + REC 유래 지방전구세포 모델」의 결과를 나타낸다. 도 9b의 왼쪽 열의 저배율 도면 내에 나타낸 사각의 범위를 확대한 것을 오른쪽 열에 나타낸다. 어느 모델에서나 이식한 모낭의 상피조직은 인공피부 표피층과 접속하고 있는 것이 나타났다.
도 10은 「표피 + 진피 모델」, 「표피 + 진피 + 지방조직 모델」, 「표피 + 진피 + REC 유래 지방전구세포 모델」의 각각에 있어서 모간의 성장을 비교한 결과를 나타낸다.

본 발명은 모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 인공피부는 피지선을 갖는 모낭을 갖고 있고, 상기 모낭은 표피층을 관통하여 진피층에 매몰되어 있고, 상기 모낭의 모공부가 상기 표피층과 접속하고 있는 것을 특징으로 한다.

생체에 있어서 모낭은 모유두, 모모체, 모근초, 모섬유, 모융기, 입모근, 피지선, 모낭누두부(이른바 모공) 등의 구조를 갖는, 털을 생산하는 피부 부속기관을 의미한다. 그러나 본 명세서에 있어서 "모낭"은 이들 모든 구조를 포함하는 것에 한정되지 않고, 이들 구조의 적어도 일부를 포함하고, 털을 생산하는 기능을 갖는 구조가 유지되어 있는 것을 넓게 포함한다.

본원 명세서에 있어서 "인공피부"란 적어도 진피층을 구비하는 인공적인 피부와 유사한 구조물을 말하고, 바람직하게는 표피층을 더 구비하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서 "진피층"은 주로 콜라겐이나 섬유아세포로 구성되는 구조물을 의미하고, "표피층"은 주로 각화세포(케라티노사이트)로 구성되는 구조물을 의미한다. 본 발명에서 사용하는 인공피부(단리된 모낭을 이식하기 전의 인공피부)는 모낭의 이식 전에 조제해도 되고, 표피층과 진피층을 구비하는 시판의 인공피부를 이용해도 된다.

본 발명에서 사용하는 인공피부(단리된 모낭을 이식하기 전의 인공피부)의 제조방법은 한정되지 않지만, 진피층에 대해서는 예를 들어, 섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 겔화시킴으로써 제작할 수 있다. 바람직하게는, 섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 겔화시킨 후, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 더 첨가하고, 겔화시키는 것을 적어도 1회 이상 반복함으로써 진피층을 형성시켜도 된다. 인공피부의 진피층의 제작에 사용하는 섬유아세포의 유래는 한정되지 않지만, 예를 들어 인간, 원숭이, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 마우스, 랫트 유래의 섬유아세포를 이용할 수 있다. 또한, 인공피부의 진피층의 제작에 이용하는 섬유아세포는 생체의 어느 부위 유래여도 되고, 예를 들어 신생아, 태아, 성인의 둔부, 두피, 손바닥, 발바닥, 포피 유래의 섬유아세포를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 인공피부의 표피층은 예를 들어, 상기 방법에 의해 제작된 진피층의 표면에 각화세포 및 배양액을 포함하는 혼합액을 적용하고, 이들을 배양함으로써 형성시킬 수 있다. 인공피부의 표피층의 제작에 이용하는 각화세포의 유래는 한정되지 않지만, 예를 들어 인간, 원숭이, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 마우스, 랫트 유래의 각화세포를 이용할 수 있다. 또한, 인공피부의 표피층의 제작에 사용하는 각화세포는 생체의 어느 부위 유래여도 되고, 예를 들어 신생아, 태아 또는 성인의 둔부, 두피, 손바닥, 발바닥, 포피 유래의 각화세포를 이용할 수 있다.

또한, 본 발명의 인공피부는 진피층의 하부에 지방조직층을 더 갖고 있어도 된다. 본 발명에 있어서의 "지방조직층"은 지방세포를 포함하고, 세포의 배양이 가능한 조성을 갖는 구조물인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 지방조직을 포함하는 콜라겐겔이어도 된다.

또한, 본 발명의 인공피부에 있어서는 모낭이 표피층을 관통하여 진피층에 매몰되어 있지만, 상기 모낭이 상기 진피층 내에서 지방전구세포로 덮이도록 구성하여도 된다. 그러한 구성을 갖는 인공피부의 제작방법은 한정되지 않지만, 예를 들어 표피층 및 진피층으로 이루어지는 인공피부에 모낭을 이식하기 전에 모낭의 이식부위에 지방전구세포를 매립하고, 그 후 모낭을 이식함으로써 원하는 구성을 얻을 수 있다. 또한, 예를 들어 이식용 모낭의 주위에 지방전구세포를 접착시킨 후에 표피층 및 진피층으로 이루어지는 인공피부에 모낭을 이식함으로써 원하는 구성을 얻을 수도 있다.

본 발명에서 사용하는 지방전구세포의 유래는 특별히 한정되지 않고, 시판의 지방전구세포여도 되고, 시판의 혹은 생체로부터 단리된 간엽계 간세포로부터 공지의 방법으로 유도한 지방전구세포여도 되고, 생체의 조직으로부터 직접 단리된 지방전구세포여도 된다.

본 발명에서 사용하는 단리된 모낭은 동물의 피부로부터 채취된 단리된 모낭이어도 된다. 이 경우, 모낭을 채취하는 동물의 종류는 한정되지 않고, 예를 들어 인간, 원숭이, 돼지, 소, 말, 개, 고양이, 마우스, 랫트 유래의 단리된 모낭을 이용할 수 있다. 동물의 피부로부터 채취된 모낭의 트리밍 방법은 한정되지 않고, 예를 들어 채취된 피부로부터 피지선을 손상시키지 않도록 모낭을 단리함으로써 본 발명에 이용하는 단리된 모낭을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용하는 단리된 모낭으로서 인공적으로 유도된 모낭을 이용할 수도 있다. 인공적으로 유도된 모낭의 제조방법은 한정되지 않고, 예를 들어 WO2012/108069나 WO2012/115079에 기재된 방법을 이용하여 인공적으로 유도된 모낭을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 간엽계 세포로 실질적으로 구성되는 제1 세포집합체와 상피계 세포로 실질적으로 구성되는 제2 세포집합체를 밀착시켜 지지체 내부에서 배양함으로써 제조되는 재생 모낭원기(原基) 유래의 모낭을 본 발명에서 이용할 수 있다. 이 경우, 상기 간엽계 세포 또는 상기 상피계 세포의 적어도 하나는 미분화세포(예를 들어, iPS 세포, ES 세포, 각종 조직 간세포, 각종 전구세포)를 유도함으로써 얻어지는 간엽계 세포 또는 상피계 세포여도 된다. 또한, 상기 간엽계 세포 또는 상기 상피계 세포의 적어도 하나는 동물의 모낭 유래의 단일화된 세포로부터 얻어지는 간엽계 세포 또는 상피계 세포여도 된다. 또한, 상기 방법에 의해 얻어진 재생 모낭원기를 생체의 피부에 이식하고, 모낭이 어느 정도 성장한 후에 다시 채취하여 본 발명에 이용하여도 된다.

또한, 예를 들어 WO2016/039279에 기재된 방법을 이용하여 인공적으로 유도된 모낭을 본 발명에 이용할 수도 있다. 구체적으로는, Wnt 경로를 활성화시킬 수 있는 생리활성물질로 다능성 간세포 유래의 배양체를 자극한 후에 해당 배양체를 발판재료와 결합하고, 해당 결합체를 동물의 생체에 이식한다. 그러면, 해당 이식부위에 모낭이나 피지선 등의 피부 부속기관을 고빈도로 포함하는 테라토마가 형성되므로, 해당 테라토마로부터 채취한 모낭을 본 발명에 이용할 수 있다.

본 발명의 인공피부의 제조방법에 있어서는 단리된 모낭을 인공피부의 진피층의 표면과 상기 단리된 모낭의 모공부의 위치가 실질적으로 일치하도록 인공피부에 이식한다. 이 공정에 의해, 모낭의 이식 후 모낭의 모공부와 인공피부의 표피층이 접속되어 모낭 및 피지선이 피부 부속기관으로서 기능적인 것이 된다. 본 발명에 있어서, 모낭의 모공부와 인공피부의 표피층이 "접속한다"(혹은 모낭의 모공부와 인공피부의 표피층이 "연속한다")란 모낭의 모공부와 인공피부의 표피층이 적어도 부분적으로 조직학적으로 결합하고 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 특별히 정의된 것을 제외하고, 특정의 실시형태를 설명하기 위해서 이용되는 것이며, 발명을 한정하려는 의도는 아니다.

또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 "포함한다"라는 용어는 문맥상 분명하게 다른 이해를 하여야 할 경우를 제외하고, 기술된 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 의도하는 것이고, 그 이외의 사항(부재, 단계, 요소, 숫자 등)이 존재하는 것을 배제하지 않는다.

다른 정의가 없는 한, 여기에 사용되는 모든 용어(기술용어 및 과학용어를 포함함)는 본 발명이 속하는 기술의 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 사용되는 용어는 다른 정의가 명시되어 있지 않는 한, 본 명세서 및 관련기술 분야에 있어서의 의미와 정합적인 의미를 갖는 것으로서 해석되어야 하고, 이상화되거나 또는 과도하게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다.

이하에 있어서 본 발명을 실시예를 참조하여 더 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 양태에 의해 구현화할 수 있고, 여기에 기재되는 실시예에 한정되는 것으로서 해석되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1: 모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부의 제조

본 발명의 방법에 의해 제조되는 인공피부의 모식도를 도 1에 나타내었다. 또한, 본 실시예에 있어서 실시한 본 발명의 인공피부의 제조방법의 2개의 실시형태의 순서를 도 2에 나타내었다.

1. 재료와 방법

(1) 실험동물

B57/B6 마우스는 시미즈 실험재료(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 마우스의 관리 및 조작은 NIH의 실험동물지침에 따랐다. 모든 실험은 이화학연구소의 동물실험위원회의 심사를 받아 그 인가후 실시하였다.

(2) 인간재료

본 연구에 있어서 인간재료는 "헬싱키선언"(1975년 도쿄 개정)의 주지를 따라 이화학연구소 및 제공 의료기관에 있어서의 연구윤리심사위원회에 자문하여 승인을 얻은 후, 「인간을 대상으로 하는 의학계 연구에 관한 윤리지침」(2014년 문부과학성·후생노동성 고시 제3호) 및 관련규제에 따라 제공자로부터 사전동의를 얻은 후에 공동연구의료기관에 의해 채취 제공을 받아 이화학연구소 다세포시스템형성연구센터의 소정 시설에서 사용하였다. 본 연구에 있어서의 인간재료란 일본내의 의료기관으로부터 제공을 받은 두피조직 및 이로부터 분리한 모낭 및 주변조직을 가리키고, 구입한 배양 인간유래 세포는 포함되지 않는다.

(3) 세포배양

정상 인간 신생아 포피 섬유아세포(HDFn)와 정상 인간 신생아 포피 표피각화세포(HEKn)는 제1계대 후의 동결세포로서 쿠라보로부터 구입하였다. HDFn와 HEKn 세포는 37℃의 온욕에서 급속히 해동한 후, 10% 소태아혈청과 50 유닛(units)/ml, 페니실린 및 50 μg/ml, 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 수정이글배지(DMEM10)로 세정하고, HDFn 세포는 DMEM10 배지, HEKn 세포는 HuMedia-KG2 배지(쿠라보)를 채운 배양 플라스틱접시에 2,500 세포/cm²의 세포 밀도로 파종하고, 이것을 제2계대 세포로 하였다. 계대배양은 통상법에 따라 D-PBS(-)(Nacalai Tesque)에 0.25% 트립신-1 mM EDTA(Invitrogen)를 첨가한 용액을 이용하여 소화시켜 분산시킨 후, 세포밀도를 조정하여 각 세포에 설정한 배지조건으로 계대하였다. 정상 인간세포는 제3계대까지 계대배양하여 인공피부 제작에 제공하거나, 또는 동결스톡으로 하여 해동후 제4계대 세포로서 인공피부의 제작에 이용하였다. 동결스톡으로 하는 경우, 양자 모두 60-80% 컨플루언트까지 배양을 계속하고, 인공피부의 제작에 있어서는 80% 이상의 컨플루언트가 된 상태에서 사용하였다.

(4) 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 제작

(3)에서 계대배양한 HDFn 세포를 트립신 EDTA 용액에 의해 소화시켜 단일 세포화시켰다. 그 다음에 최종농도 3.8 mg/ml 콜라겐(I-AC 5 mg/mL, KOKEN), 1xDMEM(SIGMA), 10 mM NaHCO₃(와코쥰야쿠), 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4가 되도록 적정 조정, 와코쥰야쿠), 5% 소태아혈청을 포함하는 콜라겐 중성용액을 제작하고, 빙온조건에서 조용히 교반하면서 원심분리에 의해 펠릿화된 HDFn 세포를 분산시켰다. 콜라겐 산성용액을 중화하여 세포생존 환경으로 하기 위한 첨가제로서 10배 농도 DMEM, 1M NaHCO₃, 1M HEPES 버퍼를 제작하고, 스톡으로 하여 4℃ 냉장보관하였다. 콜라겐 중성용액에 분산한 HDFn 세포를 12웰 용 세포배양 인서트(0.4 μm/고밀도 포아)에 400 μl씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂, 100% 습도조건하에 30분간 정치하여 겔화시키고, 두께 3-4 mm의 인공진피층을 형성시켰다. 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 표면이 세포배양 인서트 천장부의 필터 면과 수평이 되도록 또한 일정하게 겔화를 진행시키기 위해서 콜라겐 액 조제 및 세포분산은 빙상에서 수행하고, 조정한 콜라겐액은 세포배양 인서트에의 분주시까지 얼음 안에 매몰시켜 보존하였다. 세포 함유 콜라겐용액의 겔화로부터 인공진피층을 형성한 세포배양 인서트는 10 ng/ml FGF2(와코쥰야쿠)를 포함하는 DMEM10 배지를 채운 12웰 배양플레이트에 설치하여 하룻밤 배양하였다. 이하의 배양조건은 모두 37℃, 5% CO₂, 100% 습도 조건으로 하였다.

인간 섬유아세포 함유 콜라겐겔을 하룻밤 배양한 후에, 마이크로피브릴 형성에 의해 겔 수축된 것을 육안으로 확인하였다. 그 후 새로운 세포배양 인서트에 100 μl의 최종농도 3.8 mg/ml의 소 유래 천연형 콜라겐 1 산성용액(I-AC 5 mg/mL, KOKEN), 1 XDMEM(SIGMA), 10 mM NaHCO₃(와코쥰야쿠), 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4), 5% 소태아혈청을 포함하는 콜라겐용액을 넣고, 수축한 겔을 핀셋에 의해 옮겼다. 그 후 37℃, 5% CO₂, 100% 습도조건하에 30분간 정치하여 겔화시키고, 외주의 틈을 세포 비함유 콜라겐겔로 보충함으로써 12웰 플레이트의 배지 성분이 세포배양 인서트내에 유입하는 것을 방지하였다. 마찬가지의 처리를 겔 형성 후 3일간에 걸쳐 1일 1회의 비율로 실시하였다. 각 처리시에 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 매크로사진을 촬영하고, 3일째까지 급속히 수축이 진행되고, 그 후 거의 정상상태가 되는 것을 계측하고, 섬유아세포 함유 콜라겐겔이 생리적으로 적절히 기능하도록 제작된 것을 확인하였다.

2. 진피층에의 모낭 삽입후에 표피형성을 수행하는 것에 의한 인공피부의 제작(도 3)

상기 (1) 내지 (4)의 방법에 의해 제작한 섬유아세포 함유 콜라겐겔에 모낭을 삽입하고, 그 후 표피층을 중층함으로써 인공피부를 작성하였다.

구체적인 방법은 다음과 같다. 우선 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 형성후 1일째에 해당 콜라겐겔에 대하여 모낭 삽입용 절개를 수행하였다. 안과용 마이크로메스(스트레이트나이프 Straight 22.5°, 마니)를 이용하여 겔 표면에 모낭의 약 1.2배 폭의 슬릿을 형성하였다. 슬릿 심도는 세포배양 인서트의 저부 필터면에 손상을 미치지 않는 한계까지의 심도로 하고, 약 30도의 경사각으로 하였다. 이 슬릿 내에 수염의 모낭, 몸통등부 피부의 체모의 모낭 또는 인간 두발의 모낭(모두 단리된 모낭)을 표면측으로부터 삽입하였다. 삽입되는 모낭으로부터 성장하고 있는 모간만을 핀셋으로 잡아 모구부나 모공부에는 접촉하지 않도록 하였다. 삽입시에 세포 비함유 콜라겐 중성액에 모낭을 담가 슬릿 내로의 삽입을 수행하였다. 모낭의 모공부와 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 표면이 거의 일치하도록 이식 모낭의 심도 조절을 수행하였다.

그 후, 후술하는 「3. 진피층 및 표피층 형성 후에 모낭삽입을 수행하는 것에 의한 인공피부의 제작」과 마찬가지의 방법에 의해 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 표면에 표피층을 형성시키고, 에어컬처를 수행하였다.

인공피부에 삽입하는 모낭은 생후 5-7일령의 B57/B6 마우스의 수염과 몸통등부 피부의 체모 및 인간 두발모낭 중 성장기 Ⅵ기에 있고, 체표면으로부터 모종을 특정가능한 모간을 성장시키고 있는 것을 이용하였다. 또한, 클럽헤어가 잔존하고 있는 마우스 수염과 등부피부 체모 및 인간 두피모낭을 각각 선행문헌(Toyoshima et al.(NATURE COMMUNICATIONS｜3:784｜DOI:10.1038/ncomms1784, 2012), Asakawa et al.(SCIENTIFIC REPORTS, 2:424｜DOI:10.1038/srep00424, 2012), Under et al.(Hair Transplantation 5th edn(2010)))에 기재된 모낭기관의 피부내 이식기술에 기초해서 실체현미경을 이용하여 분리 및 가공을 수행하였다. 마우스 수염은 콜라겐시스를 보유하고, 피지선과 외모근초가 손상하지 않도록 모낭협부보다 위쪽에 위치하는 진피성 조직 및 콜라겐시스와 피부표피층을 서지컬 메스로 절제하였다. 체모는 10-15개의 완전모낭으로 이루어지는 모군으로서, 피부표피층·진피층·피하지방층을 포함하도록 모낭에 대하여 수평이 되도록 피부로부터 잘라 나누어 분리하였다. 인간모낭은 1모낭 또는 2모낭으로 이루어지는 모군의 상태가 되도록 분리하고, 수염과 마찬가지로 모낭 상부의 진피성 조직 및 피부표피층의 트리밍을 수행하였다.

3. 진피층 및 표피층 형성 후에 모낭삽입을 수행하는 것에 의한 인공피부의 제작(도 4)

상기 (1) 내지 (4)의 방법에 의해 제작한 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 표면에 표피층을 형성시키고, 그 후 모낭을 삽입함으로써 인공피부를 제작하였다.

구체적인 방법은 다음과 같다. 60%-80% 컨플루언트까지 증식시킨 HEKn 세포를 트립신 소화에 의해 단일 세포화하고, 2x10⁶ 세포/ml가 되도록 HuMedia-KG2 배지에서 현탁시켰다. 1웰당 500 μl의 세포현탁액을 (4)에서 작성한 섬유아세포 함유 콜라겐겔상에 중층파종하고 배양함으로써, 섬유아세포 함유 콜라겐겔 상에 각화표피층을 형성시켰다. 중층한 HEKn 세포는 파종 후 4일째까지 HuMedia-KG2 배지 또는 DMEM10 배지 중에서 배양하고, HEKn 세포 파종후 1, 2, 3일째에 중층파종시와 동일한 배지조건으로서 전량 배지교환을 수행하였다. 상술한 조작은 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 수축에 수반하는 콜라겐겔의 보충 후에 수행하였다. 웰 내의 10 ng/ml FGF2를 포함하는 DMEM10 배지량은 세포배양 인서트 내의 HuMedia-KG2 배지의 액면과 동일해지도록 조정하였다. HEKn 세포 중층후 4일째에 세포배양 인서트 내의 배지를 제거함으로써 표피층이 직접 대기의 산소분압조건에 노출되는 배양조건인 에어컬처를 개시하였다.

다음으로 표피층이 형성된 섬유아세포 함유 콜라겐겔에 대하여 모낭의 삽입을 수행하였다. HDFn 세포 함유 콜라겐겔에 HEKn 세포를 중층하여 3일째에 모낭의 삽입을 수행하고, 4일째에 에어컬처를 개시하였다. 본 실시예에 있어서는 「2. 진피층에의 모낭삽입 후에 표피형성을 수행하는 것에 의한 인공피부의 제작」에 기재된 방법에 의해 준비한 단리된 마우스 수염을 이용하였다. 인공피부에의 모낭삽입은 「2. 진피층에의 모낭삽입 후에 표피형성을 수행하는 것에 의한 인공피부의 제작」에 기재한 방법과 마찬가지로, 표피층과 세포 함유 콜라겐겔 층의 양자를 관통하는 슬릿을 형성하여 수행하였다. 슬릿 형성에 있어서 중층화 표피층과 세포 함유 콜라겐겔층의 박리를 방지하기 위해서 우선 안과용 마이크로메스를 수평방향으로 얕게 움직임으로써 표피층의 절개를 형성하고, 그 후에 진피층에 절개를 넣었다.

4. 인공피부에 삽입한 모낭의 기능평가

4-1. 상피간 접속

모낭이나 땀샘 등의 외배엽성 기관은 모공이나 도관의 개구부를 통하여 피부표피층과 연결함으로써 피부 기관계(외피계)로서 기능한다. 즉, 모낭과 함께 인공피부에 삽입한 피지선이 기능적인 것이 되기 위해서는 삽입한 모낭의 모공부와 인공피부의 표피층이 연속하고 있는 것이 중요해진다.

모낭삽입 후 4일째와 7일째에 배지를 제거하고, 포르말린 고정액(SuperFix, KURABO)을 세포배양 인서트 내와 플레이트 웰 내에 각각 1 ml와 2 ml씩 넣어 조직고정을 수행하였다. 실온환경에서 6시간 내지 12시간 조직고정을 수행하고, 고정 종료후에 실온의 PBS(-) 중으로 옮기고, 모낭삽입형 인공피부의 한 가운데와 모공과 모성장 방향을 포함하는 표피층에 대하여 수직이 되는 할면(割面)을 잘라내어 파라핀포매 블록을 제작하였다. 그 후 통상법에 따라 10 μm 두께의 연속 절편을 제작하고, H&E 염색을 수행하여 모낭과 표피층의 연속위치 및 그에 이어지는 모구부를 추적하였다.

도 3B 및 도 3C에 나타내는 바와 같이 진피층에의 모낭삽입후에 표피형성을 수행한 인공피부에 있어서 인공피부에 삽입한 모낭의 상부모공영역에 있어서 모낭 외모근초와 인공피부의 표피층이 연결되어 있는 것이 나타났다.

또한, 도 4B에 나타내는 바와 같이 진피층 및 표피층 형성후에 모낭삽입을 수행한 인공피부에 있어서도 인공피부에 삽입한 모낭의 상부 모공영역에 있어서 모낭 외모근초와 인공피부의 표피층은 연결되어 있음이 나타났다.

이들 결과로부터 본 발명의 방법에 의해 제작되는 인공피부 중의 모낭은 모공을 통하여 인공피부 표피층과 연결되어 있고, 기능적인 피부 부속기관을 갖는다는 것이 나타났다.

4-2. 조직학적 평가

모낭삽입후 4일째와 7일째의 H&E 염색상을 이용하여 모구부의 모모세포 및 모유두세포의 비생리적인 변성이나 세포사에 수반하는 핵형태나 세포질 염색성의 변화와 각각의 조직에 특유한 세포배치를 조직학적으로 해석하고, 천연모낭의 조직과 비교하였다.

인공피부에 삽입된 모낭의 모구부를 구성하는 세포가 생존하여 모간형성을 유지하고 있는 것을 조직학적으로 해석한 결과, 진피층에의 모낭삽입 후에 표피형성을 수행한 인공피부에서도(도 3B, 도 3C), 진피층 및 표피층 형성 후에 모낭삽입을 수행한 인공피부에서도(도 4B) 모구부의 모모 및 모유두세포는 생존하고 있다는 것이 나타났다.

4-3. 모간 성장

실체현미경(Stemi2000, Zeiss)을 이용하여 모낭 삽입시(Day 0)부터 Day 3, 4, 7, 14까지 경시적으로 매크로 사진촬영을 수행하고, 화상해석 소프트웨어(AxioVision, Zeiss 및 Image J, NIH)를 이용하여 모간 길이의 변화를 계측하였다. 또한, 이식전의 모낭 및 모간길이 및 모낭삽입형 인공피부로부터 경시적으로 모낭을 채취하여 모낭 및 모간길이를 마찬가지로 화상해석에 의해 계측하여 모간 성장을 정량적으로 기능평가하였다.

그 결과, 진피층으로의 모낭삽입 후에 표피형성을 수행한 인공피부에 있어서 인공피부에 삽입한 모낭으로부터 4일간에 걸쳐 모간이 성장하는 것이 나타났다(도 5A-C). 또한, 진피층 및 표피층 형성후에 모낭삽입을 수행한 인공피부에서도 모간 성장이 계속되는 것이 나타났다(도 6).

이들 결과로부터 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 인공피부는 기능적인 피부 부속기관을 갖고 있는 것이 나타났다.

실시예 2: 지방조직층을 더 갖는 인공피부의 제조

1. 6-well 포맷 인공피부의 제작

6-웰 포맷 인공피부의 제작은 이하의 순서로 수행하였다.

<세포배양>

정상 인간 신생아 포피 섬유아세포(HDFn)와 정상 인간 신생아 포피 표피각화세포(HEKn)는 제1계대후의 동결세포로서 쿠라보로부터 구입하였다. HDFn와 HEKn 세포는 37℃의 온욕에서 급속히 해동한 후, 10% 소태아혈청과 50 단위(units)/ml, 페니실린 및 50 μg/ml, 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 수정이글배지(DMEM10)로 세정하고, HDFn 세포는 DMEM10 배지, HEKn 세포는 HuMedia-KG2 배지(쿠라보)를 채운 배양 플라스틱 접시에 2,500 세포/cm²의 세포 밀도로서 파종하고, 이것을 제2계대 세포로 하였다. 계대배양은 통상법에 따라 D-PBS(-)(Nacalai Tesque)에 0.25% Trypsin-1 mM EDTA(Invitrogen)를 첨가한 용액을 이용하여 소화시키고 분산시킨 후, 세포 밀도를 조정하여 각 세포에 설정한 배지조건으로 계대하였다. 정상 인간 세포는 제2계대까지 계대배양하여 인공피부 제작에 제공하거나 또는 동결스톡으로 하여 해동 후 제3계대 세포로서 인공피부의 제작에 이용하였다. 동결스톡으로 하는 경우, 양자 모두 60-80% 컨플루언트까지 배양을 계속하고, 인공피부의 제작에 있어서는 80% 이상의 컨플루언트가 된 상태에서 사용하였다.

<섬유아세포 함유 콜라겐겔의 제작>

계대배양한 HDFn 세포를 트립신 EDTA 용액에 의해 소화하여 단일 세포화하였다. 그 다음에 최종농도 3.8 mg/ml 콜라겐(I-AC 5 mg/mL, KOKEN), 1xDMEM(SIGMA), 10 mM NaHCO₃(와코쥰야쿠), 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4가 되도록 적정 조정, 와코쥰야쿠), 5% 소태아혈청을 포함하는 콜라겐 중성용액을 제작하고, 빙온조건에서 조용히 교반하면서 원심분리에 의해 펠릿화한 HDFn 세포를 분산시켰다. 콜라겐 산성용액을 중화하여 세포생존 환경으로 하기 위한 첨가제로서 10배 농도 DMEM, 1M NaHCO₃, 1M HEPES 버퍼를 제작하고, 스톡으로 하여 4℃ 냉장보관하였다. 콜라겐 중성용액에 분산시킨 HDFn 세포를 6웰 용 세포배양 인서트(0.4 μm/고밀도 포아)에 400 μl씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂, 100% 습도조건하에 30분간 정치하여 겔화시키고, 두께 1.0-1.5 mm의 인공진피층을 형성시켰다. 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 표면이 세포배양 인서트 천장부의 필터 면과 수평이 되도록 또한 일정하게 겔화를 진행시키기 위해서 콜라겐액 조제 및 세포분산은 빙상에서 수행하고, 조제한 콜라겐액은 세포배양 인서트에의 분주시까지 얼음 내에 매몰시켜 보존하였다. 세포 함유 콜라겐 용액의 겔화로부터 인공진피층을 형성한 세포배양 인서트는 10 ng/ml FGF2(와코쥰야쿠)를 포함하는 DMEM10 배지를 채운 6웰 배양플레이트에 설치하여 표피층 형성까지 배양을 계속하였다. 이하의 배양조건은 모두 37℃, 5% CO₂, 100% 습도조건으로 하였다.

<표피층의 형성>

상기 방법에 의해 제작한 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 표면에 표피층을 형성시켜 인공피부를 제작하였다.

구체적인 방법은 다음과 같다. 60%-80% 컨플루언트까지 증식시킨 HEKn 세포를 트립신 소화에 의해 단일 세포화시키고, 3.7x10⁶ 세포/ml가 되도록 HuMedia-KG2 배지에서 현탁시켰다. 1웰당 1 ml의 세포현탁액을 실시예 1의 (4)에서 작성한 섬유아세포 함유 콜라겐겔 상에 중층파종하고 배양함으로써 섬유아세포 함유 콜라겐겔 상에 각화표피층을 형성시켰다. 중층한 HEKn 세포는 파종 후 4일째까지 HuMedia-KG2 배지 또는 DMEM10 배지 중에서 배양하고, HEKn 세포파종 후 1, 2, 3일째에 중층 파종시와 동일한 배지조건으로서 전량 배지교환을 수행하였다. 상술한 조작은 섬유아세포 함유 콜라겐겔의 수축에 수반하는 콜라겐겔의 보충 후에 수행하였다. Well내의 10 ng/ml FGF2를 포함하는 DMEM10 배지량은 세포배양 인서트 내의 HuMedia-KG2 배지의 액면과 동일해지도록 조정하였다. HEKn 세포 중층 후 4일째에 세포배양 인서트 내의 배지를 제거함으로써 표피층이 저산소 분압조건에 노출되는 배양조건인 에어컬처(37℃, 5% CO₂, 12.5% O₂, 100% 습도조건 하)를 개시하였다.

에어컬처를 2일간 수행한 상기 인공피부를 후술하는 피하지방 함유 콜라겐겔(지방조직층)의 위에 중층하고, 그 후 모낭의 삽입에 제공하였다.

2. 피하지방 함유 콜라겐겔(지방조직층)의 제작

마우스 등부 피부조직으로부터 결합조직 등의 불필요한 부위를 트리밍한 피부조직을 리본모양으로 재단한 후, 핀셋을 이용하여 지방조직을 채취하였다. 세절한 지방조직을 실시예 1의 (4)에 기재된 방법으로 조제한 콜라겐 중성용액 내에 분산시키고, 37℃, 5% CO₂, 100% 습도조건 하에 30분간 정치함으로써 겔화시킨 것을 다시 3 mm 각으로 자르고, 콜라겐겔 중성용액 내에 배치하고, 상기와 마찬가지의 방법으로 겔화시킨 것을 피하지방층으로 하였다. 대조로서 지방조직을 포함하지 않는 콜라겐겔도 작성하였다.

3. 이식용 모낭의 준비(도 7)

본 실시예에 이용한 모낭은 실시예 1의 「2. 진피층에의 모낭삽입 후에 표피형성을 수행하는 것에 의한 인공피부의 제작」에 기재된 방법에 의해 준비하고, 콜라겐시스를 떼어낸 마우스 수염을 이용하였다.

성장기의 마우스 수염을 채취하여 콜라겐시스를 포함하는 인택트 모낭(도 7 상단) 및 가변영역의 콜라겐시스를 제거한 모낭(도 7 하단)을 제작하였다. 각각의 조건의 모낭을 6 cm 플라스틱배양접시의 저면에 박층 콜라겐겔로 접착하고, 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12(1:1)중에서 5% CO₂ 환경하에서 침지배양을 3일째까지 수행하였다.

배양개시 시(Day 0)로부터 매일 실체현미경에 의해 경과관찰을 수행하였다. 화살표는 모간 선단을 나타내고, 화살촉은 모구부의 위치를 나타낸다. 오른쪽 열에는 배양 3일째의 모구부 확대 상을 나타낸다. 점선은 모낭 최외층의 간엽조직 경계를 나타낸다. 통상 성장기로부터 퇴행기를 거쳐 휴지기에 도달하는 모낭의 구조변화에 있어서 모구부는 모낭상부로 이동하여 2차모아(毛芽)라고 불리는 구조를 형성하는 것이 알려져 있다. 그 때문에 모구부 위치의 상승과 모낭의 간엽조직 경계의 엇갈림은 퇴행기 또는 휴지기인 것을 나타낸다.

또한, 마우스 수염모낭은 콜라겐시스에 싸인 상태로 생체내에 있고, 성장기의 모낭을 콜라겐시스가 부착된 상태로 생체외배양을 수행하면 모간이 신장하여 성장기를 유지하는 것이 알려져 있다(예를 들어, Biochemical and Biophysical Research Communications 367(2008) 299-304). 한편, 단모낭 이식술 등에 제공하는 모낭은 퇴행기를 거쳐 휴지기에 돌입하는 것이 식모 의료현장에서는 잘 알려져 있다. 이와 마찬가지로 콜라겐시스를 떼어내는 등의 외적 처치에 의해 자극된 성장기의 마우스 수염모낭을 생체외 배양하면 모구부 위치와 모구부의 간엽조직 경계의 엇갈림을 일으키고, 퇴행기 또는 휴지기로 이행하는 것이 발견되었다(도 7).

4. 피하지방 부착 인공피부의 제작 및 모낭의 삽입(도 8a)

지방조직층상에 에어컬처 2일후의 인공피부를 배치한 후, 모낭의 삽입을 수행하였다. 인공피부에의 모낭삽입은 실시예 1의 「2. 진피층에의 모낭삽입 후에 표피형성을 수행하는 것에 의한 인공피부의 제작」에 기재한 방법과 마찬가지로 표피층과 지방조직층의 양자를 관통하는 슬릿을 형성하고, 상기 콜라겐시스를 떼어낸 모낭을 제작하고, 핀셋을 이용하여 삽입함으로서 수행하였다. 모낭의 삽입후, 3일간의 기관배양을 수행하였다. 기관배양조건은 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12(1:1), 5% CO₂ 환경하로 하여 반기상 배양에 의해 실시하였다.

5. 지방조직층의 유무에 의한 모낭성장의 비교(도 8b)

도 8b는 기관배양 3일째의 이식모낭의 조직 상을 나타낸다. 지방조직층을 갖지 않는 인공피부에 삽입된 모낭(도 8b의 왼쪽)은 퇴행기를 나타내는 선상의 모낭간엽상(화살표)인 것에 대하여 지방조직층을 갖는 인공피부에 삽입된 모낭(도 8b의 오른쪽)은 성장기 모구부인 것이 나타났다. 사진 오른쪽의 점선은 진피(Der)와 지방조직(Adp)의 경계를 나타낸다.

이상의 결과로부터 지방조직은 모낭의 성장을 촉진하는 효과가 있는 것이 나타났다. 즉, 본 발명의 인공피부는 모낭과 피하지방조직의 상호작용에 의한 모낭성장의 평가가 가능한 것이 나타났다.

실시예 3: 재생 모낭원기를 이용한 인공피부의 제조

1. REC 세포로부터의 지방전구세포의 유도

지방전구세포는 시판의 간엽계간세포인 REC(Rapidly Expanding Cell, 베이바이오사이언스로부터 구입)로부터 선행문헌(Mabuchi Y. et al., Stem Cell Reports, 1, 152-165, 2013)에 따라 유도하였다.

REC는 37℃의 온욕에서 급속히 해동한 후, 지방생성 유지 배지(Adipogenic Maintenance Medium, Lonza)로 세정하고, 동일한 배지를 채운 배양 플라스틱 접시에 21,000 세포/cm²의 세포 밀도로서 파종하고, 3일간 배양을 수행하였다. 다음에 지방세포로 분화 유도하기 위해서 지방생성 유지 배지를 제거한 후, 지방생성 유도 배지(Lonza)로 치환하고, 다시 2일간 배양을 수행하였다. 세포의 회수는 통상법에 따라 D-PBS(-)(Nacalai Tesque)에 0.25% 트립신-1 mM EDTA(Invitrogen)를 첨가한 용액을 이용하여 수행하였다. 얻어진 세포에 있어서의 지방전구세포 마커 PPARγ 유전자의 발현을 확인하고, REC유래 지방전구세포로서 이용하였다.

2. 이식용 재생 모낭의 제작(도 9a)

E18.5 마우스 등부피부로부터 효소처리에 의해 단일 세포화한 피부 표피와 간엽계 세포를 조제하고, 이들을 이용하여 재생 모낭원기를 제작하였다. 재생 모낭원기의 작성은 WO2012/108069 및 WO2012/115079에 기재된 방법을 이용하여 수행하였다.

재생 모낭원기를 세포배양 인서트상에 옮기고, 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12(1:1) 배지를 이용하여 멀티가스 챔버에 의해 가스분압을 조제하면서 7일간 기관배양을 수행하였다. 7일 후에 모낭 발생이 실체현미경 하에서 구해졌다(도 9a의 중앙 왼쪽). 이것을 모군마다 분할하여(도 9a의 중앙 오른쪽) 인공피부에의 삽입에 제공하였다.

3. 재생 모낭의 인공피부에의 이식(도 9a)

준비한 재생 모낭을 이하의 3종류의 인공피부에 삽입하고, 3일간 기관배양(10% FBS를 포함하는 DMEM/F12(1:1) 배지, 5% CO₂ 환경)한 후, 조직학적 해석을 수행하였다.

1. 표피 + 진피 모델(실시예 1에 있어서의 모낭삽입 전의 인공피부)

2. 표피 + 진피 + 지방조직 모델(실시예 2에 있어서의 모낭삽입 전의 인공피부)

3. 표피 + 진피 + REC 모델(1의 인공피부에 있어서 모낭이 이식되는 이식구멍에 REC로부터 유도된 지방전구세포를 삽입한 인공피부)

어느 인공피부에서나 25G 주사바늘을 이용하여 인공피부의 하층까지 이르는 이식구멍을 형성하고, 인공피부 표면과 분할한 모낭의 모공부가 되는 위치가 일치하는 심도가 되도록 삽입을 수행하였다.

「표피 + 진피 + REC 모델」에 있어서는 마이크로피펫을 이용하여 이식공 내에 배양액을 제거한 REC 유래 지방전구세포 집괴 0.2 μl를 주입하고, 그 후 상기와 마찬가지의 방법으로 모낭을 삽입하였다.

4. 이식한 모낭의 조직학적 해석(도 9b)

도 9b의 상단은 「표피 + 진피 모델」, 중단은 「표피 + 진피 + 지방조직 모델」, 하단은 「표피 + 진피 + REC 유래 지방전구세포 모델」의 결과를 나타낸다. 도 9b 왼쪽 열의 저배율 도면 내에 나타낸 사각의 범위를 확대한 것을 오른쪽 열에 나타낸다. 어느 모델에서나 이식한 모낭의 상피조직은 인공피부 표피층과 접속하고 있는 것이 나타났다.

「표피 + 진피 모델」에 이식된 재생 모낭조직은 모낭조직의 분화경향으로부터 빗나가 있고, 상피조직에 의해 싸인 간엽세포(도 9b의 상단 오른쪽 화살표)는 확인되었지만, 상피세포의 모모세포 분화는 볼 수 없었다.

「표피 + 진피 + 지방조직 모델」에서는 이식된 모낭 중에 상피에 의해 감싸진 간엽세포의 집괴가 다수 확인되었지만(도 9b 중단 오른쪽 화살표), 간엽세포 주위의 상피세포에는 모구부 특유인 분화경향은 낮은 결과가 되었다. 또한, 양 모델 모두 상피조직의 신장(*애스터리스크)이 보이지만, 모낭 상피에의 분화경향은 조직학적으로는 확인되지 않았다.

「표피 + 진피 + REC 유래 지방전구세포 모델」에 이식된 모낭에서는 모모에의 분화경향이 강한 상피에 의해 간엽세포가 채워져 있었다(도 9b의 하단 백색 화살표). 또한, 이식된 모낭의 상피 중앙에는 각화경향이 강한 모간형상의 구조(HS)가 확인되었다. 모낭 주위에는 REC 유래 지방전구세포가 분포하고 있었다(화살촉). 인공피부에 있어서의 구조로서 Epi는 표피층, Der은 진피층을 나타내고, 또한 Adp는 피하지방조직을 나타낸다.

실시예 4: 인공피부 내의 모낭의 모간 성장에 대한 지방조직과 지방전구세포의 효과

성장기의 마우스 수염을 채취하여 가변영역의 콜라겐시스를 제거한 모낭을 제작하였다. 해당 모낭을 실시예 3의 「표피 + 진피 모델(지방조직 없음)」, 「표피 + 진피 + 지방조직 모델」 또는 「표피 + 진피 + REC 유래 지방전구세포(유도기간 2일 혹은 7일) 모델」의 인공피부에 삽입하고, 3일간의 기관배양을 수행하였다.

기관배양조건은 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12(1:1), 5% CO₂, O₂ 대기분압환경하로서 반기상 배양에 의해 실시하였다. 배양 3일째의 모간 성장은 실체현미경(Stemi2000, Zeiss)을 이용하여 매크로사진촬영을 수행하고, 화상해석 소프트웨어(AxioVision, Zeiss 및 Image J, NIH)를 이용하여 모간 길이의 변화를 계측하였다. 또한, 이식 전의 모낭 및 모간길이 및 모낭삽입형 인공피부로부터 경시적으로 모낭을 채취해서 모낭 및 모간길이를 마찬가지로 화상해석에 의해 계측하여 모간 성장을 정량적으로 기능평가하였다.

결과를 도 10에 나타낸다. 「표피 + 진피 모델」에 대하여 「표피 + 진피 + 지방조직 모델」혹은 「표피 + 진피 + REC 유래 지방전구세포 모델」은 모간 성장효과를 나타내고, 특히 유도기간 7일간의 REC 유래 전구세포가 가장 높은 모낭성장효과를 나타내었다.

이상과 같이 본 발명의 방법에 의해 제조된 인공피부에 있어서의 모낭은 생체의 피부에 있어서의 모낭과 유사한 거동을 나타내는 것이 나타났다. 즉, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인공피부는 종래의 인공피부보다 생체의 피부에 가까운 구조나 기능이 재현되어 있었다. 또한, 본 발명에 있어서의 인공피부에 있어서는 모낭 등의 피부 부속기뿐만 아니라 지방 및 이와 비슷한 세포의 도입도 가능하다는 것이 나타났다. 그러므로 본 발명의 인공피부는 예를 들어 피부에 대한 의약품이나 화장품의 약효평가나 안전성 평가에 있어서의 유용성이 매우 높다고 할 수 있다.

Claims

모낭, 피지선 및 모공을 갖는 인공피부의 제조방법으로서,
상기 제조방법은 하기 각 단계
(A): 진피층 및 표피층을 갖는 인공피부 또는 진피층만을 갖는 인공피부를 준비하는 단계; 및
(B): 단계 (A)에서 준비한 인공피부에 단리된 모낭을 이식하는 단계;
를 포함하고, 여기서
상기 단리된 모낭은 피지선을 갖는 것이고,
상기 단리된 모낭은 상기 인공피부의 상기 진피층의 표면과 상기 단리된 모낭의 모공부의 위치가 일치하도록 상기 인공피부에 이식되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (A)에 있어서 진피층만을 갖는 인공피부가 사용되고,
상기 단계 (B)의 후에 아래의 단계
(C): 상기 인공피부의 상기 진피층상에 표피층을 형성시키는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (A)에 있어서의 인공피부의 진피층은 섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 겔화시킴으로써 형성된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (A)에 있어서의 인공피부의 진피층은 섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 겔화시킨 후, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 혼합액을 더 첨가하고, 겔화시키는 것을 적어도 1회 이상 반복함으로써 형성된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (A)에 있어서의 「진피층 및 표피층을 갖는 인공피부」의 표피층은 상기 진피층의 표면에 각화세포 및 배양액을 포함하는 혼합액을 적용하고, 이들을 배양함으로써 형성된 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 단계 (C)는 상기 인공피부의 상기 진피층의 표면에 각화세포 및 배양액을 포함하는 혼합액을 적용하고, 이들을 배양함으로써 표피층을 형성시키는 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (A)가
(A): 진피층, 표피층 및 지방조직층을 갖는 인공피부를 준비하는 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 (A)의 후 또한 상기 단계 (B)의 전에 이하의 단계
(A'): 단계 (B)에 있어서 단리된 모낭이 이식되는 인공피부의 부위에 지방전구세포를 매립하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단리된 모낭은 동물의 피부로부터 단리된 모낭인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 동물이 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단리된 모낭은 인공적으로 유도된 재생 모낭인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 재생 모낭은 간엽계 세포로 실질적으로 구성되는 제1 세포집합체와 상피계 세포로 실질적으로 구성되는 제2 세포집합체를 밀착시켜 지지체 내부에서 배양함으로써 제조되는 재생 모낭인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 간엽계 세포 또는 상기 상피계 세포의 적어도 하나는 미분화세포를 유도함으로써 얻어진 것인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 간엽계 세포 또는 상기 상피계 세포의 적어도 하나는 동물의 모낭 유래의 단일화된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
모낭, 피지선을 갖는 인공피부로서, 모공을 더 갖는 것을 특징으로 하는 인공피부.
제15항에 있어서,
섬유아세포, 콜라겐 및 배양액을 포함하는 겔로 이루어지는 진피층,
상기 진피층의 표면에 형성되고, 실질적으로 각화세포로 이루어지는 표피층, 및
피지선을 갖는 모낭을 포함하고,
상기 모낭은 상기 표피층을 관통하여 상기 진피층에 매몰되어 있고,
상기 모낭의 모공부가 상기 표피층과 접속하고 있는 인공피부.
제16항에 있어서,
상기 진피층의 하부에 지방조직층을 더 갖는 것을 특징으로 하는 인공피부.
제16항에 있어서,
상기 모낭이 상기 진피층 내에서 지방전구세포로 덮여 있는 것을 특징으로 하는 인공피부.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인공피부는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 제작되는 것을 특징으로 하는 인공피부.